Name: Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Naucz się generowania znakowanych i bezznacznikowych mutantów w sinicach Synechocystis sp. PCC6803 oraz Synechococcus sp. PCC7002. Ta metoda umożliwia wielokrotne modyfikacje genetyczne chromosomu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Environmental Services Association Education Trust, funduszowi Synthetic Biology in Cambridge SynBio oraz Ministerstwu Sprawiedliwości Społecznej i Upodmiotowienia, Rządowi Indii, za wsparcie finansowe.

<ol><li>Zwirglmaier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+phylogeography+of+marine+Synechococcus+and+Prochlorococcus+reveals+a+distinct+partitioning+of+lineages+among+oceanic+biomes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Global phylogeography of marine Synechococcus and Prochlorococcus reveals a distinct partitioning of lineages among oceanic biomes.</a> Environ Microbiol. 10, 147-161 (2008).</li>
<li>Galloway, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+cycles%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biogeochemistry%22%5BJournal%5D)">Nitrogen cycles: past, present, and future.</a> Biogeochemistry. 70, 153-226 (2004).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+cyanobacterial+alkane+production+to+the+ocean+hydrocarbon+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contribution of cyanobacterial alkane production to the ocean hydrocarbon cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2015).</li>
<li>Howe, C. J., Barbrook, A. C., Nisbet, R. E. R., Lockhart, P. J., Larkum, A. W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The origin of plastids.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 2675-2685 (2008).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Bombelli, P., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic%2C+respiratory+and+extracellular+electron+transport+pathways+in+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic, respiratory and extracellular electron transport pathways in cyanobacteria.</a> Biochim Biophys Acta. , (2015).</li>
<li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+production+through+oxygenic+photosynthesis+using+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+in+a+bio-photoelectrolysis+cell+%28BPE%29+system%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hydrogen production through oxygenic photosynthesis using the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 in a bio-photoelectrolysis cell (BPE) system.</a> Energy Environ. Sci. 6, 2682-2690 (2013).</li>
<li>Bradley, R. W., Bombelli, P., Lea-Smith, D. J., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+oxidase+mutants+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+show+increased+electrogenic+activity+in+biological+photo-voltaic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Terminal oxidase mutants of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 show increased electrogenic activity in biological photo-voltaic systems.</a> Phys Chem Chem Phys. 15, 13611-13618 (2013).</li>
<li>Ducat, D. C., Way, J. C., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cyanobacteria+to+generate+high-value+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering cyanobacteria to generate high-value products.</a> Trends Biotechnol. 29, 95-103 (2011).</li>
<li>Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+phototrophs%3A+efficient+alternatives+to+land-based+crops+for+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 235-240 (2008).</li>
<li>Tan, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+natural+products+from+marine+cyanobacteria+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioactive natural products from marine cyanobacteria for drug discovery.</a> Phytochemistry. 68, 954-979 (2007).</li>
<li>Volk, R. B., Furkert, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antialgal%2C+antibacterial+and+antifungal+activity+of+two+metabolites+produced+and+excreted+by+cyanobacteria+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Antialgal, antibacterial and antifungal activity of two metabolites produced and excreted by cyanobacteria during growth.</a> Microbiol Res. 161, 180-186 (2006).</li>
<li>Scott, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+algae%3A+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from algae: challenges and prospects.</a> Curr Opin Biotechnol. 21, 277-286 (2010).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phycobilisome-deficient+strains+of+Synechocystis+sp.+PCC+6803+have+reduced+size+and+require+carbon-limiting+conditions+to+exhibit+enhanced+productivity%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Phycobilisome-deficient strains of Synechocystis sp. PCC 6803 have reduced size and require carbon-limiting conditions to exhibit enhanced productivity.</a> Plant Physiol. 165, 705-714 (2014).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thylakoid+terminal+oxidases+are+essential+for+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+to+survive+rapidly+changing+light+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Thylakoid terminal oxidases are essential for the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 to survive rapidly changing light intensities.</a> Plant Physiol. 162, 484-495 (2013).</li>
