Dwucząsteczkowa komplementacja fluorescencji

Eksperyment ten ma na celu określenie, czy dwa białka oddziałują na siebie w komórkach i nakreślenie aspektów miejsc tej interakcji. Pierwsze komórki są transfekowane konstruktami ekspresyjnymi kodującymi dwa interesujące białka, z których jedno jest połączone z końcem rozdrobnionego białka fluorescencyjnego, a drugie z komplementarnym końcem C rozdrobnionego białka fluorescencyjnego. Po umożliwieniu transfekowanym komórkom rozwinięcia sygnału fluorescencyjnego w hodowli, kompleksy białkowe są wizualizowane przez obrazowanie i immunoblotting.

Następnie zebrane obrazy są eksportowane do oprogramowania do obrazowania, takiego jak Image J W celu ilościowego określenia średniej intensywności fluorescencji na komórkę w kontrolowanym eksperymencie, wyniki BIFC mogą wykazać interakcje białek białkowych i lokalizację tych kompleksów, takich jak trzy domeny SH przecinającego się białka rusztowania i pro bogata domena PI trzy KC dwie beta. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak kolokalizacja, immunoprecypitacja i fret, jest to, że BFC pozwala na przestrzenną lokalizację słabszych oddziaływań przejściowych w komórce. A ta metoda nie wymaga obszernego przetwarzania obrazów po przekształceniu, jak widać w przypadku progów.

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarze transdukcji sygnału, takie jak oddziaływanie białek DO X i Y, a jeśli tak, to jakie są konkretne przedziały, do których te kompleksy są zlokalizowane w komórce? Ogólnie rzecz biorąc, nowicjusze w tej metodzie będą mieli trudności, ponieważ nie wybrali właściwej konfiguracji do wyrażania biopsji. Oznaczone białka będące przedmiotem zainteresowania Zacznij od wybrania jednego z wielu fluoroforów dla białek fuzyjnych BIFC.

Weźmy pod uwagę, że aminowe i karboksylowe końce końcowe Wenus są w stanie utworzyć kompleks w temperaturze 37 stopni Celsjusza, podczas gdy fragmenty Y-F-P-B-I-F-C wymagają wstępnej inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Zaprojektuj wektory ekspresji do dodawania znaczników do białek będących przedmiotem zainteresowania, rozważając, w jaki sposób przyłączenie fragmentów BIFC może wpływać na funkcję białek będących przedmiotem zainteresowania. Na przykład rodzina RZS, GTP a są modyfikowane lipidami na końcu karboksylowym i nie mogą być oznaczone na tym końcu bez zakłócenia tej modyfikacji.

Zawsze wykonuj eksperymenty pilotażowe w celu określenia warunków transfekcji. Monitoruj również komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić optymalny czas na rozwój sygnału. Następnie wykonaj analizę zachodniego kwitnienia, aby potwierdzić równe wyrażenie konstruktów.

Co ważne, barwienie immunologiczne dla znacznika HA lub flagi w celu sprawdzenia, czy dodanie fragmentów BIFC nie zmienia lokalizacji komórkowej białek będących przedmiotem zainteresowania dla każdej płytki próbki. 1,3 razy 10 z pięciu komórek powodujących każdą na jednej szklanej płytce z dnem i dwóch dołkach na płytce sześciodołkowej i pozwól komórkom osiąść na noc w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia. Przygotować DNA do transfekcji przez lipektomię lub inną preferowaną metodę.

Najpierw rozcieńczyć DNA w 250 mikrolitrach DMEM wolnego od surowicy jako kontrolę transfekcji. Dodaj CFP do jednego 50, ilości całkowitego DNA BIFC. Teraz rozcieńczyć wargę w 250 mikrolitrach DMEM bez surowicy, używając 10 mikrolitrów wargi na jeden mikrogram DNA.

Wymieszać DNA i rozcieńczenia warg, inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Dwukrotnie spłucz komórki ciepłym serum bez DMEM. Dodaj dwa mililitry DMEM wolnego od surowicy do każdej szklanej płytki dolnej lub dołka naczynia z sześcioma dołkami.

