Name: Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj skaningową mikroskopię elektronową zmacerowanej tkanki serca do wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta metoda pozwala badać organizację macierzy i jej wpływ na fibrozę oraz kardiomiopatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Institutes of Health (NIH), Heart, Lung, and Blood Institute (NIHLB): K01-HL-121045, K08-HL-094703, 5T32HL007411-35, P20 HL101425, U01 HL100398. 
Obrazowanie i przetwarzanie tkanek (po maceracji NaOH) zostało przeprowadzone za pomocą Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Cell Imaging Shared Resource (CISR) (wspieranego przez granty NIH CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 i EY08126). Jesteśmy szczególnie wdzięczni głównym dyrektorom VUMC CISR (dr Samowi Wellsowi i dr W. Grayowi (Jayowi) Jerome'owi) za cenne porady techniczne, a także za udostępnienie podstawowej przestrzeni i zasobów na potrzeby filmowania techniki przedstawionej w tym artykule. 
Chcielibyśmy wyrazić nasze najgłębsze podziękowania dla dr Yan Ru Su i Pani Kelsey Tomasek z Cardiology Core Lab for Translational and Clinical Research na Uniwersytecie Vanderbilt za dostarczenie technicznej wiedzy i pobranie próbek tkanek ludzkich wykorzystywanych w tym badaniu.

