Name: Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę obserwacji morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D. Technika ta pozwala na rejestrację ruchów łuków skrzelowych w czasie rzeczywistym u zarodków dzikiego typu i mutantów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Melissie Griffin i Jennie Rozacky za ich fachową opiekę nad rybami. PDM dziękuje EGN za pomoc w pisaniu, hojność i cierpliwość. Prace te były wspierane przez NIH/NIDCR R01DE020884 do JKE.

1. Hodowla zwierząt i zmutowane allele
<ol>
	<li>Hoduj i hoduj danio pręgowanego zgodnie z opisem21.</li>
	<li>Zmutowane allele danio pręgowanego użyte w tym badaniu to pdgfra b1059 16, smad5 b1100 22 i smob577 23. Źródłem tych szczepów danio pręgowanego jest ZIRC.</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozwiązań i wdrożeń
Uwaga: Wszystkie rozwiązania i narzędzia mogą być wykonane z wyprzedzeniem i przechowywane do wykorzystania w przyszłości.
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę zarodkową (EM) zgodnie z wcześniejszym opisem21.</li>
	<li>Przygotuj 4 g/l MS-222 (Trikaina). Rozpuścić 4 g fosforanu disodowego (Na2HPO4) w 450 ml sterylnej wody. Dodać 2 g MS-222 do roztworu. Dostosuj pH w zakresie 7,0-7,2. Dodaj sterylną wodę do całkowitej objętości 500 ml.</li>
	<li>Opcjonalnie: Przygotuj 4 g/l olejku goździkowego. Odważyć 0,2 g czystego olejku goździkowego w stożkowej tubie o pojemności 50 ml. Dodać EM do całkowitej objętości 50 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zrób 3% metylocelulozy. Doprowadzić 50 ml EM + 0,1 M HEPES do wrzenia. Zdjąć z ognia. Mieszać z 1,5 g metylocelulozy, aż roztwór będzie jednorodny. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zrób 0,2% agarozy. Dodaj 0,1 g agarozy do 50 ml EM. Doprowadź EM do wrzenia w kuchence mikrofalowej lub na płycie grzejnej i sprawdź, czy agaroza się rozpuściła. Porcjować na 500 μl objętości w probówkach do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze 4 °C. Uwaga: Objętości można regulować w zależności od potrzeb.</li>
	<li>Zrób pogrzebacze kapilarne. Umieść kroplę super kleju w kapilarnej probówce o średnicy wewnętrznej 0,9 mm. Włóż testową żyłkę monofilamentową o długości 4-5 cm i wadze 6 funtów do rurki kapilarnej tak, aby około 3-4 mm żyłki wystawało poza koniec rurki.</li>
	<li>Wykonaj dwa zmostkowane szkiełka nakrywkowe na próbkę. Klej Super-Glu szkło nakrywkowe 22 x 22-1 na każdym końcu szkła nakrywkowego 24 x 60-1, pozostawiając wolny środek. Dla zarodków w wieku poniżej jednego dnia należy wykonać pojedyncze (1 małe szkło nakrywkowe na końcu), podwójne (2 małe szkła nakrywkowe ułożone jeden na drugim na końcu) dla zarodków w wieku od jednego do czterech dni lub potrójne (3 małe szkła nakrywkowe na jednym drugim na końcu) dla zarodków w wieku pięciu dni lub starszych.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml smarem wysokopróżniowym. Uwaga: Smar próżniowy służy jako uszczelniacz, aby zapobiec odwodnieniu próbek przez długi czas i ma niski potencjał toksyczności w porównaniu z bardziej lotnymi uszczelniaczami.</li>
</ol>
3. Montaż zarodków danio pręgowanego do mikroskopii konfokalnej (patrz rysunek 1)
<ol>
	<li>Przygotuj podłoże znieczulające. Rozpuść podwielokrotność 0,2% agarozy w kuchence mikrofalowej w 20-sekundowych odstępach, aż stanie się całkowicie płynna. Wymieszaj 8 μl MS-222 ze 192 μl 0,2% agarozy lub 5 μl 4 g/l olejku goździkowego ze 195 μl 0,2% agarozy. Przechowywać w bloku grzewczym o temperaturze 42 °C. Uwaga: Długa ekspozycja na MS-222 powoduje silniejsze opóźnienia rozwojowe niż olejek goździkowy u embrionalnego danio pręgowanego24.</li>
