Analiza morfogenezy twarzoczaszki u danio pręgowanego przy użyciu mikroskopii konfokalnej 4D
30 stycznia 2014
Obrazowanie konfokalne w czasie jest potężną techniką przydatną do charakteryzowania rozwoju embrionalnego. W tym miejscu opisujemy metodologię i charakteryzujemy morfogenezę twarzoczaszki w zarodkach typu dzikiego, a także pdgfra, smad5 i zmutowanych smo
.Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja i scharakteryzowanie ruchów łuku gardłowego w rozwijającej się głowie danio pręgowanego. Osiąga się to poprzez uprzednie osadzenie transgenicznego zarodka danio pręgowanego w znieczulającym żelu akrylowym. Drugim krokiem jest zamontowanie zatopionego w agarozie zarodka w kropli metylocelulozy na szkiełku mikroskopowym.
Następnie zarodek jest zamykany między dwoma szkiełkami mikroskopowymi za pomocą smaru próżniowego. Ostatecznie poklatkowa mikroskopia konfokalna służy do pokazania różnic między dzikim i zmutowanym danio pręgowanym oraz ruchów morfogenetycznych łuków gardłowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami obrazowania statycznego jest to, że rejestruje ona rozwój łuku gardłowego w czasie rzeczywistym, umożliwiając badaczowi bezpośrednią obserwację ruchów tkanek, które mają kluczowe znaczenie dla morfogenezy.
Aby wykonać zmostkowane szkiełko nakrywkowe, super klej, szkło nakrywkowe A 22 na 22 na każdym końcu szkła nakrywkowego o wymiarach 24 na 60. Pozostawiając środek wolny. Zrób single dla zarodków w wieku krótszym niż jeden dzień.
Podwójne dla zarodków w wieku od jednego do czterech dni lub potrójne dla zarodków w wieku pięciu dni lub starszych. Dla każdej próbki użyj dwóch zmostkowanych szkiełek nakrywkowych. Teraz napełnij 10-mililitrową strzykawkę smarem o wysokiej próżni.
Przygotuj świeży środek znieczulający w 0,2% płynnym aras i utrzymuj w bloku grzewczym o temperaturze 42 stopni Celsjusza. Aby ręcznie usunąć powłokę, niewyklute zarodki transgeniczne powoli rozrywaj Corian, aż zarodek zostanie uwolniony. Teraz przenieś powlekane zarodki do czystej pożywki zawierającej MS 2 22 i estetyczne.
Aby przygotować zmostkowany szkiełko nakrywkowe, powoli wypchnij smar próżniowy ze strzykawki, tworząc gładką, ciągłą ścieg, która przylega do i wewnątrz mostków i krawędzi szkiełka nakrywkowego. Rozłóż okrąg z 4% metylocelulozy na środku mostu, aby pokryć poślizg. Po znieczuleniu zarodka należy go pobrać do szklanej pipety.
Trzymaj pipetę pionowo pionowo, aby zarodek opadł na dno płynu w pipecie. Następnie przenieś pipetę do roztworu agro i pozwól zarodkowi wpaść do aros bez wydalania płynu. Narysuj trochę roztworu agro i zarodek do pipety.
Następnie wydal zarodek w kropli roztworu aro. Na wierzchu metylocelulozy. Wepchnij zarodek w dół na metylocelulozę i ustaw zarodek zgodnie z potrzebami, aby obrazowanie zamknęło próbkę.
Umieść jedno zmostkowane szkiełko nakrywkowe na zamontowanym szkiełku skierowanym w dół. Zastosuj równomierny nacisk po obu stronach szkiełek nakrywkowych umieszczonych warstwowo, aż mostki zetkną się bezpośrednio, a agros upuści uszczelki na oba szkiełka nakrywkowe. Sprawdź, czy zarodek jest prawidłowo zorientowany.
Przetrzyj drewnianym aplikatorem szkło, aby wygładzić pęknięcia i szczeliny w prędkości smaru próżniowego. Zetrzyj nadmiar tłuszczu z krawędzi. Aktywuj mikroskop konfokalny i wszelkie zewnętrzne urządzenia laserowe.
