Name: Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Naucz się techniki flat mount dla zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą WISH. Usunięcie żółtka umożliwia lepszą wizualizację struktur zarodka z widoku grzbietowego w badaniach biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze dla RAW z każdego z następujących: NIH przyznaje DK083512 K01, OD008470 DP2 i R01 DK100237; Nagroda grantowa March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar #5-FY12-75; pozyskanie funduszy z University of Notre Dame College of Science i Wydziału Nauk Biologicznych. Chcielibyśmy szczególnie podziękować Elizabeth i Michaelowi Gallagherom, a także całej rodzinie Gallagherów, która przekazała hojny dar na rzecz Uniwersytetu Notre Dame w celu wspierania badań nad komórkami macierzystymi. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji ani przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy pracownikom Wydziału Nauk Biologicznych za ich wsparcie oraz Centrum Badań nad Danio Pręgowanym w Notre Dame za ich wyjątkowe poświęcenie w opiece i dobrostanie naszej kolonii danio pręgowanego. Na koniec dziękujemy członkom naszego laboratorium badawczego za ich komentarze, dyskusje i spostrzeżenia na temat tej pracy, a także Marigold (Maripooka) i Zinnia Wingert za dostarczenie naturalnie zrzucanych kocich wąsów, aby stworzyć najdoskonalsze narzędzia do rzęs do naszych badań.

<ol><li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+use+of+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet+3%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+zebrafish%3A+swimming+in+potential+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+3rd+ed%22">The Zebrafish Book. 3rd ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+probe+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5036%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5037%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5038%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li>
<li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li>
<li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+details%3A+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li>
<li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li>
<li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc%2Ftfap2a+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W ostatnich latach danio pręgowany okazał się niezwykle cennym organizmem modelowym w całej społeczności naukowej. Danio pręgowany wykazuje znaczny stopień ochrony genetycznej w porównaniu z wyższymi kręgowcami, a zalety związane z ich anatomią, hodowlą i cyklem życiowym sprawiają, że gatunek ten jest bardzo podatny na analizy eksperymentalne. Co więcej, postęp w technikach molekularnych mających zastosowanie do danio pręgowanego jeszcze bardziej przyczynił się do wykorzystania tego organizmu modelowego w badaniach naukowych. Na przykład, stworzono wiele różnych transgenicznych linii danio pręgowanego, aby zbadać postęp choroby i odpowiedzieć na wiele podstawowych pytań, które leżą u podstaw kluczowych mechanizmów rozwoju, w tym organogenezy.
W związku z tym, w oparciu o dynamiczne wykorzystanie danio pręgowanego zarówno w badaniach nad chorobami, jak i rozwojem, metodologie znakowania komórek i kwantyfikacja sygnałów są kluczowym aspektem analiz danych. Podczas gdy metody wykorzystujące przeciwciała fluorescencyjne mogą być stosowane do wykrywania ekspresji białek u transgenicznego danio pręgowanego, naukowcy zazwyczaj polegają na standardowych procedurach, takich jak WISH12-16, aby zbadać czasoprzestrzenną lokalizację transkryptów genów w stałej, nietransgenicznej próbce danio pręgowanego. W rzeczywistości WISH jest jedną z najczęściej stosowanych technik w biologii i jest istotnym narzędziem używanym do charakteryzowania fenotypu mutacji genetycznych i chemicznych zaburzeń genetycznych. Niemniej jednak WISH wiąże się z wieloma potencjalnymi pułapkami i wyzwaniami. Aby potwierdzić swoistość antysensownej rybosondy, rybosondy sensacyjne mogą być używane jako kontrola do oceny swoistości wzorców barwienia antysensownej rybosondy. Podczas gdy sekcje 4 i 5 są przedstawione w kolejności etykietowania i wykrywania sondy znakowanej digoksygeniną, a następnie sondy znakowanej fluoresceiną, kolejność tę można odwrócić. Zazwyczaj słabsze sygnały (geny o niższych poziomach ekspresji) są najlepiej wykrywane za pomocą sond znakowanych digoksygeniną, a to barwienie rozwija się najpierw za pomocą fioletowego substratu, a następnie wykrywania i barwienia silniejszego sygnału (genu o większej ekspresji) za pomocą czerwonego substratu. Jeśli jednak mają być przeprowadzone reakcje dwukolorowe, zaleca się przetestowanie różnych kombinacji etykiet i substratów w celu znalezienia procedury, która jest najbardziej odpowiednia do zbierania i analizy danych. Ponadto czasy przewidziane na blokowanie, inkubację przeciwciał i płukanie podane w sekcjach 4-5 są dostosowane do zarodków młodszych niż 24 godziny po zapłodnieniu; Długie odstępy między tymi samymi krokami ze starszymi zarodkami mogą prowadzić do gromadzenia się soli na próbce. Obszerne wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów ze standardowym zarodkiem danio pręgowanego WISH zostały już udokumentowane w literaturze12-16. Prawdopodobnie najczęstszym dylematem jest wysokie tło. Zalecamy zwiększenie liczby prań MABT w kroku 4.7 do 15-20 prań w razie potrzeby, chociaż z naszego doświadczenia wynika, że dodanie "super-prania" MABT na noc daje znakomite rezultaty, gdy jest używane w połączeniu z 10 lub więcej krótkimi praniami MABT przed przejściem do kroku 4.8. Innym przykładem dylematu jest słaba infiltracja sondy, która może wystąpić w przypadku długich rybosond. Ścinanie rybosondy zgodnie z krokiem 3.6 poprzez hydrolizę alkaliczną może temu przeciwdziałać. Z naszego doświadczenia z młodymi próbkami wynika, że ścinanie sondą zazwyczaj nie jest wymagane. Należy jednak pamiętać, że parametry takie jak ten mogą być czynnikami przyczyniającymi się do wyniku eksperymentu WISH i sugerujemy zapoznanie się z tymi przydatnymi instrukcjami rozwiązywania problemów, które są już publicznie dostępne w społeczności, w razie potrzeby, aby udoskonalić parametry eksperymentalne dla WISH wewłasnych badaniach.
