Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie szczegółowego procesu dokładnego oczyszczania i osadzania polirybosomów mózgu na mice oraz uzyskanie tysięcy obrazów w rozdzielczości nanoskali bez konieczności ciężkiego przetwarzania końcowego lub analiz rekonstrukcji 3D. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie translacji i kontroli translacji, takie jak zrozumienie wpływu organizacji rybosomów w obrębie polisomów podczas zmiany ekspresji genów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie jest wymagane utrwalanie ani znakowanie próbki, a pomiary można przeprowadzać w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, aby łatwo zidentyfikować rybosomy i nagie stanowiska RNA.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w organizację polirybosomu ssaków, można ją również zastosować do innych mikroorganizmów, takich jak drożdże, bakterie i owady, a także do statusu obejmującego translacyjną kontrolę ekspresji genów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ obchodzenie się z próbką polisomalną w celu absorpcji miki i etapy mycia są dość trudne i wymagają umiejętności i doświadczenia w obsłudze. Procedurę zademonstrują Paola Bernabo i Lorenzo Lunelli.

Aby rozpocząć, zbierz i zamroź tkankę mózgową zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Następnie wyciągnij zamrożoną chusteczkę z zamrażarki i przynieś ją na ławkę. Umieść zamrożoną tkankę mózgową i ciekły azot w schłodzonym moździerzu i sproszkowaj go za pomocą tłuczka, aż utworzy się proszek.

Przenieś około 25 miligramów proszku mózgowego do zimnej probówki mikrowirówkowej i natychmiast dodaj 0,8 mililitra buforu do lizy. Pipetuj mieszaninę w górę i w dół 25 razy szybko, aby rozbić komórki. Następnie odwiruj probówkę o stężeniu 12 000 x g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby rozdrobnić resztki komórkowe.

Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut. Następnie odwiruj probówkę przez pięć minut, aby osadzać jądra i mitochondria. Następnie ostrożnie usuń jeden mililitr z wierzchu wcześniej przygotowanego gradientu sacharozy.

Nakładaj sacharozę kropla po kropli na supernatant z lizatu cytozolowego. Gdy próbka zostanie teraz załadowana na górę gradientu, ostrożnie opuść rurkę i rurkę przeciwwagi do kubełków wahadłowego wirnika kubełkowego. Odwirowywać gradient przez 100 minut.

Po ultraodwirowaniu pozostaw probówki w wiadrach na 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby gradient się ustabilizował. Następnie ostrożnie wyjmij probówkę z próbką i zamontuj ją na urządzeniu kolektorowym systemu frakcjonowania w gradionym gradieniu gęstości. Zbierz frakcje o wielkości jednego mililitra, monitorując absorbancję kwasów nukleinowych na głębokości 260 nanometrów za pomocą detektora światła widzialnego UV i umieść je na lodzie.

Następnie przygotuj 30-40 mikrolitrowych porcji interesujących frakcji i trzymaj je na lodzie. Jeśli próbki nie zostaną od razu wykorzystane, przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza i podejmij kroki w celu ograniczenia liczby cykli zamrażania i rozmrażania. Aby przygotować próbki do obrazowania AFM, najpierw przykryj umyty arkusz miki 200 mikrolitrami jednego milimolowego siarczanu niklu ii i inkubuj arkusz przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń roztwór, osusz powierzchnię sprężonym powietrzem i umieść szalkę Petriego na lodzie. Następnie delikatnie dodaj całą porcję z interesującej frakcji kropla po kropli na mikę. Używając końcówki o pojemności 100 lub 200 mikrolitrów, rozprowadź próbkę na całej powierzchni miki i inkubuj próbkę na lodzie przez trzy minuty.

Następnie przykryj arkusz miki kropla po kropli 200 mikrolitrami zimnego buforu AFM i inkubuj próbkę na lodzie przez godzinę. Utrzymywanie próbki w temperaturze 40 stopni i używanie zimnego buforu, który został przygotowany w wodzie wolnej od RNaz, jest ważne dla zachowania organizacji polirybosomów. Po inkubacji ostrożnie usunąć bufor i przemyć mikę trzy do czterech razy 200 mikrolitrami zimnego buforu AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy.

Następnie umyj mikę trzykrotnie zimnym roztworem myjącym i odcedź nadmiar wody z miki za pomocą papieru. Całkowite usunięcie sacharozy z próbek absorbentu ma kluczowe znaczenie teraz, gdy odcięto zarówno rybosom, jak i nagie RNA w polisomie. Pozostawić próbkę do wyschnięcia pod pokrywą chemiczną z częściowo otwartą górną częścią płytki Petriego.

Po dwóch godzinach zamknij szalkę Petriego. Próbka może być teraz przechowywana w temperaturze pokojowej. Przymocować przygotowaną próbkę do uchwytu próbki AFM za pomocą taśmy dwustronnej.

Następnie włożyć uchwyt na próbkę do stolika AFM zgodnie z instrukcjami producenta. Po kalibracji zbliżyć się do próbki, aż końcówka wspornika zatli się z powierzchnią. Wybierz obszar skanowania o wymiarach dwa na dwa mikrony, rozdzielczość co najmniej 512 x 512 pikseli, wybierz tryb odejmowania tła na żywo i wybierz skalę Z 20-25 nanometrów.

Następnie rozpocznij akwizycję obrazu. Sprawdź obraz, szukając obecności okrągłych obiektów charakteryzujących się wysokością od 10 do 15 nanometrów podczas pozyskiwania obrazów w powietrzu. Następnie dostosuj wartość zadaną i parametry sprzężenia zwrotnego, aż zostaną wyświetlone ostre obiekty.

Tło powinno wydawać się stosunkowo płaskie w dobrych próbkach z obiektami o wysokości od dwóch do czterech nanometrów. Gdy obraz wygląda dobrze, wykonaj kilka skanów dwa na dwa mikrony w różnych obszarach próbki. Po osadzeniu się alikwot sacharozy na mice, AFM dostarcza dokładnych opisów wielkości pojedynczych polisomów, które pojawiają się jako skupiska ciasno upakowanych rybosomów.

Bliższe przyjrzenie się jednemu z pików rybosomalnych za pomocą analizy przekroju poprzecznego ujawnia, że wysokość pików rybosomalnych wynosi około 14 nanometrów. Jest to zgodne z tym, co wcześniej zaobserwowano dla ludzkich rybosomów i polisomów po wysuszeniu na powietrzu. Na obrazie po prawej stronie użyto makra do identyfikacji lokalizacji rybosomu i oznaczenia każdego rybosomu czerwonym kółkiem.

Korzystając z tych informacji, można przeanalizować rozkład częstości liczby rybosomów na polisom. Ten eksperymentalny rozkład został wyposażony w krzywą Gaussa, która była wyśrodkowana na 5,8 rybosomów na polisom, z odchyleniem standardowym 1,3. Po opanowaniu, ta technika, od sproszkowania mózgu do pozyskiwania obrazów polirybosomów, może być wykonana w mniej niż osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przechowywaniu próbki na lodzie i stosowaniu zimnych do osadzania próbki na mice. Postępując zgodnie z tą procedurą i korzystając z wtyczki ImageJ programisty, która ma być dostępna w Twoim artykule, możesz dokładnie policzyć liczbę rybosomów na polisom. Po każdym opracowaniu, technika ta utoruje drogę do zrozumienia kinetyki tworzenia polisomów i identyfikacji zmian w organizacji polisomów oraz ich różnych warunków komórkowych lub tkankowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać tysiące obrazów polisomów w celu systematycznej analizy i badania ich organizacji.