Name: Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metody fenotypowania bakterii Streptomyces dla badań mikrobiologicznych przy użyciu Streptomyces coelicolor. Techniki obejmują mikroskopię kontrastu fazowego i fluorescencyjne barwienie próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Uniwersytetowi Otterbein za stypendia dla studentów studiów licencjackich oraz nagrody Studenckiego Funduszu Badawczego dla GVK i SGK; oraz Otterbein Professor Gilbert E. Mills Memorial Endowed Sabbatical Program Award oraz The Department of Biology and Earth Science Faculty Research and Scholarship Endowed Award dla JAB. and Jane Horn Endowed Student Research Fund in the Sciences został przyznany GVK i SGK. Autorzy chcieliby również wyrazić wdzięczność za stypendia w ramach programu badań licencjackich ufundowane przez Uniwersytet Duquesne dla GVK i SGK. Byli studenci studiów licencjackich Juniata College, Ryan Johnson i Lindsey Draper, przyczynili się do powstania obrazów mikroskopowych odpowiednio na rysunkach 2 i 3.

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych, roztworów i szalek Petriego
<ol>
	<li>Wykałaczki w autoklawie w zlewce o pojemności 50 ml pokrytej folią aluminiową, aby zachować sterylność.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie suche produkty, które będą używane (końcówki, patyczki, szkło itp.) w autoklawie. 
	UWAGA: Uwaga! Postępuj zgodnie ze wszystkimi wskazówkami bezpieczeństwa dla używanego modelu autoklawu. Autoklawy stwarzają ryzyko wybuchu i oparzeń parą wodną oraz kontaktem z gorącymi powierzchniami, materiałami i mediami. Aby zapewnić bezpieczeństwo autoklawu, zobacz "Prawidłowe korzystanie z autoklawów"34.</li>
	<li>Przygotuj agar MS (Mannitol Soya Flour (SFM))14 do uprawy kultur.
	<ol>
		<li>Dodać 5 g mąki sojowej i 5 g agaru do kolby o pojemności 1 l.</li>
		<li>Rozpuścić 5 g mannitolu w 250 ml wody z kranu i rozlać do kolby zawierającej mąkę sojową i agar.</li>
		<li>Dodać korek piankowy i folię do otworu kolby i autoklawu w temperaturze 121 °C, 15 psi przez co najmniej 30 min. 
		UWAGA: To podłoże łatwo kipi. Użyj kolby, która może pomieścić co najmniej czterokrotność rzeczywistej objętości agaru MS poddawanego autoklawizowi. Standardowy szybkowar może być używany zamiast autoklawu z podobnymi względami bezpieczeństwa. Alternatywnie, kuchenka mikrofalowa może być używana do sterylizacji mediów i materiałów, jeśli dostęp do autoklawu nie jest możliwy35,36. Nauczyciele szkół średnich mogą również chcieć współpracować z lokalnymi szkołami wyższymi lub uniwersytetami, aby uzyskać dostęp do materiałów sterylizowanych w autoklawie.</li>
		<li>Schłodź nośnik, aż będzie wystarczająco wygodny, aby można go było obsługiwać. Należy uważać, aby nie schładzać go zbyt długo, ponieważ agar krzepnie w temperaturach poniżej 50 °C.</li>
		<li>Wlać agar MS z kolby do sterylnych szalek Petriego, aż dno każdej szalki Petriego będzie wypełnione w przybliżeniu do połowy (około 25 ml pożywki na szalkę Petriego). Pozostawić do zestalenia się przed użyciem płytek agarowych. Przechowuj płytki agarowe w plastikowej torbie w temperaturze pokojowej, aż będą potrzebne. 
		UWAGA: Płytki agarowe mogą być również przechowywane w lodówce, zwłaszcza jeśli w pożywce potrzebne są antybiotyki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Smugi Streptomyces na płytkach do rozmnażania
<ol>
	<li>Smugi Streptomyces szczepy na płytkach agarowych MS do pojedynczych kolonii przy użyciu standardowej metody, takiej jak metoda smug kwadrantowych, jak pokazano w Sanders, 201237. 
	UWAGA: Można użyć pętli do zaszczepiania lub sterylnych wykałaczek. Opcjonalnie: Inne podłoża są powszechnie używane dla gatunków Streptomyces, takie jak R2YE i minimal media14.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Zmieniaj płytki, zbierając pojedynczą kolonię co 4–6 dni. Wraz z wiekiem kolonie stają się podatne na losowe mutacje.</li>
</ol>
3. Tworzenie zapasów grzybni glicerolu do przechowywania bakterii
UWAGA: Zapasy grzybni mogą być tworzone dla wszystkich szczepów Streptomyces, w tym szczepów whi i bld oraz innych mutantów rozwojowych, które nie są w stanie zakończyć zarodnikowania.
<ol>
	<li>Macerować 15–20 kolonii w 200–500 μl 20% glicerolu za pomocą sterylnego drewnianego aplikatora kołkowego.</li>
	<li>Przenieś gnojowicę z macerowanych kolonii do probówki hodowlanej do zamrażarki o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety lub sterylnej pipety do przenoszenia. 
	UWAGA: Podstawy korzystania z mikropipet są omówione w innym miejscu38.</li>
	<li>Dodaj tyle 20% glicerolu, aby uzyskać ostateczną objętość 1 ml i delikatnie wymieszaj. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Uwaga! Używaj kriogenicznych rękawic ochronnych i fartucha laboratoryjnego, aby chronić skórę przed kontaktem z ekstremalnym zimnem. Alternatywnie można zastosować zamrażarkę o temperaturze -20 °C, która może skrócić czas długotrwałego przechowywania. Unikaj nadmiernego zamrażania i rozmrażania, aby przedłużyć żywotność.</li>
</ol>
4. Tworzenie zapasów zarodników glicerolu dla szczepów zdolnych do zarodnikowania
UWAGA: Zapasy zarodników są preferowane dla długoterminowej żywotności, ale są możliwe tylko dla szczepów, które są zdolne do zakończenia zarodnikowania.
<ol>
	<li>Rozprowadź 100 μl zmacerowanego materiału (z kroku 3.1) na płytce agarowej, aby uzyskać zlewający się trawnik wzrostu37. 
	UWAGA: Poszycie rozsiewane jest pokazane w Sanders37 (Modyfikacja: Gramofon nie jest wymagany.). Płytkę można obracać jedną ręką, a drugą ręką przesuwać rozsiewacz delikatnym ruchem w przód iw tył po podłożu agarowym.
	<ol>
		<li>Odmierzyć pipetą 100 μl macerowanej grzybni na środek płytki agarowej MS.</li>
		<li>Wysterylizuj szklane lub metalowe narzędzie do rozprowadzania, częściowo zanurzając je w 70% etanolu i powoli przepuszczając rozsiewacz przez płomień palnika Bunsena, aby przyspieszyć parowanie etanolu. 
		UWAGA: Etanol jest wysoce łatwopalny. Nie umieszczaj płonącego rozsiewacza w etanolu ani nie pozwól, aby płonąca kropla etanolu wpadła do naczynia z etanolem. Alternatywnie użyj jednorazowego sterylnego wacika, aby rozprowadzić bakterie na talerzu, który nie wymaga etanolu ani płomienia.</li>
		<li>Obrócić płytkę agarową MS jedną ręką, wykonując ruchy w przód iw tył, aby zaszczepić płytkę sterylnym rozsiewaczem.</li>
		<li>Inkubować przez 5–7 dni w temperaturze 30 °C, aż szczep będzie dobrze zarodnikowany. 
		UWAGA: Czas inkubacji będzie się różnić w zależności od gatunku i szczepu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 2 ml sterylnej soli fizjologicznej (0,8% NaCl) do środka zlewającego się trawnika komórek Streptomyces, który został poddany zarodnikowaniu.</li>
	<li>Zbierz zarodniki, delikatnie pocierając powierzchnię grzybni sterylną pętlą zaszczepiającą (lub wacikiem), powoli przesuwając się w kierunku krawędzi trawnika.</li>
	<li>Odpipetować sól fizjologiczną zawierającą zarodniki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Energicznie wiruj, aby rozbić łańcuchy zarodników na pojedyncze komórki.</li>
	<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy około 2 500 x g.</li>
	<li>Odpipetować supernatant i wyrzucić. Rozproszyć osad zarodników przez energiczne mieszanie wirowe w niewielkiej ilości pozostałej cieczy.</li>
	<li>Ponownie zawiesić zarodniki w 1 ml 20% glicerolu, wciągając roztwór w górę iw dół za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieś wywar z zarodników glicerolu do probówki zamrażarki o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Używaj kriogenicznych rękawic ochronnych i fartucha laboratoryjnego, aby chronić skórę przed kontaktem z ekstremalnym zimnem. Alternatywnie można zastosować zamrażarkę o temperaturze -20 °C, która może zmniejszyć żywotność przy długotrwałym przechowywaniu. Unikaj nadmiernego zamrażania i rozmrażania, aby przedłużyć żywotność.</li>
</ol>
5. Wykonaj mutagenezę
<ol>
	<li>Przeprowadź mutagenezę w oparciu o pożądane wyniki, o których mowa we Wprowadzeniu i niedawno zrecenzowane przez Baltz, 201639. 
	UWAGA: Niektóre eksperymenty fenotypowania nie wymagają mutagenezy, np. zamiar identyfikacji nowych gatunków ze środowiska. Metody mutagenezy losowej obejmują użycie transpozonu8,9,10,11,12,13, promieniowanie UV lub chemikalia14. Mutageneza kierowana na stronę15,16,17,18,19,20 techniki mogą być używane do tworzenia określonych mutacji punktowych, delecji lub innych typów mutacji.</li>
</ol>
6. Porównaj i zapisz wygląd wizualny
<ol>
	<li>Zwróć uwagę na morfologię kolonii dla każdego mutanta w porównaniu ze szczepem rodzicielskim typu dzikiego po przerzuceniu wszystkich szczepów, jak w kroku 2. Porównaj nowy izolat z dobrze zbadanym gatunkiem, takim jak S. coelicolor lub S. venezuelae, podczas charakteryzowania nowych gatunków Streptomyces. Zwróć uwagę na cechy charakterystyczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), takie jak podstawowy kształt, powierzchnia kolonii (rozmyta, łysa, pomarszczona, itp.), krycie, wysokość i pigmentacja (rozróżnij grzybnię wegetatywną, grzybnię powietrzną i/lub otaczające podłoże).</li>
	<li>Oznacz płytkę agarową MS i rozłóż szczepy typu dzikiego i zmutowanego we wzory klinowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). Uważaj, aby żaden szczep nie dotykał innego szczepu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Zanotuj datę i godzinę, kiedy szczepy są rozmazywane na talerzu. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Umieść wyrośnięte szalki Petriego na kolorowym lub białym papierze, aby ujednolicić tło. Napisz na papierze nazwę szczepu, datę, temperaturę inkubacji i czas od pierwszego smugowania płytki. Zrób cyfrowe zdjęcie (zdjęcia) tabliczki z tymi ostatnimi informacjami zapisanymi na tle papieru, aby zminimalizować zamieszanie. 
	UWAGA: Napis może zostać wycięty ze zdjęcia w późniejszym czasie, jeśli ma być użyty do przygotowania figury.</li>
