Skaningowa mikroskopia elektronowa zmacerowanej tkanki w celu wizualizacji macierzy zewnątrzkomórkowej

Ogólnym celem tej metody jest wizualizacja struktury macierzy serca przy braku komórek lub innych materiałów niebędących matrycą. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zwłóknienia, a zwłaszcza w jaki sposób różnice w zawartości macierzy mogą wpływać na organizację macierzy oraz jak te zmiany mogą wpływać na różne kardiomiopatie lub inne choroby zwłóknieniowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia jakościowy widok macierzy, który można wykorzystać do rozszerzenia miar ilościowych.

Dr Galindo i dr Sawyer po raz pierwszy wpadli na pomysł zastosowania tej techniki po tym, jak odkryli, że regularne leczenie świń po zawale powodowało zmiany w ekspresji genów, które były podobne do zmian w zawartości matrycy po leczeniu. Osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mogą mieć trudności, jeśli nie mają wcześniejszego doświadczenia w przygotowywaniu próbek SEM, ze względu na wymagane umiejętności motoryczne. Próbka tkanki powinna być wystarczająco duża, aby była łatwo widoczna i przechowywana w czteroprocentowym roztworze aldehydu glutarowego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wyjmij chusteczkę z chłodni i spłucz ją w wodzie destylowanej. Następnie zanurz tkankę w roztworze 10-procentowego wodorotlenku sodu, przygotowanym świeżo z granulek w wodzie. Pamiętaj, aby podjąć odpowiednie środki ostrożności.

Przechowywać tkankę w roztworze wodorotlenku sodu przez sześć do 10 dni w temperaturze pokojowej. Kontynuuj, gdy kolor tkanki stanie się białawy lub biały. Następnie spłucz chusteczkę wodą destylowaną, aż stanie się przezroczysta.

Następnie załóż rękawiczki i zanurz tkankę w jednoprocentowym kwasie garbnikowym na cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po kąpieli z kwasem garbnikowym opłucz tkankę w wodzie destylowanej przez noc. W trakcie przygotowania, w dygestorio, w rękawicach, przygotować 0,2 molowy roztwór podstawowy buforu kakodylanu sodu i dwuprocentowy wodny roztwór podstawowy tetratlenku osmu.

Używaj osłony przeciwbryzgowej, ponieważ tetratlenek osmu stanowi poważne zagrożenie wdychania. Teraz rozcieńczyć bufor kakodylanu sodu o 0,1 mola i inkubować w nim tkankę przez pięć minut, delikatnie mieszając. Zmienić bufor dwukrotnie, aby przemyć tkankę w sumie trzy razy kakodylanem sodu.

Następnie przygotuj mieszaninę jeden do jednego podstawowego kakodylanu sodu i podstawowego tetratlenku osmu. Inkubuj tkankę w nowej mieszaninie na rotatorze przez godzinę. Później przywróć tkankę do 0,1 molowego kakodylanu sodu i inkubuj ją z delikatnym mieszaniem przez pięć minut.

Zmieniaj ten roztwór do kąpieli dwa razy w ciągu 15 minut. Następnie odwodnić tkankę za pomocą serii kąpieli etanolowych o rosnących stężeniach. Pozwól chusteczce moczyć się przez 15 minut w każdej kąpieli z delikatnym mieszaniem.

Następnie przenieś tkankę i roztwór na płytką szalkę Petriego wypełnioną 100-procentowym etanolem. Następnie, ostrożnie, trzymaj dwie bardzo ostre żyletki tak, aby płaskie boki stykały się ze sobą, a krawędzie tnące krzyżowały się, tworząc dwa boki trójkąta równobocznego nad próbką. Teraz użyj dominującej ręki, aby umieścić drugie ostrze po lewej stronie próbki i pokrój w prawo.

W ten sposób przesuwaj ostrza względem siebie z przeciwnych kierunków, aby uzyskać pojedyncze gładkie cięcie przy minimalnych zniekształceniach lub sile rozrywającej. Celem jest odsłonięcie jak największej powierzchni bez uszkodzenia próbki. Powtarzaj proces, aż zostanie przygotowana wystarczająca ilość zadowalających przekrojów do zbadania przez SEM.

Za pomocą szpatułki lub pęsety przenieś tkankę do uchwytu próbki CPD, jednocześnie zanurzając tkankę w 100-procentowym etanolu. Tkanka nie może być wystawiona na działanie powietrza dłużej niż kilka sekund. Użyj CPD, aby zastąpić etanol ciekłym dwutlenkiem węgla i przeprowadzić cykl suszenia zgodnie ze wskazaniami producenta.

Następnie przygotuj wycinek próbki SEM dla każdej próbki. Przyklej zakładkę kleju węglowego do górnej powierzchni aluminiowego króćca. Pod stereoskopem ostrożnie przyklej próbkę do zakładki samoprzylepnej tak, aby powierzchnia przekroju poprzecznego była skierowana do góry, z dala od wypustki i maksymalnie płaska z powierzchnią króćca.

