Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Ogólnym celem tej procedury jest zmapowanie miejsc interakcji ACAP LBC z PDE cztery, D, trzy. Mierząc średnią intensywność fluorescencji biomolekularnej, fluorescencji, komplementacji lub BC za pomocą cytometrii przepływowej. Aby to zrobić, komórki są transfekowane ACAP LBC i PDE czterema fragmentami D trzy połączone z końcową częścią N lub C fluorescencyjnego białka reporterowego.

Następnie wykonuje się cytometrię przepływową Venus w celu oceny fluorescencji, czy fragmenty białka oddziałują na Wenus i fluorescencja. Jeśli fragmenty białka nie wchodzą w interakcje, nie wykrywa się fluorescencji. Przeprowadza się bezpłatną analizę krwi zachodniej w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka.

Siła oddziaływań białek białkowych jest następnie obliczana poprzez normalizację średniej intensywności fluorescencji YFP z poziomami ekspresji białek. Uzyskane dane wskazują, że wiązanie PDE 43 z ACAP LBC odbywa się za pośrednictwem wielu regionów w PDE 43, głównie poprzez chroniony region pierwszy lub UCR. Główne zalety tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak koimmunoprecypitacja i BP C przy użyciu mikroskopu, lub to, że jest stosunkowo prosta, czuła i ułatwia szybkie badanie przesiewowe dużej liczby komórek.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji białko-białko, może być również wykorzystana do badań przesiewowych pod kątem czynników regulujących interakcje białko-białko w celu odkrycia leków. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ należy określić liniową odpowiedź B. Wyrażenie konstruktu powinno być podobne, tak aby można było porównać ze sobą różne fragmenty białka.

W opisanych tutaj eksperymentach komórki są transfekowane kot końcowym fragmentem N pochodnej YFP, Wenus połączonej do pełnej długości ACAP LBC i C-końcowym fragmentem Wenus połączonej z jednym z poniższych, pełnej długości PDE E 43, konserwowanym regionem górnym jeden UCR jeden PDE E 43 lub górny konserwatywny region drugi plus region katalityczny UCR R dwa plus CAT PDE 43 dzień przed transfekcją w Sześć. Cóż, płytki do hodowli tkankowych wysiewają się 1,2 razy 10 do piątej HEC 2 9 3 limfocytów T na studzienkę w dwóch mililitrach całkowitego wzrostu. Średni materiał siewny, trzy studzienki kontrolne plus trzy studzienki dla każdego z testów.

Cotran inkubuje się w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia należy przygotować się do transfekcji konstruktów DNA osocza BC i wektora CFP, który jest transfekowany konstruktami BS C jako markerem. Dla każdego warunku dodaj odpowiednią ilość DNA do 250 mikrolitrów pożywki wolnej od surowicy Optum M1.

W sterylnej probówce jedna probówka wystarcza do transfekcji trzech dołków. Następnie dodać trzy mikrolitry LT tranzytowych, jeden odczynnik na każdy mikrogram do rozcieńczonej mieszaniny DNA i delikatnie pipetować do mieszania, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji w 250 mikrolitrach mieszaniny transfekcji kroplami do komórek, a następnie inkubować w 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 24 godziny.

Po transfekcji sprawdź fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym epi, komórki powinny wyrażać żółtą fluorescencję dla sygnału BC i fluorescencję CFP w celu zgłoszenia skuteczności transfekcji. Aby przygotować komórki do analizy cytometrii przepływowej, najpierw umyj je dwoma mililitrami lodowatego PBS, a następnie odłącz komórki, dodając 250 mikrolitrów 0,05% trypsyny, inkubuj przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie za pomocą mikroskopu sprawdź odłączenie komórek.

Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę jednym mililitrem DMEM. Następnie przenieś jeden mililitr komórek do jednej mikroprobówki wirówkowej, a następnie przenieś 0,25 mililitra komórek do drugiej mikroprobówki wirówkowej. Wiruj rurki w 500 serach przez pięć minut.

Próbka o pojemności 250 mikrolitrów zostanie poddana dalszej obróbce do cytometrii przepływowej. Odłóż jednomililitrową próbkę na lód do zachodniej analizy krwi, którą należy wykonać równolegle po wirowaniu Resus. Zawieś komórki w 250 mikrolitrach bufora faksu i umieść je na lodzie, komórki można również zamocować w 1% aldehydzie Paraform w PBS Jeśli analiza cytometrii przepływowej nie będzie tutaj natychmiastowa, cytometrię przepływową wykonuje się przy użyciu cyjanu Beckman Coulter DP wyposażony w lasery półprzewodnikowe 488 nanometrów, 405 nanometrów i 642 nanometrów, oprogramowanie szczytowe służy do akwizycji i analizy po kalibracji cytometru przepływowego za pomocą standardowych kulek, wykreślić rozrzut do przodu lub FSC w porównaniu z rozrzutem bocznym SSC na skali liniowej i chód na populacji żywych komórek.

