Name: Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę mikroskopii sił atomowych do obrazowania polisosomów mózgu ssaków bez konieczności utrwalania próbek. Technika ta umożliwia badanie organizacji rybosomów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez projekt badawczy AXonomIX finansowany przez Provincia Autonoma di Trento, Włochy.

Praktyki stosowane do pozyskiwania tkanek myszy zostały zatwierdzone przez Organ Ochrony Zwierząt (OPBA) Uniwersytetu w Trydencie (Włochy), protokół nr 04-2015, zgodnie z art. 31 dekretu ustawodawczego nr 26/2014. Wszystkie myszy utrzymywano w Ośrodku Organizmów Modelowych Centrum Biologii Integracyjnej (CIBIO) Uniwersytetu w Trydencie we Włoszech.
Uwaga: Aby uniknąć degradacji RNA w próbkach, należy przygotować wszystkie przy użyciu wody uzdatnionej przez DEPC w celu zminimalizowania zanieczyszczenia RNazą.
1. Przygotowanie polisomów z całych mózgów
<ol>
	<li>Pobieranie tkanek mózgowych (15 min)
	<ol>
		<li>Eutanazja szczepu myszy typu dzikiego C57BL/6 z uduszeniem CO2 przez 5 minut36. Ostrożnie wypreparuj mózg z czaszki36, umieść tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieść ją w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatu (30 min)
	<ol>
		<li>Sproszkować całą tkankę mózgową za pomocą moździerza i tłuczka pod ciekłym azotem.</li>
		<li>Przenieść około 25 mg proszku do zimnej probówki do mikrowirówki i natychmiast (aby uniknąć rozmrożenia sproszkowanej tkanki) dodać 0,8 ml buforu do lizy (patrz Tabela 1) i rozbić komórkę poprzez pipetowanie w górę i w dół 25 razy szybko.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki i trzymać probówkę na lodzie przez 15 minut.</li>
		<li>Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia jąder i mitochondriów.</li>
		<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Supernatant należy przechowywać w temperaturze –80 °C maksymalnie przez 6 miesięcy lub zużyć natychmiast.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie gradientu sacharozy i odwirowanie (2 godziny i 30 minut)
	<ol>
		<li>Probówki ultrawirówek należy dokładnie umyć wodą wolną od RNaz (woda uzdatniona dietylowęglanem (woda DEPC) lub dostępna) i roztworem 3%H2O2/DEPC H2O.</li>
		<li>Umieścić probówki na lodzie i dodać 5,5 ml zimnego 50% roztworu sacharozy na dno każdej probówki (patrz Tabela 1 dla roztworów sacharozy). Ostrożnie dodawaj 15% roztwór sacharozy kropla po kropli, trzymając się blisko interfazy, aby zachować ostrą interfazę, aż probówka zostanie całkowicie wypełniona. Gdy rurka jest całkowicie napełniona, zamknij ją gumowym korkiem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>W chłodnym pomieszczeniu delikatnie ułóż rurki poziomo i utrzymuj je w tej pozycji przez 2 godziny. Po tym czasie powoli wyprostuj rurki z powrotem do pozycji pionowej i połóż je na lodzie. Gradienty są teraz gotowe do użycia. Alternatywnie, przygotuj 15-50% gradient sacharozy przy użyciu konwencjonalnego gradientu.</li>
		<li>W chłodni ostrożnie usunąć 1,0 ml z wierzchołka gradientu i nałożyć sacharozę kropla po kropli na lizat cytozolowy (tj. supernatant otrzymany w kroku 1.2).</li>
		<li>Ostrożnie opuść rury do kubełków wahliwego wirnika łyżki. Wirować gradienty przez 100 minut przy 180 000 x g w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki.   </li>
		<li>Po odwirowaniu pozostawić probówki w wiadrach na 20 minut w temperaturze 4 °C, aby gradienty się ustabilizowały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Frakcjonowanie w gradiencie sacharozy (2 godz.)
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij jedną rurkę ultrawirówki z wirnika ultrawirówki i zamontuj ją na urządzeniu kolektorowym systemu frakcjonowania w gradiencie gęstości. Zebrać frakcje o wielkości 1 ml, monitorując absorbancję przy długości fali 260 nm za pomocą detektora UV/VIS (patrz rysunek 1 na górnym panelu). Zebrane frakcje trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Przygotować porcje 30-40 μl interesujących frakcji, przechowywać je na lodzie przed przechowywaniem w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Nie należy używać podwielokrotności lub frakcji sacharozy, które przeszły więcej niż dwa cykle zamrażania i rozmrażania (patrz rysunek 1 dolny panel).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do mikroskopii sił atomowych (3 godz.)