Włącz również komputer podłączony do mikroskopu konfokalnego i wybierz system startowy oraz oprogramowanie do obrazowania konfokalnego. Następnie opuść platformę stopniową mikroskopu konfokalnego i przesuń soczewki obiektywu z pozycji. Zastąp domyślny stage elektronicznym podgrzewanym stage.
Włącz sterownik podgrzewanego stage i ustaw temperaturę na 29,5 stopnia Celsjusza. Umieść zamontowaną próbkę na podgrzewanym stoliku. Przesuń soczewkę obiektywu 20 x na miejsce i podnieś platformę pomostową.
Następnie aktywuj emiter światła widzialnego i wyśrodkuj głowę zarodka w polu view. Aby aktywować kanały fluorescencyjne, wybierz długość fali fluorescencji, która ma być wykrywana, i wybierz tabele wyszukiwania kolorów dla każdego kanału. Dla każdego kanału fluorescencji ustaw intensywność lasera na 10.0, a napięcie powielacza zdjęć w zakresie od 600 do 700.
Aby zmniejszyć tło i zwiększyć zbierane informacje fluorescencyjne, ustaw uśrednianie na dwa lub cztery, a głębię bitową na 16 bitów. Aktywuj moduły stosu ZS i szeregów czasowych. W razie potrzeby wyreguluj otwór.
Ustaw przedział czasu i czas trwania eksperymentu. Przełącz aparat w tryb na żywo. Dostosuj ostrość i w razie potrzeby zwiększ intensywność lasera.
Aby zobaczyć fluorescencję. Ustaw zoom cyfrowy na 0,6, aby uzyskać szerszy widok. W razie potrzeby.
Ustaw scenę w taki sposób, aby wszystkie interesujące nas struktury były widoczne, a w polu widzenia było miejsce na wzrost. Grzbietowo i z przodu skupiają się przez zarodek do górnej i dolnej granicy fluorescencji. Ustaw pozycję pierwszego i ostatniego plasterka Pocka na co najmniej 100 mikrometrów lub więcej poza tymi limitami.
Następnie ustaw tabelę przeglądową wyświetlania na wskaźniki zakresu, tak aby struktury fluorescencyjne wyglądały na odcień szarości, a reszta pola powinna być niebieska lub. W razie potrzeby zwiększ napięcie mnożnika zdjęć do poziomu tuż poniżej miejsca, w którym pojawiają się nasycone czerwone piksele. Jeśli struktury fluorescencyjne wydają się czerwone, zmniejsz intensywność lasera i/lub wzmocnienie, aż staną się odcieniem szarości.
W razie potrzeby dostosuj przesunięcie. Tak więc obszary poza próbką są niebieskie. Ustaw dla najmniejszej średnicy, która umożliwia zbieranie obrazów w odpowiednim czasie.
Interwał Z powinien być zawsze ustawiony na sugerowaną optymalną odległość dla średnicy otworka, wykonuj krótkie skany w celu przetestowania ustawień, zawsze używając najniższego możliwego natężenia lasera. Teraz uruchom eksperyment przez żądany okres czasu. Następnie wyjmij zarodek z podgrzanego etapu i powoli oddziel szkiełka nakrywkowe, zanurz pokrywę, poślizg i zarodek w nim na 30-milimetrowej szalce Petriego.
Za pomocą szklanej pipety delikatnie zmyj zarodek ze szkiełka nakrywkowego i usuń szkiełko nakrywkowe z szalki Petriego. Umieść zarodek w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, aby mógł się dalej rozwijać. Pod koniec eksperymentów zrób indywidualne zdjęcia Zacka zarodków rodzeństwa zamontowanych na agrosie, które były podobnie zaawansowane jak próbka na początku eksperymentów, ale zostały wyhodowane w inkubatorze EM i 28,5 stopnia Celsjusza.
W razie potrzeby zmierz łuki gardłowe za pomocą oprogramowania konfokalnego lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazowania u zarodków typu dzikiego. Po populacji grzebienia nerwowego łuki gardłowe wydłużają się wzdłuż przednich tylnych i grzbietowych brzusznych AE, poruszając się w kierunku rostralnym. Na jego przednim końcu pierwszy łuk gardłowy tworzy domeny szczękowe i żuchwowe oddzielone ektodermą jamy ustnej, kluczowe ruchy morfogenetyczne są znacznie zakłócone u wygładzonych mutantów.
