Name: Wykrywanie interakcji białkowych w roślinie za pomocą systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z bramką (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Poznaj metodę BiFC do badania interakcji białkowych w roślinach z użyciem kompatybilnych z bramką wektorów YFP. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Vi Nguyen za zapoznanie się z manuskryptem oraz ogólną pomoc laboratoryjną.

1. Przygotowanie hodowli Agrobacterium
<ol>
 <li>Szczep Agrobacterium GV3101 uprzednio transformowany wektorami BiFC pEarleyGate201-YC i pEarleyGate202-YN kompatybilnymi z systemem Gateway, z których każdy zawiera konstrukt fuzyjny GOI.</li>
 <li>Zaszczepić 5 ml kultury YEB (5g L-1 ekstraktu wołowego, 1g L-1 ekstraktu drożdżowego, 5g L-1 peptonu, 5g L-1 sacharozy, 2mM MgSO4, pH 7.2) z transformowanymi agrobacterium konstruktami białek fuzyjnych BiFC z odpowiednim antybiotykiem selekcyjnym. Inkubować kulturę przez noc w 28°C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.</li>
 <li>Przenieść 1 ml kultury do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
 <li>Zwirować komórki z prędkością 1 000g przez 10 min w temperaturze pokojowej, a następnie odlać nadsącz.</li>
 <li>Przemyć osad, dodając 1 ml pożywki do infiltracji (5 g L-1 D-glukozy, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na3PO4, 0.1 mM acetosyringonu) 11. Resuspendować osad poprzez pipetowanie, a następnie ponownie zwirować komórki z prędkością 1 000g przez 10 min.</li>
 <li>Powtórzyć etap przemywania jeszcze dwa razy.</li>
 <li>Resuspendować osad w 0,5 ml pożywki do infiltracji.</li>
 <li>Zmierzyć absorbancję przy 600 nm i dostosować końcową wartość OD600 do poziomu 1,0–1,2.</li>
 <li>Odmiarkować równą ilość zawiesiny agrobacterium każdego konstruktu do nowej probówki 1,5 ml i mieszać na wortexie przez 10 s. Do pojedynczej infiltracji wystarczy 100 μL każdego konstruktu.</li>
 <li>Mieszanina agrobacterium jest teraz gotowa do infiltracji.</li>
</ol>
2. Infiltracja
<ol start="11">
 <li>N. benthamiana hoduje się w temperaturze 21°C, przy 16-godzinnym cyklu światła i 8-godzinnym cyklu ciemności. Do infiltracji należy używać roślin w wieku od pięciu do sześciu tygodni.</li>
 <li>Przenieś rośliny z pomieszczenia hodowlanego i umieść je pod białym światłem na 1 h przed infiltracją, aby szparki mogły się całkowicie otworzyć.</li>
 <li>Pobierz resuspensowaną mieszaninę agrobacterium do 1-ml strzykawki tuberkulinowej z cienką końcówką, bez igły.</li>
 <li>Przyłóż końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia i delikatnie naciśnij tłok, podtrzymując jednocześnie górną stronę liścia jednym palcem. Płyn będzie dyfundował przez liść, wypełniając przestrzenie powietrzne mezofilu.</li>
 <li>Oznacz miejsce infiltracji markerem w celu późniejszej identyfikacji.</li>
 <li>Podczas infiltracji różnymi konstruktami należy pamiętać o zmianie rękawiczek lub ich oczyszczeniu 70% etanolem pomiędzy kolejnymi zabiegami. Jeśli to możliwe, pozostaw jedną przestrzeń między nerwami głównymi między różnymi próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym.</li>
 <li>Umieść rośliny w komorze wzrostowej w normalnych warunkach hodowli.</li>
</ol>
3. Obserwacja sygnału zrekonstytuowanego YFP
<ol start="18">
 <li>Wyciąć fragment tkanki liścia o wymiarach 5mm x 5mm z obszaru zinfiltrowanego</li>
 <li>Umieścić próbkę w wodzie na szklanym szkiełku przedmiotowym, przykryć szkiełkiem nakrywnym i zbadać interakcje przy użyciu mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego.</li>
 <li>Ekspresję należy monitorować co 24 godziny od momentu infiltracji przez okres do 5 dni, ponieważ nadekspresja lub transport wewnątrzkomórkowy mogą sprawić, że fluorescencyjne białka fuzyjne będą widoczne w kilku różnych lokalizacjach w czasie.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki:
Przykład oddziaływania białko-białko zbadanego za pomocą testu BiFC przedstawiono na Ryc. 1. AtTHP1 i AtSAC3A są uważane za komponenty homologu kompleksu TREX-2 drożdży u Arabidopsis. Mogą one oddziaływać z nukleoporyną AtNUP1 i ułatwiać eksport mRNA10. AtTHP1 i AtSAC3A sklonowano do wektora pEarlyGate201-YC, natomiast AtNUP1 sklonowano do pEarlyGate202-YN. Następnie konstrukty przekształcono do szczepu GV3101. Trzy konstrukty sparowano w 3 możliwych kombinacjach (AtTHP1+AtNUP1; AtTHP1+AtSAC3A; AtNUP1+AtSAC3A) w celu infiltracji. Sygnał zrekonstytuowanego białka YFP obserwowano pod LCSM 48 godzin po infiltracji. Sygnały zaobserwowano w komórkach epidermy, gdzie lokalizowały się one na obwodzie jądra lub w plazmie jądrowej, co jest zgodne z subkomórkową lokalizacją tych białek. Kontrole negatywne nie wykazały żadnego sygnału YFP.
<img src="/files/ftp_upload/3473/3473fig1.jpg" alt="Mikroskopia komórek roślinnych; markery fluorescencyjne podkreślają lokalizację białek; analiza porównawcza." data-altupdatedat="1788840098000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Arabidopsis Składniki kompleksu eksportu mRNA TREX-2 oddziałują ze sobą. Liście N. benthamiana, współtransformowane konstruktami GOI połączonymi z pEarleyGate201-YC oraz pEarleyGate202-YN (zgodnie z oznaczeniem), obrazowano 48-72 h po infiltracji przy użyciu konfokalnego mikroskopu Leica TCS SP2. Obrazy przedstawiają nałożone na siebie obrazy konfokalne YFP i jasnego pola komórek epidermalnych liści N. benthamiana

