Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie systemu generowania nieoznakowanych mutantów w gatunku sinic Synechocystis PCC6803 i znakowanych mutantów w gatunkach Synechococcus PCC7002. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki sinic. Na przykład, jak wprowadzić zmiany chromosomowe do szczepu.

Poprzez wprowadzenie genu oporności na antybiotyki, a następnie usunięcie tej kasety przy użyciu ujemnego markera selekcyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczepy mogą być wielokrotnie manipulowane genetycznie. Pozwala to na wprowadzenie do szczepu tylu zmian, ile jest to pożądane.

Po przygotowaniu pożywki, szczepów sinic i plazmidów, zgodnie z protokołem tekstowym. Przygotuj świeżą hodowlę, zaszczepiając pętlę pełną komórek sinicowych w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę w świetle w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, do OD7500, równego 0,2 do 0,6.

Po inkubacji odwirować od jednego do dwóch mililitrów kultury w stężeniu 2 300 g przez pięć minut. Następnie, po odrzuceniu supernatantu, należy użyć pożywki BG11 do jednokrotnego umycia granulek, delikatnie pipetując w celu ponownego zawieszenia komórek. Ponieważ wirowanie może spowodować utratę pilusów, które są niezbędne do wychwytu DNA.

Po ponownym granulowaniu komórek i usunięciu supernatantu, dodaj pożywkę BG11 do końcowej objętości 100 mikrolitrów i przenieś komórki do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Następnie dodaj 1 mikrogram wcześniej przygotowanego plazmidu A do komórek. I delikatnie stuknij, aby wymieszać.

Następnie połóż probówki poziomo w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza i inkubuj przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji rozprowadzić podwielokrotności mieszaniny plazmidowego DNA z hodowli komórkowej na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków. I inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Około 24 godziny później przygotuj 0,6% roztwór agaru w wodzie zawierającej kanamycynę. I pozwól mu ostygnąć do 42 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 2,5 do trzech mililitrów na krawędzie płytek hodowlanych i przechyl płytkę, aby roztwór utworzył równą górną warstwę agaru na powierzchni.

Inkubuj płytki przez około siedem dni, aby kolonie były widoczne. Następnie podziel świeżą płytkę z agarem BG11 i kanamycyną na sześć sektorów. I użyj wykałaczki z końcem, aby usunąć pojedyncze kolonie.

Aby przeprowadzić PCR, aby potwierdzić oznaczony nokaut, przenieś niewielką ilość komórek do probówki zawierającej 50 mikrolitrów wody i około 20 425 do 600 mikrometrów szklanych kulek. Potrząsaj komórkami i kulkami z prędkością około 2 000 obr./min przez pięć minut, a następnie wiruj z prędkością 15 700 g przez pięć minut. Następnie użyj pięciu mikrolitrów supernatantu, aby przygotować 50 mikrolitrowe reakcje PCR z wstępnymi praktykami sczepnego DNA.

Aby zweryfikować mutanty, po zaprojektowaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, należy amplifikować produkt za pomocą następującego programu i dołączyć kontrolę typu dzikiego. Za pomocą elektroforez żelowych sprawdź genotyp transformantów nokautujących. Pokazuje pasmo około czterech kilopar zasad i nie ma pasma typu dzikiego.

Więcej informacji można znaleźć w protokole tekstowym. Jeśli pasmo typu dzikiego jest nadal obecne, ponownie nałóż szczep na świeżą płytkę i powtórz PCR. Powtarzaj proces walidacji, aż mutant zostanie oddzielony, a w reakcji PCR nie zaobserwuje się prążka typu dzikiego.

W przypadku szczepu, który wykazuje wyraźny profil mutanta, ponownie nałóż smugi na świeżą płytkę, aby użyć do wygenerowania nieoznaczonego nokautu. Aby wygenerować nieoznaczone mutanty Synechocystis, należy skonfigurować świeżą hodowlę oznaczonego nokautu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę przez dwa do trzech dni, aby i OD750, równy 0,2 do 0,6.

Odwirować 10 mililitrów kultury w stężeniu 2,300 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie użyj pożywki BG11, aby delikatnie umyć komórki. Po dodaniu BG11 do końcowej objętości 200 mikrolitrów i przeniesieniu komórek do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem, dodaj 1 mikrogram plazmidu B DNA do komórek i delikatnie postukaj, aby wymieszać.

