Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych
16 marca 2016
Chociaż struktura rybosomów została szczegółowo opisana, organizacja polisomów jest nadal niedostatecznie zbadana. Aby przezwyciężyć ten brak wiedzy, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół przygotowania do dokładnego obrazowania polisomów ssaków za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w powietrzu i cieczy.
Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie szczegółowego procesu dokładnego oczyszczania i osadzania polirybosomów mózgu na mice oraz uzyskanie tysięcy obrazów w rozdzielczości nanoskali bez konieczności ciężkiego przetwarzania końcowego lub analiz rekonstrukcji 3D. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie translacji i kontroli translacji, takie jak zrozumienie wpływu organizacji rybosomów w obrębie polisomów podczas zmiany ekspresji genów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie jest wymagane utrwalanie ani znakowanie próbki, a pomiary można przeprowadzać w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, aby łatwo zidentyfikować rybosomy i nagie stanowiska RNA.
Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację polirybosomu ssaków, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów, takich jak drożdże, bakterie i owady, a także do statusu obejmującego translacyjną kontrolę ekspresji genów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obchodzenie się z próbką polisomalną w celu absorpcji miki i etapy mycia są dość trudne i wymagają umiejętności i doświadczenia w obsłudze. Procedurę zademonstrują Paola Bernabo i Lorenzo Lunelli.
Aby rozpocząć, zbierz i zamroź tkankę mózgową zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wyciągnij zamrożoną chusteczkę z zamrażarki i przynieś ją na ławkę. Umieść zamrożoną tkankę mózgową i ciekły azot w schłodzonym moździerzu i sproszkowaj go za pomocą tłuczka, aż utworzy się proszek.
Przenieś około 25 miligramów proszku mózgowego do zimnej probówki mikrowirówkowej i natychmiast dodaj 0,8 mililitra buforu do lizy. Pipetuj mieszaninę w górę i w dół 25 razy szybko, aby rozbić komórki. Następnie odwiruj probówkę o stężeniu 12 000 x g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozdrobnić resztki komórkowe.
Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut, aby osadzać jądra i mitochondria. Następnie ostrożnie usuń jeden mililitr z wierzchu wcześniej przygotowanego gradientu sacharozy.
Nakładaj sacharozę kropla po kropli na supernatant z lizatu cytozolowego. Gdy próbka zostanie teraz załadowana na górę gradientu, ostrożnie opuść rurkę i rurkę przeciwwagi do kubełków wahadłowego wirnika kubełkowego. Odwirowywać gradient przez 100 minut.
Po ultraodwirowaniu pozostaw probówki w wiadrach na 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby gradient się ustabilizował. Następnie ostrożnie wyjmij probówkę z próbką i zamontuj ją na urządzeniu kolektorowym systemu frakcjonowania w gradionym gradieniu gęstości. Zbierz frakcje o wielkości jednego mililitra, monitorując absorbancję kwasów nukleinowych na głębokości 260 nanometrów za pomocą detektora światła widzialnego UV i umieść je na lodzie.
Następnie przygotuj 30-40 mikrolitrowych porcji interesujących frakcji i trzymaj je na lodzie. Jeśli próbki nie zostaną od razu wykorzystane, przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza i podejmij kroki w celu ograniczenia liczby cykli zamrażania i rozmrażania. Aby przygotować próbki do obrazowania AFM, najpierw przykryj umyty arkusz miki 200 mikrolitrami jednego milimolowego siarczanu niklu ii i inkubuj arkusz przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń roztwór, osusz powierzchnię sprężonym powietrzem i umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie delikatnie dodaj całą porcję z interesującej frakcji kropla po kropli na mikę. Używając końcówki o pojemności 100 lub 200 mikrolitrów, rozprowadź próbkę na całej powierzchni miki i inkubuj próbkę na lodzie przez trzy minuty.
