Name: Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Poznaj metodę BiFC z cytometrią przepływową do ilościowej analizy interakcji białko-białko między AKAP-Lbc a PDE4D3 w żywych komórkach HEK293T. Technika umożliwia szybkie mapowanie domen wiążących.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy laboratorium O'Bryana w UIC za krytyczną ocenę eksperymentalną i dyskusję. Praca ta była wspierana przez American Heart Association Grant 11SDG5230003 dla GKC oraz National Center for Advancing Translational Science - UIC Center for Clinical and Translational Sciences Grant UL1TR000050.

1. Transfekcja komórkowa
<ol>
	<li>Płytki komórkowe dzień przed transfekcją, posiewając mniej komórek w celu immunofluorescencji.
	<ol>
		<li>Do immunofluorescencji: na płytce 6-dołkowej pokryć szkiełka nakrywkowe (1 na studzienkę) 0,02% żelatyny w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny, przemyć raz pożywką i dla każdej studzienki płytkę 1 x 105 komórek HEK 293T w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej [zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco plus 10% FBS].</li>
		<li>Do analiz metodą cytometrii przepływowej i Western blot: płytka 1,2 x 105 komórek HEK 293T/basenik w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej na płytce 6-dołkowej (0,3 x 105 komórek HEK 293T w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej na basenie na płytce 24-dołkowej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj DNA do transfekcji zgodnie z protokołem producenta: Effecten (Qiagen) jest używany do immunofluorescencji. TransIT-LT1 (Mirus) jest używany do analizy metodą cytometrii przepływowej i Western blot. Ilość użytego DNA jest podana poniżej.
	<obramowanie tabeli="1">
		<tbody>
			<tr>
				<td> </td>
				<td>Płytka 24-dołkowa (ng)</td>
				<td>Płytka 6-dołkowa (ng)</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Wektor CFP</td>
				<td>10</td>
				<td>50</td> Rozdział
			</tr>
			<tr>
				<td>VN N-AKAP-Lbc</td>
				<td>200</td> szt.
				<td>1000</td> szt.
			</tr>
			<tr>
				<td>VC N-PDE4D3-FL (PDE4D3 o pełnej długości)</td>
				<td>2,5, 5, 10, 20, 40, 80</td>
				<td>100</td> szt.
			</tr>
			<tr>
				<td>VC N-PDE4D3-UCR1 (N-końcowy fragment PDE4D3 zawierający domenę UCR1)</td>
				<td> </td>
				<td>100</td> szt.
			</tr>
			<tr>
				<td>VC N-PDE4D3-UCR2+CAT (fragment C-końcowy PDE4D3 zawierający UCR2 i domeny katalityczne)</td>
				<td> </td>
				<td>100</td> szt.
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	Transfekcja przy użyciu Effectenu (6-dołkowego):
	<ol>
		<li>Dodać wskazaną ilość plazmidowego DNA + 4 μl wzmacniacza do 100 μl buforu EC, wymieszać i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	 <li>Dodać 5 μl efektenu, wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodawaj kroplami do komórek.	 </li>
 </ol>
 Transfekcja za pomocą TransIT-LT1 (6-dołkowa/24-dołkowa):
 <ol>
		<li>Dodać wskazaną ilość plazmidowego DNA do 250 μl/50 μl pożywki bez surowicy Opti-MEM I w sterylnej probówce.</li>
		<li>Dodaj odczynnik TransIT-LT1 do rozcieńczonej mieszaniny DNA i delikatnie odpipetuj do mieszania. (Stosunek odczynnika TransIT-LT1 do DNA wynosi 3 μl odczynnika TransIT-LT1 na 1 μg DNA).</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i dodawać kroplami do komórek.</li>
	</ol>
 </li>
 </ol>
2. Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej, Western Blot i immunofluorescencji
<ol>
	<li>24 godziny po transfekcji, sprawdź fluorescencję pod mikroskopem epifluorescencyjnym przed pobraniem komórek.</li>
	<li>Przygotowanie komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej:
	<ol>
		<li>Umyj komórki 0,5 ml/2 ml lodowatego PBS dla płytek 24-dołkowych/6-dołkowych.</li>
		<li>Odłącz komórki za pomocą 50 μl/250 μl 0,05% trypsyny.</li>
		<li>Zneutralizować trypsynę za pomocą 200 μl/1 ml pożywki DMEM.</li>
		<li>Zebrać 250 μl komórek (zarówno dla płytki 24-dołkowej, jak i 6-dołkowej) przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut, pozostałe komórki (1 ml) wykorzystać do analizy Western blot.</li>
		<li>Zawiesić komórki w buforze FACS o pojemności 250 μl [PBS + 0,5% (w/v) BSA + 2 mM EDTA], przechowywać na lodzie do analizy cytometrycznej przepływowej. Komórki można również utrwalić w 1% paraformaldehydzie (w PBS), jeśli analiza cytometrii przepływowej nie będzie natychmiastowa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek do analizy Western blot: przeprowadzane równolegle z przygotowaniem komórek do analizy metodą cytometrii przepływowej.
