Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Protokół ten opisywał metodę liczenia czerwonych komórek nowotworowych i klinicznej izolacji CTC. Na początek hoduj komórki nowotworowe MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa w kolbie do hodowli komórkowej raz 10 do jednej piątej w jednym milimetrze DMEM, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Gdy linie komórkowe wyrosną jako przylegające monowarstwy do 95% konfluencji, odłącz je od naczynia hodowlanego z 0,25% roztworem trypsyny na dwie minuty. Wybarwić komórki nowotworowe, dodając trzy mikrolitry Calceiny AM i umieścić naczynie w inkubatorze na 30 minut. Pod koniec inkubacji trawić wszystkie komórki trypsyną.

Policz hodowlę komórek nowotworowych w PBS za pomocą komory do liczenia komórek i rozcieńcz do uzyskania 100 komórek nowotworowych na jeden mililitr PBS. Następnie wprowadzić rozcieńczoną zawiesinę komórkową do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki z pompką strzykawkową przy różnych prędkościach przepływu. Uzyskaj wydajność wychwytywania dla różnych natężeń przepływu i określ optymalne natężenie przepływu.

Policz liczbę komórek nowotworowych przechwyconych na chipie i wypływających z ujścia. Oblicz skuteczność wychwytywania przy użyciu podanego wzoru. Powtórz procedurę, aby uzyskać skuteczność wychwytywania dla różnej liczby komórek nowotworowych, od 10 do 100.

Przetestuj i zweryfikuj chip mikroprzepływowy pod kątem rzadkiej liczby komórek nowotworowych. Wstrzyknij te 10 zawiesin próbek do chipów mikroprzepływowych za pomocą wydrążonej igły wykonanej za pomocą ściągacza do mikropipet w celu odessania rozcieńczonych komórek nowotworowych. Wykryj i policz liczbę komórek nowotworowych dla każdej próbki po ich przechwyceniu na chipie.

Następnie wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM i wyliczyć 100 komórek nowotworowych w pięciu mikrolitrach PBS. Zwiększ te komórki do jednego mililitra całej, normalnej próbki krwi. Wprowadź te komórki do chipa i policz liczbę komórek nowotworowych uchwyconych na chipie za pomocą zielonej immunofluorescencji.

Przeprowadzić wyliczenie in vivo zgodnie z opisem i obliczyć skuteczność wychwytywania po schwytaniu. Wymień od jednej do 10 komórek nowotworowych bez barwienia. Zwiększ te komórki do jednego mililitra pełnej, normalnej krwi.

Wprowadź te próbki do chipa mikroprzepływowego i przechwyć komórki nowotworowe. Dodaj trzy do pięciu mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego do 20 do 30 mikrolitrów PBS i wprowadź ten roztwór do chipa za pomocą strzykawki. Wylicz liczbę komórek nowotworowych wychwyconych na chipie za pomocą immunofluorescencji niebieskiej i zielonej, aby określić skuteczność wychwytywania.

Następnie zmodyfikuj powierzchnię chipa za pomocą 100 mikrolitrów 4%3-merkaptopropylotrimetoksysilanu i etanolu w temperaturze pokojowej przez 45 minut w celu wychwycenia cząsteczki adhezji komórek antynabłonkowych na podstawie powinowactwa. Pod koniec inkubacji umyj chip trzykrotnie etanolem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów środka sprzęgającego GMBS i pozwól mu oddziaływać przez 30 minut.

Pod koniec inkubacji za pomocą strzykawki umyć chip jednym mililitrem PBS. Potraktuj chip 30 do 40 mikrolitrami 10 mikrogramów na mililitr neutrawaryny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, prowadząc do unieruchomienia komórek na GMBS, a następnie przepłucz PBS w celu usunięcia nadmiaru awidyny. Zmodyfikuj chip za pomocą trzech mikrolitrów przeciwciała przeciwko biotynylowanej cząsteczce adhezyjnej komórek nabłonka i inkubuj przez noc.

Wszystkie komórki nowotworowe zostały uchwycone wokół układu chipa falowego bez brakujących komórek, co wskazuje na wysoką skuteczność wychwytywania chipa mikroprzepływowego. Komórki nowotworowe barwione Hoechst i Calcein AM są pokazane tutaj. Pokazano tutaj CTC od pacjenta z rakiem żołądka uchwyconego za pomocą mikrofiltrów z małą elipsą.

Pokazano również CTC od pacjenta z rakiem jelita grubego uchwyconego za pomocą mikrofiltrów trapezowych i emitujących zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję. Wysoką skuteczność wychwytywania i żywotność zaobserwowano w przypadku komórek nowotworowych wychwyconych za pomocą mikrofiltrów o dużej elipsie. Kliniczna analiza immunofluorescencyjna CTC jelita grubego uchwyconych na chipie mikroprzepływowym rozpoznała CTC jako DAPI-dodatnie, CK-dodatnie, CD45-ujemne, a WBC jako DAPI-dodatnie, CK-ujemne, CD45-dodatnie.

Pokazano tutaj komórki nowotworowe jelita grubego wyhodowane na chipie dużej elipsy po schwytaniu oraz komórki nowotworowe jelita grubego uchwycone na mikrofiltrach dużej elipsy. Ta metoda modyfikacji za pomocą aptameru zapewnia nowe podejście do wzbogacania izolacji CTC.