<li>Liu, X., Sheng, J., Curtiss, R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+production+in+genetically+modified+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6899-6904 (2011).</li>
<li>Xu, H., Vavilin, D., Funk, C., Vermaas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+deletions+of+small+cab-like+proteins+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC+6803+-+Consequences+for+pigment+biosynthesis+and+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple deletions of small cab-like proteins in the cyanobacterium Synechocystis sp PCC 6803 - Consequences for pigment biosynthesis and accumulation.</a> J Biol Chem. 279, 27971-27979 (2004).</li>
<li>Castenholz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+methods+for+Cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Culturing methods for Cyanobacteria.</a> Method Enzymol. 167, 68-93 (1988).</li>
<li>Mitschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimentally+anchored+map+of+transcriptional+start+sites+in+the+model+cyanobacterium+Synechocystis+sp+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An experimentally anchored map of transcriptional start sites in the model cyanobacterium Synechocystis sp PCC6803.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2124-2129 (2011).</li>
<li>Ried, J. L., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+nptI-sacB-sacR+cartridge+for+constructing+directed%2C+unmarked+mutations+in+gram-negative+bacteria+by+marker+exchange-eviction+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An nptI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in gram-negative bacteria by marker exchange-eviction mutagenesis.</a> Gene. 57, 239-246 (1987).</li>
<li>Vieira, J., Messing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pUC+plasmids%2C+an+M13mp7-derived+system+for+insertion+mutagenesis+and+sequencing+with+synthetic+universal+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.</a> Gene. 19, 259-268 (1982).</li>
<li>Vermaas, W. F. J., Williams, J. G. K., Rutherford, A. W., Mathis, P., Arntzen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+Engineered+Mutant+of+the+Cyanobacterium+Synechocystis+6803+Lacks+the+Photosystem-Ii+Chlorophyll-Binding+Protein+Cp-47%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically Engineered Mutant of the Cyanobacterium Synechocystis 6803 Lacks the Photosystem-Ii Chlorophyll-Binding Protein Cp-47.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 9474-9477 (1986).</li>
<li>Westphal, S., Heins, L., Soll, J., Vothknecht, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+deletion+mutant+of+Synechocystis%3A+A+connection+between+bacterial+phage+shock+and+thylakoid+biogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vipp1 deletion mutant of Synechocystis: A connection between bacterial phage shock and thylakoid biogenesis?</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4243-4248 (2001).</li>
<li>Zhang, S. Y., Shen, G. Z., Li, Z. K., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vipp1+Is+Essential+for+the+Biogenesis+of+Photosystem+I+but+Not+Thylakoid+Membranes+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Vipp1 Is Essential for the Biogenesis of Photosystem I but Not Thylakoid Membranes in Synechococcus sp PCC 7002.</a> J Biol Chem. 289, 15904-15914 (2014).</li>
<li>Taroncher-Oldenberg, G., Nishina, K., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+the+polyhydroxyalkanoate-specific+beta-ketothiolase+and+acetoacetyl+coenzyme+A+reductase+genes+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp+strain+PCC6803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of the polyhydroxyalkanoate-specific beta-ketothiolase and acetoacetyl coenzyme A reductase genes in the cyanobacterium Synechocystis sp strain PCC6803.</a> Appl Environ Microbiol. 66, 4440-4448 (2000).</li>
<li>Hein, S., Tran, H., Steinbuchel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synechocystis+sp.+PCC6803+possesses+a+two-component+polyhydroxyalkanoic+acid+synthase+similar+to+that+of+anoxygenic+purple+sulfur+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synechocystis sp. PCC6803 possesses a two-component polyhydroxyalkanoic acid synthase similar to that of anoxygenic purple sulfur bacteria.</a> Arch Microbiol. 170, 162-170 (1998).</li>
<li>Ng, A. H., Berla, B. M., Pakrasi, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+of+photoautotrophic+protein+production+by+combining+promoters+and+neutral+sites+in+Synechocystis+6803%2C+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fine tuning of photoautotrophic protein production by combining promoters and neutral sites in Synechocystis 6803, a cyanobacterium.</a> Appl Environ Microbiol. , (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Najbardziej krytycznymi etapami generowania nieoznakowanych mutantów są: 1) staranne projektowanie plazmidu, aby zapewnić, że zmieniony zostanie tylko region docelowy; 2) zapewnienie, że próbki pozostają akseniczne, zwłaszcza gdy są hodowane na sacharozy; 3) posiew przekształconych komórek w celu wytworzenia znaczonego mutantu początkowo na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków, a następnie dodanie agaru i antybiotyków 24 godziny później; 4) hodowla oznakowanych mutantów przez 4 pełne dni przed posiewem na płytkach BG...