	<ol>
		<li>Umyj komórki 1x 2 ml lodowatego PBS, lizuj komórki, dodając 100 μl buforu do lizy komórek [10 mM bufor fosforanu sodu, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100].</li>
		<li>Zebrać lizat komórkowy przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Określ ilościowo stężenie białka za pomocą testu białka Bradforda, załaduj równe ilości białka na linię dla SDS-PAGE i przenieś do nitrocelulozy w celu immunoblottingu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek do immunofluorescencji.
	<ol>
		<li>Przepłukać komórki 3x 2 ml PBS, utrwalić komórki w 1 ml 3,7% paraformaldehydu (w PBS) przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3x 2 ml PBS przez 5 min.</li>
		<li>Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą medium montażowego. W razie potrzeby uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą lakieru do paznokci.</li>
		<li>Przed badaniem przechowywać szkiełka w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa i mikroskopia immunofluorescencyjna
<ol>
	<li>Cytometria przepływowa jest wykonywana przy użyciu cyjanowego ADP Beckman Coulter, wyposażonego w lasery na ciele stałym o długości fali 488 nm, 405 nm i 642 nm. Oprogramowanie Summit służy do akwizycji i analizy.
	<ol>
		<li>Skalibruj cytometr przepływowy za pomocą standardowych kulek.</li>
		<li>Wykreśl rozproszenie do przodu (FSC)/rozproszenie boczne (SSC) na skali liniowej do bramkowania populacji żywych komórek.</li>
		<li>Wykreślić szerokość impulsu FSC/napięcia dla bramkowania niezagregowanej populacji żywych komórek.</li>
		<li>Wykreślić liczbę/FL6 (fluorescencja CFP, 405 nm) na skali logarytmicznej do bramkowania niezagregowanych żywych komórek CFP-dodatnich.</li>
		<li>Wykreślić liczbę/FL1 (fluorescencja YFP, 488 nm) w skali logarytmicznej dla intensywności BiFC.</li>
		<li>Uruchom YFP-CFP- podwójnie ujemne próbki, dostosuj napięcie lampy fotopowielacza FSC, SSC, FL1 i FL6 (PMT), aby ustawić próg dla każdego sygnału.</li>
		<li>Uruchom pojedyncze próbki dodatnie (zarówno YFP+, jak i CFP+) w celu przyszłej kompensacji off-line</li>
		<li>Uzyskaj co najmniej 10 000 zdarzeń bramkowanych (niezagregowanych żywych komórek CFP+) do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia immunofluorescencyjna wykonywana jest przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510. Uwaga: ważne jest, aby wszystkie ustawienia (takie jak powiększenie, otwórka, wzmocnienie detektora, przesunięcie wzmacniacza, rozmiar klatki, prędkość skanowania, średnia skanowania i moc lasera) były spójne między próbkami, aby zapewnić prawidłowe porównanie wszystkich danych.</li>
</ol>
4. Analiza danych (wykonana za pomocą oprogramowania Summit)
<ol>
	<li>Skonfiguruj protokół analizy podobny do tego do akwizycji z odpowiednim bramkowaniem: 
	Bramka 1 na wykresie punktowym FSC/SSC dla żywych komórek. 
