Name: Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj wizualizację pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów metodą mikroskopii konfokalnej w próbkach płucnych. Technika ta pozwala badać odpowiedzi immunologiczne na zakażenia i stymulację zapalną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana z grantów Uniwersytetu Monash, Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych oraz Instytutu Płuc i Snu Monash. Autorzy chcieliby podziękować personelowi Immunologii Klinicznej w Monash Health, Judy Callaghan, Alexowi Fulcherowi, Kirstin Elgass i Camden Lo z Monash Micro Imaging (MMI) za pomoc w obrazowaniu mikroskopii konfokalnej, a także dziękują za udogodnienia MMI Uniwersytetu Monash. Autorzy doceniają wyposażenie oraz pomoc naukową i techniczną Platformy Histologicznej Monash.

Ten protokół jest zgodny z eksperymentami zatwierdzonymi w: (1) ludziach przez Komisję Etyki Centrum Medycznego Monash, oraz (2) zwierzętach przez Komisję Etyki Uniwersytetu w Melbourne.
1. Makrofagi z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)
<ol>
	<li>Użyj BAL, aby uzyskać makrofagi płucne w: (1) ludziach za pomocą bronchoskopii6 i (2) myszach za pomocą aspiracji dotchawiczej13. 
	UWAGA: Akwizycja makrofagów na ogół powoduje pewną aktywację tych komórek. Makrofagi uzyskuje się od pacjentów, którzy wymagają bronchoskopii w celu zbadania potencjalnego problemu medycznego i nie wszyscy uczestnicy mogą nadawać się do analizy MET (będzie to musiało zostać określone dla każdego indywidualnego projektu).
	<ol>
		<li>Pobrać roztwór BAL i odwirować (500 x g przez 10 min), aby utworzyć osad, przepłukać dwukrotnie pożywką hodowlaną (Pożywka Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 5% płodową surowicą cielęcą i 1% L-glutaminą) w temperaturze pokojowej, a następnie rozcieńczyć komórki w 4 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Jeśli to konieczne, poproś o formalne zliczenie różnicowe; większość komórek (zwykle >80%) to makrofagi6. 
		UWAGA: Zazwyczaj będzie to wykonywane przez kliniczną usługę histologiczną przy użyciu morfologicznego wyglądu różnych typów komórek6.</li>
		<li>Przeprowadzić żywotną liczbę komórek makrofagów w roztworze BAL, używając wykluczenia błękitu trypanowego i hemocytometru. 
		UWAGA: Roztwór BAL otrzymuje się od ludzi i myszy, jak wspomniano w kroku 1.1.</li>
		<li>Dodać 1 - 4 x 105 makrofagów do 24-dołkowych płytek na szkiełkach nakrywkowych w 500 μl pożywki hodowlanej na basenie i pozostawić na noc w temperaturze 37°C; komórki przylgną do szkiełek nakrywkowych. W przypadku próbek pobranych od ludzi należy dodać antybiotyki (np. penicylinę i streptomycynę, 104 U/ml), aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Znakowanie immunofluorescencyjne/Mikroskopia makrofagów BAL
UWAGA: Komórki są przyklejane do szkiełek nakrywkowych, jak wspomniano powyżej.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Utrwalić komórki w 2% utrwalaczu paraformaldehydu/periodatu/lizyny (PLP) przez 10 min.</li>
	<li>Umyj komórki krótko w PBS, a następnie przepuszczalność w 0,2% Tween 20 w PBS przez 20 minut.</li>
	<li>Blokuj komórki z 10% surowicą kurczaka w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczonej w PBS przez 30 min.</li>
	<li>Inkubować z pierwszorzędowymi i kontrolnymi przeciwciałami izotypowymi przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w stężeniach 1:100 (bardziej szczegółowe informacje podano w tabeli materiałów) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: W przypadku próbek BAL zwykle nie jest wymagany specyficzny marker makrofagów.</li>
	<li>Po dodaniu przeciwciał pierwszorzędowych umyć komórki w PBS i dalej inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj skrawki w PBS i zamontuj za pomocą medium montażowego na bazie DAPI w celu wizualizacji za pomocą mikroskopu konfokalnego (jak wspomniano powyżej) przy wzbudzeniach laserowych 405, 488, 561 i 647 nm oraz obiektywie olejowym 40X, 1.0 NA.</li>
</ol>
3. Próbki tkanki płucnej
UWAGA: Do badań in vivo tkanki płucnej, badaj próbki po odpowiednim narażeniu (np., jak opisali O'Sullivan et al.7). Ekspozycja, która jest najbardziej istotna dla tego eksperymentu, to zakaźne mikroorganizmy, szczególnie bakterie. Szczepy myszy, które można wykorzystać do tej metody, to myszy C57BL/6 lub BALB/c, w wieku 10 - 12 tygodni, o wadze 25 - 30 g i samce.