Oprócz tradycyjnych technik WISH12-16, stale pojawiają się postępy w metodologiach WISH i alternatywnych protokołach, które zostały sformułowane. Należą do nich nowe sposoby detekcji sygnałów, takie jak wykorzystanie fluorescencji17-19, po metody umożliwiające lokalizację mikroRNA20. Mimo to, pomimo wielu ulepszeń, które zostały wprowadzone do obecnych metod znakowania komórek, skuteczność tych procedur jest negowana, jeśli barwienia nie mogą być łatwo zobrazowane w próbce zainteresowania w pożądanym punkcie czasowym. To ograniczenie jest problematyczne dla badaczy, zwłaszcza gdy dotyczy wczesnych etapów embrionalnych ontogenezy danio pręgowanego, co może potencjalnie prowadzić do luk w naszym zrozumieniu różnych procesów rozwojowych, które pojawiają się w tym czasie. Podczas normalnego rozwoju danio pręgowanego woreczek żółtkowy będzie się stopniowo zmniejszał w miarę osiągania wieku11 lat. Dlatego w tych późniejszych stadiach rozwoju (>24 godziny po zapłodnieniu) barwienie WISH jest dość proste do analizy, ponieważ zarodek jest większy w porównaniu z przylegającym do niego woreczkiem żółtkowym. Nie dzieje się tak jednak od etapu pąka ogonowego do wczesnej somitogenezy (kiedy masa embrionalna jest umieszczona wokół żółtka), gdzie nieprzezroczysty woreczek żółtkowy może czasami zasłaniać wizualizację plamy. W związku z tym metoda płaskiego montażu została opracowana, aby pomóc złagodzić problemy związane z obrazowaniem i analizą danych związane z charakteryzacją wczesnych próbek zarodków danio pręgowanego (schematyzowane na rysunku 1 i rysunku 2) i jest szeroko stosowana od czasu systematycznego fenotypowania mutacji genetycznych wyizolowanych z pierwszych badań genetycznych na dużą skalę21.
Od czasu pojawienia się techniki montażu płaskiego analiza wczesnych etapów rozwojowych została znacznie ulepszona. Po usunięciu żółtka z zarodka możliwe jest ułożenie zarodka płasko na szkiełku podstawowym w pożądanej orientacji do obrazowania. Ta dwuwymiarowa pozycja umożliwia oglądanie całego zarodka jednocześnie, co eliminuje konieczność obracania próbki. Liczne tkanki znajdują się w szerokich domenach zarodka, takich jak prekursory tworzące krew i nerki. Ponadto może być konieczne porównanie kilku różnych rozwijających się tkanek w tym samym czasie. Płaskie mocowanie umożliwia badaczowi jednoczesne oglądanie całej domeny takich grup komórek, a tym samym może znacznie pomóc w kwantyfikacji, takiej jak pomiar powierzchni tkanki lub liczby komórek. Technika ta ostatecznie pomogła doprowadzić do wielu odkryć dotyczących wielu ważnych mechanizmów rozwojowych leżących u podstaw hematopoezy, neurogenezy i organogenezy. Tak więc, po opanowaniu, zastosowania tej prostej techniki dla badaczy są dość znaczące.
Na przykład w badaniu oceniającym wybór linii podczas hematopoezy, preparaty flat mount zarodków danio pręgowanego w 14 i 18 stadiach somitowych (ss) zastosowano w celu zilustrowania zmian, które zaszły we wzorcu ekspresji czynnika transkrypcyjnego palca cynkowego pu.1 między zarodkami typu dzikiego i zarodkami z wstrzykniętym morfolinem GATA1 22. Metoda ta umożliwiła wykrycie rozszerzonej domeny pu.1 w 18 ss, co wskazuje, że gata1 najprawdopodobniej reguluje ekspresję pu.1 w pośredniej masie komórkowej (ICM) w tym punkcie czasowym. Dodatkowe płasko osadzone zarodki barwione pod kątem różnych genów erytroidalnych, w tym gtpbp1 i epsiny, wykazały utratę ekspresji tych genów w mutantach vlt, które były gata1-/-. Dalsze analizy nie wykazały żadnych zmian w ekspresji genów erytoidowych, takich jak biklf i testhymin, o których wiadomo, że są niezależne od aktywności GATA. W związku z tym, w połączeniu z innymi wynikami eksperymentalnymi, ujawniono, że gata1 jest niezbędny w regulacji różnicowania komórek w linii mielo-erytroidalnej. W badaniu rozwoju grzebienia nerwowego, płaskie mocowania wykorzystano do zbadania ekspresji grzebienia w mutantach Mont Blanc (mobm610) w badaniu badającym role funkcji genu Mont Blanc i tfap2a 23. Po 10 i 20 ss ekspresja grzebienia została całkowicie zniesiona w głowie i zmniejszyła się w obszarze tułowia mutantów mob m610 w porównaniu z normalną ekspresją typu dzikiego, co ostatecznie pomogło tej grupie wyciągnąć wnioski na temat znaczenia regulacji Mont Blanc i TFAP2A podczas tworzenia grzebienia nerwowego. Dodatkowo, jeśli chodzi o organogenezę, płaskie mocowania umożliwiły odkrycie obecności odrębnych domen we wczesnym polu progenitorowym nerki podczas rozwoju zarodka nerki danio pręgowanego, znanej jako przednercze. Zarodek danio pręgowanego zapewnia konserwatywny, a jednocześnie anatomicznie prosty system do badania, w jaki sposób progenitorzy nerek dają początek jednostkom funkcjonalnym nefronów, które składają się na przednercze, proces znany jako nefrogeneza6,7 (ryc. 4). Analiza płaskiego montażu była przydatna do dokumentowania domen komórek progenitorowych nerek i analizowania wyników zmian w sygnalizacji RZS podczas wzorca przednercza6,7 (Figura 5), co było wcześniej nieznane. Podsumowując, przykłady te sugerują, że istnieje wiele szerokich zastosowań tego płaskiego protokołu montażu w badaniu różnych procesów, które zachodzą podczas normalnego rozwoju i stanów chorobowych.
