Wykrywanie interakcji białkowych w roślinie za pomocą systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z bramką

Aby przetestować interakcję między dwoma białkami, dwa interesujące nas geny muszą zostać sklonowane do naszego BF i wektorów za pomocą techniki tęsknoty za bramą. Te konstrukty są przekształcane w aerium GV 3 1 0 1. Kultury bakterii GV 3 1 0 1 zawierające do budowy zostaną zmieszane i współinfiltrowane do liści.

Jeśli dwa białka kandydujące oddziałują ze sobą, sygnał YFP można zaobserwować za pomocą ogniskowego Meksyku końcowego. Głównym celem techniki BFC jest zbadanie interakcji między dwoma białkami. W VAVO stworzyliśmy serię kompatybilnych z bramkami BFC i IS, dwóch wektorów hybrydowych, które zapewniają naukowcom łatwe w użyciu narzędzia do wykonywania zarówno BFC, jak i ISTO dwóch hybrydowych testów.

W tym filmie pokażemy łatwość korzystania z naszego systemu BFC. Aby przetestować białko, interakcje białek w niezwykły sposób wykraczają poza system ekspresji. Najpierw musisz przygotować kulturę bakteryjną GV 3 1 0 1.

Musisz wybrać pojedynczą kolonię ze swojego talerza i zaszczepić pięć samców pożywki YEB odpowiednimi antybiotykami. Następnie musisz wstrząsnąć tymi kulturami przez noc w temperaturze 28 stopni. Prędkość wynosi 200 przebiegów na minutę.

Kultury bakteryjne powinny być gotowe następnego dnia rano. Upewnij się, że bakterie D przerosły. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś jednego samca z każdej kultury do sterylnej 1,5-męskiej probówki wirówkowej.

Umieść probówki wirówkowe w wirówce stacjonarnej. Zakręć bakterie w 1000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wyrzuć siat. Następnie obserwuj penat, dodając jeden posiłek pożywki infiltracyjnej i ponowną ocenę przez per Petting kilka razy.

Powtórz krok prania jeszcze dwa razy. Jest to ważne, ponieważ pomaga usunąć ślady antybiotyków w pożywce bakteryjnej, które sprawiają, że po infiltracji sadzisz foki. Po ostatnim myciu, resus zawiesił paletę w 0,5 męskim medium infiltracyjnym pomiary winne 600 zawiesinom tej bakterii za pomocą spektrofotometru wykorzystującego medium infiltracyjne jako kontrolę banku.

Po pomiarze średnicy zewnętrznej należy wyregulować średnicę zewnętrzną za pomocą medium infiltracyjnego. Końcowa średnica zewnętrzna powinna wynosić od jednego do 1,2. Przed przejściem do następnego kroku należy przygotować wszystkie zawiesiny bakteryjne.

Przenieś równą ilość zawiesin bakteryjnych odpowiadających dwóm białkom kandydującym i wymieszaj je w nowej 1,5 męskiej probówce Mieszanina bakterii ujemnych jest teraz związana z naciekiem. Przygotuj wszystkie kombinacje i nie zapomnij uwzględnić kontroli negatywnej. Powinieneś użyć kodu od pięciu do sześciu tygodni i najlepszych metod infiltracji.

Możesz usunąć rośliny z pomieszczenia do uprawy i umieścić je na nocy na godzinę przed infiltracją, aby otworzyć atak burzy. Pomoże to w procesie infiltracji. Pobrać około 100 mikrolitrów zawieszonych bakterii Resus.

Wymieszać w pobliżu jednej strzykawki z męską wstrzykniętą końcówką bez igły. Przyłożyć końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia. Podeprzyj palcem górną część kolana.

Zazwyczaj naciskać na tłok. Powinieneś być w stanie zobaczyć, jak ciecz dyfunduje przez liść, ale jeszcze czujesz, że cieńsze przestrzenie powietrzne Meso po infiltracji umożliwiają infiltrowane aero za pomocą pisaka do znakowania. W przeciwnym razie, po dwóch dniach, nie będziesz w stanie zidentyfikować infiltrowanego A. Jeśli musisz przeniknąć inną mieszanką bakterii, pamiętaj, aby spryskać rękawicę 50% etanolem lub zmienić rękawice G między infiltracjami.

Staraj się pozostawić jednometrową przestrzeń żeber między infiltracjami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Sygnały PFA powinny być monitorowane co 24 godziny od infiltracji do pięciu dni. Do przytrzymania próbki można użyć dwóch tulei osłonowych o różnych rozmiarach.

Najpierw umieść jedną kroplę mini wody na rękawie z wycięciem. Następnie wytnij mały kawałek tkanki noża w strefie infiltrowanej. Staraj się unikać nudności Żyła w próbce.

Przeciętą tkankę noża wkładamy do wody na zjeżdżalni pod odłożonym środkiem, przykrywamy ją mniejszym rękawem prądowym i delikatnie wciskamy. Teraz próbkę można obserwować pod kątem Meksyku. Tutaj używamy tego NACA, T, CSS, P, dwóch konfokalnych Meksyku, do wizualizacji sygnału BIFC.

Można użyć nawet zwykłego zapachu Meksyk. Konfokalny zapewnia lepszy obraz i wykrywa słabe sygnały. Parametru YFP można użyć do wykrywania sygnałów VFC w tym systemie NCAs P two.

Możesz po prostu dwukrotnie kliknąć to ustawienie YFP tutaj, co automatycznie włączy wzbudzenie i ustawi zakres wykrywania emisji. Jeśli używasz innego systemu, zapoznaj się z instrukcją, aby prawidłowo ustawić parametry. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić BFCE w celu przetestowania interakcji białek białkowych przy użyciu systemu ekspresji unbe MI Transcend.

Możesz również zastosować tę procedurę do roślin tytoniu i AY. Nasze wektory BFC zawierają również odpowiednio znacznik HA i flag, dzięki czemu można również wykonać co IP, aby zweryfikować interakcje, jeśli to konieczne.