Cyjanobakterie to ewolucyjnie starożytny i różnorodny typ bakterii, który można znaleźć w prawie każdym naturalnym środowisku na Ziemi. W ekosystemach morskich występują one szczególnie obficie i odgrywają kluczową rolę w wielu cyklach składników odżywczych, odpowiadając za około połowę wiązaniawęgla1, większość wiązaniaazotu2 i produkcję setek milionów ton węglowodorów3 w oceanach rocznie. Chloroplasty, organelle odpowiedzialne za fotosyntezę w algach eukariotycznych i roślinach, prawdopodobnie wyewoluowały z cyjanobakterii, która została pochłonięta przez organizm gospodarza4. Sinice okazały się użytecznymi organizmami modelowymi do badania fotosyntezy, transportu elektronów5 i szlaków biochemicznych, z których wiele jest zachowanych w roślinach. Ponadto sinice są coraz częściej wykorzystywane do produkcji żywności, biopaliw6, energii elektrycznej7 i związków przemysłowych8 ze względu na ich wysoce efektywne przekształcanie wody i CO2 w biomasę przy użyciu energii słonecznej9 . Wiele gatunków może być uprawianych na gruntach nieornych z minimalną ilością składników odżywczych i wody morskiej, co sugeruje, że sinice mogą być potencjalnie uprawiane na dużą skalę bez wpływu na produkcję rolną. Niektóre gatunki są również źródłem produktów naturalnych, w tym związków przeciwgrzybiczych, przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych10,11.
Zdolność do generowania mutantów jest kluczem do zrozumienia fotosyntezy, biochemii i fizjologii cyjanobakteryjnych, a także niezbędna do rozwoju szczepów do celów przemysłowych. Większość opublikowanych badań generuje genetycznie zmodyfikowane szczepy poprzez wprowadzenie kasety oporności na antybiotyki w miejscu zainteresowania. Ogranicza to liczbę mutacji, które mogą zostać wprowadzone do szczepu, ponieważ tylko kilka kaset oporności na antybiotyki jest dostępnych do stosowania u cyjanobakterii. Szczepy zawierające geny nadające oporność na antybiotyki nie mogą być wykorzystywane do produkcji przemysłowej w otwartych stawach, która prawdopodobnie będzie jedynym opłacalnym sposobem produkcji biopaliw i innych produktów o niskiej wartości12. Pokolenie nieoznakowanych mutantów pokonuje te ograniczenia. Nieoznaczone mutanty nie zawierają obcego DNA, chyba że są celowo włączone, i mogą być manipulowane wiele razy. W związku z tym możliwe jest wygenerowanie dowolnej liczby zmian w szczepie. Ponadto można zminimalizować wpływ biegunowy na geny znajdujące się za miejscem modyfikacji, co pozwala na bardziej precyzyjną modyfikację organizmu13.
Aby wygenerować zmutowane szczepy, najpierw konstruowane są plazmidy samobójcze zawierające dwa fragmenty DNA identyczne z regionami w chromosomie cyjanobakteryjnym flankującym gen, który ma zostać usunięty (określane jako regiony flankujące 5' i 3'). Dwa geny są następnie wprowadzane między te flankujące regiony. Jeden z nich koduje białko oporności na antybiotyki; drugi koduje SacB, który wytwarza lewansukrazę, związek nadający wrażliwość na sacharozę. W pierwszym etapie procesu generowane są oznaczone mutanty, czyli szczepy zawierające jakieś obce DNA. Konstrukt plazmidowy jest mieszany z komórkami sinicowymi, a DNA jest naturalnie pobierane przez organizm. Transformanty są wybierane poprzez wzrost na płytkach agarowych zawierających odpowiedni antybiotyk i zmutowany genotyp weryfikowany metodą PCR. Plazmidy samobójcze nie mogą replikować się w obrębie szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. W związku z tym wszelkie kolonie oporne na antybiotyki będą wynikać ze zdarzenia rekombinacji, w wyniku którego gen będący przedmiotem zainteresowania zostanie wstawiony do chromosomu. Aby wygenerować nieoznaczone mutanty, oznaczony mutant jest następnie mieszany z drugim plazmidem samobójczym zawierającym tylko obszary flankujące 5' i 3'. Jeśli jednak wymagana jest insercja obcego DNA, można użyć plazmidu składającego się z regionów flankujących 5' i 3' z kasetą zawierającą interesujące geny wstawione między te fragmenty DNA. Selekcja odbywa się poprzez wzrost na płytkach agarowych zawierających sacharozę. Ponieważ sacharoza jest śmiertelna dla komórek, gdy produkt genu sacB ulega ekspresji, jedynymi komórkami, które przeżywają, są te, w których wystąpiło drugie zdarzenie rekombinacji, w wyniku którego gen wrażliwości na sacharozę, oprócz genu oporności na antybiotyki, został rekombinowany z chromosomu do plazmidu. W wyniku wymiany rekombinacyjnej do chromosomu wprowadzane są regiony flankujące i wszelkie DNA między nimi.
Z powodzeniem wykorzystaliśmy te metody do generowania wielu mutacji chromosomowych w tym samym szczepie Synechocystis sp. PCC6803 (dalej określanym jako Synechocystis)13,14, do wprowadzenia mutacji jednopunktowych do interesującego genu13 oraz do ekspresji kaset genowych. Chociaż generowanie nieoznaczonych nokautów zostało zademonstrowane przed naszymi pracami w Synechocystis15,16, szczegółowa metoda, wspomagana wizualną prezentacją krytycznych kroków, nie jest publicznie dostępna. Tę samą metodę zastosowaliśmy również do generowania oznaczonych nokautów w innym modelu cyjanobakterii, Synechococcus sp. PCC7002 (zwanym dalej Synechococcus). Protokół ten zapewnia jasną, prostą metodę generowania mutantów oraz szybki protokół walidacji i przechowywania tych szczepów.