Koncepcyjnie ta procedura montażu płaskiego jest ogólnie dość prosta. Jednak manipulacje i stopień finezji wymagany do opanowania tej metody mogą być dość trudne do opanowania przy braku wizualnej demonstracji. W związku z tym protokół ten został opracowany, aby umożliwić naukowcom, zwłaszcza tym, którzy są nowicjuszami w modelu danio pręgowanego, lepsze zrozumienie, jak wykonać tę technikę i podzielenie się naszymi poradami na temat odczynników, które mogą zoptymalizować postępowanie z tkankami. Mamy nadzieję, że ten protokół ostatecznie pozwoli innym członkom społeczności na udoskonalenie najbardziej idealnych warunków próbkowania, które zostaną wykorzystane do obrazowania premium, analizy danych i komunikowania swoich wyników w publikacjach. Ostatecznie powinno to umożliwić naukowcom pokonanie anatomicznych przeszkód u danio pręgowanego na wczesnym etapie embriogenezy, które mogą zaciemniać prezentację wyników eksperymentalnych, i rozwiązanie ich problemów dzięki zastosowaniu tej prostej, ale znaczącej techniki.

Danio rerio ryba pręgowany, stał się powszechnie używanym organizmem w badaniach nad biologią rozwojową. Danio pręgowany to tropikalny, słodkowodny gatunek kręgowców należący do rodziny karpiowatych (Cyprinidae). Danio pręgowany był pierwotnie wykorzystywany do badań środowiskowych w celu uzyskania informacji na temat zagrożeń związanych z potencjalnymi zanieczyszczeniami wody, ponieważ był łatwo dostępny, niedrogi i łatwy w utrzymaniu1. W ciągu ostatnich trzydziestu lat danio pręgowany stał się uznawany za genetycznie podatny system modelowy kręgowców z wielu powodów. Danio pręgowany wykazuje wysoki poziom ochrony anatomicznej i fizjologicznej z wyższymi kręgowcami, w tym ssakami2,3. Niedawna adnotacja sekwencji genomu ujawniła, że około 70% ludzkich genów ma co najmniej jeden odpowiednik danio pręgowanego4. Na przykład wiele genów ortologicznych, które odgrywają ważną rolę podczas rozwoju nerek, zostało zidentyfikowanych między tymi gatunkami5-7. Ten ogromny stopień ochrony w odniesieniu do biologii komórkowej i molekularnej umożliwił naukowcom stworzenie modeli dla szerokiego zakresu chorób człowieka u danio pręgowanego8, a danio pręgowany stał się cennym narzędziem do identyfikacji potencjalnych terapii lekowych przy użyciu chemicznych badań genetycznych9.
Ponadto, model danio pręgowanego nie tylko jest w stanie podsumować różnorodne złożone procesy rozwojowe i stany chorobowe, które są obserwowane u ludzi, ale kilka dodatkowych atrybutów również zwiększa jego atrakcyjność jako organizmu modelowego do badań embriologicznych. Danio pręgowany jest jajorodny i rozmnaża się poprzez tarło rozsiewane, co zapewnia naukowcom łatwy dostęp do zarodków od początku zapłodnienia10. Inne zalety to wielkość zarodka, przezroczystość i szybki, zewnętrzny rozwój10. Ponadto dorosłe rybki danio pręgowanego mają wysoką płodność i zazwyczaj wytwarzają stosunkowo duże rozmiary lęgów, które mogą wynosić od 200 do 500 tygodniowo, co ostatecznie umożliwia naukowcom łatwe przeprowadzanie eksperymentów o wysokiej przepustowości, takich jak badania chemiczne oparte na fenotypie9.
Mimo to, pomimo mnóstwa zalet, które wykazuje model danio pręgowanego, istnieją wyzwania związane z analizą i komunikacją wyników eksperymentalnych uzyskanych z wczesnych etapów rozwoju. W niektórych przypadkach wrodzona anatomia zarodka danio pręgowanego może przesłonić wizualizację danych. Po zapłodnieniu początkowa komórka ulega wielu zdarzeniom rozszczepienia w miarę postępu rozwoju11. Po gastrulacji oś embrionalna wyłania się na etapie pąka ogonowego (10 hpf) tak, że jest owinięta wokół żółtka11. W miarę dalszego rozwoju w okresie segmentacji, pień będzie rósł w masę, a także wydłużał się przez wydłużenie osiowe, tak że ogon wraz z częścią samego woreczka żółtkowego wystaje z centralnej masy żółtka11. Pomiędzy stadium pączka ogonowego a stadium 20 somitów (19 hpf), próby zaobserwowania określonych cech rozwojowych po zastosowaniu różnych protokołów barwienia, takich jak WISH, mogą być trudne zarówno do wizualizacji, jak i sfotografowania ze względu na geometrię zarodka i zmętnienie woreczka żółtkowego. Jednym ze sposobów na wyeliminowanie tych wyzwań jest usunięcie żółtka, a następnie spłaszczenie zarodka do dwuwymiarowej próbki, którą można analizować w prostszy sposób.