Następnie przykryj arkusz miki kropla po kropli 200 mikrolitrami zimnego buforu AFM i inkubuj próbkę na lodzie przez godzinę. Utrzymywanie próbki w temperaturze 40 stopni i używanie zimnego buforu, który został przygotowany w wodzie wolnej od RNaz, jest ważne dla zachowania organizacji polirybosomów. Po inkubacji ostrożnie usunąć bufor i przemyć mikę trzy do czterech razy 200 mikrolitrami zimnego buforu AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy.
Następnie umyj mikę trzykrotnie zimnym roztworem myjącym i odcedź nadmiar wody z miki za pomocą papieru. Całkowite usunięcie sacharozy z próbek absorbentu ma kluczowe znaczenie teraz, gdy odcięto zarówno rybosom, jak i nagie RNA w polisomie. Pozostawić próbkę do wyschnięcia pod pokrywą chemiczną z częściowo otwartą górną częścią płytki Petriego.
Po dwóch godzinach zamknij szalkę Petriego. Próbka może być teraz przechowywana w temperaturze pokojowej. Przymocować przygotowaną próbkę do uchwytu próbki AFM za pomocą taśmy dwustronnej.
Następnie włożyć uchwyt na próbkę do stolika AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Po kalibracji zbliżyć się do próbki, aż końcówka wspornika zatli się z powierzchnią. Wybierz obszar skanowania o wymiarach dwa na dwa mikrony, rozdzielczość co najmniej 512 x 512 pikseli, wybierz tryb odejmowania tła na żywo i wybierz skalę Z 20-25 nanometrów.
Następnie rozpocznij akwizycję obrazu. Sprawdź obraz, szukając obecności okrągłych obiektów charakteryzujących się wysokością od 10 do 15 nanometrów podczas pozyskiwania obrazów w powietrzu. Następnie dostosuj wartość zadaną i parametry sprzężenia zwrotnego, aż zostaną wyświetlone ostre obiekty.
Tło powinno wydawać się stosunkowo płaskie w dobrych próbkach z obiektami o wysokości od dwóch do czterech nanometrów. Gdy obraz wygląda dobrze, wykonaj kilka skanów dwa na dwa mikrony w różnych obszarach próbki. Po osadzeniu się alikwot sacharozy na mice, AFM dostarcza dokładnych opisów wielkości pojedynczych polisomów, które pojawiają się jako skupiska ciasno upakowanych rybosomów.
Bliższe przyjrzenie się jednemu z pików rybosomalnych za pomocą analizy przekroju poprzecznego ujawnia, że wysokość pików rybosomalnych wynosi około 14 nanometrów. Jest to zgodne z tym, co wcześniej zaobserwowano dla ludzkich rybosomów i polisomów po wysuszeniu na powietrzu. Na obrazie po prawej stronie użyto makra do identyfikacji lokalizacji rybosomu i oznaczenia każdego rybosomu czerwonym kółkiem.
Korzystając z tych informacji, można przeanalizować rozkład częstości liczby rybosomów na polisom. Ten eksperymentalny rozkład został wyposażony w krzywą Gaussa, która była wyśrodkowana na 5,8 rybosomów na polisom, z odchyleniem standardowym 1,3. Po opanowaniu, ta technika, od sproszkowania mózgu do pozyskiwania obrazów polirybosomów, może być wykonana w mniej niż osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu próbki na lodzie i stosowaniu zimnych do osadzania próbki na mice. Postępując zgodnie z tą procedurą i korzystając z wtyczki ImageJ programisty, która ma być dostępna w Twoim artykule, możesz dokładnie policzyć liczbę rybosomów na polisom. Po każdym opracowaniu, technika ta utoruje drogę do zrozumienia kinetyki tworzenia polisomów i identyfikacji zmian w organizacji polisomów oraz ich różnych warunków komórkowych lub tkankowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać tysiące obrazów polisomów w celu systematycznej analizy i badania ich organizacji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół obrazowania polisomów ssaków za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Metoda ta umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości bez konieczności fiksacji lub znakowaniu próbki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- Organizacja polisomów jest słabo zbadana mimo rozległej charakteryzacji struktury rybosomów.