<table><tbody><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>kwas cytrynowy</td><td>Sigma</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>Fisher</td><td>EDT002</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Sigma</td><td>339067</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Sigma</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4.2H2O</td><td>Sigma</td><td>331058</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Co(NO3)2.6H2O</td><td>Sigma</td><td>239267</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian żelazowo-amonowy</td><td>Sigma</td><td>F5879</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>Fisher</td><td>SODC001</td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>Sigma</td><td>T1375</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>SODH001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>cyjanokobalamina</td><td>Sigma</td><td>47869</td><td></td></tr><tr><td>Na2S2O3</td><td>Sigma</td><td>72049</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakto</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>SUC001</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 90 mm potrójnie wentylowana</td><td>Greiner</td><td>633185</td><td></td></tr><tr><td>0,2 &micro; m filtry</td><td>Sartorius</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>100 ml kolby stożkowe</td><td>Pyrex</td><td>CON004</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 100 mm x 38&nbsp; m</td><td>Bemis</td><td>FIL003</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polimeraza DNA o wysokiej wierności&nbsp;</td><td>Phusion</td><td>F-530</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do oczyszczania DNA&nbsp;</td><td>MoBio</td><td>12100-300</td><td></td></tr><tr><td>Endonukleazy restrykcyjne</td><td>Ligaza NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria Bertani</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>14 ml probówka okrągłodenna</td><td>BD falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA GoTaq G2 Flexi</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>425-600 &micro; m koraliki szklane</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Żarówki fluorescencyjne</td><td>Gro-Lux</td><td>69</td><td></td></tr><tr><td>HT multitronowy fotobioreaktor</td><td>Infors</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyjanobakterie są ekologicznie ważnymi organizmami i potencjalnymi platformami do produkcji biopaliw i użytecznych produktów przemysłowych. Manipulacja genetyczna sinicami, zwłaszcza organizmami modelowymi, takimi jak Synechocystis sp. PCC6803 i Synechococcus sp. PCC7002, jest kluczowym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Wytwarzanie nieoznaczonych mutantów, w wyniku których zmiany chromosomowe są wprowadzane do szczepu poprzez wprowadzenie kasety oporności na antybiotyki (podatny na manipulację fragment DNA zawierającego jeden lub więcej genów), a następnie usunięcie tej kasety za pomocą ujemnego markera selekcyjnego, jest szczególnie skuteczną techniką. Nieoznaczone mutanty mogą być wielokrotnie manipulowane genetycznie, co pozwala na wprowadzenie do szczepu dowolnej liczby zmian. Ponadto pożądany jest brak genów kodujących białka oporności na antybiotyki w zmutowanym szczepie, ponieważ pozwala to uniknąć możliwości "ucieczki" organizmów opornych na antybiotyki do środowiska. Jednak szczegółowe metody powtarzających się rund manipulacji genetycznej sinicami nie są dobrze opisane w literaturze naukowej. W tym miejscu przedstawiamy wyczerpujący opis tej techniki, którą z powodzeniem wykorzystaliśmy do generowania mutantów z wielokrotnymi delecjami, mutacjami jednopunktowymi w obrębie genu będącego przedmiotem zainteresowania oraz insercją nowych kaset genowych.