Poniższy protokół i zasoby wideo dostarczają przewodnika, jak skutecznie usunąć żółtko i płasko zaszczepić zarodek po utrwaleniu i barwieniu, korzystając z przykładu jedno- lub dwukolorowego barwienia WISH. WISH jest szeroko stosowaną techniką, która umożliwia wykrywanie określonych kwasów nukleinowych w zachowanych próbkach, a tym samym pozwala na wykrycie miejsca (miejsc) ekspresji genów w tkankach. Techniki WISH zostały obszernie opisane i mogą być wykonywane z różnymi kolorowymi podłożami, a także z fluorescencyjnymi systemami detekcji12-20. W tym miejscu przedstawiamy nasz zmodyfikowany protokół WISH stosowany w przypadku zarodków danio pręgowanego między etapem rozwoju zawiązka ogonowego a segmentacją. Alternatywne protokoły WISH są jednak kompatybilne z opisaną tutaj procedurą montażu płaskiego, jak wspomniano na początku poniższego protokołu. Ponadto, montaż płaski może być wykorzystany w połączeniu z dowolną liczbą istniejących technik wizualizacji, takich jak immunohistochemia całej góry lub etykiety śledzenia linii komórkowych, które nie są opisane w tym protokole. Ogólnie rzecz biorąc, technika płaskiego montażu może lepiej umożliwić lepszą analizę i prezentację danych uzyskanych z eksperymentów z najwcześniejszymi etapami rozwoju embrionalnego u danio pręgowanego.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 w wodzie destylowanej. Uzupełnij błękitem metylenowym (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) w celu zahamowania zanieczyszczeń.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>Rozcieńczyć 50 X E3 w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Sitko siatkowe do herbaty</td><td>English Tea Store</td><td>SKU #ASTR_KEN, MPN#1705</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do inkubacji zarodków</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek z płaskim dnem</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka szklana</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>0,1% detergent Tween-20 w 1x PBS, wytwarzany przez rozcieńczenie 10x PBS w wodzie destylowanej.</td></tr><tr><td>Tween-20 stock</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>Rozpuścić 4% PFA (w/v) w 1x PBS, doprowadzić do wrzenia na gorącej płycie w dygestorium. Schłodzić i zamrozić porcje do przechowywania w temperaturze -20 °C. Rozmrozić tuż przed użyciem i nie zamrażać ponownie zapasów.</td></tr><tr><td>Jednostka do sterylizacji filtrów</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>System filtracyjny 1 L, 0,45 &mu; m</td></tr><tr><td>CA MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Rozpuścić w wodzie destylowanej, aby uzyskać zapas proteinazy K (10 mg / ml) i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 & stopni C.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>50% formamid, 5x SSC, 0,1% Tween-20, 5 mg/ml RNA toruli drożdżowej, 50 &mu; g/&mu; l</td></tr><tr><td>Rybosonda znakowana heparyną DIG/FLU in vitro odczynniki reakcji transkrypcyjnej</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Zapoznaj się z instrukcjami producenta.</td></tr><tr><td>Polimeraza RNA SP6 Polimeraza</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T7 Polimeraza</td> Roche <td></td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza RNA T3</td><td>Inhibitor Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNazy 1</td><td>Inhibitor</td> Roche <td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNazy 1, 10x bufor DNazy 1</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Podwielokrotność 50 ml podwielokrotności 100% EtOH i 70% EtOH (rozcieńczone wodą o czystości cząsteczkowej) i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Woda destylowana klasy molekularnej</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>Thermo</td><td>51221073</td><td>Model 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Amerykański AB00600 bioanalityczny</td><td></td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formuła: W 1,5 l wody destylowanej wymieszaj 23,2 g kwasu maleinowego, 17,5 g NaCl, 55,0 g zasady Trisma, następnie dodaj 8 ml 1M Tris-HCl pH 9,5, a następnie napełnij do 2 L. Autoklaw.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB + 0,1% (v/v) Tween-20</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> blokowy <td>Robimy w 50 ml świeże porcje: 10 ml BSA (z 10% bulionu laboratoryjnego), 5 ml FCS (z bulionu) i 35 ml MABT. Zapisz nieużywany blok na 4 & stopni; C do stosowania jako roztwór przeciwciał. Uwaga: Rozmrozić zapasy BSA i FCS na poziomie 37 & deg; C&ndash; Jeśli rozmrozisz je w wyższej temperaturze, staną się gęstym żelem (nie używaj).</td></tr><tr><td>FCS (płodowa surowica cielęca)</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>porcji Aliquot w porcjach po 5 lub 10 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Amerykański</td><td>AB00448</td><td>Bioanalityczny</td><td>Przygotować 10% bulion rozcieńczony w MAB przez rozpuszczenie płatków BSA w temperaturze pokojowej z szybkim mieszaniem, a następnie przechowywać 10 ml podwielokrotności w temperaturze -20 stopni C. Nierozpuszczone płatki BSA przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-digoksygeninowe</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyfluoresceinowe</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>12-dołkowe naczynie barwiące</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr>Bufor <td></td><td></td><td>do wstępnego barwienia</td><td>100 mM Tris pH 9,5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,1% (v/v) Tween-20. Zawsze rób świeże: wytrąci się w ciągu kilku dni.</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący-fioletowy</td><td></td><td></td><td>Na każde potrzebne 10 ml: dodać 45 &#956; l z NBT i 35 &#956; BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).</td></tr><tr><td>Roztwór barwiący - czerwony</td><td></td><td></td><td>Na każde potrzebne 10 ml: dodać 31,5 &#956; l z INT i 35 &#956; BCIP do świeżego buforu do wstępnego barwienia (niestosowanego w próbkach zarodków).</td></tr><tr><td>Zapas NBT</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 &deg; C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 70% DMF, 30% wodzie.</td></tr><tr><td>INT zapas</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>Przechowywany w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 55 mg/ml w 70% DMF, 35% wodzie.</td></tr><tr><td>Kolba BCIP</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>Przechowywana w temperaturze -20 & deg; C; proszek rozcieńczony 50 mg/ml w 100% DMF.