Name: Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj test kurczliwości żelu do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych po przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym. Ta metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i pozwala badać wpływ cytokin zapalnych na zachowanie komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Dr. Tadashi Koyama za pomoc techniczną. Prace te były częściowo wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; grant dla Grupy Badawczej ds. Niewydolności Oddechowej z Ministerstwa Zdrowia, Pracy i Opieki Społecznej w Japonii; grant na badania nad chorobami alergicznymi i immunologią, Japonia.

1. Przygotowanie i hodowla komórek nabłonka płuc
<ol>
	<li>Hodowla ludzkich komórek nabłonka płuc A549 (przylegająca linia komórkowa) w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych z naczynia hodowlanego i przemyć raz 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po umyciu należy natychmiast zassać PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty.</li>
	<li>Zebrać oderwane komórki do probówek wirówkowych zawierających pożywkę do hodowli komórkowych, odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 4 minuty przy sile 150 × g.</li>
	<li>Zawiesić osad komórek w 2 ml pożywki do hodowli komórkowych i usunąć próbkę do zliczenia komórek. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, aby sprawdzić żywotność komórek.</li>
	<li>Nasiona komórek A549 na 10 cm płytkach polistyrenowych o gęstości 0,5 - 1,0 × 106 komórek/naczynie z 10 ml pożywki do testu skurczu żelu. Wysiewaj komórki na 6 dołkach polistyrenowych o gęstości 0,5 - 1,0 × 105 komórek/studzienkę z 2 ml pożywki w celu potwierdzenia EMT. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Procedura EMT
<ol>
	<li>Dodać 10 μl TGF-β1 (5 μg/ml) i 10 μl TNF-α (10 μg/ml) do płytki do testu skurczowego żelu wysiewanego w kroku 1.6. Dodać 2 μl TGF-β1 (5 μg/ml) i 2 μl TNF-α (10 μg/ml) na płytkę w celu potwierdzenia EMT wysiewu w kroku 1.6. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie procedury EMT za pomocą PCR i Western Blotting
<ol>
	<li>Potwierdź zmianę morfologii (od brukowej kamienia do wrzecionowatego kształtu) leczonych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. 
	Uwaga: Normalne komórki A549 mają brukowany wygląd przypominający kamień i trójkątny kształt, który jest charakterystyczny dla komórek nabłonkowych, ale po stymulacji TGF-β1 i TNF-α komórki wydają się długie i wrzecionowate, co jest podobne do komórek mezenchymalnych14,15.</li>
	<li>Oceń ekspresję markera nabłonkowego, takiego jak E-kadheryna, i markerów mezenchymalnych, takich jak N-kadheryna, wimentyna i aktyna α mięśni gładkich za pomocą PCR lub Western blot.
	<ol>
		<li>Ekstrahuj całkowite RNA z komórek za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA16 i zsyntetyzuj cDNA przy użyciu odwrotnej transkryptazy17 zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Zmierz ekspresję poziomów mRNA za pomocą systemu Real Time PCR18 i zestawu do PCR z monomerycznym barwnikiem cyjaninowym zgodnie z instrukcjami producenta. Specyficzne startery dla GAPDH (dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego), ACTA2 (alfa-aktyna-2), CDH1 (kadheryna-1; E-kadheryna) i VIM (wimentyna) przedstawiono w Tabeli 1.</li>
		<li>Poddać komórki lizie za pomocą roztworu buforu do lizy (Tabela 2) zawierającego 1% koktajl inhibitorów proteazy. Zmierzyć stężenie białka we wszystkich próbkach za pomocą zestawu do oznaczania białek19,20 i nanieść te same ilości białka na żel poliakrylamidowy.
		<ol>
			<li>Wykonać elektroforezę żelową SDS i półsuchy transfer białek do błony PVDF21. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami w buforze blokującym przez 1 - 2 godziny. Po inkubacji przemyć dwukrotnie membranę buforem do przemywania i inkubować błonę przez 1 godzinę z drugimi przeciwciałami. 
			Uwaga: Patrz Tabela materiałów/sprzętu, aby zapoznać się z przeciwciałami i rozcieńczeniami stosowanymi w tych badaniach. Patrz tabela 2, aby zapoznać się ze składnikami bufora blokującego.</li>