W tym przypadku siódmy łuk gardłowy nie migruje i nie nakłada się na więcej łuków przednich w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu. Danio pręgowany SM pięć mutantów ma liczne wady czaszki twarzy. W tych statycznych obrazach konfokalnych.
Fuzje w domenach brzusznych drugiego i trzeciego łuku są widoczne po 32 godzinach od zapłodnienia. Za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej analizujemy morfogenezę łuków gardłowych. W Smad pięć zmutowanych mutacji łączy się między drugim i trzecim łukiem, pojawiając się najpierw po 32 godzinach od zapłodnienia.
Zgodne z analizą statyczną. Podczas gdy ekspresja członków rodziny PDGF sugeruje, że może być szeroko zaangażowana w morfogenezę łuku gardłowego, ruch tylnych łuków wydaje się normalny. U mutantów P-D-G-F-R-A to morfogeneza pierwszego łuku gardłowego wydaje się specyficznie zaburzona.
Procedura ta jest podatna na inne powszechnie stosowane techniki danio pręgowanego, takie jak wstrzykiwanie morfo lub generowanie mozaik genetycznych. Analizy poklatkowe pozwalają na bezpośrednią analizę konsekwencji tych manipulacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać obrazowanie poklatkowe in vivo transgenicznych zarodków danio pręgowanego poprzez odpowiednie znieczulenie i montaż próbek oraz ustawienie idealnych parametrów dla mikroskopii konfokalnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodologię obrazowania konfokalnego w odstępach czasu (time-lapse) w celu charakterystyki morfogenezy kraniofacjalnej u zarodków danio przebraniego. Technika ta umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym ruchów łuków gardzielowych, co pozwala na poznanie różnic między zarodkami typu dzikiego a mutantami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia rozwojowa
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Obrazowanie konfokalne w trybie time-lapse jest potężnym narzędziem w biologii rozwoju.
- Zrozumienie morfogenezy kraniofacjalnej ma kluczowe znaczenie dla poznania zaburzeń rozwojowych.
- Danio prążkowany stanowi doskonały organizm modelowy do badania rozwoju embrionalnego.
- Szczepy mutantów mogą ujawnić genetyczne podstawy zmian morfologicznych.
Cel badania
- Obserwacja i charakterystyka ruchów łuków gardzielowych u danio przebrany.
- Porównanie ruchów morfogenetycznych między embrionami typu dzikiego a mutantami.
- Pogłębienie wiedzy na temat rozwoju kraniofacjalnego.
Zastosowane metody
- Zatopienie transgenicznych embrionów zebrafish w anestetycznym żelu Acrost.
- Montowanie embrionów w metylocelulozie na szkiełkach mikroskopowych.
- Uszczelnianie embrionów pomiędzy szkiełkami mikroskopowymi za pomocą smaru próżniowego.
- Wykorzystanie mikroskopii konfokalnej time-lapse do obrazowania w czasie rzeczywistym.
Główne wyniki
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym rejestruje kluczowe ruchy tkanek podczas rozwoju.
- Różnice w rozwoju łuków gardzielowych są obserwowane między zarodkami typu dzikiego a mutantami.
- Technika ta dostarcza wglądu w dynamikę morfogenezy kraniofacialnej.
- Obrazowanie poklatkowe jest lepsze od metod statycznych w badaniu procesów rozwojowych.
Wnioski
- Obrazowanie konfokalne w trybie poklatkowym jest skuteczne w badaniu rozwoju zarodkowego.
- Metodykę tę można zastosować do różnych tło genetycznych u rybek zebrafish.