</td></tr><tr><td>DMF (dimetyloformaldehyd)</td>Amerykański <td>AB00450</td><td></td> <td>Bioanalityczny</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0,1 M glicyna, pH 2,2</td></tr><tr><td>Mała plastikowa szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pęseta Wzór #55</td></tr><tr><td>Narzędzie</td><td></td> do rzęs<td></td><td>Zbudowany poprzez przymocowanie odpowiedniej rzęsy do końcówki pipety (można użyć rozmiarów od P10 do P1000) za pomocą kleju superglue. Używamy naturalnie wypadającej ludzkiej rzęsy, naturalnie zrzucanych zwierzęcych wąsów lub żylastych włosów futrzanych lub rzęs naturalnych lub syntetycznych zakupionych w dziale kosmetycznym w sklepie farmaceutycznym lub detalicznym (bardzo długie rzęsy są najbardziej podatne na stabilne osadzenie na końcówce pipety). Końcówka pipety jest przymocowana do prostego pręta (o długości 8-10 cm), takiego jak uchwyt na igłę (np. , Fisher 08-965-A) w celu łatwej obsługi. Zobacz Rysunek 3 aby zobaczyć zdjęcia tych domowych narzędzi.</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modelina</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Można zastąpić inne produkty z plasteliny rzemieślniczej.</td></tr><tr><td>Uchwyt na prowadnice</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Taca kartonowa do przechowywania szkiełek na płasko.</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop złożony</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Zarodek danio pręgowanego jest teraz powszechnie używany do badań podstawowych i biomedycznych w celu zbadania genetycznej kontroli procesów rozwojowych i modelowania wad wrodzonych. W ciągu pierwszego dnia życia zarodek danio pręgowanego przechodzi przez wiele etapów rozwoju, w tym zapłodnienie, rozszczepienie, gastrulację, segmentację i organogenezę struktur takich jak nerki, serce i ośrodkowy układ nerwowy. Anatomia młodego zarodka danio pręgowanego stanowi kilka wyzwań dla wizualizacji i analizy tkanek zaangażowanych w wiele z tych zdarzeń, ponieważ zarodek rozwija się w połączeniu z okrągłą masą żółtka. Tak więc, w celu dokładnej analizy i obrazowania eksperymentalnych fenotypów w utrwalonych próbkach embrionalnych między zawiązkiem ogonowym a etapem 20 somitów (odpowiednio 10 i 19 godzin po zapłodnieniu (hpf), takich jak te barwione przy użyciu hybrydyzacji in situ (WISH), często pożądane jest usunięcie zarodka z kulki żółtkowej i umieszczenie go płasko na szkiełku podstawowym. Jednak wykonanie procedury montażu płaskiego może być żmudne. W związku z tym skuteczne i wydajne przygotowanie do montażu płaskiego jest znacznie ułatwione dzięki wizualnej demonstracji techniki preparacji, a także dzięki zastosowaniu odczynników, które pomagają w optymalnym obchodzeniu się z tkankami. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół WISH do jedno- lub dwukolorowego wykrywania ekspresji genów w zarodku danio pręgowanego i pokazujemy, w jaki sposób można przeprowadzić procedurę płaskiego montażu na tym przykładzie barwionej utrwalonej próbki. Ten płaski protokół montażu ma szerokie zastosowanie w badaniu wielu struktur embrionalnych, które pojawiają się podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego i może być stosowany w połączeniu z innymi metodami barwienia wykonywanymi na utrwalonych próbkach zarodków.

Procedura protokołu przygotowania preparatu płaskiego polega na przekształceniu zarodka danio pręgowanego z jego naturalnej anatomii, w której oś ciała jest owinięta wokół centralnie położonego żółtka, w preparat dwuwymiarowy (Rysunek 1A). Obrazowanie całego zarodka młodego danio pręgowanego jest ograniczone przez sposób, w jaki oś embrionalna owija się wokół żółtka. W rezultacie widoki boczne lub grzbietowe okazów zarodków barwionych metodą whole mount mogą uchwycić jedynie fragment osi lub przesłonić konkretne tkanki (Rysunek 1B). W porównaniu z tym, usunięcie żółtka i spłaszczenie zarodka umożliwia jednoczesną wizualizację całej osi embrionalnej (Rysunek 1B). Ograniczenia te zademonstrowano, badając zarodek barwiony metodą WISH, w którym zastosowano przeciwsensowne sondy ryboprobowe do wykrycia irx3b (kolor fioletowy), znakującego podzbiór progenitorów nerkowych zlokalizowanych sąsiadująco z somytami od 7 do 13, oraz myod1 (kolor czerwony), który znakuje somyty (Rysunek 1B). Pole progenitorów nerkowych irx3b+ jest przesłonięte w bocznym widoku całego preparatu, ponieważ transkrypty irx3b są liczne w ośrodkowym układzie nerwowym, co sprawia, że wizualizacja pola nerkowego pod kątem bocznym jest praktycznie niemożliwa; ponadto pole progenitorów nerkowych irx3b+ jest widoczne tylko częściowo, gdy zarodek zostanie obrócony do widoku grzbietowego, ponieważ pole to jest owinięte wokół żółtka (Rysunek 1B). Jednakże widok grzbietowy tego samego zarodka po przygotowaniu preparatu płaskiego umożliwia prostą analizę całego pola progenitorów nerkowych irx3b+ w relacji do somytów wzdłuż tułowia i innych struktur embrionalnych (Rysunek 1B). W ten sposób skomplikowane domeny przestrzenne mogą zostać idealnie udokumentowane za pomocą tej metody.
Pomyślne przeprowadzenie procedury preparatów płaskich (flat mount) składa się z kilku kluczowych etapów. Aby zastosować tę technikę, w pierwszej kolejności należy oddzielić worek żółtkowy od właściwego zarodka (Rysunek 2A), co można osiągnąć za pomocą precyzyjnych narzędzi, takich jak pęseta anatomiczna, podczas obserwacji zarodka pod stereomikroskopem. Po wstępnym usunięciu worka żółtkowego wykorzystuje się cienkie narzędzie z rzęsy, aby zeskrobać ziarna żółtka, które pozostały przyczepione do zarodka (Rysunek 2B). Usunięcie pozostałych ziaren żółtka ułatwia wizualizację tkanek zarodkowych. Na koniec zarodek pozbawiony żółtka jest manipulowany w celu stabilnego umieszczenia go na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 2C), co umożliwia obserwację i pomaga w dokumentacji próbki przy użyciu oprogramowania do obrazowania oraz kamery przymocowanej do mikroskopu. Narzędzia z rzęs są urządzeniami domowej roboty, które można wykonać, przyklejając odpowiednią rzęsę do końcówki pipety za pomocą superglue; w razie potrzeby można je zamontować na uchwycie (Rysunek 3A, tabela z materiałami). Można pozyskać różne rodzaje rzęs, aby stworzyć narzędzia o nieco innych charakterystykach pod kątem długości i zwężenia (Rysunek 3B), zależnie od preferencji użytkownika, które pojawią się podczas eksperymentowania z procedurą preparatów płaskich. Przykłady próbek rzęs obejmują naturalnie wypadłe ludzkie rzęsy, naturalnie wypadłe sztywne włosy lub wibrysy zwierzęce, a także syntetyczne rodzaje rzęs dostępnych w handlu w działach kosmetycznych.
