Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Ogólnym celem tej procedury jest lepsza wizualizacja barwionych, utrwalonych zarodków danio pręgowanego we wczesnych punktach rozwojowych. Osiąga się to poprzez pierwsze barwienie zarodka danio pręgowanego za pomocą domowego montażu w hybrydyzacji C dwa. Następnie wybiera się zarodek do płaskiego montażu i wykonuje się centralne nacięcie w żółtku Za pomocą pary drobnych kleszczy, a następnie za pomocą narzędzi do rzęs delikatnie zeskrobuje się i usuwa pozostałe granulki żółtka.

Na koniec zarodek jest umieszczany w glicerolu na szkiełku, aby umożliwić odpowiednie obrazowanie próbki. Ostatecznie, płaskie mocowanie pozwala na lepszą wizualizację barwionych zarodków z widoku grzbietowego poprzez usunięcie żółtka i umieszczenie zarodka w dwuwymiarowym preparatyce. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie nienaruszonych zarodków w młodszych stadiach rozwoju, jest to, że płaskie mocowanie usuwa worek żółtkowy, umożliwiając obejrzenie całego zarodka.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju, takie jak scharakteryzowanie domeny pola nerkowego przed płcią w zarodku. Ogólnie rzecz biorąc, osoby początkujące w tej metodzie zmagają się z tym, ponieważ technika ta wymaga delikatnego obchodzenia się z zarodkiem, a także dlatego, że nauczenie się odpowiedniej siły nacisku potrzebnej do usunięcia worka z żółtkiem może zająć trochę czasu. Tę procedurę zademonstruję ja, Zoe i Amanda, którzy jesteśmy doktorantami w laboratorium skrzydłowego.

Po pobraniu, utrwaleniu i wybarwieniu zarodków, zgodnie z protokołem tekstowym, należy wybrać zarodek do płaskiego montażu za pomocą jednego X-P-B-S-T. Przenieś zarodek na plastikową lub szklaną szalkę Petriego. Następnie, trzymając szalkę pod mikroskopem stereoskopowym, użyj cienkich kleszczy, aby zwinąć zarodek, tak aby uzyskać widok boczny z widocznymi końcami głowy i ogona.

Następnie użyj cienkich kleszczy, aby utrzymać zarodek stabilnie, a drugi zestaw wykonaj nacięcie w żółtku w miejscu centralnie umieszczonym między głową a ogonem zarodka. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków zgarnij żółtko z jamy komórek dębu. Użyj jednego X-P-B-S-T, aby wypłukać zabłąkane żółtko z zarodka, używając jednej lub dwóch kropli jednego XPBS.

Przenieś zarodek do płaskiego szkiełka podstawowego. Przeciągnij zarodek do krawędzi bufora tak, aby pozostał w płaskiej pozycji na szklanym szkiełku. Podczas zakotwiczania zarodka użyj narzędzia do rzęs, aby delikatnie zeskrobać powierzchnię brzuszną, aby usunąć granulki żółtka.

Jeśli roztwór PBST zostanie zaśmiecony nadmiarem żółtka lub zacznie parować, dodaj jedną lub dwie świeże krople i przeciągnij zarodek do tego świeżego bufora. Po zadowalającym usunięciu żółtka delikatnie przenieś zarodek z powrotem na szalkę Petriego PBST w celu ostatecznego płukania. Następnie przenieś zarodek na szalkę Petriego zawierającą 100% glicerol i inkubuj przez pięć minut.

Aby zamontować zarodek na szkiełku podstawowym, przenieś go do czystej szklanki. Wsuń jedną lub dwie krople 100% glicerolu i ustaw go brzuszną stroną żółtka skierowaną w stronę szkiełka podstawowego. Za pomocą narzędzia do rzęs przeciągnij zarodek do krawędzi kropli glicerolu tak, aby pozostał w płaskiej pozycji na szkiełku.

Jeśli oś zarodka jest zakrzywiona, użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie wykonać małe nacięcia w pozostałym żółtku, aby zmniejszyć napięcie, aby można było je ułożyć płasko. Na slajdzie. Umieść małe wgłębienia z plasteliny na czterech rogach szklanego szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 na 18.

Powoli umieść szkiełko nakrywkowe na zarodku, ustawiając je pod kątem, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza w glicerolu. Na koniec dodaj dodatkową kroplę 100% glicerolu z boku szkiełka nakrywkowego, aby wypełnić przestrzeń między szkłem i wyeliminować dryfowanie, użyj mikroskopu stereo lub złożonego, aby zobrazować pokazany tutaj. Zastosowano kombinację sond wraz z dwukolorowym życzeniem oznaczenia rozwijających się komórek progenitorowych nerek, które dają początek nerce, a zarodki zostały wcześnie zamontowane płasko.

Tak więc stadia roztoczy, przodkowie nerek są wyznaczeni we wzorze w kształcie litery U przez ekspresję PAX dwóch transkryptów A otaczających mezodermę parialną, która jednocześnie wyraża deltę C pokazaną na czerwono. Kiedy delta C została znakowana C za pomocą C crox 20, ujawniono poddomenę rostralną komórek progenitorowych nerek, która wyraża delta C analizując ekspresję PAX dwa a, SLC cztery A cztery, SLC 12 A trzy i S-M-Y-H-C jeden w 14. Tak więc stadium roztocza umożliwia mapowanie całej domeny progenitorowej nerki za pomocą PAX dwa A i ujawniło, że podzbiór komórek w poddomenie rostralnej wyrażał SLC cztery A cztery.

Nie pokrywało się to z poddomeną rozpieszczania komórek progenitorowych nerek, które wyrażały SLC 12 A trzy. Na tym rysunku zarodki z mutacjami w dehydrogenazie retinaldehydu Retin dwa gen wymagany do biosyntezy kwasu retinowego lub zarodki leczone inhibitorem DEAB i ALD H rozwinęły się ze zmniejszoną lub zniesioną ekspresją odpowiednio WT jeden A, co pokazuje, że dwukolorowe życzenie z preparatem flat mount jest cenne dla badania domen komórkowych podczas organogenezy. U danio pręgowanego z mutacjami genetycznymi lub gdy są chemicznie narażone na małe cząsteczki Po opanowaniu technika ta może zająć od 10 do 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja granic segmentów nerki. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak płasko zamontować zarodek poplamionego danio pręgowanego, aby lepiej uwidocznić pożądane struktury poprzez usunięcie żółtka.