Następnie wykreśl SSC w funkcji szerokości impulsu napięcia i chodu na niezagregowanej populacji żywych komórek. Następnie wykreślić FSC na skali liniowej w funkcji fluorescencji CFP przy 405 FL sześć na tym przyrządzie w skali logarytmicznej i chód na niezagregowanych żywych komórkach dodatnich CFP. Na koniec wykreśl FSC na skali liniowej w porównaniu z fluorescencją YFP przy 488 nanometrach FL jeden na tym instrumencie w skali logarytmicznej, aby zobrazować intensywność BC.

Następnie uruchom podwójnie ujemną próbkę Y-F-P-C-F-P i dostosuj lampę powielacza fotograficznego F-S-C-S-S-C FL z jednym i sześcioma FL lub napięcie PMT, aby ustawić próg dla każdego sygnału. Następnie uruchom zarówno pojedyncze dodatnie próbki YFP, jak i CFP w celu przyszłej kompensacji offline. Upewnij się, że masz co najmniej 10 000 zdarzeń bramkowanych.

Na koniec zbierz dane do próbek eksperymentalnych po zebraniu danych. Skonfiguruj protokół analizy zgodnie z akwizycją z propagacją z bramką pierwszą na wykresie kropkowym FS CSC dla żywych komórek. Bramka druga w impulsie FSC z wykresem kropkowym bramki pierwszej dla niezagregowanych komórek na żywo i bramka trzecia w wykresie kropkowym ccfp FSC bramki drugiej dla niezagregowanych dodatnich komórek na żywo ccfp.

Po skompensowaniu sygnału YFP i CCFP na wykresie kropkowym Y fp CFP przy użyciu pojedynczych komórek dodatnich YFP i CFP, określamy linie odcięcia dla komórek dodatnich CFP i YFP. Eksportuj średnią intensywność fluorescencji YFP lub MFI komórek dodatnich CFP do programu Excel w celu wykreślenia danych, a następnie w programie Excel znormalizuj Y-F-P-M-F-I do poziomu ekspresji ACAP, LBC, PDE, E, 43 i kontroli obciążenia tubuliny alfa określonej przez western blotting, aby określić liniowy zakres średniej intensywności fluorescencji YFP. CFP transektowano za pomocą VN ACAP L BBC i różnych ilości VC PDE E 43 w komórkach HEC 2 93, a interakcję oceniano za pomocą cytometrii przepływowej bif, jak opisano w tym filmie, wykres ten pokazuje względną zmianę krotności ekspresji VC PDE E 43 w funkcji transfekcji VC PDE E 43.

Średnia intensywność fluorescencji Wenus w komórkach CFP dodatnich wskazywana przez niebieskie kwadraty korelowała z ekspresją VCDE 43 i była zgodna z poziomami ekspresji określonymi przez analizę obrazu western blot, na którą wskazują czerwone trójkąty. Podobną średnią intensywność fluorescencji CFP zaobserwowano wśród próbek, jak wskazano na zielonych kwadratach, i zastosowano ją jako kontrolę ujemną w celu ograniczenia zmienności komórek. Wyniki te potwierdzają zastosowanie cytometrii przepływowej do ilościowego określenia interakcji ACAB LB C PDE 43 poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji BS e, przy jednoczesnym określeniu właściwej ilości konstruktów BIC stosowanych do badań przesiewowych w celu mapowania miejsc wiązania ACAP LBC w PDE E 43 Analiza BIC interakcji ACAP LBC z PDE E 43 fl o pełnej długości.

Za pomocą tej metody oceniono pierwszy region UCR PDE 43 i UCR drugi oraz regiony CAT PDE 43, jak pokazano tutaj. Ekspresja vn, ACAP, LBC i VC, PDE, 43 UCR, dwa plus CAT skutkuje niższym sygnałem BC w porównaniu z VC, PDE 43 FL i VC PDE 43 UCR, zaobserwowano jedną podobną ekspresję białka we wszystkich próbkach przepływowych, a średnia fluorescencja została znormalizowana do względnych poziomów ekspresji ACAP, LBC, PDE 43 i alfa tubuliny. Dlatego znormalizowany B-C-M-F-I wskazuje, że nie ma różnicy w intensywności fluorescencji między ACAP LBC PDE 43 FL a ACAP LBC PDE 43 UCR R jeden, ale znacznie niższy sygnał dla interakcji ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT.

Wyniki te sugerują, że w PDE 43 istnieje wiele regionów, które oddziałują z ACAP LBC i że PDE 43 UCR R one jest głównym regionem interakcji z ACAP LBC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać białko, interakcję białek za pomocą analizy cytometrii przepływowej BP C. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o określeniu prawidłowej ilości konstruktu BP C używanego do uzyskania podobnej ekspresji białka i liniowej odpowiedzi BP C. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak peptyd lub ryzyko, w celu określenia, za które aminokwasy w PDE 40 D trzy są odpowiedzialne.

Jego interakcje RBC ACAP.