	Bramka 2 w FSC/szerokość impulsu bramki 1 dla niezagregowanych komórek pod napięciem. 
	Bramka 3 w liczbie/CFP bramki 3 dla niezagregowanych żywych komórek CFP+.</li>
	<li>Kompensuj sygnał YFP i CFP za pomocą pojedynczych dodatnich komórek YFP+ i CFP+.</li>
	<li>Ponownie określ linie odcięcia dla komórek CFP/YFP-dodatnich.</li>
	<li>Eksportuj średnią intensywność fluorescencji (MFI) komórek CFP+ YFP do programu Excel w celu wykreślenia danych.</li>
	<li>Znormalizuj YFP MFI do poziomów ekspresji AKAP-Lbc, PDE4D3 i kontroli obciążenia α-tubuliny, zgodnie z Western blot.</li>
</ol>

<ol><li>Collura, V., Boissy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+protein-protein+complexes+to+interactomics%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">From protein-protein complexes to interactomics.</a> Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).</li>
<li>Stumpf, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+size+of+the+human+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Estimating the size of the human interactome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).</li>
<li>Shekhawat, S. S., Ghosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split-protein+systems%3A+beyond+binary+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).</li>
<li>Dwane, S., Kiely, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+used+to+study+how+protein+complexes+are+assembled+in+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng.+Bugs%22%5BJournal%5D)">Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades.</a> Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).</li>
<li>Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+methodologies+for+measuring+protein+interactions+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).</li>
<li>Wong, K. A., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).</li>
<li>Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+general+principles+and+applications+to+selected+studies+in+tumor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Adv.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology.</a> Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).</li>
<li>Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+GLUT4+translocation+to+the+plasma+membrane+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).</li>
<li>Smith, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic confocal microscopy.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).</li>
<li>Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+drug+discovery+with+contextual+assays+and+cellular+systems+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis.</a> Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).</li>
<li>Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+pharmacology+of+G+protein-coupled+receptor+signaling+complexes+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation.</a> Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

BiFC jest prostą i czułą metodą badania interakcji białko-białko. Metoda ta nie może być stosowana do identyfikacji nowych oddziaływań białko-białko, jednak jest szczególnie wygodna do potwierdzania interakcji białko-białko wewnątrz komórek i badania właściwości funkcjonalnych; takie jak subkomórkowa lokalizacja kompleksów białkowych, mapowanie miejsc interakcji białko-białko oraz badania przesiewowe małych cząsteczek / peptydów, które mogą modulować interakcję białko-białko. Ponieważ fragmenty VN i VC są niefluorescency...