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (400 mg/kg) i ksylazyny (40 mg/kg). Otwórz klatkę piersiową i odsłoń płuca i serce za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek.
	<ol>
		<li>Wlej ciepły PBS za pomocą igły o rozmiarze 21 do prawej komory, aby wypłukać krew z naczyń przez 30 s, a następnie wlej 10 ml utrwalacza 2% PLP przez 30 s (do prawej komory).</li>
		<li>Użyj ciepłego PBS (42 °C) do przepłukania otwartej jamy klatki piersiowej. Zaintubować tchawicę za pomocą igły o rozmiarze 21 G i kawałka rurki o średnicy 0,8 mm przyciętego na wymiar i wstrzyknąć 800 μl wstępnie podgrzanego (do 42 °C) roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.</li>
		<li>Zwiąż tchawicę plecionym jedwabiem (4,0 USP). Umieść nić wokół tchawicy, tuż poniżej punktu wprowadzenia kaniuli i zabezpiecz ją za pomocą prostego węzła naręcznego. Aby zestalić agarozę, podawaj lodowaty PBS wokół płuc. Usuń płuca i serce jako blok z jamy klatki piersiowej za pomocą nożyczek i rozwarstwienia. Usunąć każde płuco z osobna, a następnie utrwalić je przez 16 godzin w 2% PLP lub formalinie w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przechowywać próbki w PBS w temperaturze 4 °C do czasu podziału tkanki. Te metody pozyskiwania tkanki płucnej zostały już wcześniej opisane13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby przygotować próbki tkanki płucnej, wykonaj następujące czynności.
	<ol>
		<li>Utrwalić tkanki płuc (wycięte w kroku 3.1) w 10% naturalnie buforowanej formalinie przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Przenieś do 75% etanolu i umieść w procesorze tkankowym w cyklu 12 godzin (2,5 godziny w 75% EtOH, 3 godziny w absolutnym EtOH, 3,5 godziny w rozpuszczalniku 3B i przez 3 godziny w parafinie).</li>
		<li>Osadzanie w standardowej parafinie w celu utworzenia bloków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE), które są przechowywane w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Na tym etapie generalnie wygodnie jest przeciąć sekcje płuc w przypadku standardowych szkiełek.</li>
		<li>Wytnij odcinki płuc FFPE o grubości 4 - 5 μm za pomocą mikrotomu i zamontuj na naładowanych, powlekanych szkiełkach, jak wcześniej opisali O'Sullivan i wsp.7</li>
		<li>W celu zamontowania szkiełek należy nanieść 3 krople podłoża montażowego na szkiełka nakrywkowe o wymiarach 60 mm x 24 mm (rozmiar 1,5), odwrócić szkiełko na szkiełku nakrywkowym i wypchnąć nadmiar medium. Hermetycznie zamknąć lakierem do paznokci i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie/Mikroskopia próbek tkanki płucnej
<ol>
	<li>Aby usunąć wosk, należy ponownie nawodnić i wstępnie potraktować próbkę tkanki płucnej FFPE roztworem do pobierania antygenu.
	<ol>
		<li>Szkiełka FFPE suszyć w piekarniku przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Następnie umieść szkiełka w roztworze ksylenu na 30 minut i przenieś do 70% roztworu etanolu na 5 minut w temperaturze pokojowej. Spłucz w wodzie z kranu.</li>
		<li>Umieścić w żaroodpornej folii i poddać pobieraniu antygenu HIER w szybkowarze przez 10 minut w 10 m/mol/L Tris, 1 mmol/EDTA pH 9,0. Schłodzić przez 20 min. Umyj dwa razy w wodzie z kranu przez 5 minut na bujaku, a następnie raz z PBS na bujaku.</li>
		<li>Blok z 10% surowicą kurczaka w 5% BSA/PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Plamić tkankę.
	<ol>
		<li>Aby zdefiniować MET w makrofagach, dodaj pierwszorzędowe przeciwciała (MMP-9, H3Cit i F4/80) w 1% BSA/PBS przez 16 godzin w 4 °C w rozcieńczeniu 1/100 (szczegółowe informacje na temat ilości przeciwciał podano w Tabeli materiałów). Umyj dwa razy PBS przez 5 minut na bujaku.</li>
		<li>Osiągnąć detekcję fluorescencyjną przez inkubację z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w 1% BSA/PBS przez 40 minut w temperaturze pokojowej. Przeciwciała to: (1) kurczak anty-mysz 488 (zielony), (2) kurczak anty-koza 594 (czerwony) i (3) osł anty-mysz 647 (daleki czerwony).</li>
		<li>Umyj skrawki w PBS i zamontuj za pomocą podłoża montażowego zawierającego DAPI do barwienia chromatyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą konfokalnej laserowej głowicy skanującej podłączonej do odwróconego mikroskopu.
	<ol>