Oświadczenie etyczne: Protokoły postępowania ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, protokoły numer M/10/117 (świnie) i M/10/219 (myszy) i przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi standardami AAALAC. Wykorzystanie bankowych tkanek ludzkiego serca zostało zatwierdzone przez Vanderbilt University Medical Center IRB (numer protokołu 100887).
1. Pobieranie i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Przygotować świeży 4% aldehyd glutarowy w 0,1 M roztworze buforu fosforanowego (PB). 
	UWAGA: Aldehyd glutarowy jest toksyczny, nosić rękawice i pracować w okapie.
	<ol>
		<li>Przygotować 0,2 M roztwór podstawowy PB, pH 7,4 używając 21,8 g Na2HPO4 i 6,4 g NaH2PO4. Quantum satis (Q.s.) do 1 000 ml dH2O.</li>
		<li>Dodać 400 μl 50% aldehydu glutarowego do 2,5 ml roztworu podstawowego PB i 2,1 mldH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz kawałek (nie większy niż 2cm2) tkanki w 4% roztworze aldehydu glutarowego. Uwaga: Można również użyć mniejszych części, ale powinny one mieć wystarczający rozmiar (nie mniejszy niż 5 mm2), aby można je było łatwo zobrazować na oko w celu ułatwienia późniejszych etapów protokołu.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, a następnie przechowywać przez czas nieokreślony w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Decelularyzacja tkanki serca
<ol>
	<li>Przygotować świeży 10% wodny roztwór NaOH za pomocą 10 g granulek NaOH/100 ml dH2O. 
	UWAGA: Roztwory NaOH są i mogą powodować oparzenia alkaliczne, należy nosić rękawice.</li>
	<li>Wypłukać tkankę w dH2O.</li>
	<li>Inkubować w 10% roztworze NaOH w temperaturze pokojowej przez 6 - 10 dni (do momentu, gdy tkanka zmieni kolor z czerwonawo-brązowego na białawy lub biały).</li>
	<li>Płukać w dH2O, aż tkanka stanie się przezroczysta.</li>
	<li>Zanurz tkankę w 1% kwasie garbnikowym na 4 godziny w temperaturze pokojowej. Stosować 1 ml 5% roztworu podstawowego na 4 ml dH2O. 
	UWAGA: Kwas garbnikowy jest silnym środkiem drażniącym, należy nosić rękawiczki.</li>
	<li>Płukać w dH2O przez noc.</li>
</ol>
3. Osmikacja i odwodnienie tkanki serca (w dygestorii dla bezpieczeństwa)
<ol>
	<li>Sporządzić 0,2 M roztwór podstawowy buforu kakodylanu sodu, używając 21,4 g kakodylanu sodu, 10,0 g chlorku wapnia i 450 mldH2O. Wymieszać, a następnie dodać kwas solny w razie potrzeby, aby dostosować pH do 7,4. Q.s. do 500 ml z dH2O. 
	UWAGA: Kakodylan sodu i kwas solny są toksyczne, należy nosić rękawice i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Dla bezpieczeństwa przygotować 2% wodny roztwór podstawowy tetratlenku osmu w dygestorium, rozpuszczając 1 g kryształu tetratlenku osmu w 50 ml dH2O. 
	UWAGA: Tetratlenek osmu stanowi poważne zagrożenie wdychania; Możliwe jest utrwalanie pary wodnej błon śluzowych lub gałek ocznych, dlatego należy obchodzić się z nimi tylko w wyciągach w rękawiczkach. Zalecana jest osłona przeciwbryzgowa.</li>
	<li>Płukać tkankę w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (mieszać roztwór podstawowy 1:1 zdH2O) przez 5 minut na rotatorze (lub delikatne mieszanie).</li>
	<li>Powtórz poprzedni krok dwukrotnie, w sumie trzy płukania buforem.</li>
	<li>Zanurz tkankę w 1% tetratlenku osmu w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (wymieszaj podstawowy kakodylan sodu i podstawowy tetrtlenek osmu 1:1) na rotatorze na 1 godzinę.</li>
	<li>Wypłukać tkankę w 0,1 M buforze kakodylanu sodu 3 razy po 5 minut na rotatorze.</li>
	<li>Płukać tkanki przy użyciu rosnących stężeń etanolu (30%, 50%, 75%, 85%, 95% i na końcu 100%) przez 15 minut na rotatorze.</li>
</ol>
4. Przygotowanie powierzchni przekroju poprzecznego dla SEM
<ol>
	<li>Przenieś tkankę w 100% etanolu na płytką szalkę Petriego zawierającą również 100% etanolu.</li>
	<li>Trzymaj dwie bardzo ostre żyletki tak, aby płaskie boki stykały się ze sobą, a krawędzie tnące krzyżowały się, tworząc dwa boki trójkąta równobocznego nad próbką. Aby to osiągnąć, lewą ręką umieść jedno ostrze po prawej stronie próbki i przetnij w lewo. W tym samym czasie prawą ręką umieść drugie ostrze po lewej stronie próbki i pokrój w prawo. W ten sposób ostrza będą przesuwane względem siebie z przeciwnych kierunków, aby wykonać jedno gładkie cięcie.</li>
	<li>Dosuń boki płaskiego ostrza do siebie, aby uzyskać bardzo czyste cięcie próbki przy minimalnym zniekształceniu lub sile rozrywającej, najlepiej odsłaniając jak największą powierzchnię bez uszkadzania próbki.</li>
	<li>Powtórz tę czynność dla każdej próbki, aby odsłonić możliwie najczystsze powierzchnie przekroju poprzecznego do badania w SEM.</li>
</ol>
5. Krytyczny punkt suszenia (CPD) tkanki serca
<ol>
	<li>Za pomocą szpatułki lub pęsety przenieś tkankę do uchwytu próbki suszarki do punktu krytycznego (CPD), upewniając się, że tkanka pozostaje przez cały czas w 100% etanolu. Upewnij się, że posiadacz jest zanurzony w etanolu i że transfer odbywa się przy tkance wystawionej na działanie powietrza nie dłużej niż kilka sekund.</li>