Obszar lokalny otaczający i zawierający próbkę(i) umieszczone na szkiełku przedmiotowym (Rysunek 4A) może zostać zobrazowany w celu przeprowadzenia analizy o wysokiej rozdzielczości. Wykorzystano kombinację sond do znakowania rozwijających się progenitorów nerkowych, z których powstaje nerka w zarodku typu dzikiego we wczesnych stadiach rozwoju, za pomocą dwukolorowego WISH, a następnie wykonano preparaty typu flat mount w celu obejrzenia próbek (Rysunek 4B, 4C). Podczas wczesnych stadiów somytowych progenitorzy nerkowi są wyznaczeni w kształcie litery U przez ekspresję transkryptytów pax2a (fioletowy), otaczających mezodermę paraksjalną, która jednocześnie wykazuje ekspresję delta C (dlc) (czerwony) (lewa kolumna, Rysunek 4B)6,7. W porównaniu, gdy transkrypty dlc wykryto przy użyciu fioletowego substratu i znakowano w połączeniu z markerem tylnego mózgu krox20 (czerwony), zwizualizowano rostralny poddomenę progenitorów nerkowych wykazującą ekspresję dlc (prawa kolumna, Rysunek 4B), co odnotowano wcześniej6,7. Preparaty typu flat mount mogą być analogicznie wykorzystywane do badania późniejszych stadiów somitogenezy. W stadium 14 somytów przeanalizowano ekspresję markerów nerkowych pax2a, slc4a4 i slc12a3 (fioletowy) wraz z smyhc1 (czerwony), który znakuje somity (Rysunek 4C). Kombinacje te umożliwiają mapowanie całej domeny progenitorów nerkowych za pomocą pax2a, wykazując jednocześnie, że podzbiór komórek w rostralnej poddomenie wykazuje ekspresję slc4a4a i jest odróżniony od niepokrywającej się z nim kaudalnej poddomeny progenitorów nerkowych wykazującej ekspresję slc12a3.
Dwukolorowy WISH oraz przygotowanie preparatu w płaskiej montażu są również cenne w badaniu domen komórkowych podczas organogenezy u danio pręgowanych z mutacjami genetycznymi lub innymi zaburzeniami wynikającymi z ekspozycji środowiskowej na małe cząsteczki6,7 (Rycina 5). Mutanty nls i lib danio pręgowanego posiadają mutacje w genie dehydrogenazy aldehydowej 1a2 (aldh1a2, wcześniej znanym jako raldh2), który koduje enzym niezbędny do biosyntezy kwasu retinowego (RA). RA jest kluczowy dla prawidłowego rozwoju wielu typów komórek nerkowych, w tym dla tworzenia podocytów, które budują filtr krwi w embrionalnej nerce, znanym jako kłębuszek6,7. WISH przeprowadzono w celu oznakowania progenitorów podocytów za pomocą wt1a równolegle z wyznaczeniem rozwijających się somytów za pomocą smyhc1 oraz tylnego mózgu za pomocą krox20 w embrionach typu dzikiego, embrionach mutantów nls, embrionach mutantów lib oraz embrionach traktowanych chemicznym inhibitorem enzymu aldh, DEAB (Rycina 5). Embriony z niedoborem ekspresji aldh1a2 wykazały zredukowaną ekspresję wt1a w porównaniu z embrionami typu dzikiego, natomiast embriony traktowane DEAB wykazały zniesienie transkrypcji wt1a (Rycina 5, prawa kolumna). Podsumowując, te reprezentatywne wyniki pokazują, jak technika płaskiego montażu może być wykorzystana do precyzyjnej analizy i dokumentowania różnic anatomicznych we wczesnym embrionie, a tym samym wdrażana w wartościowych badaniach rozwojowych.
<img alt="Proces usuwania żółtka z zarodka; widok boczny całego preparatu oraz widok grzbietowy preparatu płaskiego; schemat stadiów somitycznych." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd przygotowania preparatu płaskiego dla zarodków ryb zebrafish. A) Procedura przygotowania preparatu płaskiego umożliwia jednoczesny wgląd w tkanki wzdłuż osi embrionalnej, ponieważ centralna masa żółtka zostaje usunięta, a zarodek stabilnie ułożony na płaskiej powierzchni. B) Obrazy zarodka barwionego metodą WISH w widoku bocznym i grzbietowym, a następnie po wykonaniu preparacji płaskiej. Zarodek został zabarwiony sondami antysensownymi w celu wykrycia transkryptów genów kodujących irx3b (fioletowy) oraz myod1 (czerwony).
<img alt="Schematyka preparowania zarodka Drosophila; precyzyjna pęseta, narzędzie do rzęs, modelina na szkiełku przedmiotowym." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat procedury przygotowania preparatu płaskiego dla zarodków danio pręgowanego. A) W pierwszej kolejności z zarodka usuwa się główną masę żółtka, następnie (B) z powierzchni brzusznej precyzyjnie usuwa się pozostałe granulki żółtka, a po przemyciu zarodek zostaje (C) zamocowany stroną grzbietową do góry na szkiełku przedmiotowym w celu analizy wizualnej i/lub dokumentacji fotograficznej.