Konstrukcja plazmidu jest kluczowa dla pomyślnego generowania zarówno oznaczonych, jak i nieoznaczonych mutantów. Rycina 1 przedstawia przykład plazmidu A i B użytego do wygenerowania mutanta delecji w genach Synechocystis cpcC1 i cpcC213. W każdym przypadku obszary flankujące 5' i 3' wynoszą około 900-1000 pz. Można zastosować zredukowane regiony flankujące, chociaż najmniejszy, który z powodzeniem przetestowaliśmy, wynosił około 500...

Wprowadzanie wielu zmian genomowych do cyjanobakterii jest niezbędnym narzędziem w rozwoju szczepów do celów przemysłowych i badań podstawowych. Opisano system generowania nieoznaczonych mutantów w modelowym gatunku sinic Synechocystis sp. PCC6803 oraz znakowanych mutantów w Synechococcus sp. PCC7002.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie systemu generowania nieoznakowanych mutantów w gatunku sinic Synechocystis PCC6803 i znakowanych mutantów w gatunkach Synechococcus PCC7002. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki sinic. Na przykład, jak wprowadzić zmiany chromosomowe do szczepu.Poprzez wprowadzenie genu oporności na antybiotyki, a następnie usunięcie tej kasety przy użyciu ujemnego markera selekcyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że szczepy mogą być wielokrotnie manipulowane genetycznie. Pozwala to na wprowadzenie do szczepu tylu zmian, ile jest to pożądane.Po przygotowaniu pożywki, szczepów sinic i plazmidów, zgodnie z protokołem tekstowym. Przygotuj świeżą hodowlę, zaszczepiając pętlę pełną komórek sinicowych w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę w świetle w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni, do OD7500, równego 0,2 do 0,6.Po inkubacji odwirować od jednego do dwóch mililitrów kultury w stężeniu 2 300 g przez pięć minut. Następnie, po odrzuceniu supernatantu, należy użyć pożywki BG11 do jednokrotnego umycia granulek, delikatnie pipetując w celu ponownego zawieszenia komórek. Ponieważ wirowanie może spowodować utratę pilusów, które są niezbędne do wychwytu DNA.Po ponownym granulowaniu komórek i usunięciu supernatantu, dodaj pożywkę BG11 do końcowej objętości 100 mikrolitrów i przenieś komórki do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Następnie dodaj 1 mikrogram wcześniej przygotowanego plazmidu A do komórek. I delikatnie stuknij, aby wymieszać.Następnie połóż probówki poziomo w inkubatorze w temperaturze 30 stopni Celsjusza i inkubuj przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji rozprowadzić podwielokrotności mieszaniny plazmidowego DNA z hodowli komórkowej na płytkach agarowych BG11 bez antybiotyków. I inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Około 24 godziny później przygotuj 0,6% roztwór agaru w wodzie zawierającej kanamycynę. I pozwól mu ostygnąć do 42 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 2,5 do trzech mililitrów na krawędzie płytek hodowlanych i przechyl płytkę, aby roztwór utworzył równą górną warstwę agaru na powierzchni.Inkubuj płytki przez około siedem dni, aby kolonie były widoczne. Następnie podziel świeżą płytkę z agarem BG11 i kanamycyną na sześć sektorów. I użyj wykałaczki z końcem, aby usunąć pojedyncze kolonie.Aby przeprowadzić PCR, aby potwierdzić oznaczony nokaut, przenieś niewielką ilość komórek do probówki zawierającej 50 mikrolitrów wody i około 20 425 do 600 mikrometrów szklanych kulek. Potrząsaj komórkami i kulkami z prędkością około 2 000 obr./min przez pięć minut, a następnie wiruj z prędkością 15 700 g przez pięć minut. Następnie użyj pięciu mikrolitrów supernatantu, aby przygotować 50 mikrolitrowe reakcje PCR z wstępnymi praktykami sczepnego DNA.Aby zweryfikować mutanty, po zaprojektowaniu starterów zgodnie z protokołem tekstowym, należy amplifikować produkt za pomocą następującego programu i dołączyć kontrolę typu dzikiego. Za pomocą elektroforez żelowych sprawdź genotyp transformantów nokautujących. Pokazuje pasmo około czterech kilopar zasad i nie ma pasma typu dzikiego.Więcej informacji można znaleźć w protokole tekstowym. Jeśli pasmo typu dzikiego jest nadal obecne, ponownie nałóż szczep na świeżą płytkę i powtórz PCR. Powtarzaj proces walidacji, aż mutant zostanie oddzielony, a w reakcji PCR nie zaobserwuje się prążka typu dzikiego.W przypadku szczepu, który wykazuje wyraźny profil mutanta, ponownie nałóż smugi na świeżą płytkę, aby użyć do wygenerowania nieoznaczonego nokautu. Aby wygenerować nieoznaczone mutanty Synechocystis, należy skonfigurować świeżą hodowlę oznaczonego