	<li>Uruchom CPD zgodnie z instrukcją obsługi, aby wykonać 3 cykle przedmuchiwania i napełniania w celu zastąpienia etanolu ciekłym dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Uruchomić CPD zgodnie z instrukcją obsługi, aby osiągnąć krytyczny punkt suszenia próbek i przywrócić je do ciśnienia atmosferycznego z kontrolowanym odpowietrzeniem CO2 .</li>
</ol>
6. Montaż próbek tkanek serca do SEM
<ol>
	<li>Przygotuj kikut próbki SEM dla każdej próbki, przyklejając zakładkę z kleju węglowego do górnej powierzchni aluminiowego króćca.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego ostrożnie przyklej próbkę do zakładki samoprzylepnej tak, aby powierzchnia interesującego nas przekroju poprzecznego była skierowana do góry (z dala od zakładki, widoczna) i jak najbliżej równoległej do płaszczyzny powierzchni króćca próbki. Nie sonduj ani nie dotykaj interesującej Cię powierzchni.</li>
	<li>Rozbij drewniany aplikator w sztyfcie, aby uzyskać zwężający się pędzel, idealny do nakładania farby. Nałóż farbę srebrną lub węglową na podstawę i boki próbki, aby poprawić przyczepność do kęcia.</li>
	<li>Rozciągnij bardzo cienką linię farby srebrnej lub węglowej aż do krawędzi powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić ścieżkę ładunku od powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania do masy.</li>
	<li>Nałóż 2 lub 3 małe krople farby srebrnej lub węglowej na obwodzie zakładki węglowej, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę od powierzchni zakładki węglowej do metalowego króćca, a tym samym do ziemi.</li>
	<li>Pozostaw przewodzącą farbę do wyschnięcia na dwie godziny.</li>
	<li>Używaj napylarki zgodnie z instrukcją obsługi, aby nałożyć stosunkowo ciężką powłokę (docelowy zakres 30 - 40 nm) ze stopu złota i palladu lub złota. Pompować komorę próbki do około 0,1 mbar; ustaw Timer na 40 sek. Otwarty Ustaw zawór w pozycji 8:00 (umiarkowany przepływ argonu). Naciśnij Start, aby zainicjować napylanie przy 30 mA. Fioletowe wyładowanie blasku powinno być widoczne w komorze próbki.</li>
</ol>
7. Badanie SEM próbek tkanek serca
<ol>
	<li>Wykonaj skaningową mikroskopię elektronową przy stosunkowo niskim napięciu przyspieszającym, aby zminimalizować problemy z obrazowaniem związane ze słabym rozpraszaniem ładunku w próbce (ładowanie). Sugerowane warunki początkowe obrazowania to: napięcie przyspieszające 5 kV, odległość robocza 10 mm.</li>
	<li>Z pomocą doświadczonego operatora zastosuj zwiększoną odległość roboczą, aby zwiększyć głębię ostrości w warunkach obrazowania wymagających ostrości włókien w wielu płaszczyznach ogniskowych lub światłowodów rozciągających się na znaczną długość w wymiarze z.
	<ol>
		<li>W przypadku używanego tutaj mikroskopu (patrz Spis materiałów), w interfejsie użytkownika przejdź do zakładki Nawigacja w prawym górnym rogu.</li>
		<li>Dostęp do karty Współrzędne można uzyskać z menu Stół montażowy. Aby zwiększyć odległość roboczą, wprowadź większą wartość w milimetrach dla współrzędnej Z, a następnie kliknij zakładkę Przejdź do, aby przesunąć stolik próbki na wprowadzoną odległość roboczą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z pomocą doświadczonego operatora zastosuj pochylanie i obracanie próbki, aby ustawić powierzchnię zainteresowania prostopadłą do wiązki elektronów. Dodatkowe pochylenie od 10 do 30 stopni od tej pozycji może usprawnić obserwację i dokumentację struktury matrycy.
	<ol>
		<li>W przypadku używanego tutaj mikroskopu (patrz Tabela materiałów), w interfejsie użytkownika kliknij i przytrzymaj prawy przycisk myszy, a następnie przesuń w lewo lub w prawo, aby ustawić ostrość próbki w pobliżu obrzeży przygotowanej płaszczyzny powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania, zwracając uwagę na zogniskowaną odległość roboczą.</li>
		<li>Nawiguj za pomocą joysticka ręcznego interfejsu użytkownika, aby zbliżyć się do przeciwległej krawędzi powierzchni i powtórzyć ostrość. Jeśli odległość robocza nie jest w przybliżeniu równa pierwszej pozycji, należy przechylić próbkę, aby uzyskać przybliżoną zgodność w obu lokalizacjach, korzystając z zakładki Współrzędne w menu Stolik (patrz 7.2) i wprowadzić wartość nachylenia we współrzędnej T.</li>
		<li>Obróć próbkę o dziewięćdziesiąt stopni (wprowadź wartość w polu Współrzędna R) i powtarzaj proces, aż wszystkie pozycje zostaną skupione w przybliżeniu w tej samej odległości roboczej. 
		Uwaga: Można zastosować SEM o zmiennym ciśnieniu, aby poprawić rozpraszanie ładunku, jeśli jest dostępny. Wysoka próżnia jest standardowym trybem pracy w skaningowej mikroskopii elektronowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie powierzchni przekroju poprzecznego jest najbardziej krytycznym krokiem podczas protokołu. Aby zachować delikatną strukturę, odwodnione próbki muszą pozostać w 100% etanolu przez cały czas, aż do momentu wprowadzenia do procesu suszenia w punkcie krytycznym. W związku z tym krojenie próbek w celu uzyskania powierzchni do badania EM musi być wykonywane, gdy próbki są zanurzone w etanolu w płytkim naczyniu. Bardzo ważne jest również, aby odsłonięta powierzchnia nie była dotykana ani sondowana podczas późniejsz...

