Analiza komplementarności funkcjonalnej (FCA): ćwiczenie laboratoryjne zaprojektowane i wdrożone w celu uzupełnienia nauczania szlaków biochemicznych

Ogólnym celem eseju o komplementarności funkcjonalnej jest wyjaśnienie aktywności enzymu poprzez wprowadzenie funkcjonalnej kopii odpowiedniego genu do zmutowanej komórki, aby sprawdzić, czy przywraca ona fenotyp typu dzikiego na tle zmutowanego. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z różnych dziedzin, takich jak biochemia, mikrobiologia, genetyka, biologia roślin, ewolucja i inne. Główną zaletą tej techniki jest to, że ocenia ona funkcję, aktywność i/lub rolę enzymu w warunkach in vivo, które zwykle mają charakter fizjologiczny, w przeciwieństwie do warunków in vitro, które zwykle mają charakter sztuczny.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku identyfikacji i/lub wyjaśnienia funkcji niescharakteryzowanych enzymów oraz tych, które nadal mają domniemane lub przewidywane funkcje. Demonstracją tej procedury funkcjonalnej komplementacji jest student biotechnologii i biologii molekularnej, Taylor Harkness, student w moim laboratorium. Po sklonowaniu genów DapL, TarB, MurE i RSH zgodnie z protokołem tekstowym, zaszczep 50 mililitrów płynnej pożywki pojedynczą kolonią zmutowanych komórek bakteryjnych, które mają zostać przekształcone w interesujący gen i rosnąć przez noc.

Drugiego dnia użyj 50-mililitrowej kultury przez noc, aby zaszczepić 1 litr odpowiedniej pożywki i rosnąć w temperaturze 30 stopni Celsjusza do fazy blokady lub do OD600 od 0,4 do 0,6. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 5 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie zdekantować supernatant i użyć 500 mililitrów sterylnej, lodowatej wody destylowanej do ponownego zawieszenia osadu.

Ponownie odwirować komórki, a po dekantacji supernatantu użyć 250 mililitrów sterylnego, lodowatego 10% glicerolu do ponownego zawieszenia osadu. Po ostatnim odwirowaniu komórek użyj dwóch mililitrów 10% glicerolu do ponownego zawieszenia komórek. Przenieść 50 mikrolitrów porcji do probówek do mikrowirówek i natychmiast zamrozić, umieszczając probówki w kąpieli etanolowej z suchym lodem.

Przechowuj ogniwa w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do elektroporacji. Aby przeprowadzić elektroporację, dodaj 1 mikrolitr rekombinowanego plazmidu do 50 mikrolitrowej porcji kompetentnych komórek i umieść na lodzie na pięć minut. Przenieś ogniwa do kuwety elektroporacyjnej i ustaw aparat do elektroporacji na następujące ustawienia: pojemność 25 stopni Fahrenheita, 2.5 kilowolta i rezystancja 200 omów.

Następnie z kuwetą w urządzeniu dostarcz impuls. Dodaj 1 mililitr pożywki regeneracyjnej do kuwety i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Pozwolić komórkom na regenerację poprzez inkubację kultury w inkubatorze z wytrząsaniem z delikatnym obracaniem przez 60 minut w odpowiedniej temperaturze wymaganej przez mutanta.

Aby wybrać transformanty, należy odpipetować 100 mikrolitrów kultury na pożywkę z płytkami agarowymi i użyć sterylnego rozsiewacza do rozprowadzenia roztworu. Następnie inkubować przez noc w odpowiedniej temperaturze. Więcej informacji można znaleźć w protokole tekstowym.

Aby przeprowadzić analizę komplementacji, przekształć AOH1 z pustym wektorem pBAD33 lub z wektorami ekspresji dapL za pomocą elektroporacji, jak pokazano poniżej. Mieszaninę transformacyjną należy rozłożyć na pożywce agarowej LB, uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr Dap, 34 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu i 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny. Inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed obserwacją wyników.