- Uzyskana wiedza może być pomocna w badaniach nad zaburzeniami rozwojowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie konfokalne w trybie time-lapse umożliwia bezpośrednią obserwację dynamicznych ruchów tkanek w żywych embrionach, dostarczając kluczowych informacji na temat procesów morfogenetycznych leżących u podstaw rozwoju kraniofacialnego. Podejście to wspiera walidację celu poprzez powiązanie perturbacji genetycznych z wynikami fenotypowymi w systemie istotnym dla danej choroby, co zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkrywania. Metodologia ta ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego, umożliwiając porównywanie w czasie rzeczywistym fenotypów typu dzikiego oraz mutantów, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac w ramach przedklinicznej oceny celu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację wpływu mutacji genetycznych na zaburzenia morfogenezy łuków gardzielowych u danio pręgowanego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną platformę do funkcjonalnej walidacji celów poprzez podłużne obrazowanie zachowania tkanek w obrębie czaszkowej grzebieni neuronowej.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez wykrywanie zróżnicowanych zachowań tkanek powodujących wady kraniofacjalne, łącząc genotyp z fenotypem.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów zależnej zmiennej w postaci wydłużenia łuków gardzielowych oraz ich przemieszczania się wzdłuż osi przednio-tylnej i grzbietowo-brzusznej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu poprzez zapewnienie spójności w mocowaniu embrionów, znieczuleniu oraz parametrach obrazowania we wszystkich warunkach eksperymentalnych.
- Skalowalność: Kompatybilność z rosnącą liczbą transgenicznych linii zebrafish, co wspiera wysokoprzepustowe przesiewanie embrionów mutantów oraz embrionów poddanych mikroiniekcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wykorzystanie systemu istotnego dla danej choroby do modelowania morfogenezy kraniofacialnej, w którym obserwacje u mutantów smoothened i SMAD5 odzwierciedlają mechanizmy ludzkich zaburzeń rozwojowych.
- Model przedkliniczny: Zarodki ryb danio służą jako system predykcyjny do oceny zaburzeń morfogenetycznych przed rozpoczęciem badań na ssakach.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Obrazowanie poklatkowe pozwala na wykrycie wczesnych wad fenotypowych, takich jak niepowodzenie migracji rostralnej siódmego łuku pharyngealnego w 48 hpf, co umożliwia redukcję ryzyka na wczesnym etapie.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – umożliwiając analizę w czasie rzeczywistym morfogenetycznych następstw manipulacji genetycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez bezpośrednią obserwację ruchów tkanek kluczowych dla morfogenezy w embrionach typu dzikiego oraz mutantach.
- Przesiewowanie: Zapewnia gotowość do analizy i wyniki ilościowe dzięki rejestracji time-lapse dynamiki łuków gardlowych w rozwijających się głowach danio pręgowanego.
- Analityka: Umożliwia pomiar wydłużenia i ruchu łuków gardlowych przy użyciu oprogramowania konfokalnego, dostarczając wyników statystycznych do porównywania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez analizę fenotypów mutantów, które odzwierciedlają ludzkie wady kraniofacjalne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można zastosować do różnych tła genetycznych oraz powszechnie stosowanych technik w badaniach nad danio pręgowanym, takich jak wstrzykiwanie morfolino.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w rozwoju kraniofacjalnym dzięki bezpośredniej obserwacji in vivo.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność poprzez zdefiniowane parametry przygotowania, montowania i obrazowania zarodków.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), umożliwiając wczesne wykrywanie zaburzeń morfogenetycznych i redukując ryzyko biologiczne na późniejszych etapach.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych z mierzalnymi efektami fenotypowymi w skalowalnym modelu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie embriologii rybek danio, obchodzenia się z organizmami transgenicznymi oraz obsługi mikroskopu konfokalnego.
- Metoda jest zależna od aparatury, w tym mikroskopu konfokalnego z możliwością wykonywania serii obrazów Z-stack i czasowych, stolika grzewczego oraz systemów laserowych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów znieczulania, mediów montażowych (agaroza, metyloceluloza) oraz technik uszczelniania (smar próżniowy, mostkowane szkiełka nakrywki) pomiędzy zespołami badawczymi.
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji w różnych systemach modelowych, szczególnie w zakresie dostosowania montażu embrionów w zależności od ich wieku (pojedyncze/podwójne/potrójne szkiełka mostkowane) oraz parametrów obrazowania dla danego stopnia rozwoju.
- Należy uwzględnić ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalne opóźnienia rozwojowe wynikające ze znieczulenia i montażu, choć w źródle opisano je jako minimalne.