Szacuje się, że w ludzkim interaktomie istnieje < jove_content">650 000 interakcji białko-białko, które odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu prawidłowych funkcji komórek 1,2. Oprócz koimmunoprecypitacji (co-IP), złotego standardu w badaniu interakcji białko-białko z lizatu komórkowego, opracowano kilka testów komplementacji fragmentów białek (PCA) w celu poprawy czułości wykrywania interakcji białko-białko wewnątrz komórek 3. Techniki obejmują transfer energii rezonansu Förstera (FRET), transfer energii rezonansu bioluminescencji (BRET) i dwucząsteczkową komplementację fluorescencji (BiFC) 4,5. BiFC opiera się na ułatwionym asocjacji dwóch fragmentów białka fluorescencyjnego (tutaj używamy Venus; wariantu YFP), z których każdy jest połączony z potencjalnym oddziałującym partnerem białkowym (w tym przykładzie używamy AKAP-Lbc i PDE4D3). Interakcja dwóch interesujących białek wewnątrz komórek powoduje funkcjonalną fluorescencję, którą można uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu żywych lub utrwalonych komórek 6,7,8. W porównaniu z innymi PCA, BiFC jest czuły i mniej wymagający technicznie, z potencjałem do badania lokalizacji komórkowej w żywych komórkach. Główną wadą tej techniki jest jednak to, że raz utworzonego kompleksu białek fluorescencyjnych nie można odwrócić. Dlatego nie jest to dobra metoda do badania dynamicznej interakcji białko-białko. W tym artykule używamy BiFC do mapowania miejsc interakcji PDE4D3 z AKAP-Lbc poprzez monitorowanie intensywności fluorescencji Wenus. W porównaniu z tradycyjną analizą przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej, która jest czasochłonna i pracochłonna (jeśli nie jest przeprowadzana przy użyciu zautomatyzowanych maszyn o wysokiej przepustowości), cytometria przepływowa zapewnia prostą analizę ilościową tysięcy komórek w niejednorodnej populacji w krótkim czasie 9,10. Tutaj, przeprowadzając bezpośrednie porównanie analizy cytometrii przepływowej-BiFC i tradycyjnego co-IP, pokazujemy, że te dwie metody dostarczają porównywalnych danych, jednak analiza BiFC metodą cytometrii przepływowej jest mniej czasochłonna i zużywa mniej materiału, co może być bardziej przydatne, gdy komórki będące przedmiotem zainteresowania są ograniczone.

<table><tbody><tr><td colspan="4">ODCZYNNIKI</td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s zmodyfikowany Orzeł&#8217; s media (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycyna (pióro/paciorkowiec), 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Flag</td><td>Sigma</td><td>M2, F1804</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-HA</td><td>Covance</td><td>16B12, MMS-101R</td><td></td></tr><tr><td>&#945;-tubulina</td><td>Sigma</td><td>DM1A, T9026</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFP</td><td>Clontech</td><td>632569</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowych, 6-dołkowe hodowle tkankowe poddane działaniu Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>Komórki HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu Maxiprep, szybki</td><td>Qiagen</td><td>12663</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#8217; s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS), sterylna 1x</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v)</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowe rurki okrągłodenne do barwienia FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>S74337MF</td><td></td></tr><tr><td>Prolong złoty odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P-36931</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe premium</td><td>Fisherfinest Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENTCO</td></tr><tr><td>2 inkubator z płaszczem powietrznym</td><td>NuAIR DH autoflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny LSM510 META</td><td>Carl Zeiss, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka do elektroforezy i transferu</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyan ADP Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Wśród metod badania interakcji białko-białko wewnątrz komórek, Bimolekularna Komplementacja Fluorescencyjna (BiFC) jest stosunkowo prosta i czuła. BiFC opiera się na wytwarzaniu fluorescencji przy użyciu dwóch niefluorescencyjnych fragmentów białka fluorescencyjnego (stosuje się tutaj Venus, wariant białka żółtej fluorescencji). Niefluorescencyjne fragmenty Wenus (VN i VC) są łączone z dwoma oddziałującymi białkami (w tym przypadku AKAP-Lbc i PDE4D3), dając fluorescencję w wyniku interakcji VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 i tworzenie funkcjonalnego białka fluorescencyjnego wewnątrz komórek.
BiFC dostarcza informacji na temat subkomórkowej lokalizacji kompleksów białkowych i siły oddziaływań białkowych na podstawie intensywności fluorescencji. Jednak analiza BiFC z wykorzystaniem mikroskopii do ilościowego określenia siły interakcji białko-białko jest czasochłonna i nieco subiektywna ze względu na niejednorodność ekspresji i interakcji białek. Dzięki sprzężeniu analizy cytometrii przepływowej z metodologią BiFC, fluorescencyjny sygnał interakcji białko-białko BiFC może być dokładnie zmierzony dla dużej liczby komórek w krótkim czasie. Tutaj demonstrujemy zastosowanie tej metodologii do mapowania regionów w PDE4D3, które są wymagane do interakcji z AKAP-Lbc. Ta wysokoprzepustowa metodologia może być stosowana do badań przesiewowych czynników, które regulują interakcję białko-białko.