Zwłóknienie zakłóca normalną sieć kolagenową mięśnia sercowego, która jest krytyczna dla normalnych funkcji mechanistycznych kardiomiocytów 1,2, jak również dla komunikacji międzykomórkowej, sygnalizacji wewnątrzkomórkowej i przeżycia komórek 3. Rozwój zwłóknienia jest głównym czynnikiem determinującym czynność serca, a zwłóknieniowa przebudowa śródmiąższu serca wynikająca z różnych etiologii prowadzi do zwiększonej sztywności lewej komory i dysfunkcji rozkurczowej 4. Zwłóknienie mięśnia sercowego może również prowadzić do arytmii i niezależnie od tego, czy postęp przebudowy zwłóknienia jest zjawiskiem ogólnym, czy miejscowym, jest silnie związany ze złym rokowaniem u pacjentów z kardiomiopatią niedokrwienną i nieniedokrwienną 5. Podobnie, brak zwłóknienia mięśnia sercowego jest silnym predyktorem powrotu do funkcji komór i długoterminowego przeżycia 6. 
Cechą charakterystyczną zwłóknienia jest odkładanie się nadmiaru kolagenu, który ma wytrzymałość na rozciąganie stali 7 i może niekorzystnie wpływać na funkcję kardiomiocytów na wielu poziomach. Siły mechaniczne wynikające z nadmiernie kolagenowej macierzy mogą prowadzić do zaniku kardiomiocytów 8,9, biernej sztywności tkanek 10, sztywności mięśnia sercowego wywołanej skurczem tonicznym 11-13 i zmniejszonego dostarczania tlenu do pozostałej populacji kardiomiocytów. Sprzężenie połączeń szczelinowych kardiomiocytów i mięśni może również upośledzać charakterystykę elektryczną serca, stwarzając większe ryzyko rozwoju arytmii 14-16. Zwłóknienie okołonaczyniowe zmienia reaktywność naczynioruchową śródściennych tętnic wieńcowych i tętniczek 17 i przyczynia się do zwężenia światła, które zmniejsza dopływ tlenu, a tym samym przeżycie kardiomiocytów 17-22. Patogenna przebudowa zwłóknieniowa i elektryczna, pochodząca z początkowego miejsca uszkodzenia niedokrwiennego lub nierównowagi energetycznej, nieuchronnie postępuje do niewydolności serca. 
Martwica kardiomiocytów inicjuje reakcję zwłóknieniową, a następująca po niej niekorzystna przebudowa zwłóknienia może wystąpić niezależnie od etiologii. Znalezienie sposobu kontrolowania zwłóknienia serca byłoby klinicznie korzystne w leczeniu kardiomiopatii niedokrwiennych i idiopatycznych, choroby nadciśnieniowej serca, kardiomiopatii przerostowej, wad zastawkowych serca i dystrofinopatii 23-42. Niezależnie od tego, jak rozpoczyna się proces choroby zwłóknieniowej, rozpuszczalne czynniki profibrotyczne mogą przenikać przez przestrzeń śródmiąższową i prowokować aktywację fibroblastów śródmiąższowych i przybyszowych w miejscach odległych od początkowej blizny zwłóknieniowej, tworząc efekt kaskadowy, który ostatecznie prowadzi do niewydolności serca. Optymalnym scenariuszem byłoby wykorzystanie procesu fibrylogennego za pomocą ukierunkowanego środka terapeutycznego, który może być stosowany podczas kompensacyjnego etapu przerostowego kardiomiopatii, zanim dojdzie do niewydolności pompy skurczowej, rozkurczowej niewydolności serca lub innych końcowych etapów. Ostatecznym celem byłoby odwrócenie zwłóknienia, aby martwe kardiomiocyty mogły zostać zastąpione, a funkcja serca całkowicie przywrócona. 
Znaczenie matrycy jest szeroko rozumiane, jednak metody badania matrycy ograniczają się głównie do ilościowych pomiarów głównych składników strukturalnych, zwłaszcza kolagenu, oraz względnych poziomów różnych białek macierzy i komórek macierzy. Protokół ten podkreśla rzadko stosowaną technikę, która jest przydatna do oceny różnic jakościowych w macierzy serca. Technika ta została ostatnio wykorzystana do porównania i skontrastowania fundamentalnych różnic w matrycach serca z różnych etiologii chorób serca (u ludzkich eksplantatów), do zbadania serc świń po zawale leczonych izoformą glejowego czynnika wzrostu (GGF) neureguliny-1β w porównaniu ze zwierzętami nieleczonymi 43 oraz do zbadania różnic w matrycach tkanek serca z MDX myszy (powszechnie stosowany model zwierzęcy dystrofii mięśniowej Duchenne'a) w różnym wieku i w porównaniu z grupą kontrolną typu dzikiego. Technika ta została po raz pierwszy wprowadzona przez doktorów Caulfielda i Borga w 1979 roku, ale od tego czasu w niewielu badaniach zastosowano tę potężną technikę 45-47, ponownie wprowadzoną tutaj z niewielkimi modyfikacjami. Metodologia ta jest cennym narzędziem badawczym, ponieważ dostarcza jakościowych informacji na temat ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte podczas prostego pomiaru zawartości składników macierzy i/lub poziomu zwłóknienia.

