Name: Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj metodę BiFC do wizualizacji interakcji białek i ich lokalizacji subkomórkowej w żywych komórkach. Technika ta pozwala wykrywać słabe lub przejściowe związki białkowe z rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wektory ITSN, PI3K-C2β oraz kontrolne wykorzystane w niniejszym protokole są dostępne od autorów na zapytanie, wyłącznie do celów niekomercyjnych. Autorzy pragną podziękować dr. Chang-Deng Hu za uprzejme udzielenie porad oraz dostarczenie odczynników wykorzystanych do opracowania protokołu BiFC w laboratorium O'Bryana. KAW otrzymał wsparcie finansowe z Foundation Jerome Lejeune. Prace w laboratorium O'Bryana są finansowane z grantów NIH (HL090651), DOD (PR080428), St. Baldrick's Foundation oraz Foundation Jerome Lejeune.

A. Kalibracja BiFC
<ol>
	<li>Wybierz fluorofor. Istnieje wiele fluoroforów, takich jak YFP i Venus, które dobrze sprawdzają się jako partnerzy fuzyjni w metodzie BiFC (Tabela 1). Końce aminowy i karboksylowy białka Venus są w stanie utworzyć kompleks w 37°C, podczas gdy fragmenty YFP BiFC wymagają wstępnej inkubacji w 30°C w celu ułatwienia tworzenia się fluoroforu2Inkubacja w niskiej temperaturze może zmienić niektóre procesy komórkowe, co należy uwzględnić podczas wyboru fragmentów. Wektory do fuzji białka Venus z końcem karboksylowym białek są dostępne w Addgene (<a href="http://www.addgene.org/pgvec1">http://www.addgene.org/pgvec1</a>; seepBiFC-VN173 oraz pBiFC-VC155) wraz z dodatkowymi konstruktami do wykorzystania jako kontrole, np. <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a> oraz pBiFC-bFosVC152Dodatkowe wektory, w tym wektory Venus z końcem aminowym (pFLAG-VN173 i pHA-VC15), są dostępne w następującej witrynie: <a href="http://people.pnhs.purdue.edu/%7Ehu1/">http://people.pnhs.purdue.edu/~hu1/</a>.</li>
	<li>Oznacz białko docelowe. Fragmenty BiFC są łączone z końcami aminowymi lub karboksylowymi białek kandydowanych. Niektóre białka mogą nie dopuszczać znakowania na żadnym z końców ze względu na ryzyko zaburzenia ich funkcji. Na przykład wiele białek z superrodziny GTPaz Ras ulega modyfikacji lipidowej na końcu karboksylowym, co uniemożliwia przyłączenie fragmentów BiFC do tego końca. Dlatego istotne jest posiadanie wiedzy na temat tego, w jaki sposób przyłączenie fragmentów BiFC może wpłynąć na funkcję badanych białek. W przypadku niepewności co do wpływu znakowania białka na jego funkcję należy przetestować kilka kombinacji. Oprócz fragmentu BiFC można zastosować łącznik peptydowy w celu zwiększenia elastyczności między pofragmentowanym fluoroforem a białkami kandydowanymi. Choć miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) w wektorach BiFC kodują krótkie sekwencje aminokwasowe, które mogą zapewniać wystarczającą elastyczność, w eksperymentach BiFC z sukcesem stosowano łączniki RSIAT, KQKVMNH oraz RPACKIPNDLKQKVMNH.3,9</li>
	<li>Wyznaczenie warunków transfekcji. Przed przetestowaniem wielu mutantów należy przeprowadzić kilka eksperymentów kontrolnych. Pierwsze dwie kombinacje BiFC, które należy sprawdzić, to dwie białka typu dzikiego, o których wiadomo, że oddziałują ze sobą, oraz jedno białko typu dzikiego i mutant, które nie oddziałują ze sobą. Wykorzystując te dwie kombinacje, należy przetestować różne ilości DNA oraz czasy transfekcji, aby określić optymalne warunki wykrywania sygnału BiFC dla białek kandydackich. Sugerujemy przetestowanie 0,25 µg, 0,5 µg i 1,0 µg każdego konstruktu BiFC na pojedynczą studzienkę płytki 6-dołkowej. Dzień po transfekcji należy monitorować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić optymalny czas rozwoju sygnału. <a href="http://www.addgene.org/pgvec1?f=c&amp;identifier=22012&amp;atqx=BiFC&amp;cmd=findpl">pBiFC-bJunVN173</a>oraz pBiFC-bFosVC152Konstrukty te stanowią przydatne pozytywne kontrole dla BiFC i są dostępne w Addgene (patrz wyżej). Ponadto należy przeprowadzić analizę Western blot, aby potwierdzić równy poziom ekspresji konstruktów. Warunki należy dobrać w taki sposób, aby zaobserwować sygnał fluorescencyjny pomiędzy dwoma białkami typu dzikiego, przy jednoczesnym braku lub minimalnym sygnale pomiędzy białkiem typu dzikiego a białkiem zmutowanym. Wreszcie najlepiej zachować jak najniższy poziom ekspresji białek, aby zapobiec wszelkim niespecyficznym oddziaływaniom.</li>
	<li>Należy ustalić, czy dodanie fragmentów BiFC zmienia lokalizację badanych białek. Każdy konstrukt BiFC zawiera epitop HA lub FLAG. Przeprowadź immunohistochemiczne barwienie przetransfekowanych komórek zarówno w kierunku epitopu HA lub FLAG, jak i białka endogennego (jeśli to możliwe), aby ustalić, czy znacznik BiFC wpływa na lokalizację badanych białek.</li>
</ol>
B. Wysiewanie i transfekcja komórek
<ol>
	<li>Komórki COS (1,3x105) wysiewa się po jednej na szklaną płytkę Matek oraz do dwóch studzienek płytki 6-dołkowej dla każdej próbki. Pozostawia się komórki do osadzenia na noc w temperaturze 37°C. Można również zastosować inne typy komórek, bardziej odpowiednie dla analizowanych białek kandydackich.</li>
	<li>Przygotowuje się DNA do transfekcji. W przypadku transfekcji komórek COS zazwyczaj stosujemy Lipofectamine (Invitrogen). Jednakże dla innych linii komórkowych mogą być bardziej odpowiednie inne odczynniki. Ponieważ mieszanina do transfekcji zostanie podzielona między jedną płytkę z szklanym dnem a dwie studzienki płytki 6-dołkowej, należy użyć odpowiedniej ilości DNA, aby uwzględnić ten podział. DNA rozcieńcza się w 250uL bezserwatkowego (SF) DMEM. Jako kontrolę transfekcji dodaje się CFP w ilości stanowiącej 1/5 całkowitej ilości DNA BiFC. W celu kwantyfikacji BiFC analizowane pod kątem obecności sygnału BiFC będą tylko komórki wykazujące pozytywny wynik dla CFP. Należy pamiętać, że widma CFP będą nakładać się na niektóre pary BiFC wymienione w Tabeli 1; w związku z tym może być konieczne zastosowanie alternatywnej kontroli transfekcji. Lipofectamine rozcieńcza się w 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug DNA). Mieszaniny DNA i rozcieńczalnika Lipofectamine łączy się i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 20min. 
	Uwaga: Stosunek Lipofectamine:DNA może się różnić w zależności od typu komórek. Należy zastosować odpowiednią metodę transfekcji dla danej linii komórkowej.</li>
	<li>Komórki płucze się 2x ciepłym SF DMEM. Do każdej płytki z szklanym dnem lub studzienki płytki 6-dołkowej dodaje się 2mL SF DMEM.</li>
	<li>Każdą mieszaninę do transfekcji dzieli się równomiernie między jedną płytkę z szklanym dnem a dwie studzienki płytki 6-dołkowej.</li>
	<li>Komórki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 5h.</li>
	<li>Pożywkę do transfekcji usuwa się i zastępuje pożywką kompletną (DMEM+10%FBS).</li>
	<li>Komórki inkubuje się na noc w temperaturze 37°C. Czas inkubacji po transfekcji będzie się różnić w zależności od poziomu ekspresji analizowanych białek. Przedłużona inkubacja może prowadzić do niespecyficznych oddziaływań, dlatego ten etap musi zostać określony empirycznie.</li>
</ol>
C. Przygotowanie komórek do obrazowania
<ol>
	<li>Komórki należy początkowo zbadać pod mikroskopem epifluorescencyjnym, aby upewnić się, że kontrola pozytywna wykazuje fluorescencję. W przeciwnym razie może być konieczne pozostawienie komórek na dłuższy czas w temperaturze 37°C, aż do momentu zaobserwowania sygnału.</li>