<ol><li>Ohad, N., Yalovsky, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+assay+protein-protein+interaction+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants.</a> Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).</li>
<li>Fang, Y., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiFC+imaging+assay+for+plant+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">BiFC imaging assay for plant protein-protein interactions.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2, (2010).</li>
<li>Schutze, K., Harter, K., Chaban, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+to+study+protein-protein+interactions+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to study protein-protein interactions in living plant cells.</a> Methods in molecular biology. 479, 189-202 (2009).</li>
<li>Hiatt, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis+of+protein+interactions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis of protein interactions in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 45, 185-191 (2008).</li>
<li>Barnard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+split-GFP-based+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of split-GFP-based bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays in yeast.</a> Biochemical Society Transactions. 36, 479-482 (2008).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+implementation+of+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+assays+for+the+visualization+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells.</a> Nature. 1, 1278-1286 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Grinberg, A. V., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation+%28BiFC%29+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living cells using bimolecular fluorescence complementation (BiFC) analysis.</a> Current protocols in cell biology. 21, 3-3 (2006).</li>
<li>Earley, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway-compatible+vectors+for+plant+functional+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 45, 616-629 (2006).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends in Plant Science. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Lu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+homolog+of+the+yeast+TREX-2+mRNA+export+complex%3A+components+and+anchoring+nucleoporin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+journal+%3A+for+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis homolog of the yeast TREX-2 mRNA export complex: components and anchoring nucleoporin.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 61, 259-270 (2010).</li>
<li>Sparkes, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transient+expression+of+fluorescent+fusion+proteins+in+tobacco+plants+and+generation+of+stably+transformed+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">transient expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants and generation of stably transformed plants.</a> Nature protocols. 1, 2019-2025 (2006).</li>
<li>Rackham, O., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+RNA-protein+interactions+in+living+cells%3A+FMRP+and+IMP1+interact+on+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.</a> The EMBO journal. 23, 3346-3355 (2004).</li>
<li>Demidov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+complementation+of+split+fluorescent+protein+triggered+by+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast complementation of split fluorescent protein triggered by DNA hybridization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2052-2056 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay.</a> Nature. 3, 1693-1702 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Analiza BiFC jest potężnym narzędziem do badania oddziaływań białkowych. W przeciwieństwie do tradycyjnej analizy Y2H, BiFC nie tylko pozwala na wizualizację oddziaływań białko-białko, ale dostarcza również więcej informacji na temat kompleksu białkowego, takich jak lokalizacja subkomórkowa. Możliwe jest także wykrycie oddziaływań pośrednich, o ile dwa białka kandydujące mogą zostać zbliżone do siebie przez trzeciego partnera. Jak każda technologia, BiFC ma swoje ograniczenia. Ze względu na wymóg obecności tlenu cząstecz...