</ol>
7. Wykonaj mikroskopię z kontrastem fazowym
<ol>
	<li>Wysterylizuj pęsetę, myjąc ją w 70% etanolu, a następnie przechodząc przez płomień palnika Bunsena w celu odparowania etanolu. Pozostawić do ostygnięcia.</li>
	<li>Sterylizuj szkiełka nakrywkowe, myjąc je w 70% etanolu, a następnie pozwalając im wyschnąć na sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Przygotować szkiełko nakrywkowe z narośli bakterii, które mają być zbadane.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety podnieś sterylne szkiełko nakrywkowe i umieść je na płytce agarowej ze stwardnienia rozsianego, gdzie bakterie rozwijają się gęsto. Delikatnie dociśnij tył szkiełka nakrywkowego pęsetą, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i grzybni powietrznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je tak, aby strona z materiałem komórkowym była skierowana w stronę powierzchni szkiełka mikroskopowego, z 15 μl kropli 50% glicerolu przygotowanej w wodzie do montażu. Zmniejsz ilość pęcherzyków powietrza, umieszczając szkiełko nakrywkowe pod kątem 45° do szkiełka i pozwól mu opaść na 50% glicerolu.</li>
	<li>(Opcjonalnie) Uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci w celu konserwacji szkiełka.</li>
	<li>Mikroskopię z kontrastem fazowym należy wykonać zgodnie z opisem w Frohlich40 w różnych odstępach czasu podczas cykli życia. 
	UWAGA: Wielokrotne obrazowanie pozwala na pełniejszą analizę i możliwość wykrycia opóźnień w rozwoju. Niezależne powtórzenie obserwacji w celu zapewnienia dokładności i odtwarzalności.
	<ol>
		<li>Umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj kroplę olejku immersyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Obróć obiektyw fazowy 100X na miejsce i ustaw wieżyczkę skraplacza na odpowiednie ustawienie fazy "pasującej". Ustaw ostrość obrazu za pomocą tylko pokrętła precyzyjnej regulacji, gdy soczewka obiektywu styka się z olejem.</li>
		<li>Zbadaj kilka pól widzenia, aby dostrzec zauważalne i spójne różnice między zmutowanymi szczepami a typem dzikim, takie jak zdolność do tworzenia zarodników, rozmiar i kształt zarodników oraz ogólna liczba zarodników (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Alternatywą dla mikroskopii z kontrastem fazowym jest mikroskopia z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC) 40 oraz proste techniki barwienia do stosowania w mikroskopach jasnego pola41, takie jak barwienie fioletem krystalicznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną
<ol>
	<li>Wysterylizuj pęsetę, myjąc ją w 70% etanolu, a następnie przepuszczając przez płomień palnika Bunsena.</li>
	<li>Podnieś sterylne szkiełko nakrywkowe sterylną pęsetą i umieść na płytce z agarem ze stwardnienia rozsianego w miejscu, w którym widoczny jest rozwój bakterii. Delikatnie dotknij tylnej części szkiełka nakrywkowego pęsetą, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i włókien powietrznych.</li>
	<li>Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je tak, aby strona z materiałem komórkowym była skierowana do góry, na kartonie, aby ułatwić manipulowanie szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Zalej szkiełko nakrywkowe lodowatym metanolem (~300 μl dla szkiełka nakrywkowego 20 x 20mm2) i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. 
	UWAGA: Metanol jest mutagenem. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą.</li>
	<li>Umyj szkiełko nakrywkowe trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)42, delikatnie dozując i usuwając roztwór.</li>
	<li>Dodać 15 μl ze 100 μg/ml jodku propidyny i/lub 10 μg/ml aglutyniny z kiełków pszenicy sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny (WGA-FITC) wytworzonej w 50% glicerolu do znakowanego szkiełka mikroskopowego. 
	UWAGA: Jodek propidyny barwi DNA na czerwono, aby wykryć lokalizację chromosomalnego DNA, podczas gdy WGA-FITC barwi ścianę komórkową na zielono.</li>
	<li>Odwróć szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na kroplę fluorescencyjnej plamy na szkiełku. (Opcjonalnie) uszczelnić przezroczystym lakierem do paznokci w celu zachowania szkiełka. Ponieważ barwniki są wrażliwe na światło, inkubuj przez 15 minut w zaciemnionym lub słabo oświetlonym pomieszczeniu.</li>
	<li>Obserwuj preparaty pod soczewką obiektywu 100X za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mikroskopu DIC wyposażonego w kostki wzbudzenia epifluorescencji dla jodku propidyny (zestaw filtrów "Texas Red" lub maksima wzbudzenia/emisji 535/617 nm) i FITC (zestaw filtrów FITC lub maksima wzbudzenia/emisji 490/525 nm).</li>
	<li>Umieść slajd na stoliku i ustaw ostrość za pomocą pokręteł regulacji zgrubnej i precyzyjnej.</li>
	<li>Obserwuj fluorescencję, jak pokazano w innym miejscu43.</li>
	<li>Skorzystaj z bezpłatnego pakietu oprogramowania do analizy obrazu, które może pomóc w identyfikacji zarodników o niższej intensywności fluorescencji44.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokoły dla początkujących badaczy Streptomyces w celu rozpoczęcia badań poprzez uwzględnienie kroków potrzebnych do rozmnażania szczepów i przygotowania zapasów do długoterminowego przechowywania. Następnie opisujemy protokoły wizualnej i mikroskopowej charakterystyki szczepów Streptomyces . Niektóre typowe początkowe etapy fenotypowania mutantów rozwojowych to: 1) wizualne badanie kolonii zmutowanych w porównaniu z koloniami typu dzikiego na pożywce agarowej; 2) mikroskopia z kontrastem fazowym; oraz 3) mikroskopia fluorescencyjna sporogennych strzępek powietrznych. W oparciu o fenotyp wyświetlany w tych trzech krokach, można zastosować różne techniki w celu dalszego rozpoznania fenotypu konkretnego szczepu.
Wstępne eksperymenty fenotypowe są powszechnie stosowane do charakteryzowania nowych gatunków, identyfikacji interesujących mutantów, częściowego charakteryzowania mutantów i rozpoczęcia rozpoznawania typowej roli konkretnego genu na podstawie fenotypu zidentyfikowanego mutanta. Opisane tu metody były już stosowane w uniwersyteckich laboratoriach dydaktycznych do identyfikacji i charakterystyki szerokiej gamy mutantów Streptomyces, w tym tych z defektami podziału komórek 48,49,50,51,52,53,54, zarodnikowaniem 55,56, tworzeniem grzybni powietrznej 57,58, produkcja antybiotyków59, sygnalizacja drugiego przekaźnika47 i segregacja chromosomów60. Techniki te są niezbędnymi pierwszymi krokami do określenia fenotypu mutantów w ogóle i ujawniają dużą ilość ważnych informacji na temat ról genów będących przedmiotem zainteresowania. Metody te można łatwo rozszerzyć na inne gatunki Streptomyces i były już używane do opisywania szczepów S. griseus, S. venezuelae, S. scabies i wielu innych paciorkowców. Oczekuje się, że opisane tutaj protokoły wideo posłużą jako ważne źródło informacji dla nowych badaczy wkraczających w obszary badań nad Streptomyces, takie jak odkrywanie leków. Obejmuje to nowych instruktorów, którzy pracują nad zwalczaniem kryzysu oporności na antybiotyki i kształcą niezliczoną liczbę nowych badaczy na studiach licencjackich, którzy dołączają do działań crowdsourcingowych w ramach Inicjatywy Mały Świat.
Opisane tutaj techniki można łatwo dostosować do użytku w klasach uniwersyteckich i licealnych, a także w laboratoriach badawczych, korzystając z modyfikacji opisanych w filmie i tekście. Studenci pierwszego roku modułu mikroskopowego w małym college'u sztuk wyzwolonych byli w stanie rozwarstwić szczepy, zrobić cyfrowe zdjęcia szczepów wyhodowanych na podłożach agarowych oraz wykonać mikroskopię z kontrastem fazowym i fluorescencyjną, co zakończyło się złożeniem portfolio wielopanelowych figur pod koniec 3-tygodniowego modułu, reprezentującego 15 godzin pracy w laboratorium. Około 160 studentów pierwszego roku było odpowiedzialnych za wstępne fenotypowanie 320 nowych mutantów transpozonów. Studenci studiów licencjackich z trzech instytucji uczestniczyli we wstępnym fenotypowaniu dodatkowych mutantów i późniejszej charakterystyce wielu szczepów. Kompleksowe dane uzyskane w stosunkowo krótkim czasie, ilustrują wartość opisywanych tu protokołów. Setki dodatkowych mutantów zostały zmagazynowane jako zapasy grzybni glicerolu do przyszłej charakterystyki.
Po wstępnych eksperymentach opisanych tutaj, można zastosować różne metody w celu rozszerzenia jakości informacji dotyczących szczepów będących przedmiotem zainteresowania. Jeżeli mutacja jest nieznana, należy zastosować metodę genotypowania w celu określenia typu i/lub lokalizacji mutacji. Na przykład losowa mutageneza transpozonów chromosomu 6,7,8,9,10,11,12,13 powoduje powstanie kolonii, które powinny zostać poddane wstępnym badaniom fenotypowym, takim jak te opisane powyżej. Następnie należy określić lokalizację transpozonu za pomocą techniki, takiej jak odwrócona reakcja łańcuchowa polimerazy (iPCR)61. Określenie genotypu nowo odkrytych mutantów jest ważnym krokiem po wstępnej charakterystyce.
Niektóre powszechnie stosowane zaawansowane metody późniejszej analizy fenotypowania, o których można wspomnieć w klasie lub zbadać w ramach dalszych badań, obejmują znakowanie zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w celu określenia wzorców lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania, analizy ekspresji genów, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) i globalne wzorce ekspresji genów typu dzikiego w porównaniu z mutantem za pomocą sekwencjonowania RNA (sekwencjonowanie RNA). Umiejętności fenotypowania są również wymagane do analizy komplementacji genetycznej. W eksperymencie komplementacji kopia genu typu dzikiego jest wprowadzana do zmutowanego szczepu w celu określenia, czy nowo dodany allel może zrekompensować utratę funkcji zmutowanego allelu. Konieczne jest porównanie fenotypu uzupełnionego szczepu zarówno z fenotypem oryginalnego mutanta, jak i rodzicielskiego szczepu typu dzikiego.