	<li>Komórki przepłukać 3x buforem PBS (pH 7.4). Do komórek w naczyniu z szklanym dnem dodać 2% paraformaldehydu (pH 7.4). Utwierdzić komórki przez 10min w lodzie. Komórki przepłukać 3x buforem PBS (pH 7.4). Komórki przechowywać w temperaturze 4°C, przykryte 1mL PBS (pH 7.4). Komórki nie muszą być utwierdzone do obrazowania, jednak gdy fragmenty BiFC sformują nienaruszony fluorofor, proces ten jest nieodwracalny, co uniemożliwia analizę dynamicznych oddziaływań3. Należy również pamiętać, że nieutwierdzone komórki będą nadal generować sygnał. Zlizować komórki w płytce 6-dołkowej i przygotować lizaty do analizy Western blot. Ważne jest, aby wszystkie komórki były przygotowane w tym samym czasie, tak aby zlizowane komórki były reprezentatywne dla komórek poddanych obrazowaniu.</li>
</ol>
D. Obrazowanie komórek
<ol>
	<li>Intensywność fluorescencji zostanie obliczona w przeliczeniu na komórkę. Należy upewnić się, że obrazowanie dotyczy pojedynczych komórek.</li>
	<li>CFP został dołączony jako kontrola transfekcji i do analizy sygnałów BiFC wybierane są tylko komórki wykazujące ekspresję CFP. Przyjmujemy założenie, że jeśli komórka została przetransfekowana CFP, została również przetransfekowana konstruktami BiFC. Takie podejście gwarantuje, że obrazowane komórki pozbawione sygnału BiFC są negatywne z powodu braku oddziaływania między badanymi białkami, a nie z powodu braku jednego lub obu konstruktów ekspresyjnych BiFC w danej komórce.</li>
	<li>Do obrazowania komórek wykorzystujemy konfokalny mikroskop Zeiss LSM 510. Podczas korzystania z tego mikroskopu ważne jest zachowanie spójności parametrów takich jak powiększenie (zoom), otwór pinhole, wzmocnienie detektora (gain), offset wzmacniacza, rozmiar ramki, prędkość skanowania, średnia z liczb skanowań oraz moc lasera. Przy użyciu dowolnego systemu obrazowania istotne jest utrzymanie stałych ustawień, aby fluorescencja była porównywalna między próbkami. Ponadto, podczas kwantyfikacji fluorescencji ważne jest, aby piksele nie były nasycone.</li>
</ol>
E. Ilościowe określanie fluorescencji
<ol>
	<li>Fluorescencję można ilościowo określić przy użyciu dowolnego oprogramowania do analizy obrazów. My wykorzystujemy ImageJ, który jest dostępny bezpłatnie z NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Otwórz pliki obrazów w ImageJ. Przejdź do Analyze &gt; Set Measurements. W oknie Measurements zaznacz pola Area oraz Mean Gray Value.</li>
	<li>Używając narzędzia „free hand selection”, obrysuj krawędź całej komórki w kanale CFP.</li>
	<li>Pozostawiając ten obrys, przejdź do kanału YFP. Wybierz Analyze &gt; Measure. 
	Mean Gray Value to suma wartości szarości wszystkich pikseli w zaznaczeniu podzielona przez liczbę pikseli (tj. średnia intensywność fluorescencji na obszar komórki).</li>
	<li>Dla każdego obrazu narysuj w kanale YFP okrąg w obszarze, w którym nie znajduje się komórka. Wykonaj pomiar dla tego obszaru jako tła. Odejmij wartość tła od każdego obrazu.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość Mean Gray Value pomniejszoną o tło dla wszystkich komórek zobrazowanych w jednej próbce. Będzie to średnia intensywność fluorescencji dla populacji komórek. Sugerujemy analizę ilościową około 60 komórek w ramach trzech eksperymentów.</li>
</ol>
F. Reprezentatywne wyniki:
Nasze laboratorium koncentruje się na wielodomenowym białku rusztowaniowym, intersectinie (ITSN), który oddziałuje z licznymi białkami w celu regulacji wielu szlaków biochemicznych i sygnałowych10,1,12,13,14. ITSN zawiera dwie domeny homologiczne do Eps15 (EH), region zwinięty (coiled-coil) oraz pięć domen homologicznych do Src 3 (SH3). Dłuższa izoforma ITSN zawiera również domeny homologiczne do Dbl (DH) i pleckstryny (PH), które wspólnie działają jako czynnik wymiany nukleotydów guaninowych dla Cdc4215. Ta modułowa struktura sprzyja oddziaływaniom białko-białko i sprawia, że ITSN jest idealnym kandydatem do eksperymentów BiFC. Lokalizacja subkomórkowa ITSN może zmieniać jego partnerów wiążących, a tym samym modyfikować szlaki regulowane przez ITSN (dane niepublikowane). Niedawno nasze laboratorium wykazało, że ITSN reguluje przeżywalność neuronów poprzez regulację nowej klasy II PI3K, PI3K-C2β 1. Aminokońcowa domena bogata w prolinę PI3K-C2β zawiera dwa miejsca wiązania dla domen SH3 białka ITSN. Wykorzystując ko-immunoprecypitację z zastosowaniem ITSN oraz mutantów trunkacyjnych PI3K-C2β, wykazaliśmy, że domeny SH3A i SH3C białka ITSN oddziałują z regionem aminokońcowym PI3K-C2β. Następnie zastosowaliśmy technikę BiFC, aby zwizualizować subkomórkową lokalizację tego kompleksu. ITSN został połączony z aminokońcem białka Venus (pFLAG-VN173), a konstrukty PI3K-C2β z karbokskońcem białka Venus (pHA-VC15). Jako kolejną kontrolę negatywną zastosowano niespecyficzny peptyd połączony z pHA-VC15. VN-ITSN i VC-PI3K-C2β utworzyły kompleks BiFC o rozkładzie punktowym (Rycina 2A, panele górne). Mutacje w domenie bogatej w prolinę PI3K-C2β, które zaburzają ko-precypitację ITSN i PI3K-C2β, zmniejszyły sygnał BiFC (Rycina 2A, panele dolne)1. Ta różnica w sygnale BiFC pomiędzy ITSN a dwoma białkami PI3K-C2β nie wynikała z różnic w ekspresji białek (Rycina 2B).
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig1.jpg" alt="Schemat oddziaływań białkowych, proces komplementacji VN-VC, analiza fuzji fragmentów białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. W metodzie BiFC fluorofor (w tym przypadku Venus) zostaje podzielony na koniec aminowy (VN) i karboksylowy (VC). Końce te są fuzjonowane z dwoma badanymi białkami. Gdy oba białka wchodzą ze sobą w interakcję, fragmenty VN i VC ponownie się łączą, co prowadzi do rekonstytucji fluoroforu i wystąpienia fluorescencji w miejscach interakcji. BiFC jest konkretnym przykładem testu komplementacji fragmentów białek (PCA), wykorzystywanego do pomiaru oddziaływań białko-białko.5.
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643fig2.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna ITSN+PI3K i CFP w komórkach; analiza Western blot dla VC-PI3K i VN-ITSN." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. ITSN i PI3K-C2β tworzą kompleks BiFC. A. ITSN z tagiem VNa został współtransfected z PI3K-C2β WT z tagiem VCa lub mutantem domeny bogatej w prolinę (PI3K-C2β-PA). ITSN i WT PI3K-C2β tworzą kompleks (kolor zielony). CFP (kolor czerwony) służył jako kontrola transfekcji. B. Wykonano Western blot, aby wykazać równą ekspresję konstruktów. Konstrukty z tagiem VCa są dodatkowo znakowane tagiem HA.
<img src="/files/ftp_upload/2643/2643table1.jpg" alt="Tabela wzbudzenia i emisji fragmentów BiFC; analiza widma fluorescencji; wykres danych eksperymentalnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1. Dostępnych jest wiele wektorów kompatybilnych z BiFC. YN155: 1-15 aa YFP; YC15: 15-238 aa YFP; YN173: 1-172 aa YFP; YC173: 173-238 aa YFP; VN15: 1-154 aa Venus; VC15: 15-238 aa Venus; VN173: 1-172 aa Venus; VC173: 173-238 aa Venus; CN15: 1-154 aa CFP; CC15: 155-238 aa CFP; GN173: 1-172 aa GFP; CitN15: 1-15 aa Citrine; CitC15: 15-238 aa Citrine; CitN173: 1-172 aa Citrine; CitC173: 173-238 aa Citrine; CerN173: 1-172 aa Cerulean. 2,3,9.