<table><tbody><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Klej węglowy</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>Klej węglowy Zakładki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>77825</td><td>Zamów pasujące do odcinków</td></tr><tr><td>Żyletki z podwójną krawędzią Stal nierdzewna</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250 / szt</td></tr><tr><td>Elektron</td><td>etanolu Nauki mikroskopowe</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>Aldehyd gluterowy, 50% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16310</td><td>Klasa EM, destylacja oczyszczona</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>16760 lub 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Fosforan monosodowy NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>osmu Mikroskopia elektronowa tlenku tetroksydu</td><td></td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Srebro Przewodzący klej</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy, 5% Wodny&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Trójwodzian kakodylanu sodu</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>Nauki 12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Stop złota i palladu lub</td><td>systemy rafinacji złota, Inc.&nbsp;</td><td>różni się</td><td>w zależności od marki i modelu powlekarki</td></tr><tr><td>Punkt krytyczny Suszarka</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>Zwykłe drewniane aplikatory</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 Środowiskowe SEM</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Model 108</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe kikuty próbek SEM</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>75220-12</td><td>specyficzne dla miskroskopu</td></tr></tbody></table>

skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Zwłóknienie jest składnikiem wszystkich form chorób serca, niezależnie od ich etiologii, i chociaż poczyniono znaczne postępy w dziedzinie biologii macierzy serca, nadal istnieją poważne luki związane z tym, jak powstaje matryca, jak różni się fizjologiczna i patologiczna przebudowa, a co najważniejsze, jak można manipulować dynamiką matrycy, aby przyspieszyć gojenie i zahamować zwłóknienie. Obecnie nie ma możliwości leczenia, które kontrolowałoby, zapobiegało lub odwracało zwłóknienie serca. Jednym z powodów jest prawdopodobnie sama złożoność tworzenia blizn sercowych, takich jak te, które występują po zawale mięśnia sercowego, aby natychmiast zastąpić martwe lub umierające kardiomiocyty. Sama macierz zewnątrzkomórkowa uczestniczy w przebudowie poprzez aktywację komórek rezydentnych, a także pomagając w kierowaniu komórek naciekających do nieistniejącej zmiany. Macierz jest również swego rodzaju skrytką do przechowywania białek matrikomórkowych, które są kluczowe dla prawidłowego obrotu macierzy, a także sygnalizacji zwłóknieniowej. Dodatkowo wykazano, że matryca odgrywa elektromechaniczną rolę w tkance serca. Większość technik oceny zwłóknienia nie ma charakteru jakościowego, ale raczej dostarcza wyników ilościowych, które są przydatne do porównywania dwóch grup, ale nie dostarczają informacji związanych z podstawową strukturą macierzy. Wyróżniono tutaj technikę wizualizacji ultrastruktury macierzy serca. Skaningowa mikroskopia elektronowa zdecelularizowanej tkanki serca ujawnia uderzające różnice w strukturze, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte przy użyciu tradycyjnych metod badań ilościowych.