Następnie połóż probówki poziomo w inkubatorze i inkubuj przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji dodać 1,8 mililitra pożywki BG11 i inkubować próbki przez łącznie cztery dni z wytrząsaniem. Jest to wystarczający czas, aby umożliwić zajście rekombinacji w wielu kopiach chromosomów.

Umieść 50, 10 i 1 mikrolitrowe podwielokrotności przekształconej kultury na płytkach BG11 plus 5% sacharozy i inkubuj przez około siedem dni w celu wytworzenia pojedynczych kolonii. Następnie, za pomocą wykałaczki z końcem, wykluć od 30 do 50 pojedynczych kolonii na płytkach BG11 i kanamycyny. Następnie nałóż plaster na BG11 plus 5% sacharozy.

Kolonie, które rosną na BG11 plus sacharoza, ale nie na płytkach z kanamycyną, są potencjalnymi nieoznaczonymi nokautami. Kolonie, które rosną na obu płytkach, prawdopodobnie są odporne na sacharozę z powodu mutacji w genie sacB. Postępując zgodnie z metodą PCR, zademonstrowaną wcześniej w tym filmie, zweryfikuj nieoznaczone nokaucje, które wytworzą opaskę żelową odpowiadającą rozmiarowi typu dzikiego pomniejszoną o usunięty obszar.

Jeśli szczep wykazuje nieoznaczony profil zmutowany, należy go ponownie nałożyć na świeży agar BG11 bez antybiotyków. Aby przechowywać szczepy przez długi czas, należy skonfigurować świeżą kulturę szczepu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę przez trzy do czterech dni, aby OD750 był równy 0,4 do 0,7.

Po jednokrotnym umyciu komórek BG11 należy ponownie zawiesić osad w około dwóch mililitrach BG11. Dodaj 0,8 mililitra skoncentrowanych komórek do jednej probówki. Następnie dodaj 0,2 mililitra 80% sterylizowanej glicerolu z filtrem.

Do innej probówki dodaj 0,93 mililitra skoncentrowanych komórek i 0,07 mililitra DMSO. Przechowuj obie probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby ożywić szczepy, wyjmij rurkę i użyj wykałaczki z końcem, aby zeskrobać niektóre komórki na płytkę agarową bez antybiotyków.

Następnie użyj sterylnej pętelki, aby rozprowadzić smugi jak zwykle. Na rysunku przedstawiono przykłady plazmidów A i B używanych do generowania mutantów delecyjnych. W każdym przypadku pięć pierwszych i trzy pierwsze regiony planowania to w przybliżeniu od 900 do 1 000 par zasad.

Plazmid B może również zawierać kasetę genową między pięcioma pierwszymi i trzema pierwszymi regionami flankującymi około jednej pary kilozasad. Lub zmodyfikowana wersja natywnej sekwencji genów. Po transformacji z plazmidem A po siedmiu do 10 dniach na płytce pojawi się kilkaset kolonii.

Jeśli geny nie są niezbędne, a mutanty wykazują wzrost, podobny do szczepu typu dzikiego, wówczas wszystkie chromosomy powinny zawierać kopię wstawionej sekwencji npt1 / sacB, jak określono za pomocą PCR. Jeśli geny nie są niezbędne, a mutanty rosną powoli, konieczne jest kilka rund ponownego nawijania smug ze wzrostem stężenia kanamycyny, aby uzyskać wydzielonego oznaczonego mutanta. Jeśli po ponownym pręgowaniu nie uzyska się oznaczonego mutanta, gen jest prawdopodobnie niezbędny do przeżycia.

Większość pojedynczych kolonii, uzyskanych w wyniku transformacji z plazmidem B, będzie wrażliwa na kanamycynę i odporna na sacharozę. Jak wykazano tutaj, amplifikacja PCR regionu docelowego w tych koloniach pokazuje, że prawie 100% nieoznaczonego profilu mutanta. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin przez okres sześciu tygodni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o użyciu sterylnej techniki. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak pomiar produkcji tlenu lub spektrometria mas chromatografii gazowej, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak pomiar szybkości fotosyntezy lub produkcja metabolitów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie genetyki sinic.

Zbadanie kluczowych procesów biochemicznych i fizjologicznych w tej gromadzie oraz szczepów rozwojowych do celów przemysłowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować nieoznaczone nokauty w gatunkach Synechococcus PCC6803.