		<li>Wzbudzić preparat laserami o długości fali 405, 488, 561 i 647 nm. Rób obrazy w pojedynczej płaszczyźnie o wymiarach 512 x 512 pikseli, klikając przycisk sekwencyjnego poziomowania linii (uśrednianie 2 linii) za pomocą obiektywów pneumatycznych 20X 0,1 NA i 40X 1,0 NA olejowych.</li>
		<li>Uzyskać co najmniej dziesięć pól widzenia na sekcję do analizy i danych dla każdego wyniku (tj. 10 pól widzenia dużej mocy (HFOV) dla kontroli, 10 dla stymulowanej próbki itd., dla każdej myszy). 
		UWAGA: Aby uzyskać reprezentatywną próbkę całego pola, można zastosować system matrycowy, w którym pole jest podzielone na różne sekcje i dla każdej innej próbki ta sama matryca jest używana do wyboru pól widzenia (np. pole można podzielić na 9 sekcji, a od środka i 4 rogów, pobiera się dwa HFOV).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Trójwymiarowe (3D) obrazowanie MET
UWAGA: Ponieważ MET są strukturami 3-D, wykonanie wielu obrazów z-stack, które są odtwarzane, może dostarczyć cennych informacji.
<ol>
	<li>Próbki płuc należy przeciąć z bloków parafinowych na głębokość 200 μm za pomocą wibratomu o amplitudzie ustawionej na 1,8 mm i prędkości 0,1-0,5 mm/s.</li>
	<li>Zablokuj tkankę płucną 20% odpowiedniej surowicy (10% płodu cielęcego i 10% surowicy kurczaka), a następnie przenikaj w PBS z dodatkiem i 3,75% Triton-X 100 przez 7 godzin w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>Wybarwić skrawki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (MMP-9, H3Cit i F4/80) w objętościach 200 μl w probówkach do mikrowirówek (stężenia przeciwciał podano w tabeli materiałów).</li>
	<li>Przemyć skrawki w PBS 3 razy przez 10 minut przed inkubacją z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wybarwić skrawki płuc na DAPI (1:5 000) w roztworze przez 20 minut, przed dodaniem szkiełek nakrywkowych do szkiełek mikroskopowych w PBS.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy fluorescencyjne za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego (40x 1,3 NA) wyposażonego w lasery 405 nm, 440 nm, 473 nm, 543 nm i 635 nm.</li>
	<li>Nagrywaj stosy 3D Z o grubości 0,54 μm z optymalnym przekrojem Z dla obiektywu olejowego 40x 1,3 NA. 
	UWAGA: Używane oprogramowanie będzie się różnić w zależności od indywidualnego mikroskopu. Przykład, w jaki sposób oprogramowanie może być używane do jednego mikroskopu, znajduje się w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu
UWAGA: Analiza próbek wymaga użycia specjalnego oprogramowania do analizy obrazowania, a przykłady są wymienione w Tabeli materiałów. Chociaż analiza wyników będzie zależeć od konkretnego użytego programu, ważne są poniższe punkty.
<ol>
	<li>Analiza próbek BAL
	<ol>
		<li>Zdefiniuj liczbę makrofagów, wybierając niebieski kanał dla DAPI i przypisując minimalny rozmiar komórek (np. > średnicy 18 μm). Korzystając z odpowiedniego oprogramowania, zmierz całkowitą liczbę makrofagów na pole.</li>
		<li>Policz liczbę komórek, które mają cechy MET, przez obecność chromatyny zewnątrzkomórkowej wykrytej przez DAPI z koekspresją innych markerów (np. MMP12, PAD2 i H3Cit). 
		UWAGA: Liczba markerów, które można analizować, zależy od liczby dostępnych laserów, ale najlepiej, aby oprócz DAPI dołączyły co najmniej dwa inne markery. Można zastosować inne, mniej specyficzne parametry ekspresji MET (np. liczbę komórek z chromatyną zewnątrzkomórkową i powiększonym jądrem).</li>
		<li>Aby porównać ekspresję MET w próbkach BAL (między grupami kontrolnymi, dymnymi i traktowanymi dymem/DNazą), przeanalizuj co najmniej 100 makrofagów BAL na próbkę.</li>
		<li>Aby zmierzyć drugorzędowe poziomy kontrolne fluorescencji przeciwciał i izotypów, należy zmierzyć co najmniej 100 komórek w każdej próbce pod kątem ich fluorescencji. Zmierz średni poziom fluorescencji tła dla każdego markera (np. H3Cit) za pomocą standardowego oprogramowania.</li>
		<li>Aby zdefiniować ekspresję MET, policz komórki o typowym fenotypie (np. chromatyna zewnątrzkomórkowa z koekspresją H3Cit i MMP9) i dla każdego MET zmierz poziom fluorescencji markerów (np. H3Cit i MMP9). Wyklucz komórki wytwarzające MET, jeśli ich barwienie nie było powyżej kontroli tła i izotypu.</li>
		<li>W przypadku ludzkich próbek BAL należy przeanalizować co najmniej 100 komórek dla każdej próbki pod kątem procentu makrofagów, które wytwarzają MET. W przypadku próbek mysich, ponieważ komórki są mniejsze, a MET są trudniejsze do zdefiniowania, należy przeanalizować większą liczbę komórek dla każdej próbki (np. 200 makrofagów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek tkanki płucnej
