Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Ogólnym celem tej procedury jest ocena kurczliwości komórek mezenchymalnych, które przeszły in vitro nabłonkowe przejście mezenchymalne wywołane cytokinami zapalnymi lub EMT. Ten mezenchymalny jest odmianą podstawowej funkcji komórek po EMT indukowaną zapalnymi odpowiedziami immunologicznymi, takimi jak idiopatyczne zwłóknienie płuc lub przebudowa dróg oddechowych w ciężkiej astmie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga specjalnych urządzeń i wykazuje wysoką zawartość W procesie montażu wezmą udział absolwenci Hideyuki Takeshima i Kosuke Makita z mojego laboratorium.

Zacznij od przemycia kultury ludzkich komórek nabłonka płuc A-549 za pomocą pięciu do dziesięciu mililetów PBS. Następnie odłącz przylegające komórki za pomocą dwóch mililetów trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po trzech minutach przenieść zawiesinę komórkową do stożkowych probówek zawierających pożywkę do hodowli komórkowych i odwirować komórki w wirówce.

Ponownie zawiesić osady w dwóch mililetach pożywki do hodowli komórkowych, zachowując małą elokwatę do liczenia. Następnie wysiewaj 0,5 do 1 razy 10 do 6 komórek w dziesięciu mililetach pożywki na dziesięciocentymetrową szalkę z polisterenu i inkubuj kultury komórkowe przez 24 godziny. W celu indukcji EMT, następnego dnia należy potraktować komórki 10 mikrolitrami TGF beta 1 i TNF alfa i zwrócić płytki do inkubatora na kolejne 48 godzin.

Czwartego dnia umyj kultury indukowane przez emt pięcioma do dziesięciu mililetami pbs, a następnie odłącz komórki trypsyną-EDTA, jak właśnie pokazano. Następnie odwiruj zawiesiny komórkowe w DMEM uzupełnionym inhibitorem tryspsyny i ponownie zawieś granulki w 500 mikrolitrach pbs. Następnie policz komórki i dodaj świeżo przygotowane podłoże żelowe do gęstości 3 razy 10 do 5 komórek na studzienkę, delikatnie, ale szybko mieszając roztwór pipetą przed żelowaniem.

Szybko, ale ostrożnie, dozuj 0,5 milileta komórek do każdej studzienki niepoddanej działaniu 24-dołkowej płytki w schludnych, cylindrycznych formach. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 15 minut. Gdy żel całkowicie zastygnie, przesuń wysterylizowaną szpatualę w kółko po zewnętrznej stronie każdego żelu w jednym kierunku, aby oderwać żele od płytek bez pękania.

Podczas wyjmowania żelu należy uważać, aby nie przesuwać szpatułki do przodu iz powrotem w studzience. Następnie za pomocą szpatułki delikatnie przenieś żele na indywidualne 16-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych zawierające pięć mililetów DMEM uzupełnionych jednym procentem FBS, z lub bez TGF beta 1 i TNF alfa. Na koniec delikatnie potrząśnij szalkami, aby upewnić się, że żele unoszą się na podłożu, i włóż żele z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych.

Nieleczone komórki a541 mają wygląd przypominający bruk i trójkątny, charakterystyczny dla komórek nabłonkowych. Jednak po stymulacji TGF beta 1 i TNF alfa komórki wykazują długi kształt wrzeciona, podobny do obserwowanego w komórkach mesynkremalnych. QRTCPR ekspresji markera nabłonkowego i mesynklamalnego przed i po EMT ujawnia, że komórki A541 leczone cytokinami zapalnymi przez 48 godzin wykazują znacznie zmniejszoną ekspresję CDH1 i znacznie zwiększoną ekspresję VIAM i ACTA2.

Co więcej, stymulacja tymi cytokinami osłabia ekspresję E-kadheryny, jak określono w zachodniej analizie krwi, podczas gdy ekspresja wimentyny, N-kadheryny i aktyny alfa mięśni gładkich jest indukowana. W teście skurczu żelu, po 48 godzinach, żele zawierające komórki traktowane TGF beta 1 i TNF alfa są mniejsze niż kontrolowane żele zawierające komórki traktowane PBS. Rzeczywiście, po 72 godzinach rozmiar żeli zawierających żele traktowane cytokinami jest znacznie zmniejszony w porównaniu z żelami kontrolowanymi, mierzonymi za pomocą analizatora żeli.

Jak zaobserwowano, etapy skurczu żelu można zakończyć w ciągu trzech godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o potwierdzeniu, że EMT zostało pomyślnie wywołane przed wykonaniem testu kontraktowania żelu. Po obserwacji technika ta zapewnia sposób na zmianę procesu EMT podczas stanu zapalnego, takiego jak zwłóknienie lub przebudowa płuc.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak emitować komórki, które mają EMT, do pewnego rodzaju cuagentera i spieniać je w podłożu.