Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne
10 czerwca 2016
Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena kurczliwości komórek mezenchymalnych, które przeszły in vitro nabłonkowe przejście mezenchymalne wywołane cytokinami zapalnymi lub EMT. Ten mezenchymalny jest odmianą podstawowej funkcji komórek po EMT indukowaną zapalnymi odpowiedziami immunologicznymi, takimi jak idiopatyczne zwłóknienie płuc lub przebudowa dróg oddechowych w ciężkiej astmie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga specjalnych urządzeń i wykazuje wysoką zawartość W procesie montażu wezmą udział absolwenci Hideyuki Takeshima i Kosuke Makita z mojego laboratorium.
Zacznij od przemycia kultury ludzkich komórek nabłonka płuc A-549 za pomocą pięciu do dziesięciu mililetów PBS. Następnie odłącz przylegające komórki za pomocą dwóch mililetów trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po trzech minutach przenieść zawiesinę komórkową do stożkowych probówek zawierających pożywkę do hodowli komórkowych i odwirować komórki w wirówce.
Ponownie zawiesić osady w dwóch mililetach pożywki do hodowli komórkowych, zachowując małą elokwatę do liczenia. Następnie wysiewaj 0,5 do 1 razy 10 do 6 komórek w dziesięciu mililetach pożywki na dziesięciocentymetrową szalkę z polisterenu i inkubuj kultury komórkowe przez 24 godziny. W celu indukcji EMT, następnego dnia należy potraktować komórki 10 mikrolitrami TGF beta 1 i TNF alfa i zwrócić płytki do inkubatora na kolejne 48 godzin.
Czwartego dnia umyj kultury indukowane przez emt pięcioma do dziesięciu mililetami pbs, a następnie odłącz komórki trypsyną-EDTA, jak właśnie pokazano. Następnie odwiruj zawiesiny komórkowe w DMEM uzupełnionym inhibitorem tryspsyny i ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach pbs. Następnie policz komórki i dodaj świeżo przygotowane podłoże żelowe do gęstości 3 razy 10 do 5 komórek na studzienkę, delikatnie, ale szybko mieszając roztwór pipetą przed żelowaniem.
Szybko, ale ostrożnie, dozuj 0,5 milileta komórek do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki w schludnych, cylindrycznych formach. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut. Gdy żel całkowicie zastygnie, przesuń wysterylizowaną szpatualę w kółko po zewnętrznej stronie każdego żelu w jednym kierunku, aby oderwać żele od płytek bez pękania.
Podczas wyjmowania żelu należy uważać, aby nie przesuwać szpatułki do przodu iz powrotem w studzience. Następnie za pomocą szpatułki delikatnie przenieś żele na indywidualne 16-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych zawierające pięć mililetów DMEM uzupełnionych jednym procentem FBS, z lub bez TGF beta 1 i TNF alfa. Na koniec delikatnie potrząśnij szalkami, aby upewnić się, że żele unoszą się na podłożu, i włóż żele z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.
Nieleczone komórki a541 mają wygląd przypominający bruk i trójkątny, charakterystyczny dla komórek nabłonkowych. Jednak po stymulacji TGF beta 1 i TNF alfa komórki wykazują długi kształt wrzeciona, podobny do obserwowanego w komórkach mesynkremalnych. QRTCPR ekspresji markera nabłonkowego i mesynklamalnego przed i po EMT ujawnia, że komórki A541 leczone cytokinami zapalnymi przez 48 godzin wykazują znacznie zmniejszoną ekspresję CDH1 i znacznie zwiększoną ekspresję VIAM i ACTA2.
Co więcej, stymulacja tymi cytokinami osłabia ekspresję E-kadheryny, jak określono w zachodniej analizie krwi, podczas gdy ekspresja wimentyny, N-kadheryny i aktyny alfa mięśni gładkich jest indukowana. W teście skurczu żelu, po 48 godzinach, żele zawierające komórki traktowane TGF beta 1 i TNF alfa są mniejsze niż kontrolowane żele zawierające komórki traktowane PBS. Rzeczywiście, po 72 godzinach rozmiar żeli zawierających żele traktowane cytokinami jest znacznie zmniejszony w porównaniu z żelami kontrolowanymi, mierzonymi za pomocą analizatora żeli.