Za pomocą pustego wektora pBAD33 lub wektora wyrażającego murE przekształć mutanta TKL-11 za pomocą elektroporacji, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Umieść transformanty na agarze LB, uzupełnionym 50 mikrogramami na mililitr tiaminy i 34 mikrogramami na mililitr chloramfenikolu i inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed sprawdzeniem na obecność transformantów. Przeprowadzić próbę komplementacji przez smugowanie lub posiewanie kolonii zarówno z przemian kontrolnych, jak i doświadczalnych na dwóch płytkach pożywki LB plus 0,2% arabinozy i 50 mikrogramów na mililitr tiaminy.

Inkubować jedną płytkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza, a drugą w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed oceną fenotypu wzrostu. Przekształć zmutowany szczep Hx699 i szczep Rr217 typu dzikiego z gatunku novosphingobium za pomocą pustego wektora pRK290 lub wektora zawierającego natywny gen rshNsp w dwóch oddzielnych zdarzeniach transformacji, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Umieść transformanty na dekstrozie ziemniaczanej lub agarze PD uzupełnionym 10 mikrogramami na mililitr tetracykliny i inkubuj przez co najmniej 72 godziny lub do momentu pojawienia się transformantów.

Następnie nałóż transformanty w kształcie litery X na świeże płytki agarowe PD z tetracykliną. Po inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery dni, wizualnie zbadaj fenotyp wzrostu obu płytek. Podwójnie zmutowany AOH1 E. coli zawiera mutację w genie DapE i delecję genu DapD i nie będzie rósł, dopóki nie zostanie dostarczony Dap.

Jak widać tutaj, mutant AOH1 eksprymujący DapL jest w stanie rosnąć na pożywce wolnej od LLDap poprzez konwersję THDP do LLDap w szlaku lizy Dap. Enzym MurE ułatwia dodawanie m-DAP do peptydoglikanu bakterii Gram-ujemnych. Mutant E.coli MurE, TKL-11, nie może rosnąć w temperaturze 42 stopni Celsjusza.

W tym eksperymencie tylko komórki TKL-11 przekształcone za pomocą MurE rosną w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Mutacja w genie TyrB uniemożliwia syntezę tyrozyny i fenyloalaniny. Jednak, jak pokazano tutaj, gdy zmutowany szczep DL39 TyrB ulega ekspresji genu A.thaliana At5g36160, rośnie na pożywce M9, pozbawionej tyrozyny i fenyloalaniny, co pokazuje, że enzym może syntetyzować tyrozynę.

Mutant Hx699 u gatunków Novosphingobium zawiera niefunkcjonalne białko RSH i wytwarza fenotyp hipomukooidalny. Jednak transformacja z natywnym genem RSH wytwarza bardziej rozpuszczalne zewnątrzkomórkowe polisacharydy w wielokomórkowej smugi X, która jest hiperśluzówkowa. W przeciwieństwie do tego, gdy mutant Hx699 jest przekształcany za pomocą pustego wektora, wytwarza fenotyp hipomukowialny.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około 24 do 48 godzin. Jeśli zostanie przeprowadzone prawidłowo, w zależności od wzrostu użytego organizmu modelowego, z wyłączeniem klonowania, kompetencji etapów przygotowania i transformacji. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy pamiętać o wymaganiach dotyczących warunków wzrostu mutantów stosowanych w analizie dopełnienia funkcjonalnego.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak tradycyjne charakterystyki aksjomatyczne in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak specyficzność substratu, temperatura i optimum pH oraz szybkości somatyczne i tak dalej. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom z dziedziny biologii i wielu dziedzin podkategorii, takich jak mikrobiologia, w celu wyjaśnienia funkcji lub roli enzymów in vivo pochodzących z różnych organizmów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć elektrokompetentne komórki bakteryjne, jak przekształcać bakterie za pomocą elektroporacji i jak oceniać funkcję genów/enzymów za pomocą komplementacji funkcjonalnej.

Nie zapominaj, że praca z organizmami chorobotwórczymi może być niezwykle niebezpieczna i należy podjąć niezbędne środki ostrożności.