nokautu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę przez dwa do trzech dni, aby i OD750, równy 0,2 do 0,6.Odwirować 10 mililitrów kultury w stężeniu 2,300 g przez pięć minut i wyrzucić supernatant. Następnie użyj pożywki BG11, aby delikatnie umyć komórki. Po dodaniu BG11 do końcowej objętości 200 mikrolitrów i przeniesieniu komórek do 14-mililitrowej probówki z okrągłym dnem, dodaj 1 mikrogram plazmidu B DNA do komórek i delikatnie postukaj, aby wymieszać.Następnie połóż probówki poziomo w inkubatorze i inkubuj przez cztery do sześciu godzin. Po inkubacji dodać 1,8 mililitra pożywki BG11 i inkubować próbki przez łącznie cztery dni z wytrząsaniem. Jest to wystarczający czas, aby umożliwić zajście rekombinacji w wielu kopiach chromosomów.Umieść 50, 10 i 1 mikrolitrowe podwielokrotności przekształconej kultury na płytkach BG11 plus 5% sacharozy i inkubuj przez około siedem dni w celu wytworzenia pojedynczych kolonii. Następnie, za pomocą wykałaczki z końcem, wykluć od 30 do 50 pojedynczych kolonii na płytkach BG11 i kanamycyny. Następnie nałóż plaster na BG11 plus 5% sacharozy.Kolonie, które rosną na BG11 plus sacharoza, ale nie na płytkach z kanamycyną, są potencjalnymi nieoznaczonymi nokautami. Kolonie, które rosną na obu płytkach, prawdopodobnie są odporne na sacharozę z powodu mutacji w genie sacB. Postępując zgodnie z metodą PCR, zademonstrowaną wcześniej w tym filmie, zweryfikuj nieoznaczone nokaucje, które wytworzą opaskę żelową odpowiadającą rozmiarowi typu dzikiego pomniejszoną o usunięty obszar.Jeśli szczep wykazuje nieoznaczony profil zmutowany, należy go ponownie nałożyć na świeży agar BG11 bez antybiotyków. Aby przechowywać szczepy przez długi czas, należy skonfigurować świeżą kulturę szczepu, zaszczepiając pętlę pełną komórek w 30 do 50 mililitrach pożywki BG11. Hoduj kulturę przez trzy do czterech dni, aby OD750 był równy 0,4 do 0,7.Po jednokrotnym umyciu komórek BG11 należy ponownie zawiesić osad w około dwóch mililitrach BG11. Dodaj 0,8 mililitra skoncentrowanych komórek do jednej probówki. Następnie dodaj 0,2 mililitra 80% sterylizowanej glicerolu z filtrem.Do innej probówki dodaj 0,93 mililitra skoncentrowanych komórek i 0,07 mililitra DMSO. Przechowuj obie probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby ożywić szczepy, wyjmij rurkę i użyj wykałaczki z końcem, aby zeskrobać niektóre komórki na płytkę agarową bez antybiotyków.Następnie użyj sterylnej pętelki, aby rozprowadzić smugi jak zwykle. Na rysunku przedstawiono przykłady plazmidów A i B używanych do generowania mutantów delecyjnych. W każdym przypadku pięć pierwszych i trzy pierwsze regiony planowania to w przybliżeniu od 900 do 1 000 par zasad.Plazmid B może również zawierać kasetę genową między pięcioma pierwszymi i trzema pierwszymi regionami flankującymi około jednej pary kilozasad. Lub zmodyfikowana wersja natywnej sekwencji genów. Po transformacji z plazmidem A po siedmiu do 10 dniach na płytce pojawi się kilkaset kolonii.Jeśli geny nie są niezbędne, a mutanty wykazują wzrost, podobny do szczepu typu dzikiego, wówczas wszystkie chromosomy powinny zawierać kopię wstawionej sekwencji npt1 / sacB, jak określono za pomocą PCR. Jeśli geny nie są niezbędne, a mutanty rosną powoli, konieczne jest kilka rund ponownego nawijania smug ze wzrostem stężenia kanamycyny, aby uzyskać wydzielonego oznaczonego mutanta. Jeśli po ponownym pręgowaniu nie uzyska się oznaczonego mutanta, gen jest prawdopodobnie niezbędny do przeżycia.Większość pojedynczych kolonii, uzyskanych w wyniku transformacji z plazmidem B, będzie wrażliwa na kanamycynę i odporna na sacharozę. Jak wykazano tutaj, amplifikacja PCR regionu docelowego w tych koloniach pokazuje, że prawie 100% nieoznaczonego profilu mutanta. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu kilku godzin przez okres sześciu tygodni, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o użyciu sterylnej techniki. Zgodnie z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak pomiar produkcji tlenu lub spektrometria mas chromatografii gazowej, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak pomiar szybkości fotosyntezy lub produkcja metabolitów. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie genetyki sinic.Zbadanie kluczowych procesów biochemicznych i fizjologicznych w tej gromadzie oraz szczepów rozwojowych do celów przemysłowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować nieoznaczone nokauty w gatunkach Synechococcus PCC6803.