<ol>
	<li>Za pomocą taśmy odklej arkusze miki.</li>
	<li>Umyj arkusze miki 3-4 razy wodą DEPC i umieść je na małej szalce Petriego. Następnie osusz powierzchnię za pomocą powietrza.</li>
	<li>Przykryj mikę 200 μl 1 mMNiSO4 i inkubuj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń roztwór niklu, a następnie osusz powierzchnię powietrzem. Wszystkie przyszłe kroki należy wykonać w temperaturze 4 °C, umieszczając płytkę Petriego wraz z miką na lodzie.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotność otrzymaną w ppkt 1.4.2 na lodzie i delikatnie dodać całą próbkę kropla po kropli na mikę. Za pomocą końcówki o pojemności 100-200 μl rozprowadź próbkę na całej powierzchni miki. Inkubować próbkę na lodzie przez 3 minuty.</li>
	<li>Przykryj arkusz miki kropla po kropli 200 μl zimnego buforu-AFM (patrz tabela 1) i inkubuj przez 1 godzinę na lodzie.</li>
	<li>Obrazowanie w cieczy
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij Buffer-AFM i umyj arkusze miki 3-4 razy 200 μl zimnego Buffer-AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy. Następnie umyj arkusze miki 3 razy zimnym roztworem myjącym (patrz Tabela 1), pozostawiając powierzchnię miki pokrytą kilkoma mikrolitrami roztworu.</li>
		<li>Przejdź do punktu 3 (Akwizycja obrazu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie w powietrzu
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij Buffer-AFM i umyj mikę 3-4 razy 200 μl zimnego Buffer-AFM, aby usunąć nadmiar sacharozy. Następnie umyj mikę 3 razy zimnym roztworem myjącym (patrz Tabela 1) i odcedź nadmiar wody za pomocą papieru.</li>
		<li>Pozostawić próbkę do wyschnięcia pod kapturem chemicznym z częściowo otwartą górną częścią szalki Petriego. Po 2 godzinach zamknij szalkę Petriego i przechowuj w temperaturze pokojowej. Zmierz próbkę po 2-3 godzinach, ponieważ są stabilne przez lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Akwizycja obrazu (15 min na obraz po stabilizacji termicznej)
Uwaga: Polisomy unieruchomione na mice można obrazować w powietrzu lub w cieczy w trybie prądu przemiennego.
<ol>
	<li>Przymocuj mikę do uchwytu na próbkę za pomocą taśmy dwustronnej.</li>
	<li>Włożyć uchwyt próbki do stolika AFM zgodnie ze wskazówkami producenta. Podczas obrazowania w cieczy, jeśli to możliwe, staraj się utrzymywać próbkę w temperaturze niższej niż 25 °C, aby zwiększyć stabilność polisomu w czasie.</li>
	<li>Wybierz wspornik odpowiedni do obrazowania AC i zamontuj go na uchwycie końcówki zgodnie ze wskazówkami producenta. W tym przypadku należy użyć wsporników o stałej sile w zakresie 2-20 N/m do obrazowania powietrznego i około 0,1 N/m do obrazowania cieczy.</li>
	<li>Wyreguluj plamkę lasera na wsporniku i wyzeruj sygnały detektora kwadrantowego.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią częstotliwość jazdy i napędzaj wspornik o amplitudzie 10-20 nm.</li>
	<li>Zbliż się do próbki, aż końcówka zetknie się z powierzchnią.</li>
	<li>Wybierz obszar skanowania 2x2 μm, uzyskaj obrazy o rozdzielczości co najmniej 512x512 pikseli (szerokość piksela < 4 nm), wybierz tryb odejmowania tła na żywo i skalę Z 20-25 nm.</li>
	<li>Sprawdź obraz pod kątem obecności okrągłych obiektów charakteryzujących się wysokością od 10 do 15 nm w przypadku pozyskiwania w powietrzu oraz 25 i 30 nm w stanie cieczy oraz szerokością w zakresie 25-30 nm. Dostosuj wartość zadaną i parametry sprzężenia zwrotnego, aż do wyświetlenia ostrych obiektów. W dobrych próbkach tło powinno wydawać się stosunkowo płaskie, z niektórymi obiektami o wysokości 2-4 nm (patrz rys. 2A i B).</li>
	<li>Jeśli obraz wygląda dobrze (jak wskazano w punkcie 3.8), należy wykonać kilka (co najmniej dziesięć) skanów o wymiarach 2x2 mikrony w różnych obszarach próbki.</li>
	<li>(Opcjonalnie). W razie potrzeby należy uzyskać obrazy wybranych polisomów w wysokiej rozdzielczości (patrz rysunek 2C).</li>
	<li>Zastosuj korekcje programowe (algorytmy odejmowania płaszczyzny i korekcji linia po linii), aby skorygować obrazy AFM, usuwając dowolne efekty przechyłu i dryfowania.</li>