<ol><li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+molecular+interactions+by+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).</li>
<li>Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+fluorescent+protein+fragments+for+bimolecular+fluorescence+complementation+analysis+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions.</a> Biotechniques. 40, 61-66 (2006).</li>
<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+protein-protein+interactions+by+protein+fragment+complementation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies.</a> Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).</li>
<li>Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+strategies+to+delineate+MAP+kinase+signaling+pathways+using+protein-fragment+complementation+assays+%28PCA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA).</a> Methods. 40, 287-293 (2006).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li>
<li>Hu, C. D., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+protein+interactions+in+living+cells+using+multicolor+fluorescence+complementation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis.</a> Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).</li>
<li>Martin, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+regulates+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis%2C+ubiquitylation%2C+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling.</a> Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).</li>
<li>Das, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron+survival+through+an+intersectin-phosphoinositide+3%27-kinase+C2beta-AKT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway.</a> Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).</li>
<li>Mohney, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+activates+Ras+but+stimulates+transcription+through+an+independent+pathway+involving%5BTitle%5D)+AND+%22JNK.+J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving.</a> JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).</li>
<li>Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+can+regulate+the+Ras%2FMAP+kinase+pathway+independent+of+its+role+in+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).</li>
<li>Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersectin+an+adaptor+protein+involved+in+clathrin-mediated+endocytosis%2C+activates+mitogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways.</a> J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).</li>
<li>O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenesis+and+endocytosis%3A+What%27s+at+the+INTERSECTIoN%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN?</a> Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).</li>
<li>Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+AP-1+NF-kappaB+ternary+complexes+in+living+cells+by+using+a+BiFC-based+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