Opisana technika została zastosowana w tkankach serca od niewykorzystanego dawcy ludzkiego (Rysunek 1), w tkankach wyeksplantowanych od biorców transplantatów, w sercach myszy typu dzikiego oraz myszy dystroficznych (Rysunek 3), a także w próbkach serca po zawale mięśnia sercowego w świni w modelu uszkodzenia serca (Rysunek 2). Jak pokazano na Rysunku 1, ludzka macierz serca stanowi złożoną sieć sieciowujących się białek,...

Pokazana tutaj jest metoda wizualizacji ultrastruktury macierzy zewnątrzkomórkowej w zdecelularyzowanych tkankach serca.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Ogólnym celem tej metody jest wizualizacja struktury macierzy serca w nieobecności komórek lub innych materiałów niemacierzowych. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie włóknienia, zwłaszcza w kwestii tego, jak różnice w zawartości macierzy mogą wpływać na jej organizację oraz w jaki sposób zmiany te mogą oddziaływać na różne kardiomiopatie lub inne schorzenia włókniste. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona jakościowy wgląd w macierz, który może zostać wykorzystany do uzupełnienia pomiarów ilościowych.Dr Galindo i dr Sawyer wpadli na pomysł wykorzystania tej techniki po odkryciu, że standardowe leczenie świń po zawale powoduje zmiany w ekspresji genów podobne do zmian w zawartości macierzy po zastosowaniu terapii. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, jeśli nie posiadają wcześniejszego doświadczenia w przygotowaniu próbek do SEM, ze względu na wymagane umiejętności motoryki małej. Próbka tkanki powinna być wystarczająco duża, aby była łatwo widoczna, i powinna być przechowywana w 4% roztworze glutaraldehydu w temperaturze 4 °C.Wyjąć tkankę z chłodni i opłukać ją wodą destylowaną. Następnie zanurzyć tkankę w świeżo przygotowanym roztworze 10% wodorotlenku sodu, sporządzonym z granulek w wodzie. Należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich środków ostrożności.Pozostawić tkankę w roztworze wodorotlenku sodu od sześciu do 10 dni w temperaturze pokojowej. Kontynuować procedurę, gdy tkanka nabierze barwy złamanej bieli lub bieli. Następnie płukać tkankę wodą destylowaną, aż stanie się przezroczysta.Następnie założyć rękawiczki i zanurzyć tkankę w jednoprocentowym kwasie taninowym na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po kąpieli w kwasie taninowym płukać tkankę w wodzie destylowanej przez noc. W ramach przygotowań, w dygestorium i w rękawiczkach, przygotować 0,2 M roztwór stokowy buforu k mengakodylanowego oraz dwupocentowy wodny roztwór stokowy osmianu tetroksydu.Należy użyć osłony przeciwrozpryskowej, ponieważ czterotlenek osmu stanowi poważne zagrożenie przy wdychaniu. Następnie należy przygotować 0,1 M rozcieńczenie buforu kakodylanowego i inkubować w nim tkankę przez pięć minut przy delikatnym mieszaniu. Bufor należy wymienić dwukrotnie, aby łącznie trzykrotnie przemyć tkankę kakodylanem sodu.Następnie przygotuj mieszaninę w stosunku jeden do jednego z roztworu zapasowego k搠dylanu sodu i roztworu zapasowego tetratlenku osmu. Inkubuj tkankę w nowej mieszaninie na rotatorze przez godzinę. Następnie przenieś tkankę z powrotem do 0,1 M k搠dylanu sodu i inkubuj przez pięć minut przy łagodnym mieszaniu.Wymień ten roztwór kąpieli dwukrotnie w ciągu 15 minut. Następnie odwodnij tkankę, korzystając z serii kąpieli w etanolu o rosnących stężeniach. Pozostaw tkankę do namoczenia na 15 minut w każdej kąpieli przy łagodnym mieszaniu.Następnie przenieś tkankę wraz z roztworem do płytki Petri o niskim profilu wypełnionej 100% etanolem. Następnie, ostrożnie chwyć dwa bardzo ostre ostrza żyletek w taki sposób, aby ich płaskie boki stykały się ze sobą, a krawędzie tnące krzyżowały się, tworząc dwa boki trójkąta równobocznego nad preparatem. Teraz, używając dominującej ręki, umieść drugie ostrze po lewej stronie próbki i wykonaj cięcie w prawo.Należy zatem przesuwać ostrza względem siebie z przeciwnych kierunków, aby wykonać pojedyncze, gładkie cięcie przy minimalnym zniekształceniu lub sile rozrywania. Celem jest odsłonięcie jak największej powierzchni bez uszkodzenia preparatu. Powtarzać tę czynność do momentu przygotowania wystarczającej liczby satysfakcjonujących przekrojów poprzecznych do badania za pomocą SEM.Za pomocą szpatułki lub pęsety przenieś tkankę do uchwytu na próbki w CPD, dbając o to, aby tkanka pozostawała zanurzona w 100 procent etanolu. Tkanka nie może być wystawiona na działanie powietrza przez więcej niż kilka sekund. Użyj CPD, aby zastąpić etanol ciekłym dwutlenkiem węgla, a następnie przeprowadź cykl suszenia zgodnie z instrukcjami producenta.Następnie przygotuj stub do SEM dla każdego preparatu. Przyklej węglową taśmę adhezyjną do górnej powierzchni aluminiowego stubu. Pod stereoskopem ostrożnie przytwierdź preparat do taśmy adhezyjnej tak, aby interesująca powierzchnia przekroju była skierowana ku górze, z dala od taśmy, i była maksymalnie równoległa do powierzchni stubu.Nie należy dotykać ani sondować badanej powierzchni. W przypadku najmniejszych i najtrudniejszych do obróbki próbek, należy przełamać drewniany aplikator, aby użyć go jako szpatułki. Ponadto należy pracować nad dużym arkuszem papieru filtracyjnego, aby uniknąć zgubienia upuszczonej próbki.Aby poprawić przewodność, należy użyć złamanego patyczka aplikacyjnego do stworzenia stożkowatego pędzla, a następnie nanieść farbę srebrową lub węglową na podstawę i boki próbki. Należy poprowadzić bardzo cienką linię farby aż do krawędzi powierzchni docelowej. Stworzy to ścieżkę odprowadzania ładunku z powierzchni docelowej do masy.Następnie nanieś dwie lub trzy małe kropki farby wokół obwodu prowadnika węglowego, aby zapewnić ścieżkę przewodzącą z powierzchni prowadnika do metalowego stubu. Pełni to funkcję uziemienia. Odstaw próbkę i pozostaw farbę przewodzącą do wyschnięcia na dwie godziny.Po wysuszeniu należy użyć napylacza do nałożenia na preparat stosunkowo grubej warstwy stopu złoto-pallad lub złota. Pożądana grubość powłoki wynosi od 30 do 40 nanometrów. Skaningową mikroskopię elektronową należy przeprowadzić przy stosunkowo niskim napięciu przyspieszającym, aby zminimalizować problemy związane ze słabym odprowadzaniem ładunków z próbki.Jeśli jest dostępna, należy użyć trybu zmiennego ciśnienia. Najpierw należy dostosować odległość roboczą, aby zapewnić odpowiednią głębię ostrości umożliwiającą ogniskowanie na włóknach w wymiarze Z. W tym celu należy otworzyć kartę Nawigacja (Navigation) w prawym górnym rogu.Następnie przejdź do karty Coordinates w menu stolika. Wprowadź w niej większą wartość dla współrzędnej Z, np. 20 millimeters. Na koniec naciśnij kartę Go To, aby zatwierdzić zmianę.Następnie ustaw powierzchnię badaną prostopadle do wiązki elektronów. Kliknij i przytrzymaj prawy przycisk myszy, a następnie przesuń go w lewo lub w prawo, aby ustawić ostrość preparatu w pobliżu obwodu przygotowanej płaszczyzny powierzchni badanej. Zanotuj ustawioną odległość roboczą.Następnie, korzystając z dżojstika manualnego interfejsu użytkownika, przesuń widok na przeciwległą krawędź i powtórz metodę ustawiania ostrości. Jeśli odległość robocza uległa zmianie, przechyl preparat, aby uzyskać przybliżoną zgodność w obu lokalizacjach. Użyj karty Coordinates w menu Stage i wprowadź wartość pochylenia w współrzędnej T.Następnie obróć preparat o 90 stopni, wprowadzając tę wartość w pole współrzędnej R. Potem powtórz proces pochylania, aż wszystkie pozycje zostaną ustawione w ostrości przy w przybliżeniu tej samej odległości roboczej. Opisana technika została zastosowana do tkanek serca pochodzących od nieużytego dawcy przeszczepu serca człowieka.Ludzka macierz serca stanowi złożoną sieć sieciowo powiązanych białek, która w przekroju poprzecznym przypomina strukturę plastra miodu. Każda taka komórka ma szerokość około 40 µm i zazwyczaj otacza pojedynczy miocyt. Kiedy są one połączone za pomocą dysków przerzutniczych, kilka kardiomiocytów można przedstawić jako pręt biegnący wzdłuż kształtu przypominającego tunel.Oprócz dostarczania informacji strukturalnych, SEM zdekularyzowanych tkanek umożliwia przeprowadzenie istotnej oceny jakościowej w odpowiedzi na uraz lub nieurazowe formy kardiomiopatii, takie jak zawałowate tkanki serca świni. W oddzielnym badaniu wykazano, że izoforma GGF2 białka NRG-1 beta może stanowić potencjalną metodę terapeutyczną w leczeniu niewydolności serca. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak przygotować tkankę, a konkretnie tkankę serca, do badania za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego, w tym technikę odsłaniania interesującej powierzchni oraz sposób montowania preparatu.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne techniki, takie jak spektrometria mas, sekwencjonowanie RNA oraz różne inne analizy, w celu pomiaru białek macierzy zewnątrzkomórkowej i innych białek odpowiedzialnych za sygnalizację oraz inne zjawiska organizacyjne i obserwacyjne. Należy również pamiętać, że tetroksyd osmu jest niebezpieczną substancją chemiczną ze względu na ryzyko utrwalenia błon śluzowych przez jego opary. Zawsze należy pracować w dygestorium, używając rękawic nitrylowych oraz osłony przeciwrozbrygowej lub przesłony dygestorium.