</ol>
4. Analiza danych (30 min na obraz)
<ol>
	<li>Eksportuj obrazy w formacie ImageJ (opcjonalnie: zastosuj współczynnik skali) preferencyjnie przy użyciu formatu kompresji bezstratnej, np. formatu TIFF (patrz Rysunek 3A).</li>
	<li>Użyj zestawu narzędzi makr ImageJ RiboPick.ijm (do skopiowania do podkatalogu makr/zestawu narzędzi ImageJ), aby zliczyć rybosomy w polisomach (patrz rysunek 3B) i obliczyć właściwości statystyczne próbki (patrz rysunek 3C).
	<ol>
		<li>Rozpocznij ładowanie obrazu za pomocą narzędzia <Czytaj obraz> które inicjuje program.</li>
		<li>Wskaż centra rybosomów za pomocą standardowego narzędzia ImageJ <Zaznaczanie punktowe> (shift + lewy przycisk myszy umożliwia wielokrotny wybór rybosomów). Zaznacz wybrane rybosomy za pomocą narzędzia <Zaznacz rybosomy>. Współrzędne rybosomów pojawią się w niestandardowym oknie tekstowym.</li>
		<li>Dodać więcej rybosomów do tego samego polisomu, powtarzając procedurę wskazaną w ppkt 4.2.2.</li>
		<li>Usuń błędnie zaznaczone rybosomy za pomocą narzędzia <Cofnij ostatni wybór> (rozpoczyna usuwanie od ostatniego dodanego rybosomu do pierwszego — tylko w bieżącym polisomie).</li>
		<li>Po zakończeniu tworzenia polisomu użyj narzędzia <Nowy polisom>. Gdy numer polisomu jest dodawany jako nakładka do obrazu, okno tekstowe jest aktualizowane.</li>
		<li>Użyj opcji <Zapisz wyniki i zamknij> aby zapisać plik współrzędnych rybosomu (używane są domyślne jednostki obrazu) oraz obraz PNG, który podsumowuje wybrane rybosomy i polisomy. Oryginalny obraz zostanie zamknięty bez zapisywania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li>
<li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+of+bacterial+growth%3A+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li>
<li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400(2010).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220(2012).</li>
<li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+RNA%22%5BJournal%5D)">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li>
<li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li>
<li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6(2014).</li>
<li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li>
<li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li>
<li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li>
<li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis%3A+characterization+of+the+ergosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li>
<li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li>
<li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li>
<li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 Å resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li>
<li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 Å resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li>
<li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+%C3%85+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 Å resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li>
<li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li>
<li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li>
<li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294(2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly%28A%29-tail%3A+a+cryo+electron+tomography+study%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li>
<li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li>
<li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li>
<li>Brandt, F., Carlson, L. -A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li>
<li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li>
<li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li>
<li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li>
<li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li>
<li>Bernabò, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RiboAbacus%3A+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853(2015).</li>
<li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li>
<li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych w tym artykule i nie mają nic do ujawnienia.