<img alt="Narzędzia mikrochirurgiczne do precyzyjnej dyssekcji ze skalą pomiarową; szczegółowy widok końcówek igieł." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zdjęcia przykładowych narzędzi z rzęs w porównaniu z precyzyjną pęsetą. A) Własnoręcznie wykonane narzędzia z rzęs zostały sfotografowane obok standardowej pary precyzyjnej pęsety, umieszczonych sąsiadująco z linijką metryczną w celu zapewnienia punktu odniesienia. B) Powiększony widok narzędzi z rzęs obok precyzyjnej pęsety, z milimetrową skalą odniesienia widoczną u góry obrazu. Pokazano dwa różne narzędzia z rzęs; pojedyncza gwiazdka (*) oznacza rzęsę uzyskaną z naturalnie wypadłej ludzkiej rzęsy, a podwójna gwiazdka (**) oznacza rzęsę uzyskaną z naturalnie wypadłego wąsa kota, przyciętą w celu uzyskania nieco tępego końca. W każdym przypadku rzęsa została przełożona przez końcówkę pipety i przymocowana kilkoma warstwami superkleju, aby stopniowo stworzyć trwałe uszczelnienie stabilizujące/zakotwiczające rzęsę w pipecie przymocowanej do urządzenia manipulacyjnego.
<img alt="Rozwój zarodka danio pręgowanego; analiza ekspresji genów; schemat histologiczny; markery pax2a/dlc." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Charakterystyka zmian rozwojowych w polu progenitorów nerkowych w zarodku danio pręgowanego typu dzikiego. A) Schemat preparatu wskazujący obszar obrazowany w celu analizy w (B, C). B) Zarodki typu dzikiego na etapie 1, 3 i 5 somytów zostały poddane dwukolorowej hybrydyzacji in situ (WISH), aby ocenić skład pola progenitorów nerkowych, z których powstaje nerka embrionalna, czylipronefros. (Lewa kolumna) Transkrypty kodujące czynnik transkrypcyjny pax2a (zbarwione na fioletowo) wyznaczają kilka populacji w zarodku, w tym pole progenitorów nerkowych wyłaniające się z mezodermy pośredniej. Transkrypty kodujące ligand Notch dlc wyznaczają somyty powstające z mezodermy paraksjalnej (zbarwione na czerwono). (Prawa kolumna) Podczas badania ekspresji transkryptów dlc (zbarwione na fioletowo) oraz markera rombomerów tylnego mózgu krox20 (zbarwione na czerwono) w tych samych zarodkach, ekspresję dlc można zaobserwować w rostralnej poddomenie progenitorów nerkowych położonej sąsiadująco z somytami 1-5, która była przesłonięta podczas wspólnego barwienia dlc z pax2a. C) Zarodki typu dzikiego na etapie 14 somytów zostały poddane podwójnemu lub potrójnemu barwieniu z kombinacją markera nerkowego (fioletowy), markera somytów smyhc1 (czerwony) oraz markera rombomerów tylnego mózgu krox20 (również czerwony). (Górny panel) Na tym etapie transkrypty pax2a nadal wyznaczają progenitorów nerkowych. (Środkowy i dolny panel) W obrębie terytorium progenitorów nerkowych rostralna poddomena jest wyznaczona przez slc4a4, a transkrypty kodujące slc12a3 wyznaczają poddomenę kaudalną.
<img alt="Schemat zarodka rybki zebrafish, porównanie ekspresji genów: wt1a, smyhc1, krox20 w typie dzikim i mutantach." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Wykorzystanie preparatów rozplanowanych (flat mounted) do charakterystyki fenotypów wywołanych mutacjami genetycznymi lub chemicznymi perturbacjami genetycznymi modulującymi biosyntezę kwasu retinowego.Wzorzec ekspresji WISH na etapie 15 somitów dla wt1a (fioletowy) i smyhc1/krox20 (czerwony) porównano pomiędzy typami dzikimi a zarodkami z niedoborami produkcji kwasu retinowego (RA) wynikającymi z defektów dehydrogenazy aldehydowej 1a2 (mutacje nls i lib) lub chemicznej inhibicji aktywności dehydrogenazy retinaldehydowej za pomocą diethylaminobenzaldehydu (DEAB). Redukcja produkcji RA w mutancie lib jest nieco silniejsza niż w nls, tak że zarodki lib wykazują nieco słabsze barwienie transkryptów wt1a niż zarodki mutanty nls na podobnym etapie rozwoju, podczas gdy traktowanie typów dzikich DEAB wiąże się z całkowitym zniesieniem ekspresji wt1a.

