Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ogólnym celem tej metody jest pokazanie, w jaki sposób pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów mogą być wizualizowane i badane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia, takie jak reakcje na infekcje i inne bodźce immunologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to modyfikacja dobrze znanej metody, która została wykorzystana do badania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili

Demonstracją tej procedury będzie Roleen Sharma. Po uzyskaniu makrofagów płucnych od ludzi i myszy za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BAL, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj błękitu trypanowego i hemocytometru, aby wykonać żywotną liczbę komórek w roztworze BAL. Pipetować od jednego do czterech razy od 10 do piątego makrofagów w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej na szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowych płytek, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby komórki przylegały.

Usuń pożywkę hodowlaną i użyj PBS do jednokrotnego umycia komórek. Następnie dodać 2% paraformaldehydu-periodyna-lizyny lub utrwalacz PLP i inkubować próbki przez 10 minut. Po użyciu PBS do krótkiego umycia komórek, dodaj 0,2%TWEEN 20 do PBS i inkubuj komórki przez 20 minut.

Następnie, aby zablokować komórki, dodaj 10% surowicy kurczaka do 5% BSA, rozcieńczonej w PBS i inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie zastąp roztwór blokowy stężeniem od jednego do 100 pierwszorzędowych i izotopowych przeciwciał kontrolnych i inkubuj komórki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po inkubacji należy użyć PBS do przemycia komórek przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych.

Następnie inkubować próbki przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu komórek w PBS zamontuj próbki za pomocą podłoża montażowego na bazie DAPI, a następnie zwizualizuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Aby wstępnie potraktować próbki FFPE roztworem do pobierania antygenu, wysusz szkiełka w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 60 minut.

Następnie przenieś szkiełka do roztworu ksylenu na 30 minut przed przeniesieniem próbek do 70% etanolu w temperaturze pokojowej na pięć minut. Po użyciu wody z kranu do przepłukania szkiełek, umieść je w żaroodpornej folii i poddaj pobraniu wyższego antygenu, umieszczając je w szybkowarze w Tris-EDTA pH 9,0 na 10 minut. Schłodzić próbki przez 20 minut i przenieść je do wody z kranu.

Następnie umieść je na bujaku na pięć minut. Powtórz mycie wodą z kranu, a następnie umyj szkiełka raz w PBS na bujaku. Aby zablokować próbki, dodaj 10% surowicy kurczaka do 5% BSA PBS i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie, aby zdefiniować pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów lub MET w makrofagach, dodaj rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych od 1 do 100 w 1% BSA PBS i inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Za pomocą PBS umyć próbki dwa razy na bujaku przez pięć minut każda. Dodać odpowiednie fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe w 1% BSA PBS i inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 40 minut.

Po przepłukaniu PBS należy użyć pożywki montażowej zawierającej DAPI do wybarwienia chromatyny i zamontowania próbek. Za pomocą konfokalnej laserowej głowicy skanującej przymocowanej do odwróconego mikroskopu uchwyć obrazy fluorescencyjne za pomocą obiektywów 20X 0.1 NA air i 40X 1.0 NA oil. Uchwyć obrazy pojedynczej płaszczyzny o wymiarach 512 na 512 pikseli, klikając przycisk Poziomowanie sekwencyjne linii.

Uzyskaj co najmniej 10 pól widoku na sekcję do analizy i danych dla każdego wyniku. Aby wybarwić skrawki w probówkach do mikrowirówek, dodaj odpowiednie przeciwciała pierwszorzędowe w objętości 200 mikrolitrów i inkubuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Przemyć skrawki w PBS trzy razy przez 10 minut przed dodaniem odpowiednich przeciwciał drugorzędowych i inkubacją próbek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.

Użyć DAPI do barwienia skrawków płuc w roztworze i inkubować próbki przez 20 minut przed dodaniem szkiełek nakrywkowych do skrawków na szkiełkach mikroskopowych w PBS. Użyj odwróconego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 40X 1,3 NA, wyposażonym w lasery 405 nanometrów, 440 nanometrów, 473 nanometrów, 543 nanometrów i 635 nanometrów, aby uchwycić obrazy i zarejestrować stosy 3D Z o grubości 0,54 mikrona z optymalnym przekrojem Z. Na koniec przeanalizuj obrazy zgodnie z protokołem tekstowym.

Przykład MET w próbce BAL pokazano tutaj. Pierwszą wykrywalną cechą jest ruch jądra do krawędzi komórki, co widać w tym wcześniejszym etapie MET, który ma mniej więcej kulisty kształt. Po nim następuje chromatyna zewnątrzkomórkowa z innymi mediatorami o współekspresji, takimi jak H3Cit i proteazy ziarniste, jak widać w tym bardziej dojrzałym MET.

Wcześniejszy etap MET znajduje się w lewym górnym rogu, a późniejszy etap MET znajduje się poniżej tego w kierunku środka. Na tym rysunku pokazano MET tkanki płucnej. Ponieważ płuca są napełniane płynem w celu zdefiniowania architektury płuc, MET zostaną dociśnięte do ścian pęcherzyków płucnych.

Morfologia MET będzie się również różnić w zależności od tego, w jakiej płaszczyźnie tkanka została przecięta. Standardowe przekroje używane do próbek tkanki płucnej mają grubość od czterech do pięciu mikronów. Grubsze skrawki tkanki umożliwiają wykonanie wielu obrazów, a następnie oglądanie MET w 3D.

Przykład obrazu 3D z tkanki płucnej myszy pociętej na odcinki od 25 do 35 mikronów przedstawiono tutaj. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni barwienia i obrazowania, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z praniem.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak zymografia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak ekspresja proteazy. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę do badania odpowiedzi zapalnych makrofagów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować MET za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Nie zapominaj, że praca z PLP może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawic i ochrona oczu.