Ponieważ udowodniono, że struktura DNA ma ogromne znaczenie dla opisania procesu transkrypcji, a organizacja chromatyny pogłębiła naszą wiedzę na temat transkrypcyjnej kontroli ekspresji genów, niezbędna jest analiza organizacji i struktury polisomów w celu poprawy prawdziwego zrozumienia translacji i jej regulacji.
Dzięki opisanemu protokołowi uzyskuje się optymalną gęstość polisomów delikatnie unieruchomionych na płaskiej powierzchni, odpowiednią do obrazowania AFM. Korzystając z tych warunk...

Synteza białka jest najbardziej energochłonnym procesem w komórkach1,2. W związku z tym nie jest zaskakujące, że obfitość białek jest głównie kontrolowana na poziomie translacyjnym, a nie transkrypcyjnym3,4,5. Polisom jest podstawowym składnikiem makromolekularnym, który przekształca informacje mRNA w funkcjonalne odczyty białkowe. Polisomy są do tej pory rozpoznawane jako kompleksy makromolekularne, w których zbiega się kilka kontroli translacyjnych6-13. Pomimo setek badań nad strukturą rybosomów14-16, szczegółowe informacje molekularne na temat dynamiki translacji i topologii polisomów spotkały się z ograniczonym zainteresowaniem. W związku z tym organizacja natywnego polisomalnego kompleksu rybonukleoproteinowego i jego potencjalny wpływ na translację są nadal dość niejasnymi kwestiami. Polisomy mogą ukrywać wciąż nieznane, uporządkowane i funkcjonalne organizacje, potencjalnie odzwierciedlając to, co nukleosomy i kontrole epigenetyczne reprezentowały dla pola transkrypcyjnego. Rzeczywiście, zbadanie tej intrygującej hipotezy wymaga dodatkowych badań i nowych podejść technicznych. W tej linii techniki strukturalne i mikroskopia sił atomowych mogą owocnie współpracować, aby odkryć nowe mechanizmy kontrolowania ekspresji genów, podobnie jak to osiągnięto w przypadku nukleosomu17,18.
Od czasu odkrycia rybosomu14-16, jego struktura została szczegółowo scharakteryzowana u prokariontów19,20, drożdży21, a ostatnio u człowieka22, dostarczając molekularnego opisu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek. Polisomy zostały początkowo rozpoznane na błonie retikulum endoplazmatycznego, tworząc typowe organizacje geometryczne 2D14. Jak wspomniano wcześniej, składanie polisomów nie było przedmiotem stałego zainteresowania jak struktura rybosomowa. W przeszłości polisomy były badane głównie za pomocą technik transmisyjnych opartych na EM. Dopiero od niedawna techniki cryo-EM umożliwiły rekonstrukcję 3D oczyszczonych polisomów z systemów translacji in vitro 23-26, ludzkich lizatów komórkowych27 lub w komórkach28. Techniki te dostarczyły bardziej szczegółowych informacji na temat organizacji rybosom-rybosom w polisomach23, 26-28 oraz wstępnego opisu molekularnego powierzchni kontaktowych sąsiednich rybosomów w polisomach kiełków pszenicy24. W związku z tym tomografia kriogeniczna EM pozwala na ujawnienie interakcji rybosom-rybosom ze szczegółami molekularnymi, ale jest obciążona obszernymi analizami post-processingu i rekonstrukcji, które wymagają dużych zasobów obliczeniowych do obsługi danych. Ponadto, aby uzyskać szczegóły molekularne interakcji rybosom-rybosom, wymagana jest mapa rybosomu o wysokiej rozdzielczości, a ten rodzaj rybosomu referencyjnego jest dostępny tylko dla kilku gatunków. Co ważne, tomografia krio-EM nie jest w stanie wykryć wolnego RNA. W związku z tym potrzebne są nowe techniki, aby w pełni zrozumieć organizację maszynerii tłumaczeniowej.
Oprócz cryo-EM, AFM jest również używany jako użyteczne narzędzie do bezpośredniego obrazowania polisomów u niższych eukariontów29-33 i ludzi27. W porównaniu z EM, AFM nie wymaga utrwalania ani etykietowania próbki. Ponadto pomiary mogą być przeprowadzane w warunkach zbliżonych do fizjologicznych i z unikalną możliwością jednoznacznej identyfikacji zarówno rybosomów, jak i nagich nici RNA27. Obrazowanie pojedynczych polisomów można przeprowadzić stosunkowo szybko, uzyskując tysiące obrazów w rozdzielczości nano przy niewielkim wysiłku związanym z przetwarzaniem końcowym w porównaniu z obszernymi i ciężkimi analizami końcowymi i rekonstrukcyjnymi wymaganymi przez mikroskopię krio-EM. Dzięki temu obsługa i analiza danych AFM nie wymaga drogich stacji roboczych i dużej mocy obliczeniowej. W związku z tym technika ta zbiera informacje o kształtach polisomalnych, cechach morfologicznych (takich jak wysokość, długość i szerokość), gęstości rybosomów, obecności wolnego RNA i liczbie rybosomów na polisom27 o wyższej przepustowości niż krio-EM. W ten sposób AFM stanowi potężne i uzupełniające podejście do technik EM do przedstawiania polisomów27.
Tutaj prezentujemy kompletny proces od oczyszczania do analizy danych, gdzie AFM jest stosowany do obrazowania i analizy polisomów mózgu myszy. Proponowany protokół koncentruje się na kwestiach oczyszczania i dokładnym osadzaniu polisomów na substratach miki, które są używane do obrazowania AFM. Oprócz konwencjonalnej analizy cząstek, którą można łatwo przeprowadzić za pomocą popularnego oprogramowania używanego przez społeczność AFM, przedstawiono wtyczkę ImageJ34 o nazwie RiboPick do zliczania liczby rybosomów na polisom27, 35.