			<li>Dwukrotnie przemyć membranę buforem do mycia. Zrób zdjęcia membrany za pomocą zestawu do wykrywania Western blotting22 za pomocą zimnej kamery CCD11,23.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test skurczu żelu do oceny EMT
<ol>
	<li>Odessać kondycjonowaną pożywkę z naczynia do hodowli komórkowej i dobrze przemyć 5 - 10 ml PBS w celu usunięcia martwych komórek. Po umyciu należy natychmiast zassać PBS.</li>
	<li>Dodać 2 ml 0,05% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 3 minuty.</li>
	<li>Zebrać oderwane komórki do probówek wirówkowych zawierających DMEM uzupełniony inhibitorem trypsyny (1 mg/ml), odwirować probówki w temperaturze pokojowej przez 4 minuty w temperaturze 150 ×g.</li>
	<li>Wymieszaj żel kolagenowy typu 1 z wodą destylowaną i 4× skoncentrowanym DMEM, aby dostosować objętości, aby osiągnąć stężenie kolagenu 1,75 mg / ml i stężenie 1× DMEM. Na tym etapie upewnij się, że podłoże żelowe znajduje się na lodzie. 
	Uwaga: Aby przygotować 6 ml podłoża żelowego, dobrze wymieszaj 3,5 ml żelu kolagenowego typu 1 (3 mg / ml), 1,5 ml 4× skoncentrowanego DMEM i 1 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl PBS i usunąć próbkę do zliczenia komórek. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru z barwieniem trypanowym, aby sprawdzić żywotność komórek.</li>
	<li>Dodać podłoże żelowe, aby dostosować objętości w celu uzyskania gęstości komórek 3,0 × 105 komórek/dołek (6,0 × 105 komórek/ml) i delikatnie, ale szybko wymieszać, pipetując bez żelowania.</li>
	<li>Szybko i ostrożnie dozować 0,5 ml mieszaniny do każdej studzienki 24-dołkowej, niepoddanej działaniu substancji płytki, aby uzyskać schludną cylindryczną formę. Uważaj, aby pęcherzyki powietrza nie zanieczyściły żeli (Rysunek 1A). 
	Uwaga: Podłoże żelowe zawierające komórki jest lepkie i może łatwo żelować i tworzyć kształt półksiężyca w studzience.</li>
	<li>Inkubować płytkę przez 15 minut w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%, aż do całkowitego zżelowania.</li>
	<li>Odłącz żele od płytki bez pękania, przesuwając wysterylizowaną szpatułkę w taki sposób, aby narysować obwód w jednym kierunku. Za pomocą szpatułki delikatnie przenieś żele na 60-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych zawierające 5 ml DMEM/1% FBS z lub bez TGF-β1 (5 ng/ml) i TNF-α (10 ng/ml).</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij naczyniami, aby upewnić się, że żele unoszą się na podłożu. Inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
</ol>
5. Pomiar rozmiaru żelu
<ol>
	<li>Zmierz rozmiar żelu kolagenowego po 0, 24, 48 i 72 godzinach za pomocą systemu analizy obrazu.
	<ol>
		<li>Włącz system dokumentacji żelu (Rysunek 2A) i włóż naczynia do szafki z osłoną światła. Następnie zdejmij pokrywkę naczyń w szafce.</li>
		<li>Otwórz powiązane oprogramowanie do analizy żeli. Kliknij przycisk "akwizycja obrazu" na pasku menu, aby wyświetlić obraz żeli w szafce. Następnie kliknij "pobierz" na pasku menu, aby zrobić zdjęcia żeli (Rysunek 2B).</li>
		<li>Kliknij "przycisk wykrywania" na pasku menu (Rysunek 2C) i dostosuj obszar pomiaru (żółte kółko na rysunku 2C), przeciągając myszą. Następnie kliknij przycisk "automatyczne wykrywanie" na pasku menu (patrz przycisk na rysunku 2D). Oprogramowanie automatycznie wykrywa żele, wyświetlając mapę cieplną (rysunek 2D).</li>
		<li>Kliknij "OK", aby wyodrębnić kontur żeli poprzez przetwarzanie obrazu i obliczyć obszary otoczone konturem (Rysunek 2E). Po obliczeniu powierzchni obliczony obszar jest wyświetlany w osobnym oknie wyskakującym. 
		Uwaga: Jeśli żele nakładają się na siebie podczas obrazowania, delikatnie przesuwaj żele za pomocą sterylnej końcówki pipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół opracowany w tym badaniu składa się z dwóch etapów. Pierwszym krokiem jest indukcja EMT, natomiast drugim krokiem jest test skurczu żelu. Ponieważ ważne jest, aby potwierdzić, że komórki przeszły EMT, krok 2 stanowi doskonałe uzupełnienie zmian morfologicznych i ekspresji genów. Poprzednie badania wykazały, że EMT komórek A549 był indukowany przez TGF-a1 tylko24; jednakże, jak informowaliśmy wcześniej10, leczenie TNF-α zwiększa EMT i pozyskiwanie mezenchymalnych markerów komórkowych. Uważa ...