Konstrukcje AKAP-Lbc i PDE4D3 (Ryc. 1B) połączono odpowiednio z fragmentami VN i VC. Interakcja AKAP-Lbc i PDE4D3 skutkuje funkcjonalną fluorescencją YFP (Ryc. 1A). W niniejszej pracy wykorzystujemy metodę BiFC do mapowania miejsc wiązania AKAP-Lbc w PDE4D3. Region zachowany 1 w górze strumienia (UCR1), region zachowany 2 w górze strumienia (UCR2) oraz region katalityczny (CAT) są konserwatywne wśród białek rodziny PDE4, dlatego do przesiewania miejsc wiązania PDE4D3 z AKAP-Lbc wykorzyst...

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zmapowanie miejsc oddziaływania ACAP LBC z PDE four D three. Odbywa się to poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji w metodzie biomolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BC) z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. W tym celu komórki są transfekowane fragmentami ACAP LBC oraz PDE four D three połączonymi z częścią N- lub C-końcową fluorescencyjnego białka reporterowego.Następnie przeprowadzono cytometrię przepływową białka Venus w celu oceny fluorescencji; jeśli fragmenty białek oddziaływały ze sobą, odnotowano fluorescencję. W przypadku braku oddziaływań fragmentów białek nie wykryto fluorescencji. Uzupełniająco wykonano analizę Western blot w celu określenia względnych poziomów ekspresji białek.Siłę oddziaływań białko-białko oblicza się następnie poprzez normalizację średniej intensywności fluorescencji YFP względem poziomów ekspresji białek. Otrzymane dane wskazują, że wiązanie PDE 43 z ACAP LBC jest zapośredniczone przez wiele regionów w obrębie PDE 43, przede wszystkim poprzez górny konserwowany region jeden, czyli UCR one. Głównymi zaletami tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak koimmunoprecypitacja i BP C z użyciem mikroskopu, są jej względna prostota, czułość oraz ułatwienie szybkiego przesiewu dużej liczby komórek.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań białko-białko, może być również wykorzystana do przesiewania czynników regulujących te oddziaływania w celu opracowania nowych leków. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą zazwyczaj napotykają trudności z wyznaczeniem liniowej odpowiedzi B. Poziom ekspresji konstruktów powinien być zbliżony, aby wyniki uzyskane dla różnych fragmentów białek można było wzajemnie porównać.W opisanych tutaj eksperymentach komórki poddawano kotransfekcji fragmentem N-końcowym pochodnej YFP, Venus, połączonym z pełnowymiarowym ACAP LBC, oraz fragmentem C-końcowym Venus połączonym z jednym z następujących białek: pełnowymiarowym PDE E 43, upstream conserved region one (UCR1) PDE E 43 lub upstream conserved region two wraz z regionem katalitycznym (UCR2 + CAT) PDE 43. Dzień przed transfekcją w sześciodołkowych płytkach do hodowli tkankowej wysiano 1,2 × 10⁵ komórek HEK 293T na dół w 2 ml kompletnej pożywki wzrostowej. Wysiano trzy dołki kontrolne oraz po trzy dołki dla każdego z wariantów testowych.Inkubować Cotran w atmosferze 5% dwutlenku węgla w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia przygotować do transfekcji konstrukty plazmidowego DNA BC oraz wektor CFP, który jest współtransfekowany z konstruktami BS C jako marker. Dla każdego wariantu dodać odpowiednią ilość DNA do 250 µL bezserwatkowego pożywki Optum M1.W sterylnej probówce (jedna probówka wystarcza do transfekcji trzech dołków) do rozcieńczonej mieszaniny DNA dodać 3 µL odczynnika TransIT-L1 na każdy 1 µg DNA, a następnie delikatnie wymieszać pipetą i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji do komórek dodać kroplami 