<table><tbody><tr><td>Cykloheksymid</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>RiboLock RNAzy Inhibitor</td><td>Life technologie</td><td>EO-0381</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Przygotowanie mikrowirówki lizatu</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Przygotowanie lizatu</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Przygotowanie gradientu sacharozy</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Wirowanie gradientowe sacharozy</td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Wirowanie gradientowe sacharozy</td></tr><tr><td>Rurka poliallomerowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Wirowanie w gradiencie sacharozy</td></tr><tr><td>System frakcjonowania w gradionym gradiencie gęstości&nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Frakcjonowanie gradientu sacharozy</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Wizualizacja polisomów</td></tr></tbody></table>

przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Maszyneria translacyjna, tj. polisom lub polirybosom, jest jedną z największych i najbardziej skomplikowanych maszynerii cytoplazmatycznych w komórkach. Polisomy, utworzone przez rybosomy, mRNA, kilka białek i niekodujące RNA, reprezentują zintegrowane platformy, na których zachodzą kontrole translacyjne. Jednak, chociaż rybosom został szeroko zbadany, organizacja polisomów nadal nie jest w pełni zrozumiała. W związku z tym potrzeba wiele wysiłku, aby wyjaśnić organizację polisomów i wszelkie nowatorskie mechanizmy kontroli translacyjnej, które mogą być osadzone. Mikroskopia sił atomowych (AFM) to rodzaj mikroskopii z sondą skaningową, która umożliwia pozyskiwanie obrazów 3D w rozdzielczości nanoskali. W porównaniu z technikami mikroskopii elektronowej (EM), jedną z głównych zalet AFM jest to, że może ona uzyskiwać tysiące obrazów zarówno w powietrzu, jak i w roztworze, umożliwiając utrzymanie próbki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych bez konieczności barwienia i utrwalania. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół dokładnego oczyszczania polisomów z mózgu myszy i ich osadzania na substratach miki. Protokół ten umożliwia obrazowanie polisomów w powietrzu i cieczy za pomocą AFM oraz ich rekonstrukcję jako obiektów trójwymiarowych. Proponowana metoda, uzupełniająca mikroskopię krioelektronową (cryo-EM), może być wygodnie stosowana do systematycznej analizy polisomów i badania ich organizacji.