BiFC jest doskonałą metodą wizualizacji oddziaływań białko-białko w całych komórkach oraz określania subkomórkowej lokalizacji tych kompleksów. Zaletą metody BiFC jest to, że fluorescencję wykazują jedynie białka oddziałujące, oddziaływania przejściowe zostają ustabilizowane, a postprocessing danych obrazowych jest minimalny. Dwie wadami tej metody są czas dojrzewania fluoroforu oraz nieodwracalność kompleksu fluoroforu. W niektórych zastosowaniach ta nieodwracalność może być wykorzystana jako zaleta. Przykładowo, w komp...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Cellgro</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Szalki z mikrowyciśkami o szklanym dnie</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14C</td><td></td></tr><tr><td>Szalki 6-dołkowe</td><td>Falcon BD</td><td>35-3846</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine</td><td>Invitrogen</td><td>18324020</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr></tbody></table>

bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Bimolecular Fluorescence Complementation

Określenie rozmieszczenia subkomórkowego kompleksów sygnalizacyjnych jest niezbędne do zrozumienia efektu działania danego kompleksu. Konwencjonalne metody, takie jak immunoprecypitacja, nie dostarczają informacji o lokalizacji przestrzennej kompleksów. W przeciwieństwie do nich, BiFC monitoruje interakcje i kompartymentację subkomórkową kompleksów białkowych. W tej metodzie białko fluorescencyjne jest podzielone na niefluorescencyjne fragmenty aminokońcowy i karboksykońcowy, które następnie są łączone z dwoma badanymi białkami. Interakcja białek prowadzi do rekonstrukcji fluoroforu (Rysunek 1)1,2. Ograniczeniem BiFC jest fakt, że po rekonstrukcji pofragmentowanego fluoroforu kompleks staje się nieodwracalny3. Ograniczenie to jest korzystne przy wykrywaniu interakcji przejściowych lub słabych, ale wyklucza analizę kinetyczną dynamiki kompleksu. Dodatkową uwagą jest to, że zrekonstruowany fluorofor wymaga 30min na dojrzewanie i emisję fluorescencji, co ponownie uniemożliwia obserwację interakcji w czasie rzeczywistym4. BiFC jest szczególnym przykładem testu komplementacji fragmentów białek (PCA), który wykorzystuje białka reporterowe, takie jak warianty zielonego białka fluorescencyjnego (BiFC), reduktazę dihydrofolianową, β-laktamazę oraz lucyferazę, do pomiaru interakcji białko-białko5,6. Alternatywnymi metodami badania interakcji białko-białko w komórkach są ko-lokalizacja fluorescencyjna oraz Försterowski transfer energii rezonansowej (FRET)7. W przypadku ko-lokalizacji dwa białka są znakowane indywidualnie, albo bezpośrednio fluoroforem, albo poprzez pośrednią immunofluorescencję. Jednak podejście to prowadzi do wysokiego tła białek nieoddziałujących, co utrudnia interpretację danych o ko-lokalizacji. Ponadto, ze względu na granice rozdzielczości mikroskopii konfokalnej, dwa białka mogą wydawać się ko-lokalizowane, niekoniecznie wchodząc w interakcję. W BiFC fluorescencja jest obserwowana tylko wtedy, gdy dwa badane białka wchodzą w interakcję. FRET jest kolejną doskonałą metodą badania interakcji białko-białko, ale może być wymagająca technicznie. Eksperymenty FRET wymagają, aby donor i akceptor mieli podobną jasność i stechiometrię w komórce. Ponadto należy uwzględnić przenikanie sygnału donora do kanału akceptora i odwrotnie. W przeciwieństwie do FRET, BiFC wykazuje niewielką fluorescencję tła, wymaga niewielkiej postprodukcji danych obrazowych, nie wymaga wysokiej nadekspresji i może wykrywać słabe lub przejściowe interakcje. Bioluminescencyjny transfer energii rezonansowej (BRET) jest metodą podobną do FRET, z wyjątkiem tego, że donorem jest enzym (np. lucyferaza), który katalizuje substrat, aby stał się bioluminescencyjny, pobudzając tym samym akceptor. BRET jest pozbawiony problemów technicznych związanych z przenikaniem sygnału i wysoką fluorescencją tła, ale nie pozwala na uzyskanie informacji przestrzennych ze względu na brak lokalizacji substratu w konkretnych przedziałach8. Podsumowując, BiFC jest doskonałą metodą wizualizacji lokalizacji subkomórkowej kompleksów białkowych, pozwalającą uzyskać wgląd w kompartymentowaną sygnalizację.

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Określenie rozmieszczenia wewnątrzkomórkowego kompleksów sygnałowych jest niezbędne do zrozumienia efektu ich działania. Konwencjonalne metody, takie jak ...