Następnie podziel każdą mieszaninę transfekcji równomiernie między jedno naczynie ze szklanym dnem i dwie studzienki po sześć. Dobrze inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć godzin. Na koniec usuń nośnik transfekcyjny i zastąp go kompletnym nośnikiem DMEM plus 10% FBS.

Inkubować komórki przez czas określony w eksperymentach pilotażowych, aby uzyskać niezbędne poziomy ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania. Zbadaj transfekowane komórki pod mikroskopem epifluorescencyjnym, aby upewnić się, że kontrola pozytywna jest fluorescencyjna. Przepłucz komórki trzykrotnie PBS w celu zobrazowania żywych komórek.

Umieść komórki w pożywce bez matryc wskaźnikowych. Do obrazowania komórek stałych. Dodaj 2% para formaldehydu i umieść na lodzie na 10 minut.

Następnie przepłucz komórki trzykrotnie PBS pokrytym teraz jednym mililitrem PBS i przechowuj w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza, natychmiast przetrzyj komórki w naczyniu z sześcioma dołkami. W przypadku analiz Western blot ważne jest, aby wszystkie komórki były przygotowane w tym samym czasie, tak aby komórki lys były reprezentatywne dla komórek obrazu. Wykonaj western blot, aby upewnić się, że białka znacznika ulegają ekspresji na równoważnych poziomach.

Podczas obrazowania komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego ważne jest, aby utrzymać stałe ustawienia przez cały czas trwania eksperymentu, aby fluorescencja była porównywalna między próbkami. Pamiętaj, aby zobrazować pojedyncze komórki, w których piksele nie są nasycone. Ponieważ CFP został uwzględniony jako kontrola transfekcji, do analizy sygnałów BIFC należy wybierać tylko komórki CFP dodatnie.

Określ ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak obraz J.Otwórz pliki obrazów w Image J.Go, aby przeanalizować ustawione pomiary. Zaznacz pola pola powierzchni i średniej wartości szarości w polu pomiarów. Zauważ, że w tym przykładzie obrazy żylne zostały pseudo pokolorowane na zielono, a obrazy CFP pseudo pokolorowane na czerwono.

Korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego, narysuj kontur wokół krawędzi całej komórki w kanale CFP, pozostawiając ten kontur na miejscu. Przełącz się na kanał YFP. Przejdź do analizy, zmierz średnią wartość szarości odzwierciedla średnią intensywność fluorescencji na komórkę dla każdego obrazu.

Narysuj okrąg w kanale YFP w obszarze, który nie zawiera komórki. Wykonaj pomiar dla tego obszaru jako tła. Odejmij tło od każdego obrazu.

Na koniec, aby obliczyć średnią intensywność fluorescencji dla populacji komórek, należy uśrednić średnią wartość oceny pomniejszoną o tło dla wszystkich komórek obrazowanych w jednej próbce. Najlepiej określić ilościowo 60 komórek w trzech eksperymentach. Wielodomenowe białko rusztowania przecinające się reguluje przeżycie neuronów poprzez regulację nowej kinazy PI klasy drugiej, kinazy PI trzy, KC dwóch beta przecinających SH trzech domen oddziałuje z aminokońcowym regionem bogatym w prolinę PI trzy KC dwie beta transfekcja VN oznaczona przecinająca się z VC oznaczona PI trzy KC dwie beta powoduje sygnał fluorescencyjny w kanale YFP, który jest pseudo koloru zielonego wskazującego na złożoną formację.

Pseudo CFP zabarwiony tutaj na czerwono jest używany jako kontrola do oznaczania mutacji transfekowanych komórek w bogatej w prolinę domenie PI trzy KC dwa beta, które zakłócają co wytrącanie się przecinających się i PI trzy KC dwa beta zmniejszają sygnał BIFC. Ta różnica w sygnale BIFC nie wynika z różnic w ekspresji białek trzech K typu dzikiego i PA PI Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o uruchomieniu odpowiednich kontroli i sprawdzeniu ekspresji białka, aby upewnić się, że różnice w sygnale BC wynikają z różnic w tworzeniu kompleksu, a nie z ekspresji zgodnie z tą procedurą.

Inne techniki, takie jak plazma powierzchniowa na mieszkańcach, mogą być wykonane w celu odpowiedzi na pytania, takie jak: jakie są różne powinowactwa tych kompleksów do siebie?