Profilowanie polisomalne w gradiencie sacharozy dla całego mózgu myszy
Możliwe jest oczyszczanie polisomów z lizatu komórkowego za pomocą profilowania polisomalnego, które oddziela makrocząsteczki zgodnie z ich masą i rozmiarem. W profilowaniu polisomalnym lizaty cytoplazmatyczne otrzymane z hodowli komórkowych lub tkanek, tak jak w niniejszym przykładzie, nanosi się na liniowy gradient sacharozy i poddaje ultra...

Chociaż struktura rybosomów została szczegółowo opisana, organizacja polisomów jest nadal niedostatecznie zbadana. Aby przezwyciężyć ten brak wiedzy, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół przygotowania do dokładnego obrazowania polisomów ssaków za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w powietrzu i cieczy.

Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie szczegółowego schematu dokładnego oczyszczania i osadzania polirybosomów mózgowych na mikach w celu uzyskania tysięcy obrazów o rozdzielczości nanometrycznej bez konieczności stosowania intensywnego post-processingu lub analizy rekonstrukcji 3D. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu translacji i kontroli translacyjnej, takie jak zrozumienie wpływu organizacji rybosomów w obrębie polisomów podczas reorganizacji ekspresji genów. Głównymi zaletami tej techniki są brak konieczności fiksacji lub znakowania próbek oraz możliwość przeprowadzania pomiarów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, co pozwala na łatwą identyfikację rybosomów i wolnych nici RNA.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat organizacji polirybosomów ssaków, można ją również zastosować w odniesieniu do innych mikroorganizmów, takich jak drożdże, bakterie i owady, a także w badaniu stanów obejmujących kontrolę translacyjną ekspresji genów. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie próbek polizomalnych do adsorpcji na miki oraz etapy płukania są dość skomplikowane i wymagają odpowiednich umi

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

W tym filmie demonstrujemy statyczną mikroskopię sił atomowych, aby zobrazować złożone nukleosomy. Ta technika obrazowania o wysokiej rozdzielczości pozwala na badanie struktury nukleosomów.

Statyczna mikroskopia sił atomowych w celu wizualizacji i scharakteryzowania złożonych nukleosomów

Źródło: Lunelli, L., et. al. Przyglądanie się polisomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych. J. Vis. exp.(2016). Ten film przedstawia obrazowanie polisomów przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Arkusz miki pokryty jonami niklu zakotwicza RNA z dołączonymi rybosomami. Próbka jest myta, suszona i umieszczana na stoliku mikroskopowym. Końcówka wspornikowa skanuje powierzchnię próbki, rejestrując ugięcia lasera w celu odwzorowania topologii. Oprogramowanie służy do korekcji zniekształceń i...

 Obrazowanie polisomów wyizolowanych z mózgu myszy za pomocą mikroskopii sił atomowych

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Metoda badania struktury fotoreceptora białkowego za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) jest opisana w tym artykule. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) ujawnia nienaruszone dimery białkowe na powierzchni miki.

Mikroskopia sił atomowych fotoreceptorów światła czerwonego przy użyciu ilościowego mapowania właściwości nanomechanicznych PeakForce

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Rozwój mózgu ssaków wymaga właściwej kontroli ekspresji genów na poziomie translacji. W tym miejscu opisujemy system profilowania polisomów z łatwą do złożenia platformą do tworzenia gradientu sacharozy i frakcjonowania w celu oceny stanu translacji mRNA w rozwijającym się mózgu.

Analiza translacji w rozwijającym się mózgu myszy przy użyciu profilowania polisomów

Ten protokół opisuje, jak wygenerować profil polisomowy bez użycia automatycznych kreatorów gradientów lub systemów frakcjonowania gradientów.

Profilowanie polisomów bez kreatorów gradientów i systemów frakcjonowania

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Poznaj metodę mikroskopii sił atomowych do obrazowania polisosomów mózgu ssaków bez konieczności utrwalania próbek. Technika ta umożliwia badanie organizacji rybosomów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Przyglądanie się polisosomom mózgu za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przeglądaj więcej filmów