Zwłóknienie bierze udział w patogenezie różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc, zwłóknienie serca, marskość wątroby, końcowa niewydolność nerek, twardzina układowa i choroba autoimmunologiczna1. Wśród śródmiąższowych chorób płuc idiopatyczne włóknienie płuc (IPF) jest przewlekłą chorobą postępującą i wykazuje złe rokowanie. Patologicznym znakiem rozpoznawczym IPF jest rozwój ognisk fibroblastycznych składających się z aktywowanych fibroblastów i miofibroblastów, które są związane z rokowaniem. Sugeruje się, że pochodzenie takich fibroblastów płucnych wywodzi się z kilku komórek mezenchymalnych, w tym pierwotnie rezydujących fibroblastów płucnych i krążących fibrocytów ze szpiku kostnego. Ostatnio zaproponowano, że przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) jest związane z powstawaniem komórek mezenchymalnych2 i przyczynia się do patogenezy zaburzeń zwłóknieniowych.
Uważa się, że EMT odgrywa ważną rolę w procesie rozwoju płodu, gojenia się ran i progresji raka, w tym inwazji guza i przerzutów3. W wyniku procesu EMT komórki nabłonkowe uzyskują zdolność komórek mezenchymalnych poprzez utratę markerów nabłonkowych, takich jak E-kadheryna, oraz poprzez ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak wimentyna i aktyna α-mięśni gładkich (SMA)4,5. Wcześniejsze badania wykazały dowody na to, że proces EMT jest związany z rozwojem zwłóknienia tkanek w nerkach6 i płucach7. Dodatkowo przewlekły stan zapalny sprzyja chorobie zwłóknieniowej8; ponadto takie cytokiny zapalne, jak nadrodzina czynnika martwicy nowotworu 14 (TNFSF14; Wykazano, że czynnik martwicy nowotworu (TNF)-α i interleukina-1β zwiększają EMT9-12.
Test skurczu żelu kolagenowego, test skurczu komórek oparty na kolagenie, w którym fibroblasty są trójwymiarowo osadzone w żelu kolagenowym typu I, jest idealnym modelem in vitro do oceny kurczliwości. Kurczliwość jest jedną z charakterystycznych funkcji fibroblastów i przyczynia się do prawidłowego gojenia się ran i zwłóknienia13. W tym teście uważa się, że przyłączanie fibroblastów do kolagenu typu I poprzez mechanizmy zależne od integryn ma w pewnych warunkach wytwarzać napięcie mechaniczne, a w konsekwencji prowadzić do skurczu tkanek.
Tutaj rozwój testu skurczu żelu jest dostosowany do oceny nabycia funkcji skurczu w komórkach, które przeszły EMT. Raport ten pokazuje, że ten zmodyfikowany test jest odpowiedni do oceny kurczliwości w komórkach mezenchymalnych, które przeszły EMT.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>Dla A549 średni</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-&beta; 1, Ludzkie, rekombinowane</td><td>chemikalia laboratoryjne Wako</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TNF-&alpha;</td><td>R& Systemy D</td><td>210-TA/CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Kadheryna (24E10) Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td># 3195</td><td>Rozcieńczenie 1: 3,000</td></tr><tr><td>Wimentyna (D21H3)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td># 5741</td><td>Rozcieńczenie 1:3 000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe</td><td>sigma</td><td>aldrich T9026</td><td>Rozcieńczenie 1:10 000</td></tr><tr><td>Monoklonalna antyaktyna, &alfa;-Przeciwciało mięśni gładkich& nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10,000 rozcieńczenie</td></tr><tr>Przeciwciało<td>anty-N-kadheryny</td><td>Laboratoria Transdukcji BD #</td> <td>610920</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (przeciwciało wtórne)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1:20,000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (przeciwciało wtórne)</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1:20,000 odczynnik blokujący rozcieńczenie</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>2% w TBS-T</td></tr><tr><td>6 Well Clear Flat Bottom Multiwell Multiwell Cell Culture Plate, z pokrywką</td><td>corning</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>#93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, technologie trwałości proszku</td><td></td><td>12100-046</td><td>Dla 4 i razy; Żel kolagenowy DMEM</td></tr><tr><td>typu 1</td><td>Nitta żelatyna</td><td>Cellmatrix typ I-A</td><td></td></tr><tr><td>24 Well Płytka do hodowli komórkowych</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>System dokumentacji żelu&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Gel imager</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy żelu</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, wersja 3.00</td><td>oprogramowanie analityczne w zestawie z AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), phenol red</td><td>life technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowymi płytkami, niepoddanymi obróbce</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>life technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji RNA</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Technologie odwrotnej transkryptazy</td><td>życia</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>System PCR w czasie rzeczywistym</td> Zielony zestaw PCR <td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Cocktail (100x)</td><td>technologie życia</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td> <td>PVDFATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Żel poliakrylamidowy</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do wykrywania Western blot</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>na zimno ATTO</td><td>Ez-Capture MG/ST</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurynian polioksyetylenu (20)sorbitanu</td><td>Wako Chemikalia laboratoryjne</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Eter polioksyetylenowy (9) oktiifenylowy</td><td>Wako Chemikalia laboratoryjne</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Zwłóknienie jest często zaangażowane w patogenezę różnych przewlekłych postępujących chorób, takich jak śródmiąższowa choroba płuc. Patologicznym znakiem rozpoznawczym jest powstawanie ognisk fibroblastycznych, co wiąże się z ciężkością choroby. Sugeruje się, że komórki mezenchymalne składające się z ognisk fibroblastycznych pochodzą z kilku źródeł komórkowych, w tym pierwotnie rezydujących fibroblastów wewnątrzpłucnych i krążących fibrocytów ze szpiku kostnego. Od niedawna uważa się, że komórki mezenchymalne, które przeszły przemianę nabłonkowo-mezenchymalną (EMT), również mają przyczyniać się do patogenezy zwłóknienia. Ponadto EMT może być indukowany przez przekształcanie czynnika wzrostu β, a EMT może być wzmocniony przez cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworu α. Test skurczu żelowego jest idealnym modelem in vitro do oceny kurczliwości, która jest jedną z charakterystycznych funkcji fibroblastów i przyczynia się do gojenia ran i zwłóknienia. W tym miejscu zademonstrowano opracowanie testu skurczu żelu do oceny zdolności skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły EMT.