250 µL mieszaniny do transfekcji, a następnie inkubować w 5% CO2 w temperaturze 37°C przez 24 godziny.Po transfekcji sprawdź fluorescencję pod mikroskopem epifluorescencyjnym; komórki powinny wykazywać fluorescencję żółtą dla sygnału BC oraz fluorescencję CFP dla oceny wydajności transfekcji. Aby przygotować komórki do analizy cytometrycznej, najpierw przemyj je 2 ml lodowatego PBS, a następnie odklej komórki, dodając 250 µL 0,05% trypsyny i inkubując przez 2 do 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie za pomocą mikroskopu sprawdź, czy komórki zostały odklejone.Po odlepieniu komórek zneutralizuj trypsynę za pomocą 1 mL DMEM. Następnie przenieś 1 mL zawiesiny komórkowej do jednej probówki do mikrowirówki, a 0,25 mL zawiesiny komórkowej do drugiej probówki do mikrowirówki. Wirować probówki przy 500 g przez pięć minut.Próbkę o objętości 250 µL poddaje się dalszej obróbce do cytometrii przepływowej. Jednomililitrową próbkę należy odstawić na lód do analizy western blot, którą należy przeprowadzić równolegle po resuspensji wirówki. Komórki zawiesza się w 250 µL buforu FACS i umieszcza na lodzie; komórki można również utrwalić w 1% Paraformaldehydzie w PBS, jeśli analiza cytometrii przepływowej nie zostanie wykonana natychmiast. Cytometrii przepływowej dokonuje się przy użyciu urządzenia Beckman Coulter CytoFLEX wyposażonego w lasery półprzewodnikowe o długościach fali 488 nm, 405 nm i 642 nm. Do akwizycji i analizy danych wykorzystuje się oprogramowanie CytExpert. Po skalibrowaniu cytometru przepływowego za pomocą standardowych kulek, należy wykreślić rozproszenie przednie (FSC) względem rozproszenia bocznego (SSC) w skali liniowej i wyznaczyć bramkę dla populacji żywych komórek.Następnie narysuj wykres SSC w funkcji szerokości impulsu napięcia i wyznacz bramkę dla nieagregowanej populacji żywych komórek. Następnie narysuj FSC w skali liniowej w funkcji fluorescencji CFP przy 405 FL 6 na tym urządzeniu w skali logarytmicznej i wyznacz bramkę dla nieagregowanych żywych komórek CFP-dodatnich. Na koniec narysuj FSC w skali liniowej w funkcji fluorescencji YFP przy 488 nanometrach FL 1 na tym urządzeniu w skali logarytmicznej, aby zwizualizować intensywność BC.Następnie przeprowadź pomiar próbki podwójnie negatywnej Y-F-P-C-F-P i dostosuj napięcie fotomnożników (PMT) dla kanałów F-S-C-S-S-C FL one oraz FL six, aby ustawić próg dla każdego sygnału. Następnie zmierz obie próbki pojedynczo dodatnie YFP i CFP w celu późniejszej kompensacji offline. Należy upewnić się, że zarejestrowano co najmniej 10 000 zdarzeń w bramce.Na koniec, po zakończeniu procesu pozyskiwania danych, zbierz dane dla próbek eksperymentalnych. Skonfiguruj protokół analizy zgodnie z akwizycją, stosując bramkowanie kaskadowe: bramka pierwsza w wykresie kropkowym FS CSC dla komórek żywych, bramka druga w wykresie kropkowym FSC pulse dla bramki pierwszej w celu wyłonienia niezagregowanych komórek żywych oraz bramka trzecia w wykresie kropkowym ccfp FSC dla bramki drugiej w celu wyłonienia niezagregowanych, żywych komórek wykazujących ekspresję ccfp.Po skompensowaniu sygnałów YFP i CFP na wykresie kropkowym YFP/CFP przy użyciu komórek pojedynczo pozytywnych dla YFP i CFP, wyznacza się linie odcięcia dla komórek pozytywnych dla CFP i YFP. Średnią intensywność fluorescencji (MFI) YFP dla komórek pozytywnych dla CFP eksportuje się do programu Excel w celu wykreślenia danych, a następnie w programie Excel normalizuje się YFP-MFI względem poziomu ekspresji ACAP LBC PDE E 43 oraz kontroli ładunku (alfa-tubuliny) wyznaczonej metodą western blotting, aby określić zakres liniowy średniej intensywności fluorescencji YFP. CFP ko-transfekowano z VN ACAP L BBC i zmiennymi ilościami VC PDE E 43 w komórkach HEC 2 93, a interakcję oceniano za pomocą biflowcytometrii zgodnie z opisem w tym filmie; wykres ten przedstawia względną krotność zmiany w ekspresji VC PDE E 43 jako funkcję ilości przetransfekowanego VC PDE E 43.