Celem tego eksperymentu jest określenie, czy dwa białka oddziałują ze sobą w komórkach, oraz opisanie aspektów miejsc tej interakcji. W pierwszej kolejności komórki są transfektowane konstruktami ekspresyjnymi kodującymi dwa badane białka, z których jedno jest połączone z końcem N pofragmentowanego białka fluorescencyjnego, a drugie z komplementarnym końcem C pofragmentowanego białka fluorescencyjnego. Po umożliwieniu transfektowanym komórkom wykształcenia sygnału fluorescencyjnego w hodowli, kompleksy białkowe są wizualizowane za pomocą obrazowania i immunoblottingu.Następnie zebrane obrazy są eksportowane do oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak Image J, w celu określenia średniej intensywności fluorescencji na komórkę. W kontrolowanym eksperymencie wyniki BIFC mogą wykazać interakcje białko-białko oraz lokalizację tych kompleksów, na przykład w przypadku przecinania się domen SH3 białka rusztowującego i domeny bogatej w prolinę PI3KC2β. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kolokalizacja, immunoprecypitacja i FRET, jest to, że BIFC pozwala na przestrzenną lokalizację słabszych, przejściowych interakcji w komórce. Metoda ta nie wymaga również rozległego post-processingu obrazów, co ma miejsce w przypadku FRET.Niniejsza metoda pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu transdukcji sygnału, takie jak: czy białka X i Y oddziałują ze sobą, a jeśli tak, to w których konkretnie przedziałach komórkowych lokalizują się te kompleksy? Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności wynikające z niewłaściwego doboru konfiguracji ekspresji swoich konstruktów. Białka docelowe z etykietą: rozpocznij od wyboru jednego z wielu fluoroforów dla białek fuzyjnych w technice BIFC.Przyjmijmy, że końce aminowy i karboksylowy białka Venus są w stanie utworzyć kompleks w temperaturze 37°C, podczas gdy fragmenty Y-F-P-B-I-F-C wymagają wstępnej inkubacji w temperaturze 30°C. Zaprojektuj wektory ekspresyjne do dodania znaczników do białek zainteresowania, biorąc pod uwagę, w jaki sposób przyłączenie fragmentów BIFC może wpłynąć na funkcję tych białek. Na przykład białka z rodziny RAs oraz GTPazy są modyfikowane lipidowo na końcu karboksylowym i nie mogą być znakowane na tym końcu, aby nie zakłócić tej modyfikacji.Zawsze należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe w celu ustalenia warunków transfekcji. Należy również monitorować komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić optymalny czas rozwoju sygnału. Następnie należy wykonać analizę western blot, aby potwierdzić równą ekspresję konstruktów.Ważne jest przeprowadzenie barwienia immunocytochemicznego na znacznik HA lub flag, aby zweryfikować, czy dodanie fragmentów BIFC nie zmienia lokalizacji komórkowej białek zainteresowania dla każdej płytki z próbkami. Wysiać 1,3 × 10⁵ komórek na każdą szklaną płytkę do hodowli oraz do dwóch studni płytki 6-dołkowej i pozostawić komórki do osadzenia przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Następnego dnia przygotować DNA do transfekcji metodą lipofekcji lub inną preferowaną metodą.W pierwszej kolejności rozcieńcz DNA w 250 µL bezsurowiczego DMEM, który będzie służył jako kontrola transfekcji. Dodaj CFP w stosunku 1:50 w odniesieniu do całkowitej ilości DNA BIFC. Następnie rozcieńcz lipofekcyjną mieszaninę w 250 µL bezsurowiczego DMEM, stosując 10 µL lipofekcjanta na 1 µg DNA.Wymieszać rozcieńczenia DNA i lipidów, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przepłukać komórki dwukrotnie ciepłym medium DMEM bez surowicy. Dodać 2 ml medium DMEM bez surowicy do każdej płytki z szklanym dnem lub do każdego dołka płytki 6-dołkowej.Następnie podziel każdą mieszaninę do transfekcji równomiernie pomiędzy jedną szalkę z dnem szklanym a dwa dołki płytki sześciodołkowej i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć godzin. Na koniec usuń medium do transfekcji i zastąp je kompletnym medium DMEM z dodatkiem 10% FBS.Inkubować komórki przez czas określony w badaniach pilotażowych, aby uzyskać wymagany poziom ekspresji interesujących białek. Zbadać transfekowane komórki pod mikroskopem epifluorescencyjnym, aby upewnić się, że kontrola pozytywna wykazuje fluorescencję. Przepłukać komórki trzy razy PBS w celu obrazowania żywych komórek.Przenieś komórki do pożywki pozbawionej barwników wskaźnikowych. W przypadku obrazowania utrwalonych komórek dodaj 2% paraformaldehydu i inkubuj w lodzie przez 10 minut.Następnie trzykrotnie wypłucz komórki PBS, po czym pokryj je 1 mL PBS i przechowuj w ciemności w