- Rozumienie organizacji rybosomów jest kluczowe dla poznania regulacji ekspresji genów.
- Ta metoda może być zastosowana do różnych organizmów, w tym drożdży i bakterii.
- Wiзуalna demonstracja jest niezbędna ze względu na złożoność obsługi próbek polisomalnych.
Cel badania
- Dostarczenie niezawodnego protokołu do oczyszczania i obrazowania poliribosomów mózgowych.
- Ułatwienie badań nad kontrolą translacji i ekspresją genów.
- Umożliwienie obrazowania w warunkach prawie fizjologicznych.
Stosowane metody
- Mikroskopia sił atomowych (AFM) do obrazowania.
- Oczyszczanie poliribosomów mózgowych na miki.
- Obrazowań bez ciężkiej obróbki pozakresowej lub rekonstrukcji 3D.
- Techniki obsługi do absorpcji próbki i mycia.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie poliribosomów z rozdzielczością nanoskalową.
- Identyfikacja rybosomów i nagich nici RNA w próbkach.
- Wgląd w organizację poliribosomów ssaków.
- Potencjalne zastosowania w badaniu kontroli translacji w różnych organizmach.
Wnioski
- Protokół zwiększa zrozumienie organizacji rybosomów w polisomach.
- Dostarcza cennego narzędzia dla badaczy zajmujących się ekspresją genów.
- Zastosowanie metody do różnych organizmów poszerza jej wpływ.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding polysome organization provides mechanistic insights into translational control, a critical layer of gene expression regulation relevant to target validation in neuroscience and metabolic disease programs. The ability to image polysomes in near-physiological conditions without fixation or labeling enables reproducible, quantitative analysis of ribosome dynamics, supporting early-stage hypothesis testing and biological de-risking. This approach offers a complementary, label-free method to assess translational states in disease-relevant systems, aiding in the prioritization of targets with strong mechanistic rationale.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of ribosome organization to interrogate translational hypotheses and clarify pathway-level effects of genetic or pharmacological perturbations.
- Operational Value: Provides a reproducible, label-free imaging readout that reduces variability associated with fixation or staining artifacts.
- Predictive Value: Supports assessment of translational state changes as a functional biomarker for target engagement and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative polysome imaging data suitable for high-content analysis of ribosome number and distribution.
- Reproducibility: Allows thousands of nanoscale-resolution images to be acquired under consistent conditions, enabling statistical robustness.
- Scalability: Compatible with fractionation workflows that can be adapted to multi-sample screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to brain tissue, enabling direct study of polysome organization in neurodegenerative and neuropsychiatric disease models.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to ex vivo brain systems, supporting mechanistic de-risking before in vivo validation.
- Cross-Species Utility: Can be extended to yeast, bacteria, and insects, allowing conservation studies and target validation across model organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis validation through mechanistic de-risking, providing biophysical data on translational machinery organization that complements genomic and proteomic approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking changes in polysome structure to translational control during gene expression rewiring.
- Analytics: Enables extraction of quantitative metrics such as ribosome count per polysome and spatial distribution, facilitating comparative analysis across conditions.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging capability for studying translational dynamics in diverse disease-relevant systems without reagent-dependent labeling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in translational control by providing direct nanoscale observation of polysome architecture.
- Operational Value: Eliminates need for fixation, labeling, or heavy post-processing, streamlining workflow and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by offering early, structure-function insights into target-mediated translational effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated translational mechanism in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polysome purification, density gradient fractionation, and AFM operation.
- Depends on access to ultracentrifugation, AFM instrumentation, and RNase-free buffer preparation.
- Necessitates standardized sample handling to ensure consistent deposition on mica and preservation of native polysome structure.
- Must account for tissue-specific variability in polysome yield and stability, particularly in post-mortem or frozen brain samples.
- Limited by the need for specialized training in sample preparation and AFM imaging techniques, as noted in the procedural demonstration requirement.