Średnia intensywność fluorescencji Venus w komórkach CFP-dodatnich, oznaczona niebieskimi kwadratami, korelowała z ekspresją VCDE 43 i była zgodna z poziomami ekspresji określonymi na podstawie analizy obrazu western blot, co wskazują czerwone trójkąty. Podobną średnią intensywność fluorescencji CFP zaobserwowano w próbkach oznaczonych zielonymi kwadratami i wykorzystano ją jako kontrolę negatywną w celu ograniczenia zmienności komórkowej. Wyniki te potwierdzają przydatność cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania interakcji ACAB LB C PDE 43 poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji BS e, przy jednoczesnym określeniu właściwej ilości konstruktów BIC wykorzystanych do przesiewu w celu zmapowania miejsc wiązania ACAP LBC w obrębie PDE E 43 BIC w analizie interakcji ACAP LBC z pełnowymiarową formą PDE E 43 fl.Region UCR one PDE 43 oraz regiony UCR two i CAT PDE 43 zostały ocenione przy użyciu tej metody, jak pokazano tutaj. Ekspresja vn ACAP LBC i VC PDE 43 UCR two plus CAT skutkuje niższym sygnałem BC w porównaniu z VC PDE 43 FL i VC PDE 43 UCR one; w wszystkich próbkach przepływowych zaobserwowano podobną ekspresję białka, a średnią fluorescencję znormalizowano do względnych poziomów ekspresji ACAP LBC PDE 43 oraz alpha tubulin. Zatem znormalizowane B-C-M-F-I wskazuje, że nie ma różnicy w intensywności fluorescencji między ACAP LBC PDE 43 FL a ACAP LBC PDE 43 UCR R one, lecz znacznie niższy sygnał dla oddziaływania ACAP LBC PDE 43 UCR two plus CAT.Wyniki te sugerują, że w PDE 43 istnieje wiele regionów oddziałujących z ACAP LBC i że PDE 43 UCR R one jest głównym regionem oddziaływania z ACAP LBC. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat badania oddziaływań białko-białko za pomocą analizy BP C metodą cytometrii przepływowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o oznaczeniu właściwej ilości konstruktu BP C niezbędnej do uzyskania podobnej ekspresji białka i liniowej odpowiedzi BP C. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza peptydowa lub risk, w celu ustalenia, które aminokwasy w PDE 40 D trzy są za to odpowiedzialne.Interakcje ACAP z RBC.

flow-cytometric-analysis-bimolecular-fluorescence-complementation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza cytometrii przepływowej komplementacji fluorescencji bimolekularnej: Metoda ilościowa wysokiej wydajności do badania interakcji białko-białko

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj opisujemy zestaw metod charakteryzujących interakcje białek z błonami komórkowymi lub mikropęcherzykami.

Analiza interakcji białek znakowanych fluorescencyjnie ze sztucznymi mikropęcherzykami fosfolipidowymi przy użyciu ilościowej cytometrii przepływowej

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Poznaj metodę BiFC z cytometrią przepływową do ilościowej analizy interakcji białko-białko między AKAP-Lbc a PDE4D3 w żywych komórkach HEK293T. Technika umożliwia szybkie mapowanie domen wiążących.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko (Wideo) | JoVE Journal

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Przeglądaj więcej filmów