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest lepsza wizualizacja barwionych, utrwalonych embrionów ryby danio na wczesnych etapach rozwoju. Osiąga się to poprzez wstępne barwienie embrionu ryby danio z wykorzystaniem metody home mount w C two hybridization. Następnie wybiera się embrion do preparacji typu flat mount i za pomocą precyzyjnej pęsety wykonuje się nacięcie centralne w żółtku, a następnie przy użyciu narzędzi typu lash tools delikatnie zdrapuje się i usuwa pozostałe ziarna żółtka.Na koniec zarodek montuje się w glicerolu na szkiełku przedmiotowym, aby umożliwić odpowiednie obrazowanie preparatu. Ostatecznie, montaż płaski pozwala na lepszą wizualizację barwionych zarodków w rzucie grzbietowym poprzez usunięcie żółtka i ustawienie zarodka w preparacie dwuwymiarowym. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak obrazowanie nienaruszonych zarodków na wcześniejszych etapach rozwoju, jest to, że montaż płaski usuwa worek żółtkowy, co umożliwia obejrzenie całego zarodka.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak charakterystyka domeny przedpłciowego pola nerkowego w zarodku. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ technika ta wymaga delikatnego obchodzenia się z zarodkiem, a wyczucie odpowiedniej siły nacisku niezbędnej do usunięcia pęcherzyka żółtkowego może wymagać czasu. Procedurę tę zademonstrują ja, Zoe oraz Amanda, doktoranci w laboratorium Wingera.Po zebraniu, utrwaleniu i barwieniu embrionów zgodnie z protokołem tekstowym, należy wybrać embrion do montażu na płasko za pomocą jednej pęsety X-P-B-S-T. Przenieś embrion do plastikowej lub szklanej szalki Petriego. Następnie, umieściwszy szalkę pod stereomikroskopem, użyj precyzyjnej pęsety, aby obrócić embrion tak, by uzyskać widok boczny z widocznymi końcami głowy i ogona.Następnie za pomocą precyzyjnej pęsety unieruchom zarodek, a drugą pęsetą wykonaj nacięcie w żółtku w miejscu położonym centralnie między głową a ogonem zarodka. Następnie precyzyjną pęsetą usuń żółtko z jamki komórki żółtkowej. Użyj jednej pipety X-P-B-S-T, aby wypłukać resztki żółtka z zarodka, stosując jedną lub dwie krople XPBS.Przenieś embrion na płaskie szkiełko przedmiotowe. Przesuń embrion do krawędzi buforu tak, aby pozostał w płaskiej pozycji przy szkiełku. Podczas stabilizacji embrionu użyj narzędzia typu lash, aby delikatnie zeskrobać powierzchnię brzuszną w celu usunięcia ziarn żółtka.Jeśli roztwór PBST zostanie zanieczyszczony nadmiarem żółtka lub zacznie parować, należy dodać jedną lub dwie świeże krople i przeciągnąć zarodek do tego świeżego buforu. Po zadowalającym usunięciu żółtka należy ostrożnie przenieść zarodek z powrotem do szalki Petriego z PBST w celu końcowego płukania. Następnie należy przenieść zarodek do szalki Petriego zawierającej 100% glicerolu i inkubować przez pięć minut.Aby zamocować embrion na szkiełku przedmiotowym, przenieś go na czyste szkiełko. Nanieś jedną lub dwie krople 100% glicerolu i ułóż embrion stroną brzuszną z żółtkiem skierowaną w stronę szkiełka. Używając narzędzia z rzęsy, przesuń embrion do krawędzi kropli glicerolu tak, aby pozostał w płaskiej pozycji przy szkiełku.Jeśli oś embrionalna jest zakrzywiona, należy użyć pęsety precyzyjnej, aby delikatnie wykonać niewielkie nacięcia w pozostałym żółtku w celu zmniejszenia napięcia, co umożliwi płaskie ułożenie embrionu na szkiełku. Na czterech rogach szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 na 18 mm należy umieścić małe grudki plasteliny.Powoli nałóż szkiełko nakrywkę na embrion, ustawiając je pod kątem, aby zminimalizować liczbę pęcherzyków powietrza w glicerolu. Na koniec dodaj dodatkową kroplę 100% glicerolu z boku szkiełka nakrywki, aby wypełnić przestrzeń między szkłami i wyeliminować dryfowanie; do obrazowania przedstawionego tutaj użyj mikroskopu stereoskopowego lub biologicznego. Do znakowania rozwijających się progenitorów nerkowych, z których powstaje nerka, zastosowano kombinację sond wraz z dwiema kolorami, a embriony poddano montowaniu na płasko wczesnym etapie.W stadium 14 somit progenitorów nerkowych wyznaczone są w kształcie litery U poprzez ekspresję transkryptów PAX2a, które otaczają mezodermę pośrednią jednocześnie wykazującą ekspresję delta C, zaznaczoną na czerwono. Po jednoczesnym znakowaniu delta C oraz C-crox20 ujawniono rostralną poddomenę progenitorów nerkowych wykazującą ekspresję delta C. Analiza ekspresji PAX2a, SLC4A4, SLC12A3 oraz SMYH C1 w stadium 14 somit umożliwiła zmapowanie całej domeny progenitorów nerkowych za pomocą PAX2a oraz wykazała, że podzbiór komórek w poddomenie rostralnej wykazuje ekspresję SLC4A4.Nie pokrywało się to z poddomeną coddle progenitorów nerkowych, które wykazywały ekspresję SLC 12 A 3. Na tej rycinie zarodki z mutacjami w genie retinaldehydydehydrogenazy 2, niezbędnym do biosyntezy kwasu retinowego, lub zarodki traktowane DEAB (inhibitorem ALDH), rozwijały się z odpowiednio zredukowaną lub zniesioną ekspresją WT 1 A, co dowodzi, że metoda preparacji flat mount jest wartościowa w badaniu domen komórkowych podczas organogenezy u rybek zebrafish z mutacjami genetycznymi lub po chemicznej ekspozycji na małe cząsteczki. Po opanowaniu technika ta zajmuje od 10 do 15 minut, jeśli jest prawidłowo wykonywana.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. o położenie granic segmentów nerki. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować preparat płaski z zabarwionego zarodka zebrafisha, aby lepiej zwizualizować pożądane struktury poprzez usunięcie żółtka.

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie do montażu płaskiego do obserwacji i analizy zabarwionych przez całość hybrydyzacji in situ zarodków rybki labiryntowej

Hybrydyzacja in situ w preparatach całych jest jedną z najszerzej stosowanych technik w biologii rozwoju. Przedstawiamy tutaj protokół podwójnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości, służący do analizy precyzyjnego wzorca ekspresji pojedynczego genu oraz określania nakładania się domen ekspresji dwóch genów. Włączyliśmy barwienie jąder jodkiem propidyny w celu uwydatnienia organizacji tkanki.

Wysokorozdzielcza podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w całych embrionach ryby danio-ostrobłysku

Ten artykuł opisuje metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania. Metoda ta jest opłacalna i łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowy montaż agaru: przygotowanie żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu

Ten film opisuje krok po kroku instrukcje dotyczące montażu żywych zarodków danio pręgowanego na 6-dołkowej płytce przy użyciu niskotopliwej agarozy. Zapewnia również proces pozyskiwania obrazów żywych zarodków i analizowania ich za pomocą oprogramowania.

Montaż agarowy: podstawowa metoda montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długotrwałego obrazowania

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Naucz się techniki flat mount dla zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą WISH. Usunięcie żółtka umożliwia lepszą wizualizację struktur zarodka z widoku grzbietowego w badaniach biologii rozwoju.

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Przeglądaj więcej filmów