	<ol>
		<li>Aby określić obecność MET w tkance płucnej, należy użyć specyficznego markera makrofagów, takiego jak F4/80.</li>
		<li>Określić obecność MET w tkance płucnej, wykorzystując kolokalizację F4/80 w komórkach, które wyrażają chromatynę zewnątrzkomórkową z innymi parametrami wymienionymi w sekcji 6.1.</li>
		<li>Określić poziomy fluorescencji tła w próbkach z przeciwciałami drugorzędowymi i kontrolami izotypu. Wyklucz MET z analizy, która nie znajduje się powyżej tła.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Brinkmann, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+is+immunity+the+second+function+of+chromatin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?</a> J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).</li>
<li>Jorch, S. K., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+role+for+neutrophil+extracellular+traps+in+noninfectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease.</a> Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).</li>
<li>Cheng, O. Z., Palaniyar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NET+balancing%3A+a+problem+in+inflammatory+lung+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+immunol%22%5BJournal%5D)">NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases.</a> Frontiers immunol. 4, 1(2013).</li>
<li>Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+traps+and+macrophages%3A+new+roles+for+the+versatile+phagocyte%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte.</a> J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).</li>
<li>King, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nontypeable+Haemophilus+influenzae+induces+sustained+lung+oxidative+stress+and+protease+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Nontypeable Haemophilus influenzae induces sustained lung oxidative stress and protease expression.</a> PloS one. 10 (3), e0120371(2015).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney Int. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hypercitrullination+mediates+chromatin+decondensation+and+neutrophil+extracellular+trap+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation.</a> J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).</li>
<li>Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+elastase+and+myeloperoxidase+regulate+the+formation+of+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 191 (3), 677-691 (2010).</li>
<li>Rohrbach, A. S., Slade, D. J., Thompson, P. R., Mowen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PAD4+in+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activation of PAD4 in NET formation.</a> Front Immunol. 3, 360(2012).</li>
<li>Lewis, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+PAD4+activity+is+sufficient+to+disrupt+mouse+and+human+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of PAD4 activity is sufficient to disrupt mouse and human NET formation.</a> Nat Chem Biol. 11 (3), 189-191 (2015).</li>
<li>Ruwanpura, S. M., McLeod, L., Dousha, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Targeting+of+the+IL-6+Trans-Signaling%2FMechanistic+Target+of+Rapamycin+Complex+1+Axis+in+Pulmonary+Emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Targeting of the IL-6 Trans-Signaling/Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Axis in Pulmonary Emphysema.</a> Am J Respir Crit Care Med. 194 (12), 1494-1505 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+how+to+generate+and+visualize+them%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (36), (2010).</li>
<li>Chow, O. A., von Kockritz-Blickwede, M., Bright, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statins+enhance+formation+of+phagocyte+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps.</a> Cell host & microbe. 8 (5), 445-454 (2010).</li>
<li>Wong, K. W., Jacobs, W. R. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+exploits+human+interferon+gamma+to+stimulate+macrophage+extracellular+trap+formation+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis exploits human interferon gamma to stimulate macrophage extracellular trap formation and necrosis.</a> J Infect Dis. 208 (1), 109-119 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych ujawnień w związku z tą pracą.