W trakcie EMT komórki nabłonkowe tracą markery nabłonkowe, takie jak E-kadheryna, i zaczynają wykaziwać ekspresję markerów mezenchymalnych, takich jak wimentyna i α-aktyna mięśni gładkich4,5. Inkubacja ludzkich komórek nabłonkowych płuc A549 z TGF-β1 i TNF-α indukuje EMT. Normalne komórki A549 mają kształt przypominający brukowca lub trójkąt, co jest charakterystyczne dla komórek nabłonkowych (Rysunek 3A), natomiast po stymulacji TGF-β1 i TNF-α ich wygląd zmien...

Tutaj opisujemy rozwój i zastosowanie testu skurczu żelu do oceny funkcji skurczu w komórkach mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena kurczliwości komórek mezenchymalnych, które przeszły in vitro nabłonkowe przejście mezenchymalne wywołane cytokinami zapalnymi lub EMT. Ten mezenchymalny jest odmianą podstawowej funkcji komórek po EMT indukowaną zapalnymi odpowiedziami immunologicznymi, takimi jak idiopatyczne zwłóknienie płuc lub przebudowa dróg oddechowych w ciężkiej astmie. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że nie wymaga specjalnych urządzeń i wykazuje wysoką zawartość W procesie montażu wezmą udział absolwenci Hideyuki Takeshima i Kosuke Makita z mojego laboratorium.Zacznij od przemycia kultury ludzkich komórek nabłonka płuc A-549 za pomocą pięciu do dziesięciu mililetów PBS. Następnie odłącz przylegające komórki za pomocą dwóch mililetów trypsyny-EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla. Po trzech minutach przenieść zawiesinę komórkową do stożkowych probówek zawierających pożywkę do hodowli komórkowych i odwirować komórki w wirówce.Ponownie zawiesić osady w dwóch mililetach pożywki do hodowli komórkowych, zachowując małą elokwatę do liczenia. Następnie wysiewaj 0,5 do 1 razy 10 do 6 komórek w dziesięciu mililetach pożywki na dzies