Jak zaobserwowano, etapy skurczu żelu można zakończyć w ciągu trzech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o potwierdzeniu, że EMT zostało pomyślnie wywołane przed wykonaniem testu kontraktowania żelu. Po obserwacji technika ta zapewnia sposób na zmianę procesu EMT podczas stanu zapalnego, takiego jak zwłóknienie lub przebudowa płuc.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak emitować komórki, które mają EMT, do pewnego rodzaju cuagentera i spieniać je w podłożu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje test kurczenia żelu opracowany w celu oceny funkcji kurczliwości komórek mezenchymalnych, które przeszły przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT). Technika ta jest szczególnie istotna dla badań nad wpływem cytokin zapalnych na zachowanie komórek.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Neuronauka
- Badania nad zapaleniem
Tło
- Przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT) jest krytycznym procesem w różnych chorobach.
- Cytokiny zapalne mogą wywołać EMT w komórkach nabłonkowych płuc.
- Przejście to wiąże się z chorobami takimi jak idiopatyczne stwardnienie płuc i ciężki astma.
- Rozumienie kurczliwości w komórkach mezenchymalnych jest istotne dla strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Ocenić kurczliwość komórek mezenchymalnych po EMT.
- Opracować prosty test, który nie wymaga specjalistycznego sprzętu.
- Zgłębić zrozumienie zachowania komórek w kontekście zapalnym.
Stosowane metody
- Płukanie ludzkich komórek nabłonkowych płuc A-549 buforem PBS.
- Odrywanie komórek za pomocą trypsyny-EDTA.
- Centryfugowanie komórek.
- Ocenianie funkcji kurczliwości za pomocą testu kurczenia żelu.
Główne wyniki
- Test skutecznie mierzy kurczliwość w komórkach mezenchymalnych.
- Wykazuje wysoką zawartość i powtarzalność.
- Wyniki wskazują na znaczne zmiany w zachowaniu komórek po EMT.
- Technika ta jest dostępna dla różnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Test kurczenia żelu jest cennym narzędziem do badania EMT.
- Dostarcza wglądu w kurczliwe właściwości komórek mezenchymalnych.
- Ta metoda może ułatwić dalsze badania nad chorobami zapalnymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mesenchymal cell contractility following epithelial-mesenchymal transition (EMT) addresses a critical gap in early fibrosis research and target validation. This in vitro gel contraction assay enables mechanistic de-risking by linking cytokine-induced EMT to functional outputs relevant for disease modeling and therapeutic hypothesis testing. The approach supports predictive confidence at the discovery-to-preclinical inflection point for fibrosis and tissue remodeling portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EMT-driven contractile phenotypes in response to inflammatory cytokines.
- Supports biological de-risking by functionally validating mesenchymal transition in disease-relevant contexts.
- Facilitates predictive confidence in target selection for fibrosis and remodeling indications.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying contractile function post-EMT.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
- Prepares validated cell systems for downstream compound screening or mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro contractility measurements with fibrotic disease mechanisms observed in vivo.
- Enables continuity from discovery-stage EMT models to preclinical evaluation of anti-fibrotic strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking molecular changes to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This assay positions within the early discovery to preclinical continuum, bridging mechanistic EMT studies and functional validation of fibrotic targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on EMT induction and contractile phenotype emergence.
- Screening: Offers reproducible, quantitative contractility readouts for assay-ready systems.
- Analytics: Enables statistical comparison of gel contraction across cytokine treatments and controls.
- Translational Research: Connects in vitro EMT contractility to disease-relevant fibrotic endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a broadly applicable platform for EMT and fibrosis research across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EMT-driven fibrosis models and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and device-independent contractility assessment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking molecular EMT markers to functional outputs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-fibrotic and tissue remodeling assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, EMT induction, and quantitative image analysis.
- Needs access to standard tissue culture and gel handling infrastructure.
- Demands cross-team standardization of EMT induction and contractility measurement protocols.
- Adaptable to various epithelial cell lines and cytokine conditions as supported by the protocol.
- Dependent on confirmation of EMT induction prior to contractility assessment.