Metoda opisana w niniejszym przeglądzie opiera się na metodzie użytej do zdefiniowania obecności NET14. Makrofagi są zdecydowanie dominującym typem komórek w próbkach BAL, a ta metoda zbierania jest szczególnie przydatna do badania MET. Jeśli w BAL obecne są krwinki czerwone, komórki te należy poddać lizie przy użyciu chlorku amonu. Procedura BAL na ogół aktywuje makrofagi i dlatego oczekuje się, że w próbkach niestymulowanych będą obecne MET. Makrofagi BAL są zwykle bardzo przylegające. Makrofagi...

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET), zostały po raz pierwszy opisane przez Brinkmanna i wsp.1 Są one głównie wytwarzane w odpowiedzi na infekcję (zwłaszcza na bakterie) i odgrywają ważną rolę w obronie gospodarza1,2. Opisano również, że występują w odpowiedzi na choroby niezakaźne, w tym zapalenie naczyń krwionośnych i toczeń rumieniowaty układowy (SLE); oraz do mitogenu forbolu 12-miryzynianu 13-octanu (PMA)2,3. Niedawno uznano, że inne typy komórek mogą również wytwarzać pułapki zewnątrzkomórkowe, w tym makrofagi. Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów (MET) nie są jeszcze dobrze zdefiniowaną jednostką w literaturze4,5. Niedawno opracowaliśmy metody wykrywania obecności MET zarówno in vitro, jak i in vivo6,7. W artykule zostanie opisany pomiar MET za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Kluczowe cechy NETosi<Kluczowe cechy NETosis, które odróżniają ją od innych szlaków komórkowych (takich jak apoptozasup class="xref">8) to ekstruzja chromatyny w połączeniu z: (1) cytrulinacją histonów (H3Cit)9, (2) koekspresją proteaz ziarnistych10, oraz (3) udziałem deiminazy peptydyloargininowej (PAD) 411,12. Makrofagi wyrażają również H3Cit, proteazy ziarniste i PAD, a cechy te można wykorzystać do określenia obecności MET.
MET mogą odgrywać szczególnie ważną rolę w płucach, ponieważ makrofag jest dominującą komórką obecną w pęcherzykach płucnych i drogach oddechowych i odgrywa początkową rolę w kierowaniu komórkową odpowiedzią immunologiczną na infekcję/stan zapalny. Ponadto, podczas gdy znaczna część płuc to pusta przestrzeń (np. w pęcherzykach płucnych), MET są potencjalnie zdolne do rozszerzania się w dostępną przestrzeń, w przeciwieństwie do narządów stałych.
Najczęściej używaną metodą do określania obecności NET jest mikroskopia konfokalna. Nie ma jeszcze jasno zdefiniowanego sposobu mierzenia MET. Technika pomiaru NET została dostosowana do pomiaru obecności MET w tym protokole. Głównymi wymaganiami dla tej metody jest dostęp do mikroskopii konfokalnej i odpowiedniego oprogramowania do obrazowania do analizy.