<table><tbody><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa 1 mL ze ściętą końcówką</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (bifc) kompatybilnego z systemem gateway

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

Opracowaliśmy technikę BiFC służącą do badania oddziaływań między dwoma białkami in vivo. Jest to realizowane poprzez rozdzielenie żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w tej samej ramce odczytu co gen zainteresowania. Konstrukcje te mogą być następnie współtransformowane do Nicotiana benthamiana za pośrednictwem transformacji zapośredniczonej przez Agrobacterium, co umożliwia przejściową ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka wchodzą w interakcję1-7. W celu przetestowania i walidacji oddziaływań białko-białko, BiFC można stosować w połączeniu z testem dwuhybrydowym drożdżowym (Y2H). Pozwala to na wykrycie pośrednich interakcji, które mogą zostać pominięte w Y2H. Technologia Gateway jest uniwersalną platformą, która umożliwia badaczom przenoszenie genu zainteresowania (GOI) do jak największej liczby systemów ekspresyjnych i analiz funkcjonalnych8,9. Zarówno orientacja, jak i ramka odczytu mogą zostać zachowane bez użycia enzymów restrykcyjnych lub ligacji w celu stworzenia klonów gotowych do ekspresji. Dzięki temu można wyeliminować wszystkie etapy ponownego sekwencjonowania, aby zapewnić spójne wyniki w trakcie eksperymentów. Stworzyliśmy serię wektorów BiFC i Y2H kompatybilnych z systemem Gateway, które dostarczają badaczom łatwych w użyciu narzędzi do przeprowadzania testów BiFC i Y2H10. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwość zastosowania naszego systemu BiFC do badania oddziaływań białko-białko w roślinach N. benthamiana.

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Opracowaliśmy technikę BiFC w celu badania interakcji między dwoma białkami in vivo. Jest to osiągane poprzez rozdzielenie żółtego białka fluorescencyjnego...

