Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Ogólnym celem poniższych technik jest przeszkolenie początkujących badaczy do pracy ze Streptomyces i innymi pokrewnymi gatunkami w środowisku uniwersyteckim, dydaktycznym, laboratoryjnym i szkolnym. Obserwacja fenotypowa jest ważna dla wielu badaczy zajmujących się badaniami nad Streptomyces. Ten film opisuje metody namnażania się bakterii, przechowywania oraz badania wzrokowego i mikroskopowego.

Opisane tutaj metody phenotpyingu wykorzystują Streptomyces coelicolor jako model. Metody te mają jednak zastosowanie do wszystkich członków dużego rodzaju, jak również do blisko spokrewnionych Actinomyces. Główną zaletą tych technik jest to, że są one zaprojektowane tak, aby były dostępne dla początkujących badaczy w klasie szkoły średniej lub laboratorium nauczycielskim na studiach licencjackich, a także dla doświadczonego personelu laboratoryjnego.

Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu dołączonego protokołu, nowi badacze powinni być w stanie manipulować swoimi szczepami Streptomyces, odpowiednio je przechowywać i rozpocząć eksperymenty z charakterystyką wizualną. Procedury zademonstrują Garret Kandell i Sean Kirk, studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium na Uniwersytecie Otterbein. Na początek użyj standardowej metody, takiej jak metoda smug kwadrantowych zademonstrowana w Saunders 2012, aby umieścić szczepy Streptomyces na płytkach agarowych MS i wyhodować je w pojedynczych koloniach.

Co cztery do sześciu dni zbieraj pojedynczą kolonię i układaj ją ponownie na świeżym talerzu. Wraz z wiekiem kolonie stają się podatne na losowe mutacje. Po przeprowadzeniu mutagenezy zgodnie z protokołem tekstowym należy zwrócić uwagę na morfologię kolonii dla każdego mutanta w porównaniu ze szczepem rodzicielskim typu dzikiego.

Charakteryzując nowe gatunki Streptomyces, porównaj nowy izolat z dobrze zbadanym gatunkiem, zwracając uwagę na podstawowy kształt, powierzchnię kolonii, nieprzezroczystość, wysokość i pigmentację. Oznacz płytkę agarową MS i smuguj szczepy typu dzikiego i zmutowane we wzory klinowe. Uważaj, aby żaden szczep nie dotykał innego szczepu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.

Zanotuj datę i godzinę, kiedy szczepy są rozmazywane na talerzu. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pamiętaj, że niezwykle ważne jest, aby zawsze chronić próbkę Streptomyces przed zanieczyszczeniem.

Używaj swojej najlepszej sterylnej techniki na wszystkich etapach, otwierając płytki i probówki przez jak najkrótszy czas. Umieść wyrośnięte szalki Petriego na kolorowym lub białym papierze, aby ujednolicić tło. Napisz na papierze nazwę szczepu, datę, temperaturę inkubacji i czas od pierwszego smugowania płytki.

Zrób cyfrowe zdjęcia płyty z informacjami o naprężeniu zapisanymi na tle papieru, aby zminimalizować zamieszanie. Wysterylizuj pęsetę, myjąc ją w 70% etanolu, a następnie przepuszczając przez płomień palnika Bunsena w celu odparowania etanolu. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe, myjąc je w 70% etanolu, a następnie pozwalając im wyschnąć na sterylnej szalce Petriego.

Następnie, aby przygotować nakrywkę do liftingu bakterii, użyj sterylnej pęsety, aby podnieść sterylne szkiełko nakrywkowe i umieść szkiełko nakrywkowe na płytce agarowej MS, gdzie rozwój bakterii jest gęsty. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij tylną część szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i grzybni powietrznej. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je pod kątem 45 stopni, tak aby materiał komórkowy był skierowany do powierzchni szkiełka mikroskopowego zawierającego 15 mikrolitrów kropli 50% glicerolu.

Pozwól, aby szkiełko nakrywkowe opadło na glicerol, co zmniejszy pęcherzyki powietrza. Aby wykonać mikroskopię z kontrastem fazowym w różnych odstępach czasu, umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj kroplę olejku immersyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Obróć obiektyw fazowy 100x na miejsce i ustaw wieżyczkę skraplacza na odpowiednie ustawienie fazy.

Gdy soczewka obiektywu zetknie się z olejem, do ustawienia ostrości obrazu należy używać wyłącznie pokrętła precyzyjnej regulacji. Zbadaj kilka pól widzenia, aby dostrzec zauważalne i spójne różnice między zmutowanymi szczepami a typem dzikim. Takich jak zdolność do tworzenia zarodników, wielkość i kształt zarodników oraz ogólna liczba zarodników.

Za pomocą sterylnej pęsety przygotuj szkiełko nakrywkowe z płytki agarowej MS, tak jak poprzednio, gdzie widoczny jest rozwój bakterii, delikatnie dotykając pęsetą tylnej części szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakteryjnych i włókien powietrznych. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je na kartonie tak, aby strona z materiałem komórkowym była skierowana do góry, aby ułatwić i manipulować szkiełkiem nakrywkowym. Lodowatym metanolem zalej szkiełko nakrywkowe i pozostaw na pięć minut.

Za pomocą PBS umyj szkiełko nakrywkowe dwa razy, delikatnie dozując i usuwając roztwór. Dodać 15 mikrolitrów 10 mikrogramów na mililitr roztworu jodku propidyny i lub 10 mikrogramów na mililitr WGA-FITC do szkiełka. Połóż szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na kropli fluorescencyjnej plamy.

Próbki należy inkubować w zaciemnionym lub słabo oświetlonym pomieszczeniu przez 15 minut. Zapasy barwników fluorescencyjnych i próbek plam należy chronić przed światłem. Zaleca się, aby badacze korzystali z warunków słabego oświetlenia podczas przygotowywania próbek i używali ciemnego pudełka do przechowywania próbek po ich przygotowaniu.

Obserwuj szkiełka pod soczewką obiektywową 100x za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mikroskopu DIC wyposażonego w kostki wzbudzenia epifluorescencji dla jodku propidyny i FITC. Przeanalizuj obrazy zgodnie z protokołem tekstowym. Przedstawiono przykłady mutantów Streptomyces powstałych w wyniku mutagenezy transpozonów.

Jaśniejsza grzybnia powietrzna może wskazywać na niższy poziom szarego pigmentu spowodowany defektem zarodnikowania. Lub brak rozmytego wyglądu wskazuje na blok w tworzeniu się grzybni powietrznej. Jak widać za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, kolonie S. coelicolor typu dzikiego zazwyczaj wytwarzają grzybnię powietrzną po około dwóch dniach wzrostu.

I długie łańcuchy zarodników przez trzy dni wzrostu. Białe mutanty mogą być opóźnione w tworzeniu się zarodników, wykazywać zmniejszenie obfitości wytwarzanych zarodników, wytwarzać zarodniki z wadami kształtu i/lub wielkości lub po prostu wytwarzać niższe poziomy dojrzałego, szarego pigmentu zarodników. Pokazane tutaj przy użyciu mikroskopii DIC i fluorescencji z barwieniem PI, regularne barwienie łańcucha zarodników w próbce typu dzikiego jest porównywane z przerywanym wzorcem barwienia dla dwóch mutantów insercji transpozonów, które wykazują defekt segregacji chromosomów.

Użycie WGA-FITC do barwienia ściany komórkowej szczepu dzikiego typu S.venezuelae jest obecny w postaci gładkich włókien powietrznych wśród łańcuchów zarodników. I wykazuje boczny układ przegród podziałowych, które są zwykle widoczne podczas zarodnikowania. Praca z organizmem nitkowatym bardzo różni się od pracy z dobrze znaną bakterią w kształcie pręcika.

Przedstawione tutaj protokoły wideo powinny służyć jako ważne źródło informacji dla zupełnie nowych badaczy wkraczających w dziedzinę badań nad Streptomyces. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpocząć badanie gatunków Streptomyces i innych pokrewnych bakterii. Po tych wstępnych eksperymentach, w laboratorium badawczym można zastosować różne techniki, aby dowiedzieć się więcej o szczepach Streptomyces.

Na przykład niektóre z zaawansowanych technik mogą obejmować znakowanie białek lub analizy ekspresji genów, takie jak PCR w czasie rzeczywistym i sekwencja RNA. Wstępne eksperymenty fenotypowania są wykorzystywane do identyfikacji i charakterystyki nowych szczepów oraz rozpoznania typowej roli określonego genu. Metody te były już stosowane w uniwersyteckich laboratoriach dydaktycznych do identyfikacji i charakterystyki szerokiej gamy szczepów Streptomyces.