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy zastosowanie testu opartego na komórkach ES myszy w celu zidentyfikowania krytycznych okien czasowych aktywacji sygnałów Wnt/β-catenin i BMP podczas indukcji kardiogennej. Metoda ta stanowi standaryzowaną platformę, która pozwala na wiarygodne ilościowe określenie wydajności kardiogennej i może być stosowana do badania innych linii komórkowych.

Zmodyfikowany test oparty na mysich embrionalnych komórkach macierzystych do ilościowego określania wydajności indukcji kardiogennej

Mezenchyma czaszki ulega gwałtownym ruchom morfogenetycznym, które prawdopodobnie stanowią siłę napędową dla uniesienia fałdów neuronalnych.1,2W niniejszym opracowaniu opisujemy prostą ex vivo test z eksplantem w celu charakterystyki zachowań komórkowych mezenchymy czaszki podczas neurulacji. Metoda ta znajduje liczne zastosowania, w tym możliwość wprowadzania manipulacji farmakologicznych oraz przeprowadzania analiz z wykorzystaniem obrazowania na żywo.

Test eksplantacyjny do oceny zachowania komórkowego mezenchymy czaszki

Opisana jest prosta metoda indukcji przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego (EMT) w różnych typach komórek.  Uwzględniono metody analizy komórek w stanach EMT za pomocą immunocytochemii.

Indukcja i analiza przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Tutaj opisujemy metody izolowania pierwotnych komórek nasierdziowych myszy za pomocą testu hodowli outgrowth i oceny funkcjonalnej migracji komórek pochodzących z nasierdzia (EPDC) za pomocą systemu hodowli serca ex vivo. Protokoły te są odpowiednie do identyfikacji genetycznych i chemicznych modulatorów przejścia nabłonka nasierdzia do mezenchymalnego (EMT) i ruchliwości.

Test hodowli wzrostu nasierdzia i ocena ex vivo migracji komórek pochodzących z nasierdzia

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Nasierdzie odgrywa kluczową rolę w rozwoju i naprawie serca, dostarczając komórek i czynników wzrostu do ściany mięśnia sercowego. W tym miejscu opisujemy metodę hodowli ludzkich pierwotnych komórek nasierdziowych, która umożliwia badanie i porównanie ich cech rozwojowych i dorosłych.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego

Prezentujemy test siły pociągowej o wysokiej przepustowości wykonany z gumy silikonowej (PDMS). Ten nowatorski test nadaje się do badania fizycznych zmian kurczliwości komórek podczas różnych procesów i chorób biologicznych i biomedycznych. Wykazujemy użyteczność tej metody, mierząc zależny od TGF-β wzrost kurczliwości podczas przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego.

Wysokoprzepustowa mikroskopia sił trakcyjnych z wykorzystaniem PDMS ujawnia zależne od dawki efekty transformacji czynnika wzrostu β na przejście z nabłonka do mezenchymów

Ta praca przedstawia elastyczny protokół wykorzystania technologii fluorescencyjnie znakowanych elastomerowych powierzchni skurczowych (FLECS) w formacie mikrostudzienki do uproszczonej, bezobsługowej kwantyfikacji sił skurczu pojedynczej komórki na podstawie wizualizacji przemieszczeń mikrowzorów białek fluorescencyjnych.

Uproszczona, wysokoprzepustowa analiza kurczliwości pojedynczych komórek przy użyciu elastomerów mikrowzorzystych

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Poznaj test kurczliwości żelu do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych po przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym. Ta metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i pozwala badać wpływ cytokin zapalnych na zachowanie komórek.

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie testu in vitro do oceny funkcji skurczowej komórek mezenchymalnych, które przeszły przejście nabłonkowo-mezenchymalne

Przeglądaj więcej filmów