temperaturze 4 °C, a następnie natychmiast poddaj komórki w płytce 6-dołkowej lizie. W przypadku analiz Western blot ważne jest, aby wszystkie komórki były przygotowane w tym samym czasie, tak aby zlizowane komórki były reprezentatywne dla komórek obrazowanych. Wykonaj Western blot, aby upewnić się, że białka z tagiem są ekspresowane na równym poziomie.Podczas obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego ważne jest zachowanie stałych ustawień przez cały czas trwania eksperymentu, aby fluorescencja była porównywalna pomiędzy próbkami. Należy upewnić się, że obrazowane pojedyncze komórki nie wykazują nasycenia pikseli. Ponieważ CFP został zastosowany jako kontrola transfekcji, do analizy sygnałów BIFC należy wybierać wyłącznie komórki CFP-dodatnie.Ilościowo określ fluorescencję przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu, takiego jak ImageJ. Otwórz pliki obrazów w programie ImageJ. Przejdź do Analyze i wybierz Set Measurements. W oknie pomiarów zaznacz pola Area oraz Mean Gray Value. Zauważ, że w tym przykładzie obrazy żył zostały sztucznie pokolorowane na zielono, a obrazy CFP na czerwono.Używając narzędzia zaznaczania wolną ręką, obrysuj krawędź całej komórki w kanale CFP, pozostawiając ten obrys na miejscu. Przełącz się na kanał YFP. Przejdź do analizy i zmierz średnią wartość szarości, która odzwierciedla średnią intensywność fluorescencji na komórkę dla każdego obrazu.Narysuj okrąg w kanale YFP w obszarze, który nie zawiera komórki. Wykonaj pomiar dla tego obszaru jako tła. Odejmij tło od każdego obrazu.W końcu, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji dla populacji komórek, należy wyciągnąć średnią z wartości średniego stopnia pomniejszonej o tło dla wszystkich komórek obrazowanych w jednej próbce. Idealnie należy poddać kwantyfikacji 60 komórek w trzech eksperymentach. Wielodomenowe białko rusztowaniowe intersecting reguluje przeżywalność neuronów poprzez regulację nowej klasy drugiej kinazy PI3K, PI3K C2β. Domeny SH3 białka intersecting oddziałują z regionem bogatym w prolinę na końcu aminowym PI3K C2β. Transfekcja VN-tagged intersecting oraz VC-tagged PI3K C2β skutkuje sygnałem fluorescencyjnym w kanale YFP, który został zabarwiony pseudokolorem zielonym, co wskazuje na tworzenie kompleksu.CFP, tutaj sztucznie zabarwiony na czerwono, służy jako kontrola do znakowania przetransformowanych komórek; mutacje w domenie bogatej w prolinę białka PI3K2β, które zaburzają współwytrącanie interaktora i PI3K2β, zmniejszają sygnał BIFC. Ta różnica w sygnale BIFC nie wynika z różnic w ekspresji białek typu dzikiego i zmutowanych białek PI3K. Po opanowaniu technika ta może zostać przeprowadzona w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu odpowiednich kontroli oraz sprawdzeniu ekspresji białek, aby upewnić się, że różnice w sygnale BIFC wynikają z różnic w tworzeniu kompleksów, a nie z różnic w ekspresji po zastosowaniu opisanej procedury.Można zastosować inne techniki, takie jak rezonans plazmonowy powierzchniowy, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, jakie są różnice w powinowactwie tych kompleksów względem siebie.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komplementacja fluorescencji bimolekularnej

Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji...

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

W tym filmie pokazaliśmy oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej, BiCAP, do wykrywania i izolowania specyficznych dimerów białkowych za pomocą specyficznych dla konformacji przeciwciał jednodomenowych.

Oczyszczanie powinowactwa do komplementacji bimolekularnej w celu wyizolowania dwóch oddziałujących białek

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Ten manuskrypt opisuje protokół oczyszczania powinowactwa do uzupełnienia bimolekularnego (BiCAP). Ta nowatorska metoda ułatwia specyficzną izolację i dalszą charakterystykę proteomiczną dowolnych dwóch oddziałujących białek, wykluczając jednocześnie nieskompleksowane pojedyncze białka, a także kompleksy utworzone z konkurującymi partnerami wiążącymi.

Analizowanie wielobiałkowych kompleksów sygnalizacyjnych za pomocą oczyszczania powinowactwa z komplementacją bimolekularną (BiCAP)

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

Poznaj metodę BiFC do wizualizacji interakcji białek i ich lokalizacji subkomórkowej w żywych komórkach. Technika ta pozwala wykrywać słabe lub przejściowe związki białkowe z rozdzielczością przestrzenną.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Przeglądaj więcej filmów