Nie sonduj ani nie dotykaj interesującej Cię powierzchni. W przypadku najmniejszych, najtrudniejszych próbek złam drewniany aplikator w sztyfcie, aby użyć go jako szpatułki. Pracuj również na dużym kawałku bibuły filtracyjnej, aby uniknąć utraty upuszczonej próbki.

Aby poprawić przyczepność, użyj złamanego aplikatora w sztyfcie, aby zrobić stożkowy pędzel i nałóż farbę srebrną lub węglową na podstawę i boki próbki. Rozciągnij bardzo cienką linię farby aż do krawędzi powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania. W ten sposób utworzy się ścieżka ładunku od powierzchni zainteresowania do ziemi.

Następnie nałóż dwie lub trzy małe krople farby na obwodzie zakładki węglowej, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę od powierzchni wypustki do metalowego króćca. To działa jak ziemia. Odłóż próbkę na bok i pozostaw przewodzącą farbę do wyschnięcia na dwie godziny.

Po wyschnięciu uruchom powlekarkę, aby nałożyć na próbkę stosunkowo ciężką warstwę złota, stopu palladu lub złota. Pożądana jest powłoka o grubości od 30 do 40 nanometrów. Wykonaj skaningową mikroskopię elektronową przy stosunkowo niskim napięciu przyspieszającym, aby zminimalizować problemy związane ze słabym rozpraszaniem ładunku w próbce.

Użyj trybu zmiennego ciśnienia, jeśli jest dostępny. Po pierwsze, popraw odległość roboczą, aby zapewnić wystarczającą głębię ostrości, aby skupić się na włóknach w wymiarze Z. Aby to zrobić, otwórz kartę Nawigacja w prawym górnym rogu.

Następnie przejdź do zakładki Współrzędne z menu sceny. W tym miejscu wprowadź większą wartość współrzędnej Z, na przykład 20 milimetrów. Na koniec naciśnij kartę Idź do, aby wykonać zmianę.

Następnie ustaw powierzchnię zainteresowania prostopadle do wiązki elektronów. Kliknij i przytrzymaj prawy przycisk myszy, a następnie przesuń go w lewo lub w prawo, aby ustawić ostrość próbki w pobliżu obrzeży przygotowanej płaszczyzny powierzchni będącej przedmiotem zainteresowania. Zwróć uwagę na zogniskowaną odległość roboczą.

Następnie, za pomocą joysticka ręcznego interfejsu użytkownika, przesuń widok na przeciwległą krawędź i powtórz metodę ustawiania ostrości. Jeśli odległość robocza uległa zmianie, przechyl próbkę, aby uzyskać przybliżoną zgodność w obu miejscach. Na karcie Współrzędne w menu Stage (Stół montażowy) wprowadź wartość nachylenia we współrzędnej T.

Teraz obróć próbkę o 90 stopni, wprowadzając tę wartość w polu współrzędnych R. Następnie powtarzaj proces przechylania, aż wszystkie pozycje zostaną skupione w przybliżeniu w tej samej odległości roboczej. Opisaną technikę zastosowano do tkanek serca pochodzących od niewykorzystanego dawcy ludzkiego serca po przeszczepie.

Ludzka macierz serca to skomplikowany splot usieciowanych białek, który w przekroju ma wzór przypominający plaster miodu. Każda struktura plastra miodu ma około 40 mikronów szerokości, zwykle omija pojedynczy miocyt. Po połączeniu interkalowanymi dyskami kilka miocytów sercowo-naczyniowych można sobie wyobrazić jako pręt biegnący wzdłuż przez kształt przypominający tunel.

Oprócz dostarczania informacji strukturalnych, SEM tkanek pozbawionych komórek może umożliwić znaczącą ocenę jakościową w odpowiedzi na uraz lub nieszkodliwe formy kardiomiopatii, takie jak zawał tkanek serca świni. W innym badaniu wykazano, że izoforma GGF2 NRG-1 beta jest potencjalnym sposobem leczenia niewydolności serca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak przetwarzać tkankę, tkankę serca, do skaningowego mikroskopu elektronowego, w tym technikę naświetlania interesującej nas powierzchni i mocowania próbki.

Zgodnie z tą procedurą, inne techniki, takie jak specyfikacja masy, sekwencjonowanie RNA i różne inne testy, mogą być stosowane w celu pomiaru białek macierzy zewnątrzkomórkowej i innych odpowiedzialnych za sygnalizację i inne organizacyjne zjawiska obserwacyjne. Nie zapominaj również, że tetratlenek osmu jest niebezpieczną substancją chemiczną ze względu na możliwość wiązania par w błonach śluzowych. Zawsze należy pamiętać o pracy pod wyciągiem z rękawicami nitrylowymi, przy użyciu osłony przeciwbryzgowej lub skrzydła maski.