Aby zbadać interakcję między dwoma białkami, dwa interesujące nas geny muszą zostać sklonowane do naszych wektorów BF i innych za pomocą techniki klonowania Gateway. Konstrukty te są transformowane do szczepu Agrobacterium GV3101. Bakteryjne hodowle GV3101 zawierające oba konstrukty zostaną zmieszane i wspólnie infiltrowane do liści.Jeśli dwa białka kandydackie oddziałują ze sobą, sygnał YFP można zaobserwować przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Głównym celem techniki BFC jest badanie oddziaływań między dwoma białkami. W vavo stworzyliśmy serię kompatybilnych z systemem Gateway wektorów BFC oraz dwuhybrydowych wektorów IS, które zapewniają badaczom łatwe w użyciu narzędzia do przeprowadzania analiz BFC oraz testów dwuhybrydowych ISTO.W tym filmie zaprezentujemy łatwość obsługi naszego systemu BFC. W celu przetestowania oddziaływań białkowych w systemie ekspresyjnym typu bimolecular fluorescence complementation. W pierwszej kolejności należy przygotować hodowlę bakteryjną GV 3 1 0 1.Należy wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić ją w 5 ml pożywki YEB z odpowiednimi antybiotykami. Następnie hodowle należy inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 28 °C. Prędkość wytrząsania powinna wynosić 200 obr./min.Kultury bakteryjne powinny być gotowe następnego ranka. Upewnij się, że bakterie nie przerostły. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś jedną pętlę z każdej kultury do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.Umieść probówki w wirówce stołowej. Wirować bakterie przy 1000 G przez 10 Minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Potem wypłukać osad, dodając jedną miarkę medium infiltracyjnego i resuspendować, delikatnie pipetując kilka razy.Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy. Jest to istotne, ponieważ pomaga usunąć ślady antybiotyków z podłoża bakteryjnego, które mogą powodować obumieranie komórek roślinnych po infiltracji. Po końcowym płukaniu ponownie zawieś osad w 0,5 ml medium do infiltracji. Zmierz OD600 tej zawiesiny bakteryjnej za pomocą spektrofotometru, używając medium do infiltracji jako kontroli pustej.Po pomiarze OD należy skorygować wartość OD za pomocą medium infiltracyjnego. Końcowa wartość OD powinna mieścić się w przedziale od 1 do 1,2. Wszystkie zawiesiny bakteryjne powinny zostać przygotowane przed przejściem do następnego kroku.Przenieś równe ilości zawiesin bakteryjnych odpowiadających dwóm białkom kandydackim i wymieszaj je w nowej probówce 1,5 ml. Mieszanina bakterii jest teraz gotowa do infiltracji. Przygotuj wszystkie kombinacje i nie zapomnij o dołączeniu kontroli negatywnej. Do infiltracji należy użyć pięcio- lub sześciotygodniowych roślin Nicotiana benthamiana.Rośliny można wyjąć z pomieszczenia wzrostowego i pozostawić je na jedną godzinę przed infiltracją w celu otwarcia aparatów szparkowych. Ułatwi to proces infiltracji. Pobierz około 100 µL zawiesiny bakterii.Wymieszaj w strzykawce z tępym końcem, bez igły. Przyłóż końcówkę strzykawki do dolnej strony liścia. Podtrzymaj górną stronę kolanka palcem.Zazwyczaj należy nacisnąć tłok. Powinno być widać, jak ciecz dyfunduje przez liść, wypełniając przestrzenie międzykomórkowe tkanki mezofylu. Po infiltracji należy oznaczyć zinfiltrowany obszar markerem. W przeciwnym razie po dwóch dniach nie będzie można zidentyfikować miejsca infiltracji. Jeśli istnieje potrzeba przeprowadzenia infiltracji z różnymi mieszaninami bakteryjnymi, należy pamiętać o spryskaniu rękawiczek 50% ethanol lub o zmianie rękawiczek pomiędzy kolejnymi infiltracjami.Należy pozostawić jednocentymetrową przestrzeń między infiltracjami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej. Sygnały PFA powinny być monitorowane co 24 godziny od momentu infiltracji przez okres do pięciu dni. Do unieruchomienia próbki można użyć dwóch tulei ochronnych o różnych rozmiarach.W pierwszej kolejności nanieś jedną kroplę wody na szkiełko nakrywkowe. Następnie wycięcie małym kawałkiem tkanki za pomocą skalpela z obszaru nacieku. Staraj się unikać naczyń żylnych w próbce.Umieść wycięty preparat tkankowy w wodzie na szkiełku przedmiotowym. Przykryj go mniejszym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij. Teraz próbka może być obserwowana pod mikroskopem. W tym przypadku używamy konfokalnego mikroskopu NACA T CSS P two do wizualizacji sygnału BIFC.Można użyć nawet zwykłego mikroskopu. Mikroskop konfokalny zapewnia lepsze obrazy i pozwala wykryć słabe sygnały. Do wykrywania sygnałów VFC w tym systemie NCAs P two można wykorzystać parametr YFP.Można po prostu dwukrotnie kliknąć tutaj na to ustawienie wstępne YFP, co automatycznie włączy wzbudzenie i ustawi zakres detekcji emisji. W przypadku korzystania z innego systemu prosimy o zapoznanie się z instrukcją w celu prawidłowego ustawienia parametrów. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo w stanie przeprowadzić BFCE w celu przetestowania oddziaływań białko-białko przy użyciu systemu ekspresyjnego unbe MI Transcend.Można zastosować tę procedurę również w przypadku tytoniu oraz roślin AY. Nasze wektory BFC zawierają odpowiednio znacznik HA i znacznik flag, dzięki czemu w razie potrzeby można również przeprowadzić ko-immunoprecypitację (co IP) w celu walidacji interakcji.

detection-protein-interactions-plant-using-gateway-compatible

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie interakcji białkowych w roślinach za pomocą zgodnego z Gateway układu dwucząsteczkowego dopełniania fluorescencji (BiFC)

Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji...

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Opisana tutaj jest metoda etykietowania zbliżeniowego do identyfikacji partnerów interakcji domeny TIR receptora immunologicznego NLR w tkance liścia Nicotiana benthamiana. Podano również szczegółowy protokół identyfikacji interakcji między innymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania przy użyciu tej techniki u Nicotiana i innych gatunków roślin.

Znakowanie zbliżeniowe oparte na TurboID do identyfikacji sieci interakcji białko-białko in planta

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) to technika obrazowania służąca do wykrywania interakcji białek w żywych komórkach. W tym miejscu przedstawiono protokół FRET w celu zbadania związku enzymów modyfikujących histony z czynnikami transkrypcyjnymi, które rekrutują je do docelowych promotorów w celu epigenetycznej regulacji ekspresji genów w tkankach roślinnych.

Badanie interakcji między enzymami modyfikującymi histony a czynnikami transkrypcyjnymi in vivo poprzez transfer energii rezonansu fluorescencyjnego

Poznaj metodę BiFC do badania interakcji białkowych w roślinach z użyciem kompatybilnych z bramką wektorów YFP. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym w żywych komórkach.

Wykrywanie interakcji białkowych w roślinie za pomocą systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z bramką (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Przeglądaj więcej filmów