<table><tbody><tr><td>< silny> Próbki ludzkie: Przeciwciała pierwotne< / silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki H3Cit (Cytrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug / ml</td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki MMP12</td><td>Novus Biological</td><td>NB110-57214</td><td>1:100 stężenie niekwantyfikowalne</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka MMP9</td><td>Novus Biological</td><td>AB119906</td><td>1:200 wodobrzusze, bez stężenia podany</td></tr><tr><td>Królik anty-ludzki PADI2/PAD2</td><td>Abcam</td><td>AB16478</td><td>7 ug/ml</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Owca anty-ludzka NE</td><td>LifeSpan Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</silny></td><td><silny>Uwagi</td></tr><tr><td>Próbki myszy: Przeciwciała pierwszorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-myszy MMP9</td><td>Abcam</td><td>AF909</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Królik anty-mysz H3Cit (Cytrulina R26)</td><td>Abcam</td><td>AB5103</td><td>10 ug/ml</td></tr><tr><td>Szczurzy anty-mysz F4/80</td><td>In-house (hybridoma)</td><td>We własnym domu</td><td>20 ug/ml</td></tr><tr><td>Owca anty-ludzka anty-HNE /NE</td><td>Sapphire Bioscience</td><td>LS-B4244</td><td>25 ug/ml</td></tr><tr><td>Mysz anty-ludzka i nieśmiała; &nieśmiały; &nieśmiały; &nieśmiały; PADI4/PAD4</td><td>Abcam</td><td>AB128086</td><td>10,1 ug/ml</td></tr><tr><td>Prowadnice Super-frost plus</td><td>Menzel</td><td>S41104A</td><td></td></tr><tr><td>Dapi-prolong gold</td><td>Sondy molekularne</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9434</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td> Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-rabbit AF 488/</td><td>Life technologies</td><td>A-21441</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-królik AF 594</td><td>Life technologies</td><td>A-21442</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-koza AF 594</td><td>Life technologie</td><td>a-21468</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-myszy AF488</td><td>Technologie życia</td><td>A-21200</td><td></td></tr><tr><td>Anty-owce osła AF 594</td><td>Technologie życia</td><td>A-11018</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-myszy AF 647</td><td>Technologie życia</td><td>A-21463</td><td></td></tr><tr><td>Oślica anty-owce AF 594</td><td>Technologie życia</td><td>A-11016</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola</td><td></td><td></td> izotypu<td></td></tr><tr><td>Królik IgG</td><td>w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik IgG</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1</td><td>BD Bioscience</td><td>550878</td><td></td></tr><tr><td>Królik IgG</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG2a</td><td>BioLegend</td><td>400201</td><td></td></tr><tr><td>Owca IgG</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Programy komputerowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Do średniej intensywności fluorforów można użyć standardowej aplikacji biurowej, takiej jak Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>mikroskopy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV1200 Konfokalny mikroskop skaningowy</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Źródła tkanek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie próbki BAL z pracowni bronchoskopii w Monash Medical Center</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próbki BAL myszy i tkanka płucna z Wydziału Farmakologii Uniwersytetu w Melbourne.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>r8758</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Other reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sudan black</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199664</td><td></td></tr><tr><td>utrwalacz paraformaldehydu/periodatu/lizyny (PLP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27387</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K2753</td><td></td></tr><tr><td>Naturalna formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42904</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>327204</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td></td></tr><tr><td>Solvent 3B</td><td>Hi-Chem</td><td>2026</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 12 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1815</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 60 x 24 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6875</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>c57 czarne 6</td><td>Monash platforma badań nad zwierzętami (MARP)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/c</td><td>MARP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