Streptomycetes to Gram-dodatnie, nitkowate bakterie glebowe znane ze swojej zdolności do wytwarzania różnych metabolitów wtórnych, w tym ponad dwóch trzecich dostępnych na rynku antybiotyków, a także leków przeciwnowotworowych, anty-HIV i przeciwpasożytniczych1. S. coelicolor jest najbardziej scharakteryzowanym genetycznie członkiem rodzaju2,3 i jest gatunkiem wykorzystywanym w opisanych tutaj metodach. S. coelicolor ma złożony cykl życiowy, który rozpoczyna się od wykiełkowania pojedynczego zarodnika, przechodząc do rozległej, rozgałęzionej grzybni wegetatywnej, która wyrasta na podłoże agarowe. W miarę postępu cyklu życiowego powstają włókna powietrzne, które łamią napięcie powierzchniowe grzybni substratowej i ostatecznie dzielą się na długie łańcuchy komórek, które ostatecznie przekształcają się w dojrzałe, szaro zabarwione zarodniki. Dyspersja tych nowo powstałych zarodników stanowi początek następnego cyklu życiowego4.
Ze względu na swój złożony wzór różnicowania, S. coelicolor służy jako doskonały model do badania rozwoju bakterii. Historycznie rzecz biorąc, mutacje skutkują blokami dla dwóch głównych etapów rozwoju i wytwarzają odrębne fenotypy wizualne. Mutanty bld (łyse) są blokowane do tworzenia grzybni powietrznej i skutkują brakiem rozmytej grzybni powietrznej, nadającej wygląd "łysej" kolonii. Mutanty zahamowane w tworzeniu i dojrzewaniu zarodników są określane jako mutanty whi (białe), ponieważ zazwyczaj nie wytwarzają dzikich poziomów szarego pigmentu zarodników, a grzybnia powietrzna pozostaje biała. Inne interesujące mutanty są hamowane w produkcji antybiotyków, podziale komórek, segregacji chromosomów lub innych ważnych procesach4,5.
Pomimo odkrycia wielu genów rozwojowych u gatunków Streptomyces, istnieje wiele innych praw, które istnieją na podstawie braku nasycenia zmutowanych ekranów. Nasze laboratoria kontynuują identyfikację nowych genów rozwojowych za pomocą skonstruowanego przez nas systemu mini-transpozonów. Nowe zmutowane szczepy wyizolowane w losowych eksperymentach mutagenezy z naszym transpozonem są poddawane fenotypowym badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania możliwej roli każdego odkrytego nowego genu6,7. Opisane tutaj metody fenotypowania bakterii są odpowiednie dla mutantów Streptomyces wyizolowanych metodą mutagenezy transpozonowej8,9,10,11,12,13 i innymi metodami losowymi, takimi jak mutageneza chemiczna i ultrafioletowa (UV)14, a także ukierunkowaną konstrukcję mutacji, takich jak delecje genów, za pomocą rekombinacji15,16 lub CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) technologia edycji genomu17,18,19 i mutacje punktowe20.
W miarę jak oporność na antybiotyki wśród patogenów staje się coraz bardziej powszechna, potrzeba nowych antybiotyków staje się coraz bardziej pilna21,22. "Small World Initiative" (lub SWI) to skuteczna nauka nauk ścisłych, technologii, inżynierii i matematyki (STEM) 23 i strategia badawcza24 w celu zwalczania oporności na antybiotyki poprzez crowdsourcing studentów, a ostatnio także uczniów szkół średnich. Wspierane kursy obejmują identyfikację nowych mikroorganizmów glebowych, które wytwarzają nowe antybiotyki (http://www.smallworldinitiative.org). Uważa się, że głównym źródłem nieodkrytych antybiotyków nadal będą gatunki Streptomyces występujące w szerokim zakresie siedlisk glebowych i wodnych25,26,27,28,29,31. Niedawno nasze laboratorium i praca innych odkryły i scharakteryzowały geny sygnałowe u gatunków Streptomyces, które regulują morfologię i rozwój, w tym produkcję antybiotyków7,32,33. Zmiany w ekspresji tych genów powodują zmianę ilości i czasu wytwarzania antybiotyków. Umiejętne fenotypowanie nowych gatunków i nowych mutantów wytwarzających antybiotyki będzie nadal ważne. Ponieważ nowi instruktorzy i ich studenci stają się głównymi twórcami w dziedzinie odkrywania leków, szkolenie w zakresie fenotypowania bakteryjnego jest niezbędne dla sukcesu tych początkujących osób. Co więcej, eksperymenty te są wykonalne dla licealnych laboratoriów STEM lub uniwersyteckich laboratoriów edukacji mikrobiologicznej. Stanowią one demonstrację podstawowych zasad genetyki drobnoustrojów w warunkach laboratoryjnych.

<table><tbody><tr><td>50% glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny (typ DF)</td><td>Cragille&nbsp;</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>Papier do soczewek</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna woda</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-1L</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki (płaskie)</td><td>Target</td><td>081-22-1957</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10 ml)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-10</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (200 ml)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-200Y</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (1,250 ml)</td><td>GeneMate</td><td>P-1240-1250</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory drewniane 6''</td><td>Solon Care</td><td>070809</td><td></td></tr><tr><td>waciki bawełniane</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Mąka sojowa&nbsp;</td><td>Czerwony młyn Boba&nbsp;</td><td>1516C164</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol 100%</td> <td>VWR amresco nauki przyrodnicze&nbsp;</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>0,8% NaCl (sól fizjologiczna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9000V</td><td></td></tr><tr><td>1,2 ml rurka zamrażająca</td><td>NEST</td><td>606101</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo niska (-80 &deg; C) zamrażarka</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice ochronne kriogeniczne</td><td>Bel-Art</td><td>H13201</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe #1.5</td><td>Thomas Scientific</td><td>64-0721</td><td></td></tr><tr><td>Slajdy</td><td>Carolina</td><td>63-2010</td><td></td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Tuttnauer</td><td>2540E</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z kontrastem fazowym&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX40</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Carolina Biologiczny</td><td>624504</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Palnik</td><td>Carolina Biological</td><td>706706</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna w postaci buforu fosforanowego)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>Biotium</td><td>29022-1</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier do paznokci</td><td>OPI</td><td>22001009000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Darmowe oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 100 ml</td><td>Pyrex USA</td><td>1000-T</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka 1 l</td><td>Carolina Biological</td><td>721253</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 1 l</td><td>Fisherbrand</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 250 ml</td><td>Pyrex USA</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cylinder z podziałką</td><td>Cylinder</td><td></td> z podziałką Carolina Biological 721788 <td></td></tr><tr><td>500 ml&nbsp;</td><td>Carolina Biological</td><td>721792</td><td></td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-271825</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Kamera do mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice nitrylowe do badań (Med)</td> <td>Bio Excell</td><td>71011002</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Carolina Biological</td><td>701077</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych streptomyces

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes to nitkowate bakterie glebowe należące do typu Actinobacteria, które występują na całym świecie i produkują szeroki wachlarz antybiotyków i innych wtórnych metabolitów. Streptomyces coelicolor jest dobrze scharakteryzowanym, niepatogennym gatunkiem, który poddaje się różnorodnym analizom w laboratorium. Opisane tutaj metody fenotypowania wykorzystują S. coelicolor jako modelowy streptomycete; Jednak metody te mają zastosowanie do wszystkich członków tego dużego rodzaju, a także do niektórych blisko spokrewnionych promieniowców. Fenotypowanie jest niezbędne do scharakteryzowania nowych gatunków Streptomyces zidentyfikowanych w środowisku, a także jest niezbędnym pierwszym krokiem w charakterystyce nowo wyizolowanych zmutowanych szczepów Streptomyces. Biegłość w fenotypowaniu jest ważna dla wielu nowych badaczy, którzy wkraczają w dziedzinę badań nad Streptomyces, która obejmuje badanie rozwoju bakterii, podziału komórek, segregacji chromosomów i sygnalizacji drugiego przekaźnika. Niedawny crowdsourcing odkryć antybiotyków poprzez izolację nowych mikroorganizmów glebowych spowodował zwiększone zapotrzebowanie na szkolenia w zakresie fenotypowania dla instruktorów nowych w dziedzinie badań nad Streptomyces oraz ich studentów lub uczniów szkół średnich. Niniejszy manuskrypt opisuje metody rozmnażania, przechowywania i charakterystyki szczepów bakteryjnych poprzez badanie wizualne i mikroskopowe. Po przeczytaniu tego artykułu nowi badacze (laboratoria edukacji mikrobiologicznej i naukowcy-obywatele) powinni być w stanie manipulować szczepami Streptomyces i rozpocząć eksperymenty z charakterystyką wizualną.

Początkowe eksperymenty fenotypowania są niezbędne do charakteryzacji nowych gatunków i szczepów oraz mogą stanowić uzupełnienie badań filogenetycznych i eksperymentów hybrydyzacji DNA-DNA stosowanych przy opisywaniu nowych gatunków. Mutanty Streptomyces uzyskane metodami mutagenezy losowej, takimi jak mutageneza chemiczna, UV lub transpozonowa, identyfikuje się zazwyczaj bezpośrednio, poprzez wizualne badania na szalakach z podłożem agarowym. Kolonie Streptomyces analizuje się pod kątem zmian fenotypu w porównaniu do szczepu typu dzikiego, rodzicielskiego. Na przykład jaśniejsza barwa micelium powietrznego może wskazywać na obniżony poziom szarego pigmentu spowodowany defektem w sporulacji, a brak puszystego wygląd jest charakterystyczny dla blokady tworzenia micelium powietrznego (Rysunek 1). Wiele aktynobakterii produkuje zabarwione antybiotyki w micelium wegetatywnym lub w otaczającym agaru. S. coelicolor wytwarza dwa antybiotyki barwne oraz dwa niebarwne. Actinorhodyna to niebiesko zabarwiony antybiotyk, a undecylprodigiozyna – czerwono zabarwiony antybiotyk45. Szczepy, które przeszły wstępną wizualną analizę kolonii, są następnie rozmnażane przez posiewy liniowe w celu uzyskania pojedynczych kolonii.
Po wizualnej identyfikacji potencjalnie interesujących mutantów szczepy poddaje się badaniu mikroskopowemu. Mikroskopia kontrastowo-fazowa szczególnie nadaje się do analizowania mutantów Streptomyces pod kątem defektów rozwojowych, przy użyciu szczepu typu dzikiego jako kontroli (Rycina 2). Kolonie typu dzikiego S. coelicolor zazwyczaj wytwarzają micelium powietrzne po około dwóch dniach wzrostu w 30 °C na agarze MS, a po trzech dniach wzrostu – długie łańcuchy zarodników. Cykl życiowy może rozwijać się nieco wolniej lub szybciej na innych rodzajach pożywek. Istotne jest, aby analizować mutanta w tych samych warunkach wzrostu co typ dziki, gdy formułuje się wnioski dotyczące defektów i opóźnień rozwojowych. Mutanty łysiejące mogą wytwarzać zarodniki po dłuższym czasie wzrostu na pożywkach agarowych. Grupę mutantów nazywanych białymi mutantami charakteryzuje opóźnienie w tworzeniu się zarodników, zmniejszona liczba wytwarzanych zarodników, występowanie defektów kształtu i/lub wielkości zarodników lub po prostu obniżony poziom dojrzałego szarego barwnika zarodników46. Inne dotychczas zbadane mutacje mogą powodować opóźnienie lub przyspieszenie przebiegu cyklu życiowego, na przykład mutacje wpływające na akumulację cząsteczek sygnałowych (np., cyklicznego-di-GMP47).
Prostym uzupełnieniem opisanej powyżej techniki mikroskopii świetlnej jest mikroskopia fluorescencyjna z zastosowaniem jodku propidyny do barwienia nukleoidów DNA chromosomowego oraz znakowanego fluorescencyjnie aglutyniny z kiełków pszenicy do barwienia ściany komórkowej sept sporulacyjnych. Spory pozbawione chromosomu nie będą wykazywały czerwonego barwienia jodkiem propidyny, natomiast spory zawierające mniej DNA niż zwykle można będzie zidentyfikować po słabszym intensywności barwienia (Rycina 3). Aglutyninę z kiełków pszenicy można wykorzystać do barwienia ściany komórkowej, a różnice w wzorcach barwienia ściany komórkowej (tj. wady podziału komórkowego) mogą zostać zaobserwowane. Na Rycinie 4 pokazano dzikiego typu szczep S. venezuelae, gatunek, który ostatnio zaczyna być wykorzystywany jako kolejny modelowy promieniowiec ze względu na szybszy cykl życiowy i zdolność do sporulacji w środowisku ciekłym45, wybarwiony WGA-FITC w celu ujawnienia drabinkowatego układu sept podziałowych, typowego dla wczesnych stadiów sporulacji.
Początkowe strategie fenotypowania opisane tutaj powinny prowadzić do następujących rezultatów: 1) Zidentyfikowania mutantów interesujących do dalszych badań; 2) Uzyskania wiedzy na temat nowo zidentyfikowanego mutantu oraz potencjalnej roli genu, w którym wystąpiła mutacja; 3) Sformułowania kolejnej serii dalszych kroków eksperymentalnych, które mogą posłużyć do dokładniejszego wyjaśnienia roli badanego genu. W przypadku nowo zidentyfikowanego aktynomyceta pochodzącego ze środowiska, badacz uzyska wiedzę na temat potencjalnego nowego gatunku w porównaniu do już scharakteryzowanych gatunków Streptomyces.
<img alt="Wzrost kolonii grzybów; diagram płytki Petriego; porównanie mutacji genetycznych w celu różnicowania szczepów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
Rycina 1: Zdjęcie reprezentatywnej płytki z podłożem agarowym pokazującej makroskopowe fenotypy kolonii S. coelicolor. Płyta agarowa ilustruje puszysty, szary wygląd micelium powietrznego u dzikiego typu S. coelicolor szczepu MT1110 (WT) w porównaniu do różnych losowych mutantów z insercją transpozonu wykazujących fenotypy rozwojowe. Mutanty albo nie posiadają micelium powietrznego [łysy (bld)] albo mają micelium powietrzne o zmniejszonej pigmentacji zarodników [białe (whi)]. Mutanty transpozonowe uzyskano za pomocą mini-Tn5 w mutagenezie insercyjnej6,7. Szczepy hodowano na podłożu MS w temperaturze 30 °C przez 5 dni. Średnica płytki Petriego wynosi 100 mm.
<img alt="Porównanie morfologii bakterii; obraz mikroskopowy; różnicowanie ściany komórkowej; sześć typów próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2: Mikrografie w kontraście fazowym przedstawiające reprezentatywny filament powietrzny u białych mutantów S. coelicolor zawierających losowe insercje mutagenu transpozony. (A) Pokazano reprezentatywny filament powietrzny typu dzikiego, w którym zachodzą synchroniczne, regularnie rozmieszczone podziały komórkowe, prowadzące do powstania zarodników o jednakowym kształcie i rozmiarze (MT1110). (B-F) Pozostałe obrazy przedstawiają wyraźnie różne fenotypy mikroskopowe różnych białych mutantów wyizolowanych metodą losowej mutagenezy transpozonowej. Panel B przedstawia filament powietrzny, w którym nie doszło do sporulacji, a zamiast tego pojawiły się wybrzuszenia w obrębie nitki. Długie strzałki na panelach C, D i F wskazują nieprawidłowo duże zarodniki charakterystyczne dla mutantów MIC42, MIC43 i TH49. Krótka strzałka na panelu D wskazuje przykład lizowanego kompartmentu zarodnika. Panel E pokazuje częściowo zwężone, mniejsze kompartmenty typowe dla łańcuchów zarodników produkowanych przez mutant TH10. Szczepy hodowano na agarze MS przez 5 dni w 30 °C. Mutanty nie są spokrewnione z tymi pokazanymi na Rycinie 1. Zarodnik typu dzikiego ma około 1,1 µm wzdłuż osi dłuższej. Skala = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.</a>
<img alt="Wizualizacja genów bakteryjnych, mikroskopia fluorescencyjna, porównanie typu dzikiego z mutantem, analiza struktury komórki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
Rysunek 3: Przykładowe mikrografie pokazujące fenotypy segregacji chromosomu u mutantów S. coelicolor. (A) Schematyczne przedstawienie typowego wzoru barwienia u typu dzikiego, charakteryzującego się regularnie rozmieszczonymi odcinkami DNA w łańcuchu zarodników (każdy zarodnik zawiera DNA chromosomowe), w porównaniu do nieregularnego wzoru barwienia u mutantów wykazujących defekt segregacji chromosomu. (B) Każda para obrazów przedstawia ten sam łańcuch zarodników: po lewej stronie obraz w kontrastowym mikroskopie interferencyjnym (DIC), po prawej – fluorescencyjny obraz po barwieniu jodkiem propidyny. Fenotyp typu dzikiego (a, b) porównano z dwoma losowymi mutantami z insercją transpozonu (c, d oraz e, f). Strzałki wskazują zarodniki pozbawione DNA. Szczepy hodowano na agarze MS przez 5 dni w 30 °C. Przedstawione mutacje są niezwiązane z mutantami pokazanymi na Rysunku 1 i Rysunku 2. Szerokość podziałki = 1 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia kontrastu fazowego i WGA nici grzybowych, znakowanie fluorescencyjne, badanie struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Mikrofotografia fluorescencyjna dzikiego typu S. venezuelae barwionego WGA-FITC. (A) Diagram nici powietrznych wykazuje gładką strukturę bez zagłębień i bez widocznych cech sporulacji w mikroskopii kontrastowej, w porównaniu do drabinkowatej struktury barwienia ściany komórkowej, wskazującej na wczesny etap rozpoczętej sporulacji tej samej nici w mikroskopii fluorescencyjnej z zastosowaniem WGA-FITC. (B) Mikrofotografie dzikiego typu S. venezuelae. (a) Obserwuje się gładkie nici powietrzne wśród łańcuchów zarodników. (b) W strukturze micelium pokazanej na panelu a jedna nić powietrzna na wczesnym etapie rozwoju wykazuje drabinkowatą organizację odkładania się ściany komórkowej. Strzałki wskazują regularnie rozmieszczone przegrody barwione przez WGA-FITC, które rozwijają się synchronicznie w obrębie pojedynczej nici powietrznej podczas rozwojowo-uwarunkowanej sporulacji. Odmianę hodowano na podłożu MYM (Maltoza, Wywar drożdżowy, Maltowy wywar) w formie agaru MYM przez 38 h w 30 °C. Szerokość skali = 2 µm. <a href="/files/ftp_upload/57373/57373fig4v3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

Ogólnym celem poniższych technik jest przeszkolenie początkujących badaczy do pracy ze Streptomyces i innymi pokrewnymi gatunkami w środowisku uniwersyteckim, dydaktycznym, laboratoryjnym i szkolnym. Obserwacja fenotypowa jest ważna dla wielu badaczy zajmujących się badaniami nad Streptomyces. Ten film opisuje metody namnażania się bakterii, przechowywania oraz badania wzrokowego i mikroskopowego.Opisane tutaj metody phenotpyingu wykorzystują Streptomyces coelicolor jako model. Metody te mają jednak zastosowanie do wszystkich członków dużego rodzaju, jak również do blisko spokrewnionych Actinomyces. Główną zaletą tych technik jest to, że są one zaprojektowane tak, aby były dostępne dla początkujących badaczy w klasie szkoły średniej lub laboratorium nauczycielskim na studiach licencjackich, a także dla doświadczonego personelu laboratoryjnego.Po obejrzeniu tego filmu i przeczytaniu dołączonego protokołu, nowi badacze powinni być w stanie manipulować swoimi szczepami Streptomyces, odpowiednio je przechowywać i rozpocząć eksperymenty z charakterystyką wizualną. Procedury zademonstrują Garret Kandell i Sean Kirk, studenci studiów licencjackich z mojego laboratorium na Uniwersytecie Otterbein. Na początek użyj standardowej metody, takiej jak metoda smug kwadrantowych zademonstrowana w Saunders 2012, aby umieścić szczepy Streptomyces na płytkach agarowych MS i wyhodować je w pojedynczych koloniach.Co cztery do sześciu dni zbieraj pojedynczą kolonię i układaj ją ponownie na świeżym talerzu. Wraz z wiekiem kolonie stają się podatne na losowe mutacje. Po przeprowadzeniu mutagenezy zgodnie z protokołem tekstowym należy zwrócić uwagę na morfologię kolonii dla każdego mutanta w porównaniu ze szczepem rodzicielskim typu dzikiego.Charakteryzując nowe gatunki Streptomyces, porównaj nowy izolat z dobrze zbadanym gatunkiem, zwracając uwagę na podstawowy kształt, powierzchnię kolonii, nieprzezroczystość, wysokość i pigmentację. Oznacz płytkę agarową MS i smuguj szczepy typu dzikiego i zmutowane we wzory klinowe. Uważaj, aby żaden szczep nie dotykał innego szczepu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.Zanotuj datę i godzinę, kiedy szczepy są rozmazywane na talerzu. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Pamiętaj, że niezwykle ważne jest, aby zawsze chronić próbkę Streptomyces przed zanieczyszczeniem.Używaj swojej najlepszej sterylnej techniki na wszystkich etapach, otwierając płytki i probówki przez jak najkrótszy czas. Umieść wyrośnięte szalki Petriego na kolorowym lub białym papierze, aby ujednolicić tło. Napisz na papierze nazwę szczepu, datę, temperaturę inkubacji i czas od pierwszego smugowania płytki.Zrób cyfrowe zdjęcia płyty z informacjami o naprężeniu zapisanymi na tle papieru, aby zminimalizować zamieszanie. Wysterylizuj pęsetę, myjąc ją w 70% etanolu, a następnie przepuszczając przez płomień palnika Bunsena w celu odparowania etanolu. Sterylizuj szkiełka nakrywkowe, myjąc je w 70% etanolu, a następnie pozwalając im wyschnąć na sterylnej szalce Petriego.Następnie, aby przygotować nakrywkę do liftingu bakterii, użyj sterylnej pęsety, aby podnieść sterylne szkiełko nakrywkowe i umieść szkiełko nakrywkowe na płytce agarowej MS, gdzie rozwój bakterii jest gęsty. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij tylną część szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakterii i grzybni powietrznej. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je pod kątem 45 stopni, tak aby materiał komórkowy był skierowany do powierzchni szkiełka mikroskopowego zawierającego 15 mikrolitrów kropli 50% glicerolu.Pozwól, aby szkiełko nakrywkowe opadło na glicerol, co zmniejszy pęcherzyki powietrza. Aby wykonać mikroskopię z kontrastem fazowym w różnych odstępach czasu, umieść przygotowane szkiełko na stoliku mikroskopu i dodaj kroplę olejku immersyjnego na środek szkiełka nakrywkowego. Obróć obiektyw fazowy 100x na miejsce i ustaw wieżyczkę skraplacza na odpowiednie ustawienie fazy.Gdy soczewka obiektywu zetknie się z olejem, do ustawienia ostrości obrazu należy używać wyłącznie pokrętła precyzyjnej regulacji. Zbadaj kilka pól widzenia, aby dostrzec zauważalne i spójne różnice między zmutowanymi szczepami a typem dzikim. Takich jak zdolność do tworzenia zarodników, wielkość i kształt zarodników oraz ogólna liczba zarodników.Za pomocą sterylnej pęsety przygotuj szkiełko nakrywkowe z płytki agarowej MS, tak jak poprzednio, gdzie widoczny jest rozwój bakterii, delikatnie dotykając pęsetą tylnej części szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić wystarczający transfer zarodników bakteryjnych i włókien powietrznych. Podnieś szkiełko nakrywkowe z płytki i umieść je na kartonie tak, aby strona z materiałem komórkowym była skierowana do góry, aby ułatwić i manipulować szkiełkiem nakrywkowym. Lodowatym metanolem zalej szkiełko nakrywkowe i pozostaw na pięć minut.Za pomocą PBS umyj szkiełko nakrywkowe dwa razy, delikatnie dozując i usuwając roztwór. Dodać 15 mikrolitrów 10 mikrogramów na mililitr roztworu jodku propidyny i lub 10 mikrogramów na mililitr WGA-FITC do szkiełka. Połóż szkiełko nakrywkowe stroną zadrukowaną do dołu na kropli fluorescencyjnej plamy.Próbki należy inkubować w zaciemnionym lub słabo oświetlonym pomieszczeniu przez 15 minut. Zapasy barwników fluorescencyjnych i próbek plam należy chronić przed światłem. Zaleca się, aby badacze korzystali z warunków słabego oświetlenia podczas przygotowywania próbek i używali ciemnego pudełka do przechowywania próbek po ich przygotowaniu.Obserwuj szkiełka pod soczewką obiektywową 100x za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mikroskopu DIC wyposażonego w kostki wzbudzenia epifluorescencji dla jodku propidyny i FITC. Przeanalizuj obrazy zgodnie z protokołem tekstowym. Przedstawiono przykłady mutantów Streptomyces powstałych w wyniku mutagenezy transpozonów.Jaśniejsza grzybnia powietrzna może wskazywać na niższy poziom szarego pigmentu spowodowany defektem zarodnikowania. Lub brak rozmytego wyglądu wskazuje na blok w tworzeniu się grzybni powietrznej. Jak widać za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego, kolonie S. coelicolor typu dzikiego zazwyczaj wytwarzają grzybnię powietrzną po około dwóch dniach wzrostu.I długie łańcuchy zarodników przez trzy dni wzrostu. Białe mutanty mogą być opóźnione w tworzeniu się zarodników, wykazywać zmniejszenie obfitości wytwarzanych zarodników, wytwarzać zarodniki z wadami kształtu i/lub wielkości lub po prostu wytwarzać niższe poziomy dojrzałego, szarego pigmentu zarodników. Pokazane tutaj przy użyciu mikroskopii DIC i fluorescencji z barwieniem PI, regularne barwienie łańcucha zarodników w próbce typu dzikiego jest porównywane z przerywanym wzorcem barwienia dla dwóch mutantów insercji transpozonów, które wykazują defekt segregacji chromosomów.Użycie WGA-FITC do barwienia ściany komórkowej szczepu dzikiego typu S.venezuelae jest obecny w postaci gładkich włókien powietrznych wśród łańcuchów zarodników. I wykazuje boczny układ przegród podziałowych, które są zwykle widoczne podczas zarodnikowania. Praca z organizmem nitkowatym bardzo różni się od pracy z dobrze znaną bakterią w kształcie pręcika.Przedstawione tutaj protokoły wideo powinny służyć jako ważne źródło informacji dla zupełnie nowych badaczy wkraczających w dziedzinę badań nad Streptomyces. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozpocząć badanie gatunków Streptomyces i innych pokrewnych bakterii. Po tych wstępnych eksperymentach, w laboratorium badawczym można zastosować różne techniki, aby dowiedzieć się więcej o szczepach Streptomyces.Na przykład niektóre z zaawansowanych technik mogą obejmować znakowanie białek lub analizy ekspresji genów, takie jak PCR w czasie rzeczywistym i sekwencja RNA. Wstępne eksperymenty fenotypowania są wykorzystywane do identyfikacji i charakterystyki nowych szczepów oraz rozpoznania typowej roli określonego genu. Metody te były już stosowane w uniwersyteckich laboratoriach dydaktycznych do identyfikacji i charakterystyki szerokiej gamy szczepów Streptomyces.

visual-microscopic-evaluation-streptomyces-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Źródło: Bennett, J. A. i wsp. Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje uprawę i porównanie fenotypowe dzikich i zmutowanych szczepów Streptomyces coelicolor . Przedstawiono w nim procedury minimalizacji spontanicznych mutacji, zapobiegania zanieczyszczeniu krzyżowemu i promowania wzrostu bakterii poprzez odpowiednie techniki powlekania. Wreszcie, film podkreśla wizualne różnice w morfologii kolonii, aby zilustrować skutki rozwojowe...

Porównanie fenotypowe dzikich i zmutowanych szczepów Streptomyces coelicolor

Źródło: Bennett, J. A. i wsp. Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje zastosowanie mikroskopii z kontrastem fazowym do badania różnic fenotypowych między dzikim a zmutowanym Streptomyces coelicolor. Przedstawiono w nim etapy związane z przygotowaniem i obrazowaniem włókien powietrznych w celu wykrycia wad rozwojowych w tworzeniu zarodników.

Mikroskopia z kontrastem fazowym do oceny mutantów rozwojowych u Streptomyces

Streptomyces charakteryzują się złożonym cyklem życiowym, który był eksperymentalnie trudny do zbadania za pomocą biologicznych metod komórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykonywania fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej całego cyklu życia poprzez hodowlę Streptomyces venezuelae w urządzeniu mikroprzepływowym.

Fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe całego cyklu życiowego S. venezuelae przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Obrazowanie morfogenezy zarodków owadów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej opartej na arkuszach świetlnych stało się najnowocześniejszym rozwiązaniem. Protokół ten nakreśla i porównuje trzy techniki montażu odpowiednie dla zarodków Tribolium castaneum, wprowadza dwie nowatorskie, wykonane na zamówienie linie transgeniczne, dobrze nadające się do obrazowania na żywo, omawia podstawowe kontrole jakości i wskazuje obecne ograniczenia eksperymentalne.

Mikroskopia fluorescencyjna oparta na arkuszach świetlnych żywych lub utrwalonych i barwionych zarodków Tribolium castaneum

Nicień Caenorhabditis elegans jest doskonałym modelem do analizy interakcji gospodarz-patogen. Opisano tutaj protokół zakażenia robaka paciorkowcami z grupy mitis i określenia aktywacji odpowiedzi na stres oksydacyjny przeciwkoH2O2wytwarzanej przez tę grupę organizmów.

Badanie stresu oksydacyjnego wywołanego przez paciorkowce z grupy Mitis w Caenorhabditis elegans

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Ten manuskrypt opisuje metodę badania przesiewowego bibliotek mutantów Candida albicans średniej wielkości pod kątem fenotypów morfogenezy podczas aktywnej infekcji u ssaków za pomocą nieinwazyjnej mikroskopii konfokalnej.

Zastosowanie obrazowania in vivo do badań przesiewowych fenotypów morfogenezy u zmutowanych szczepów Candida albicans podczas aktywnej infekcji u ssaka gospodarza

Poznaj metody fenotypowania bakterii Streptomyces dla badań mikrobiologicznych przy użyciu Streptomyces coelicolor. Techniki obejmują mikroskopię kontrastu fazowego i fluorescencyjne barwienie próbek.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Przeglądaj więcej filmów