	<li>W razie potrzeby: Ręcznie dechorionować niewyklute zarodki transgeniczne, które należy przeanalizować tuż przed analizą. Za pomocą kleszczy powoli rozerwij kosmówkę, aż zarodek zostanie uwolniony.</li>
	<li>Znieczulić zarodki danio pręgowanego. Dodać 1 ml bulionu MS-222 o stężeniu 4 g/l do 24 ml pożywki dla zarodków. Alternatywnie dodaj 390 μl 4 g/l olejku goździkowego do 24 ml wody rybnej24. Uwaga: Olejek goździkowy działa powoli, więc wykonaj ten krok co najmniej 15-20 minut przed mikroskopią poklatkową.</li>
	<li>Umieść kroplę smaru próżniowego wokół środkowej przestrzeni skierowanego do góry zmostkowanego szkiełka nakrywkowego. Powoli wypchnij smar próżniowy ze strzykawki, tworząc gładką, ciągłą kulkę, która przylega do i wewnątrz mostków i krawędzi szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Rozprowadź okrąg z 4% metylocelulozy na środku zmostkowanego szkiełka nakrywkowego za pomocą drewnianego aplikatora.</li>
	<li>Przenieś zarodek, który ma być zobrazowany. Po znieczuleniu zarodka należy go umieścić w szklanej pipecie. Trzymaj pipetę pionowo pionowo, aby zarodek opadł na dno płynu w pipecie. Włożyć pipetę do roztworu agarozy i pozwolić, aby zarodek wpadł do agarozy. Nie wylewaj płynu.</li>
	<li>Umieść próbkę. Narysuj trochę roztworu agarozy i zarodek do pipety. Wydalić zarodek w kropli roztworu agarozy na wierzchu metylocelulozy. Użyj pogrzebacza kapilarnego, aby wepchnąć zarodek w dół na metylocelulozę i ustawić zarodek zgodnie z potrzebami do obrazowania.</li>
	<li>Zapieczętuj próbkę.
	<ol>
		<li>Umieść jedno zmostkowane szkiełko nakrywkowe na zamontowanym, skierowanym w dół. Zastosuj równomierny nacisk po obu stronach szkiełek nakrywkowych ułożonych warstwowo, aż mostki zetkną się bezpośrednio, a kropla agarozy uszczelni się z obiema szkiełkami nakrywkowymi. Sprawdź, czy zarodek jest prawidłowo zorientowany.</li>
		<li>Przetrzyj drewnianym aplikatorem szkło, aby wygładzić pęknięcia i szczeliny w kulce tłuszczu próżniowego. Zetrzyj nadmiar tłuszczu z krawędzi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne transgenicznych zarodków danio pręgowanego
(Ten protokół został zoptymalizowany dla mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 710 przy użyciu oprogramowania do obrazowania ZEN i może być zmodyfikowany do użytku z innymi systemami.)
<ol>
	<li>Aktywuj ekwipunek. Włącz mikroskop konfokalny i wszelkie zewnętrzne urządzenia laserowe. Włącz komputer podłączony do mikroskopu konfokalnego. Otwórz oprogramowanie do obrazowania konfokalnego i wybierz "Start System", aby aktywować elementy sterujące akwizycją obrazu.</li>
	<li>Przygotuj podgrzaną scenę. Opuścić platformę stopniową mikroskopu konfokalnego i przesunąć soczewki obiektywu z pozycji. Zastąp domyślny stage elektronicznym podgrzewanym stage. Włącz sterownik dla podgrzewanego stage i ustaw temperaturę na 29.5 °C.</li>
	<li>Ustaw próbkę w polu view. Umieść zamontowany preparat na stoliku. Przesuń soczewkę obiektywu 20X na miejsce i podnieś platformę pomostową. Aktywuj emiter światła widzialnego i spójrz przez okulary. Wyśrodkuj głowę zarodka w polu view.</li>
	<li>Zdefiniuj ustawienia eksperymentu.
	<ol>
		<li>Aktywuj kanały fluorescencyjne, wybierając długość fali fluorescencji, która ma być wykrywana, i wybierz tabele wyszukiwania kolorów (LUT) dla każdego kanału. W razie potrzeby użyj ręcznych elementów sterujących w oprogramowaniu, aby włączyć wymagane lasery (np. 561 nm dla zapytania ofertowego). Dla każdego kanału fluorescencji ustaw intensywność lasera na 10,0, a napięcie fotopowielacza (HV lub wzmocnienie) w zakresie 600-700. Ustaw uśrednianie na 4, a głębię bitową na 16 bitów.</li>
		<li>Aktywuj moduły Z-stack i szeregi czasowe. Ustaw otwór na rozdzielczość Z 5 μm lub mniejszą, a interwał Z ustaw na sugerowaną optymalną odległość. 
		Uwaga: Ogólnie rzecz biorąc, rozdzielczość Z 5 μm pozwala na zebranie każdego obrazu stosu Z wystarczająco szybko, aby uzyskać "migawkę" zarodka w określonym punkcie czasowym, jednocześnie rozwiązując poszczególne komórki. Obniżenie średniego traktowania powoduje również skrócenie czasu przypadającego na obraz.</li>
		<li>Określ żądany odstęp czasu między obrazami (zwykle 10-20 minut) i całkowitą długość eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawianie informacji o położeniu.
	<ol>
		<li>Przełącz aparat w tryb na żywo. Dostosuj ostrość i zwiększ intensywność lasera, jeśli to konieczne, aby zobaczyć fluorescencję. W razie potrzeby ustaw zoom cyfrowy na 0,6, aby uzyskać szerszy widok.</li>
		<li>Ustaw scenę tak, aby wszystkie interesujące nas struktury były widoczne, a w polu widzenia było miejsce na wyrostek grzbietowo i przednio. Skoncentruj się przez zarodek na górnej i dolnej granicy fluorescencji. Ustaw pozycję pierwszego i ostatniego warstwy Z-stack na co najmniej 100 μm lub więcej poza tymi limitami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zoptymalizuj intensywność fluorescencji.
	<ol>
		<li>Ustaw wyświetlacz LUT na wskaźnik zasięgu. Struktury fluorescencyjne powinny być teraz białe, a reszta pola widzenia powinna być niebieska (brak wykrywania) lub.</li>
		<li>Zwiększ HV/gain do poziomu tuż poniżej miejsca, w którym pojawiają się nasycone (czerwone) piksele. W razie potrzeby dostosuj przesunięcie, aby nie została wykryta większość tła (niebieski). Uwaga: Mniejsza średnica otworu i zwiększona intensywność lasera poprawiają rozdzielczość obrazu, ale intensywność lasera musi być utrzymywana na niskim poziomie, aby zachować żywe tkanki. Zwiększona HV/wzmocnienie i średnica otworu (<5 μm) są generalnie preferowane niż zwiększona intensywność lasera.</li>
		<li>Utrzymuj średnicę otworka wystarczająco szeroka, aby zbierać obrazy w odpowiednim czasie, uśredniając zestawy do 4. Interwał Z powinien być zawsze ustawiony na sugerowaną optymalną odległość dla średnicy otworka. Wykonuj krótkie skany (uśrednianie = 1) z różnymi ustawieniami i używaj minimalnej intensywności lasera, która osiąga żądaną rozdzielczość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom eksperyment na żądany czas. Następnie usuń zarodek z podgrzanego etapu i powoli oddziel szkiełka nakrywkowe. Zanurzyć szkiełko nakrywkowe i zarodek w EM na szalce Petriego o średnicy 30 mm. Za pomocą szklanej pipety delikatnie zmyj zarodek z szkiełka nakrywkowego i usuń szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego. Umieść zarodek w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C, aby mógł się dalej rozwijać.</li>
	<li>Porównaj wzrost. Pod koniec eksperymentu należy wykonać indywidualne obrazy stosu Z zarodków rodzeństwa zamontowanych na agarozie, które były podobnie zaawansowane jak próbka na początku eksperymentu, ale były hodowane w EM w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>W razie potrzeby zmierz łuki gardłowe. Pomiary można wykonywać w niektórych pakietach oprogramowania konfokalnego. Znalezione tutaj pomiary zostały wykonane przy użyciu Fiji25 poprzez importowanie i projekcję Z plików .lsm poszczególnych klatek.</li>
</ol>

<ol><li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li>
<li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li>
<li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li>
<li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3(1996).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li>
<li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li>
<li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li>
<li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li>
<li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li>
<li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li>
<li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li>
<li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li>
<li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+A+%28pdgf-a%29+expression+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3B+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , (1993).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533(2013).</li>
<li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li>
<li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Poklatkowa mikroskopia konfokalna jest potężnym narzędziem do analizy rozwoju. Tutaj pokazujemy przydatność metody w badaniu morfogenezy łuku gardłowego u danio pręgowanego, które są zmutowane dla ważnych szlaków sygnałowych, przy użyciu transgenicznego, który znakuje komórki grzebienia nerwowego. Oprócz analiz na poziomie tkankowym analizy poklatkowe mają również zastosowanie do analiz w skali komórkowej28. Wiele szeroko stosowanych metod na danio pręgowanym można również włączyć do eksperymentów z mikroskopi...

Mornogeneza twarzoczaszki to złożony, wieloetapowy proces, który wymaga skoordynowanych interakcji między wieloma typami komórek. Większość szkieletu twarzoczaszki pochodzi z komórek grzebienia nerwowego, z których wiele musi migrować z grzbietowej cewy nerwowej do przejściowych struktur zwanych łukami gardłowymi1. Podobnie jak w przypadku wielu tkanek, morfogeneza szkieletu twarzoczaszki jest bardziej skomplikowana, niż można to zrozumieć na podstawie statycznych obrazów zarodków w określonych punktach rozwojowych. Chociaż jest to czasochłonne, mikroskopia poklatkowa in vivo zapewnia ciągły wgląd w rozwijające się komórki i tkanki zarodka. Każdy obraz w serii poklatkowej nadaje kontekst pozostałym i pomaga badaczowi przejść do wydedukowania, dlaczego zjawisko występuje, a nie do wydedukowania, co dzieje się w tym czasie.
Obrazowanie in vivo jest więc potężnym narzędziem opisowym dla eksperymentalnych podejść do dekonstrukcji ścieżek kierujących morfogenezą. Danio pręgowany Danio rerio jest popularnym modelem genetycznym rozwoju embrionalnego kręgowców i szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania morfogenezy in vivo. Nowoczesne, wygodne metody transgenezy i modyfikacji genomu szybko zwiększają liczbę narzędzi dostępnych dla badaczy danio pręgowanego. Narzędzia te udoskonalają i tak już sprawdzone metody manipulacji genetycznych i mikroskopii. Obrazowanie in vivo niemal każdej tkanki w niemal każdym pożądanym kontekście genetycznym jest bliższe rzeczywistości niż fantazji.
Ruchy morfogenetyczne łuków gardłowych są kierowane przez interakcje sygnalizacyjne między grzebieniem nerwowym a sąsiednim nabłonkiem, zarówno ektodermą, jak i endodermą. Istnieje wiele cząsteczek sygnałowych wyrażanych przez nabłonek, które są niezbędne do napędzania morfogenezy elementów szkieletowych twarzoczaszki. Wśród tych cząsteczek sygnałowych Sonic Hedgehog (Shh) jest krytycznie ważny dla rozwoju twarzoczaszki2-8. Shh jest wyrażany zarówno przez ektodermę jamy ustnej, jak i endodermę gardła2,6,9,10. Ekspresja Shh w endodermie reguluje ruchy morfogenetyczne łuków10, wzorzec grzebienia nerwowego w łukach10 i wzrost szkieletu twarzoczaszki11.
Sygnalizacja Bmp jest również krytycznie ważna dla rozwoju twarzoczaszki12 i może zmieniać morfogenezę łuków gardłowych. Sygnalizacja Bmp reguluje grzbietowo-brzuszny wzór grzebienia w obrębie łuków gardłowych13,14. Przerwanie smad5 u danio pręgowanego powoduje poważne wady podniebienia i niezdolność chrząstek Meckla do prawidłowego zrostu w linii środkowej15. Ponadto mutanty wykazują również redukcje i fuzje w elementach chrząstki brzusznej, z 2., 3., a czasem 4. elementami łuku gardłowego zrośniętymi w linii środkowej15. Fuzje te silnie sugerują, że sygnalizacja Bmp kieruje morfogenezą tych elementów gardła.
Sygnalizacja Pdgf jest niezbędna do rozwoju twarzoczaszki, ale ma nieznane role w morfogenezie łuku gardłowego. Zarówno myszy jak i danio pręgowane, mutanty Pdgfra mają głębokie rozszczepy środkowej części twarzoczaszki16-18. Przynajmniej u danio pręgowanego to rozszczepienie środkowej części twarzoczaszki jest spowodowane nieprawidłową migracją komórek grzebienia nerwowego16. Komórki grzebienia nerwowego nadal wyrażają pdgfra po wejściu do łuków gardłowych. Dodatkowo, ligandy Pdgf są wyrażane przez nabłonek twarzy i w obrębie łuków gardłowych16,19,20, dlatego sygnalizacja Pdgf może również odgrywać rolę w morfogenezie łuków gardłowych po migracji. Nie przeprowadzono jednak analiz morfogenezy łuków gardłowych u mutantów pdgfra.
Tutaj demonstrujemy in vivo mikroskopię konfokalną transgenicznego danio pręgowanego w stadium gardła i opisujemy morfogenezę łuków gardłowych w tym okresie. Ponadto wykazujemy zachowania tkanek, na które wpływają mutacje, które zakłócają szlaki sygnałowe Bmp, Pdgf i Shh.

<table><tbody><tr><td>6 lb Test żyłki monofilamentowej</td><td>Cortland Line Company</td><td>SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>Laser argonowy</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna, 100 mm, 0,9 mm ID</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr><tr><td>Olejek goździkowy</td><td>Hilltech Kanada, Inc.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator w suchej kąpieli izotemplowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Szkło osłonowe mikroskopu, 22 x 22-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu, 24 x 60-1</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4d

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Obrazowanie poklatkowe to technika, która pozwala na bezpośrednią obserwację procesu morfogenezy, czyli generowania kształtu. Ze względu na ich przejrzystość optyczną i podatność na manipulacje genetyczne, zarodek danio pręgowanego stał się popularnym organizmem modelowym, za pomocą którego przeprowadza się poklatkową analizę morfogenezy u żyjących zarodków. Obrazowanie konfokalne żywego zarodka danio pręgowanego wymaga, aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była trwale znakowana markerem fluorescencyjnym, takim jak transgen lub wstrzyknięty barwnik. Proces ten wymaga, aby zarodek został znieczulony i utrzymany na miejscu w taki sposób, aby zdrowy rozwój przebiegał normalnie. Parametry obrazowania muszą być ustawione tak, aby uwzględniały trójwymiarowy wzrost i równoważyły wymagania dotyczące rozdzielczości pojedynczych komórek, jednocześnie uzyskując szybkie migawki rozwoju. Nasze wyniki wskazują na zdolność do wykonywania długoterminowego obrazowania in vivo znakowanych fluorescencyjnie zarodków danio pręgowanego oraz do wykrywania różnych zachowań tkanek w grzebieniu nerwowym czaszki, które powodują nieprawidłowości twarzoczaszki. Opóźnienia rozwojowe spowodowane znieczuleniem i montażem są minimalne, a zarodki nie są uszkodzone przez ten proces. Zarodki zobrazowane w technice poklatkowej mogą zostać przeniesione na płynne podłoże, a następnie zobrazowane lub utrwalone w późniejszych etapach rozwoju. Dzięki rosnącej liczebności transgenicznych linii danio pręgowanego oraz dobrze scharakteryzowanym technikom mapowania losu i przeszczepiania, możliwe jest obrazowanie dowolnej pożądanej tkanki. W związku z tym poklatkowe obrazowanie in vivo łączy się z metodami genetycznymi danio pręgowanego, w tym analizami zmutowanych i mikroiniekcyjnych zarodków.

W embrionach typu dzikiego, po zasiedleniu przez populację grzebienia neuronalnego, łuki gardłowe wydłużają się wzdłuż osi przednio-tylnej oraz grzbietowo-brzusznej, przesuwając się jednocześnie w kierunku rostralnym (Movie 1). W 30. godzinie po zapłodnieniu (hpf) długość przednio-tylna pierwszego łuku gardłowego wynosi od 1,8 do 1,9 raza jego wysokość grzbietowo-brzuszna. Wydłużanie w osi grzbietowo-brzusznej postępuje stale, szybciej niż rozciąganie w osi przednio-tylnej aż do 36,5 hpf. Od tego momentu...

Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja i charakterystyka ruchów łuków gardzielowych w rozwijającej się głowie danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie zatopienie transgenicznego embrionu danio pręgowanego w anestetycznym żelu agarozowym. Drugim krokiem jest zamocowanie zatopionego w agarozie embrionu w kropli metylocelulozy na szkiełku mikroskopowym.Następnie zarodek zostaje zamknięty pomiędzy dwoma szkiełkami przedmiotowymi za pomocą smaru próżniowego. W końcowym etapie wykorzystuje się konfokalną mikroskopię poklatkową, aby wykazać różnice między danio pręgowanym typu dzikiego a mutantami oraz zobrazować ruchy morfogenetyczne łuków gardzielowych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do statycznych metod obrazowania jest możliwość rejestracji rozwoju łuków gardzielowych w czasie rzeczywistym, co pozwala badaczowi na bezpośrednią obserwację ruchów tkanek krytycznych dla morfogenezy.Aby przygotować mostkowane szkiełko nakrywkowe, przyklej za pomocą superglue szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 x 22 mm do każdego końca szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 60 mm, pozostawiając środek wolny. Dla embrionów młodszych niż jeden dzień przygotuj pojedyncze szkiełka.P

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u rybki Danio pręgowanej za pomocą mikroskopii konfokalnej 4D

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Wizualizacja danych eksperymentalnych stała się kluczowym elementem prezentacji wyników społeczności naukowej. Generowanie poklatkowych zapisów na żywo rosnących zarodków przyczynia się do lepszej prezentacji i zrozumienia złożonych procesów rozwojowych. Protokół ten jest przewodnikiem krok po kroku dotyczącym znakowania komórek poprzez fotokonwersję białka kaede u danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwoju twarzoczaszki w sox10: transgeniczna linia danio pręgowanego kaede przy użyciu poklatkowej mikroskopii konfokalnej

Organizacja komórkowa kości twarzoczaszki od dawna była przedmiotem hipotezy, ale nigdy nie została bezpośrednio zwizualizowana. Wielospektralne znakowanie komórek i obrazowanie na żywo in vivo umożliwiają wizualizację dynamicznego zachowania komórek w dolnej szczęce danio pręgowanego. Tutaj szczegółowo opisujemy protokół manipulowania transgenicznymi rybami Zebrabow i bezpośrednio obserwujemy interkalację komórek i zmiany morfologiczne chondrocytów w chrząstce Meckla.

Wizualizacja interkalacji chondrocytów i proliferacji kierunkowej za pomocą analizy komórek klonalnych Zebrabow w embrionalnej chrząstce Meckla

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisany tutaj protokół przedstawia prostą i łatwą do wykonania procedurę barwienia i preparowania chrząstek twarzoczaszki u 5-dniowej larwy danio pręgowanego. Może być używany do badania anatomii, kształtu i wielkości tych struktur w różnych warunkach rozwojowych.

Rozwarstwienie tkanek twarzoczaszki danio pręgowanego po zabarwieniu błękitem alcyjskim

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metodę obserwacji morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D. Technika ta pozwala na rejestrację ruchów łuków skrzelowych w czasie rzeczywistym u zarodków dzikiego typu i mutantów.

Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D

Przeglądaj więcej filmów