Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Aby zbadać interakcję między dwoma białkami, dwa interesujące nas geny muszą zostać sklonowane do naszych wektorów BF i innych za pomocą techniki klonowania Gateway. Konstrukty te są transformowane do szczepu Agrobacterium GV3101. Bakteryjne hodowle GV3101 zawierające oba konstrukty zostaną zmieszane i wspólnie infiltrowane do liści.

Jeśli dwa białka kandydackie oddziałują ze sobą, sygnał YFP można zaobserwować przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Głównym celem techniki BFC jest badanie oddziaływań między dwoma białkami. W vavo stworzyliśmy serię kompatybilnych z systemem Gateway wektorów BFC oraz dwuhybrydowych wektorów IS, które zapewniają badaczom łatwe w użyciu narzędzia do przeprowadzania analiz BFC oraz testów dwuhybrydowych ISTO.

W tym filmie zaprezentujemy łatwość obsługi naszego systemu BFC. W celu przetestowania oddziaływań białkowych w systemie ekspresyjnym typu bimolecular fluorescence complementation. W pierwszej kolejności należy przygotować hodowlę bakteryjną GV 3 1 0 1.

Należy wybrać pojedynczą kolonię z płytki i zaszczepić ją w 5 ml pożywki YEB z odpowiednimi antybiotykami. Następnie hodowle należy inkubować z wytrząsaniem przez noc w temperaturze 28 °C. Prędkość wytrząsania powinna wynosić 200 obr./min.

Kultury bakteryjne powinny być gotowe następnego ranka. Upewnij się, że bakterie nie przerostły. Wyjmij kultury z inkubatora i przenieś jedną pętlę z każdej kultury do sterylnej probówki do wirowania o pojemności 1,5 mL.

Umieść probówki w wirówce stołowej. Wirować bakterie przy 1000 G przez 10 Minut w temperaturze pokojowej, a następnie odrzucić nadsącz. Potem wypłukać osad, dodając jedną miarkę medium infiltracyjnego i resuspendować, delikatnie pipetując kilka razy.

Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy. Jest to istotne, ponieważ pomaga usunąć ślady antybiotyków z podłoża bakteryjnego, które mogą powodować obumieranie komórek roślinnych po infiltracji. Po końcowym płukaniu ponownie zawieś osad w 0,5 ml medium do infiltracji. Zmierz OD600 tej zawiesiny bakteryjnej za pomocą spektrofotometru, używając medium do infiltracji jako kontroli pustej.

Po pomiarze OD należy skorygować wartość OD za pomocą medium infiltracyjnego. Końcowa wartość OD powinna mieścić się w przedziale od 1 do 1,2. Wszystkie zawiesiny bakteryjne powinny zostać przygotowane przed przejściem do następnego kroku.

Przenieś równe ilości zawiesin bakteryjnych odpowiadających dwóm białkom kandydackim i wymieszaj je w nowej probówce 1,5 ml. Mieszanina bakterii jest teraz gotowa do infiltracji. Przygotuj wszystkie kombinacje i nie zapomnij o dołączeniu kontroli negatywnej. Do infiltracji należy użyć pięcio- lub sześciotygodniowych roślin Nicotiana benthamiana.

Rośliny można wyjąć z pomieszczenia wzrostowego i pozostawić je na jedną godzinę przed infiltracją w celu otwarcia aparatów szparkowych. Ułatwi to proces infiltracji. Pobierz około 100 µL zawiesiny bakterii.

Wymieszaj w strzykawce z tępym końcem, bez igły. Przyłóż końcówkę strzykawki do dolnej strony liścia. Podtrzymaj górną stronę kolanka palcem.

Zazwyczaj należy nacisnąć tłok. Powinno być widać, jak ciecz dyfunduje przez liść, wypełniając przestrzenie międzykomórkowe tkanki mezofylu. Po infiltracji należy oznaczyć zinfiltrowany obszar markerem. W przeciwnym razie po dwóch dniach nie będzie można zidentyfikować miejsca infiltracji. Jeśli istnieje potrzeba przeprowadzenia infiltracji z różnymi mieszaninami bakteryjnymi, należy pamiętać o spryskaniu rękawiczek 50% ethanol lub o zmianie rękawiczek pomiędzy kolejnymi infiltracjami.

Należy pozostawić jednocentymetrową przestrzeń między infiltracjami, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej. Sygnały PFA powinny być monitorowane co 24 godziny od momentu infiltracji przez okres do pięciu dni. Do unieruchomienia próbki można użyć dwóch tulei ochronnych o różnych rozmiarach.

W pierwszej kolejności nanieś jedną kroplę wody na szkiełko nakrywkowe. Następnie wycięcie małym kawałkiem tkanki za pomocą skalpela z obszaru nacieku. Staraj się unikać naczyń żylnych w próbce.

Umieść wycięty preparat tkankowy w wodzie na szkiełku przedmiotowym. Przykryj go mniejszym szkiełkiem nakrywkowym i delikatnie dociśnij. Teraz próbka może być obserwowana pod mikroskopem. W tym przypadku używamy konfokalnego mikroskopu NACA T CSS P two do wizualizacji sygnału BIFC.

Można użyć nawet zwykłego mikroskopu. Mikroskop konfokalny zapewnia lepsze obrazy i pozwala wykryć słabe sygnały. Do wykrywania sygnałów VFC w tym systemie NCAs P two można wykorzystać parametr YFP.

Można po prostu dwukrotnie kliknąć tutaj na to ustawienie wstępne YFP, co automatycznie włączy wzbudzenie i ustawi zakres detekcji emisji. W przypadku korzystania z innego systemu prosimy o zapoznanie się z instrukcją w celu prawidłowego ustawienia parametrów. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo w stanie przeprowadzić BFCE w celu przetestowania oddziaływań białko-białko przy użyciu systemu ekspresyjnego unbe MI Transcend.

Można zastosować tę procedurę również w przypadku tytoniu oraz roślin AY. Nasze wektory BFC zawierają odpowiednio znacznik HA i znacznik flag, dzięki czemu w razie potrzeby można również przeprowadzić ko-immunoprecypitację (co IP) w celu walidacji interakcji.