Wykrywanie interakcji białkowych w roślinie za pomocą systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z bramką
September 16th, 2011
Opracowaliśmy technikę testowania interakcji białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) jest podzielone na dwa nienakładające się na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w ramce do genu będącego przedmiotem zainteresowania za pośrednictwem systemu Gateway, umożliwiającego ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy białka dochodzeniowe oddziałują ze sobą.
Aby przetestować interakcję między dwoma białkami, dwa interesujące nas geny muszą zostać sklonowane do naszego BF i wektorów za pomocą techniki tęsknoty za bramą. Te konstrukty są przekształcane w aerium GV 3 1 0 1. Kultury bakterii GV 3 1 0 1 zawierające do budowy zostaną zmieszane i współinfiltrowane do liści.
Jeśli dwa białka kandydujące oddziałują ze sobą, sygnał YFP można zaobserwować za pomocą ogniskowego Meksyku końcowego. Głównym celem techniki BFC jest zbadanie interakcji między dwoma białkami. W VAVO stworzyliśmy serię kompatybilnych z bramkami BFC i IS, dwóch wektorów hybrydowych, które zapewniają naukowcom łatwe w użyciu narzędzia do wykonywania zarówno BFC, jak i ISTO dwóch hybrydowych testów.
W tym filmie pokażemy łatwość korzystania z naszego systemu BFC. Aby przetestować białko, interakcje białek w niezwykły sposób wykraczają poza system ekspresji. Najpierw musisz przygotować kulturę bakteryjną GV 3 1 0 1.
Musisz wybrać pojedynczą kolonię ze swojego talerza i zaszczepić pięć samców pożywki YEB odpowiednimi antybiotykami. Następnie musisz wstrząsnąć tymi kulturami przez noc w temperaturze 28 stopni. Prędkość wynosi 200 przebiegów na minutę.
Kultury bakteryjne powinny być gotowe następnego dnia rano. Upewnij się, że bakterie D przerosły. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś jednego samca z każdej kultury do sterylnej 1,5-męskiej probówki wirówkowej.
Umieść probówki wirówkowe w wirówce stacjonarnej. Zakręć bakterie w 1000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, wyrzuć siat. Następnie obserwuj penat, dodając jeden posiłek pożywki infiltracyjnej i ponowną ocenę przez per Petting kilka razy.
Powtórz krok prania jeszcze dwa razy. Jest to ważne, ponieważ pomaga usunąć ślady antybiotyków w pożywce bakteryjnej, które sprawiają, że po infiltracji sadzisz foki. Po ostatnim myciu, resus zawiesił paletę w 0,5 męskim medium infiltracyjnym pomiary winne 600 zawiesinom tej bakterii za pomocą spektrofotometru wykorzystującego medium infiltracyjne jako kontrolę banku.
Po pomiarze średnicy zewnętrznej należy wyregulować średnicę zewnętrzną za pomocą medium infiltracyjnego. Końcowa średnica zewnętrzna powinna wynosić od jednego do 1,2. Przed przejściem do następnego kroku należy przygotować wszystkie zawiesiny bakteryjne.
Przenieś równą ilość zawiesin bakteryjnych odpowiadających dwóm białkom kandydującym i wymieszaj je w nowej 1,5 męskiej probówce Mieszanina bakterii ujemnych jest teraz związana z naciekiem. Przygotuj wszystkie kombinacje i nie zapomnij uwzględnić kontroli negatywnej. Powinieneś użyć kodu od pięciu do sześciu tygodni i najlepszych metod infiltracji.
Możesz usunąć rośliny z pomieszczenia do uprawy i umieścić je na nocy na godzinę przed infiltracją, aby otworzyć atak burzy. Pomoże to w procesie infiltracji. Pobrać około 100 mikrolitrów zawieszonych bakterii Resus.
Wymieszać w pobliżu jednej strzykawki z męską wstrzykniętą końcówką bez igły. Przyłożyć końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia. Podeprzyj palcem górną część kolana.
Zazwyczaj naciskać na tłok. Powinieneś być w stanie zobaczyć, jak ciecz dyfunduje przez liść, ale jeszcze czujesz, że cieńsze przestrzenie powietrzne Meso po infiltracji umożliwiają infiltrowane aero za pomocą pisaka do znakowania. W przeciwnym razie, po dwóch dniach, nie będziesz w stanie zidentyfikować infiltrowanego A. Jeśli musisz przeniknąć inną mieszanką bakterii, pamiętaj, aby spryskać rękawicę 50% etanolem lub zmienić rękawice G między infiltracjami.
Staraj się pozostawić jednometrową przestrzeń żeber między infiltracjami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Sygnały PFA powinny być monitorowane co 24 godziny od infiltracji do pięciu dni. Do przytrzymania próbki można użyć dwóch tulei osłonowych o różnych rozmiarach.
Najpierw umieść jedną kroplę mini wody na rękawie z wycięciem. Następnie wytnij mały kawałek tkanki noża w strefie infiltrowanej. Staraj się unikać nudności Żyła w próbce.
Przeciętą tkankę noża wkładamy do wody na zjeżdżalni pod odłożonym środkiem, przykrywamy ją mniejszym rękawem prądowym i delikatnie wciskamy. Teraz próbkę można obserwować pod kątem Meksyku. Tutaj używamy tego NACA, T, CSS, P, dwóch konfokalnych Meksyku, do wizualizacji sygnału BIFC.
Można użyć nawet zwykłego zapachu Meksyk. Konfokalny zapewnia lepszy obraz i wykrywa słabe sygnały. Parametru YFP można użyć do wykrywania sygnałów VFC w tym systemie NCAs P two.
Możesz po prostu dwukrotnie kliknąć to ustawienie YFP tutaj, co automatycznie włączy wzbudzenie i ustawi zakres wykrywania emisji. Jeśli używasz innego systemu, zapoznaj się z instrukcją, aby prawidłowo ustawić parametry. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić BFCE w celu przetestowania interakcji białek białkowych przy użyciu systemu ekspresji unbe MI Transcend.
Możesz również zastosować tę procedurę do roślin tytoniu i AY. Nasze wektory BFC zawierają również odpowiednio znacznik HA i flag, dzięki czemu można również wykonać co IP, aby zweryfikować interakcje, jeśli to konieczne.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nową technikę do badania interakcji białko-białko w roślinach przy użyciu podejścia z podzielonym żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Poprzez klonowanie fragmentów YFP in-frame z genami interesującymi się badaczami, można obserwować rekonstytucję YFP, wskazującą na interakcje białkowe.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia roślin
- Interakcje białkowe
- Techniki fluorescencyjnych białek
Tło
- Rozumienie interakcji białkowych jest kluczowe dla wyjaśnienia procesów biologicznych.
- Tradycyjne metody mogą nie być odpowiednie dla systemów roślinnych.
- Technika podzielonego YFP pozwala na wizualizację interakcji w czasie rzeczywistym.
- Klonowanie Gateway ułatwia budowę białek fuzyjnych.
Cel badania
- Opracowanie efektywnej metody do badania interakcji białkowych w roślinach.
- Dostarczenie badaczom narzędzi do przeprowadzania testów hybrydowych BFC i ISTO.
- Poprawa rozumienia funkcji białek w biologii roślin.
Zastosowanie metod
- Klonowanie fragmentów YFP do wektorów kompatybilnych z Gateway.
- Transformacja konstrukcji do Agrobacterium GV3101.
- Współinfiltracja kultur bakteryjnych do liści roślin.
- Obserwacja sygnału YFP za pomocą mikroskopu, aby potwierdzić interakcje.
Główne wyniki
- Sukces rekonstytucji sygnału YFP wskazuje na interakcje białkowe.
- Wykazanie skuteczności techniki BFC w systemach roślinnych.
- Dostarczenie przyjaznych dla użytkownika narzędzi dla badaczy.
- Walidacja metody poprzez różne pary białek.
Wnioski
- Technika podzielonego YFP jest cennym narzędziem do badania interakcji białkowych w roślinach.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad biologią roślin.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badanie złożonych sieci białkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Protein-protein interaction analysis in plant systems supports target validation and mechanistic de-risking in agrochemical and biologics discovery. The Gateway-compatible BiFC system enables reproducible, in vivo interaction screening with quantitative fluorescence readouts, improving predictive confidence in early-stage target assessment. This approach reduces reliance on indirect assays and supports cross-functional collaboration between plant biology and translational research teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of protein interactions in planta.
- Operational Value: Provides a Gateway-compatible platform for rapid cloning and testing of target pairs without re-sequencing.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by confirming interactions in a native-like cellular context.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized biological systems suitable for downstream compound or modulator screening.
- Quantitative Output: YFP fluorescence intensity provides a measurable readout for interaction strength and dose-response modeling.
- Scalability: Compatible with high-throughput agroinfiltration workflows in Nicotiana benthamiana.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of plant-derived target pathways with potential translational biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings with preclinical validation through consistent interaction data.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables prioritization of targets based on confirmed interaction networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BiFC system fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and assay development prior to lead identification efforts in plant-based therapeutic discovery.
- Discovery Biology: Supports target validation and pathway clarification through direct interaction detection.
- Screening: Enables preparation of reproducible, quantitative interaction assays for compound screening campaigns.
- Analytics: YFP signal measurement provides quantifiable data for comparing interaction conditions and genetic perturbations.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery by confirming interactions in disease-relevant plant models.
- Enterprise Reuse: Gateway compatibility allows vector reuse across multiple projects and expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, visual evidence of protein interactions in living cells.
- Operational Value: Standardizes interaction testing through Gateway cloning and agroinfiltration protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by increasing confidence in target engagement early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization based on validated interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, agroinfiltration, and fluorescence microscopy.
- Depends on Agrobacterium-mediated transformation infrastructure and confocal or widefield microscopy capabilities.
- Necessitates standardization across teams for consistent OD adjustment, infiltration timing, and signal quantification.
- Adaptation to other plant species may require optimization of infiltration conditions and promoter selection.
- Signal quantification may be affected by autofluorescence or subcellular localization, requiring appropriate controls.