generation-marked-markerless-mutants-model-cyanobacterial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Weber, N., et al., Naturalna transformacja, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna. J. Vis. Exp. (2022)Ten film opisuje procedurę przeprowadzania naturalnej transformacji w nitkowatych sinicach przy użyciu plazmidowego DNA w celu uzyskania stabilnej ekspresji GFP i oporności na antybiotyki poprzez rekombinację homologiczną.

Naturalna przemiana i ekspresja GFP w nitkowatych Cyanobacterium Phormidium lacuna

Źródło: Lea-Smith, D. J., et al. Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic. J. Vis. Exp. (2016)Film przedstawia metodę generowania mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach. Protokół rozpoczyna się od hodowli sinic, po której następują etapy wirowania i mycia, które zachowują pilusy powierzchniowe. Następnie wprowadza się plazmid niosący gen oporności na antybiotyki otoczony sekwencjami homologicznymi. Podczas inkubacji plazmid jest internalizowany...

Wytwarzanie mutantów znakowanych antybiotykami w sinicach poprzez rekombinację homologiczną

Wrażliwe na temperaturę (ts) śmiertelne mutanty są cennymi narzędziami do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. W tym miejscu opisujemy metody generowania i klasyfikowania letalnych mutantów ts o wysokiej przepustowości.

Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Phormidium lacuna to nitkowata cyjanobakteria, która została wyizolowana z morskich basenów skalnych. W artykule opisano izolację włókien ze źródeł naturalnych, ekstrakcję DNA, sekwencjonowanie genomu, naturalną transformację, ekspresję sfGFP, kriokonserwację i metody ruchliwości.

Naturalna przemiana, ekspresja białek i kriokonserwacja nitkowatego Cyanobacterium Phormidium lacuna

Ten protokół dostarcza wyczerpujących wytycznych dotyczących konfiguracji i ilościowego monitorowania kokultur, w tym fotoautotroficznych cyjanobakterii wydzielających cukier i drożdży heterotroficznych.

Składanie i kwantyfikacja kokultur łączących drożdże heterotroficzne z fototroficznymi cyjanobakteriami wydzielającymi cukier

Za pomocą elektrycznej stymulacji o wysokiej częstotliwości w organizmach Drosophila można wywołać aktywność przypominającą napady drgawkowe. Aktywność ta jest łatwo rejestrowana z systemu włókien olbrzymich.

Analizy obwodów neuronowych w celu badania napadów u mutantów Drosophila z epilepsją

Naucz się generowania znakowanych i bezznacznikowych mutantów w sinicach Synechocystis sp. PCC6803 oraz Synechococcus sp. PCC7002. Ta metoda umożliwia wielokrotne modyfikacje genetyczne chromosomu.

Generowanie znakowanych i bezznacznikowych mutantów w modelowych gatunkach sinic

Przeglądaj więcej filmów