scanning-electron-microscopy-macerated-tissue-to-visualize

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Ten protokół opisuje procedurę wzbogacania białek ECM z tkanek lub guzów oraz deglikozylacji i trawienia preparatów wzbogaconych w ECM na peptydy w celu analizy ich składu białkowego za pomocą spektrometrii mas.

Wzbogacanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej z tkanek i trawienie do peptydów do analizy spektrometrii mas

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Macierz zewnątrzkomórkowa odgrywa główną rolę w definiowaniu mikrośrodowiska komórek oraz w modulowaniu ich zachowania i fenotypu. Opisujemy szybką metodę izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórki, którą można dostosować do różnych skal do badań mikroskopowych, biochemicznych, proteomicznych lub funkcjonalnych.

Szybka, skalowalna metoda izolacji, badania funkcjonalnego i analizy macierzy zewnątrzkomórkowej pochodzącej z komórek

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Celem tego protokołu jest produkcja całych włókien macierzy zewnątrzkomórkowej przeznaczonych do gojenia ran, które są odpowiednie do oceny przedklinicznej jako część regeneracyjnego implantu rusztowania. Włókna te są wytwarzane przez hodowlę fibroblastów na membranach z pustych włókien i ekstrahowane przez rozpuszczenie błon.

Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien

Ten protokół przedstawia metodę decelularyzacji i późniejszego tworzenia hydrożelu mysich poduszeczek tłuszczowych sutka po napromieniowaniu ex vivo.

Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Proponujemy protokół oceny regeneracji kości na różnych poziomach hierarchicznych. To podejście multimodalne umożliwia analizę strukturalną na różnych skalach długości, skutecznie rozwiązując wyzwania związane z przygotowaniem próbek. Zapewnia również wiarygodny sposób oceny skuteczności biomateriałów w wspieraniu regeneracji kości.

Podejście multimodalne do oceny regeneracji kości i wydajności rusztowania

Poznaj skaningową mikroskopię elektronową zmacerowanej tkanki serca do wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta metoda pozwala badać organizację macierzy i jej wpływ na fibrozę oraz kardiomiopatie.

Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Przeglądaj więcej filmów