Podstawową metodą używaną do określenia obecności pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) jest mikroskopia konfokalna. Zmodyfikowaliśmy ustalone metody mikroskopii konfokalnej w celu wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET). Te pułapki zewnątrzkomórkowe są definiowane przez obecność chromatyny zewnątrzkomórkowej ze współekspresją innych składników, takich jak proteazy ziarniste, histony cytrulinowane i deiminaza peptydyloarginazy (PAD). Ekspresja MET jest na ogół mierzona po ekspozycji na bodziec i porównywana z próbkami niestymulowanymi. Dołączone są również próbki do kontroli tła i izotypu. Komórki są analizowane za pomocą dobrze zdefiniowanego oprogramowania do analizy obrazu. Mikroskopia konfokalna może być stosowana do określenia obecności MET zarówno in vitro, jak i in vivo w tkance płucnej.

METy można wizualizować w próbkach BAL, w tkance płucnej oraz w grubszych przekrojach płuc za pomocą obrazowania 3D. Przykład METów zwizualizowanych w próbce BAL przedstawiono na Rysunku 1. Morfologia METów różni się w zależności od stopnia ich dojrzewania. Pierwszą cechą wykrywalną w badaniu mikroskopowym jest przemieszczenie jądra komórkowego ku krawędzi komórki. Następnie pojawia się zewnątrzkomórkowa chromatyna wraz z innymi współwyrażanymi mediatorami, t...

Pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów to nowo opisana jednostka. W tym artykule skoncentrujemy się na metodach mikroskopii konfokalnej i sposobie ich wizualizacji in vitro i in vivo na próbkach płuc.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Ogólnym celem tej metody jest pokazanie, w jaki sposób pułapki zewnątrzkomórkowe makrofagów mogą być wizualizowane i badane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia, takie jak reakcje na infekcje i inne bodźce immunologiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to modyfikacja dobrze znanej metody, która została wykorzystana do badania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili.Demonstracją tej procedury będzie Roleen Sharma. Po uzyskaniu makrofagów płucnych od ludzi i myszy za pomocą płukania oskrzelowo-pęcherzykowego lub BAL, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj błękitu trypanowego i hemocytometru, aby wykonać żywotną liczbę komórek w roztworze BAL. Pipetować od jednego do czterech razy od 10 do piątego makrofagów w 500 mikrolitrach pożywki hodowlanej na szkiełka nakrywkowe w dołkach 24-dołkowych płytek, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby komórki przylegały.Usuń pożywkę hodowlaną i użyj PBS do jednokrotnego umycia komórek. Następnie dodać 2% paraformaldehydu-periodyna-lizyny lub utrwalacz PLP i inkubować próbki przez 10 minut. Po użyciu PBS do krótkiego umycia ko

visualizing-macrophage-extracellular-traps-using-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

W tym filmie opisujemy protokół do immunologicznego barwienia i wizualizacji opartej na mikroskopii konfokalnej pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w tkance płucnej myszy. Makrofagi rezydujące w tkankach charakteryzują się ekspresją specyficznego dla makrofagów markera glikoproteiny powierzchniowej F4 / 80, podczas gdy MET są wizualizowane przez znakowanie markerów MET metaloproteinazy macierzy 9, cytrulinowanego histonu H3 i chromatyny zewnątrzkomórkowej.

Charakterystyka pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów w próbkach tkanki płucnej myszy

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów, MET, w makrofagach oskrzelowo-pęcherzykowych z płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, oraz ich wizualizację za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych w makrofagach z ludzkich płynów płucnych oskrzelowo-pęcherzykowych

Ten film demonstruje in vitro stymulację makrofagów zewnątrzkomórkowych pułapek (MET) u ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów przy użyciu różnych bodźców zapalnych, takich jak TNF-alfa, PMA i HOCL. Film przedstawia również metodę barwienia barwnikiem SYTOX MET w celu wizualizacji.

Stymulacja in vitro i wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do indukcji i analizy in vitro zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych (NET). Kwantyfikacja DNA, katelicydyny (LL37) i aktywności enzymów dostarczyła danych, które pokazują zmienność składu i morfologii NET indukowanych przez bodźce mikrobiologiczne i chemiczne w podobnie kontrolowanych warunkach.

Analiza morfologiczna i kompozycyjna pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili indukowanych bodźcami mikrobiologicznymi i chemicznymi

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Poznaj wizualizację pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów metodą mikroskopii konfokalnej w próbkach płucnych. Technika ta pozwala badać odpowiedzi immunologiczne na zakażenia i stymulację zapalną.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów