Name: Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Poznaj metodę izolacji krążących komórek nowotworowych za pomocą mikroprzepływowego chipu klinicznego. Technika ta upraszcza przetwarzanie próbek krwi i umożliwia szybką identyfikację pojedynczych CTCs.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca badawcza była wspierana przez Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), Projekt Badań Naukowych Komisji Edukacji Tianjin (2018KJ154), Prowincjonalny Program Badań Przyrodniczych Instytucji Szkolnictwa Wyższego Prowincji Anhui (KJ2020A0239) oraz Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Wielowymiarowe Przetwarzanie Informacji, Uniwersytet Normalny Wschodniochiński (MIP20221).

Próbki krwi pacjenta zostały dostarczone przez Longhua Hospital Affiliated to Shanghai Medical University.Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań na ludziach Trzeciego Szpitala Uniwersytetu Pekińskiego. Uzyskano świadomą zgodę pacjentów na wykorzystanie próbek do celów badawczych.
1. Eksperyment wstępny w celu sprawdzenia skuteczności wychwytywania z hodowanych komórek nowotworowych
<ol>
	<li>Hoduj komórki nowotworowe MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa w celu określenia skuteczności wychwytywania. Rozcieńczyć zawiesinę komórek nowotworowych, policzyć liczbę komórek nowotworowych i powtarzać, aż do uzyskania pożądanej liczby komórek w 1 ml PBS.
	<ol>
		<li>Hodować komórki w kolbie do hodowli komórkowej o początkowej liczbie komórek ~ 1 x 105 komórek w 1 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Inkubować w wilgotnej atmosferze w temperaturze 37 °C z 5% stężeniemCO2 w atmosferze.</li>
		<li>Kiedy linie komórkowe rosną jako przylegające monowarstwy do 95% zbieżności, odłącz je od szalek hodowlanych 0,25% roztworem trypsyny na 2 minuty, jak opisano w Chen et al.16.</li>
		<li>Wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM. Umieść 3 μl kalceiny AM w naczyniu hodowlanym i trzymaj naczynie w inkubatorze przez 30 minut. Następnie,trawić wszystkie komórki za pomocą trypsyny.</li>
		<li>Policz hodowane komórki nowotworowe w PBS za pomocą komory do liczenia komórek i rozcieńcz do uzyskania 100 komórek nowotworowych na 1 ml PBS. 
		UWAGA: Aby dokładnie określić liczbę komórek, należy pobrać 50 μl otrzymanej zawiesiny komórek, aby pod mikroskopem sprawdzić, czy liczba komórek nowotworowych w niej wynosi pięć, czy nie. Zdecyduj o objętości zawiesiny komórek, którą należy pobrać, aby uzyskać 100 komórek nowotworowych zgodnie z rzeczywistą liczbą komórek nowotworowych w 50 μl zawiesiny komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić zawiesinę komórkową zawierającą 100 komórek nowotworowych na 1 ml PBS do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki z pompą strzykawkową przy różnych natężeniach przepływu 0,5 ml/h, 1 ml/h, 2 mL/h, 3 mL/h, 4 mL/h i 5 mL/h. Uzyskaj skuteczność wychwytywania dla różnych natężeń przepływu, i określ optymalne natężenie przepływu.
	<ol>
		<li>Policz liczbę komórek nowotworowych przechwyconych na chipie i wypływających z ujścia. Oblicz skuteczność wychwytywania, jak poniżej: 
		Wydajność przechwytywania = Liczba przechwyconych komórek/(Liczba przechwyconych komórek + liczba komórek wypływających) × 100%</li>
		<li>Powtórz czynność, aby uzyskać skuteczność wychwytywania dla różnej liczby komórek nowotworowych od 10 do 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetestuj i zweryfikuj chip mikroprzepływowy pod kątem rzadkiej liczby komórek nowotworowych. Wstrzyknąć te 10 zawiesin próbek do chipów mikroprzepływowych za pomocą wydrążonej igły wykonanej za pomocą ściągacza do mikropipet, aby zassać 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 komórek nowotworowych rozcieńczonych w 1 ml PBS. Wykryj i policz liczbę komórek nowotworowych dla każdej próbki po ich przechwyceniu na chipie. 
	UWAGA: Wydrążona igła ma około 3 cm długości i średnicę zewnętrzną 1 mm.</li>
	<li>Wykonaj kliniczne testy przed eksperymentem dla komórek nowotworowych wzbogaconych o normalne próbki krwi.
	<ol>
		<li>Wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM, a następnie policzyć 100 komórek nowotworowych w 5 μl PBS. Umieść te komórki w 1 ml pełnych normalnych próbek krwi. Wprowadź te komórki do chipa i policz liczbę komórek nowotworowych uchwyconych na chipie za pomocą zielonej immunofluorescencji. Wykonaj wyliczenie in vivo na chipie, jak opisano powyżej, i oblicz skuteczność przechwytywania po przechwyceniu.</li>
		<li>Powtórzyć krok 1.4.1 dla dziewięciu dodatkowych stężeń liczby komórek nowotworowych od 10 do 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).</li>
		<li>Wylicz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10 komórek nowotworowych zgodnie z opisem w kroku 1.3 bez barwienia, wstrzyknij 1 ml pełnej normalnej krwi, wprowadź te próbki do chipa mikroprzepływowego i przechwyć komórki nowotworowe na chipie.</li>
		<li>Plama na chipie za pomocą Hoechst, CK-FITC i CD45-PE. Umieść 3-5 μl barwnika fluorescencyjnego w 20-30 μl PBS, a następnie wprowadź ten roztwór do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki. Wylicz liczbę komórek nowotworowych wychwyconych na chipie za pomocą immunofluorescencji niebieskiej i zielonej, aby określić skuteczność wychwytywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj modyfikację chipa mikroprzepływowego w celu wychwytywania anty-EpCAM. na podstawie powinowactwa
	UWAGA: Ponieważ układ falowy łączy w sobie zarówno izolację opartą na powinowactwie, jak i izolację opartą na właściwościach fizycznych, zmodyfikuj układ za pomocą agentów.
	<ol>
		<li>Zmodyfikuj powierzchnię chipa za pomocą 100 μl 4% (v/v) 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu w etanolu w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Wprowadź ten roztwór do chipa ostrożnie i powoli, na wypadek, gdyby zniszczył wewnętrzną strukturę chipa, zwłaszcza klejenie górnej powierzchni i podłoża szkło. 
		UWAGA: Powierzchnia wióra jest modyfikowana za pomocą merkaptosilanu. Oddziaływania zachodzące na chipie są determinowane przez wiązania chemiczne. Wiązania chemiczne są tworzone w celu realizacji wiązania przeciwciała zmodyfikowanego antygenem. Różne odczynniki są modyfikowane wewnątrz chipa w celu utworzenia wiązań chemicznych, które łączą się ze sobą. Ostatnim odczynnikiem, który ma być modyfikowany, jest cząsteczka anty-nabłonkowa adhezyjna (anty-EpCAM). Antygen powierzchniowy komórek nowotworowych EpCAM łączy się z anty-EpCAM wewnątrz chipa, aby zrealizować wychwytywanie CTC.</li>
		<li>Przemyć alkoholem etylowym 3x. Dodać 100 μl estru sprzęgającego N-y-maleimidobutyryloksysukcynimidu (GMBS, 1 μM) na chip i pozostawić na 30 minut.</li>
		<li>Umyć PBS 3x. Za pomocą strzykawki wprowadzić 1 ml PBS na chip w celu umycia.</li>
		<li>Potraktuj chip 30-40 μl 10 μg/ml neutrawidyny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, prowadząc do unieruchomienia komórek na GMBS, a następnie przepłucz PBS w celu usunięcia nadmiaru awidyny.</li>
		<li>Zmodyfikuj chip za pomocą 3 μl antybiotynylowanego przeciwciała EpCAM o stężeniu 10 μg/ml w 100 μl PBS z 1% (w/v) BSA. Zachowaj to na noc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Eksperyment kliniczny na chipie do liczenia krążących komórek nowotworowych (CTC)
<ol>
	<li>Wstępnie przetworzyć kliniczne próbki krwi pacjentów z rakiem za pomocą roztworu do lizy czerwonych krwinek (RBCL) lub wprowadzić 2-3 ml próbki krwi bezpośrednio do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki.
	<ol>
		<li>Wykonaj obróbkę wstępną, która trwa około 30 minut. Próbki krwi pełnej należy pobrać do probówek przeciwzakrzepowych. Dodaj 6-9 ml roztworu do lizy RBS do 2-3 ml krwi. Wirować przy 111 x g przez 5-8 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić górną warstwę czerwonego, klarownego płynu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechwyć, zabarwić, rozpoznać i wyliczyć komórki na chipie zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przechwyć komórki na chipie zgodnie z opisem w kroku 1.Wybarwić chip dla CTC przechwyconych za pomocą Hoechst, CK-FITC i CD45-PE. CK-FITC jest specyficznym barwnikiem dla komórek nowotworowych, a CD45-PE jest dla białych krwinek.</li>
		<li>Dodać 3 μl CK-FITC do 20 μl PBS. Wprowadzić go do strzykawki i przepompować rozcieńczony CK-FITC na chip. Pozostawić do zabrudzenia na 30 min. Wprowadź 300 μl PBS na chip, aby umyć chip.</li>
		<li>Dodać 3 μl CD45-PE do 20 μl PBS. Wprowadzić go do strzykawki i wpompować rozcieńczony CD45-PE na chip. Odstawić na 30 minut. Wprowadź 300 μl PBS na chip, aby umyć chip.</li>
		<li>Zidentyfikuj CTC za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego przy powiększeniu 20x lub 40x. CTC emitują zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję, a białe krwinki (WBC) emitują zarówno niebieską, jak i czerwoną fluorescencję. Zidentyfikuj CTC zarówno z niebieską, jak i zieloną fluorescencją, a WBC z niebieską i czerwoną fluorescencją.</li>
		<li>Na podstawie obrazów immunofluorescencyjnych wylicz liczbę CTC uchwyconych na chipie. Wylicz CTC jako Hoechst+/CK-FITC+/CD45−, a WBC jako Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wzbogać wychwycone CTC, przepłukując PBS przez strzykawkę w odwrotnym kierunku na chip mikroprzepływowy, aby zebrać CTC wychwycone na chipie z wlotu. Użyj strzykawki z 1 ml PBS, wprowadź ją z wylotu, aby wzbogacić CTC wychwycone na chipie w ciągu 2-3 minut i zbierz je z wlotu. Użyj 1 ml PBS na każdy etap prania i powtórz 3 razy.</li>
	<li>Wybarwić komórki nowotworowe lub CTC uchwycone na chipie mikroprzepływowym, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Plamić za pomocą kalceiny AM. Dodać 5 μl kalceiny AM do 20 μl PBS, barwić komórki przez 30 min, następnie odwirować przy 111 x g przez 2 min w temperaturze pokojowej w celu uzyskania komórek nowotworowych i zawiesić w 1 ml PBS.</li>
		<li>Aby zidentyfikować jądra komórkowe, dodaj 20 μl roztworu DAPI (10 μl odczynnika DAPI w 20 μl PBS) do chipa przy optymalnym natężeniu przepływu 1 ml/h dla mikrofiltrów o dużej elipcie i 1,5 ml/h dla trapezowych. Przepuścić przez 20 μl roztworu podstawowego antycytokeratyny (3 μl przeciwciała antycytokeratynowego w 20 μl PBS), aby reagować z chipem przez 30 minut.</li>
		<li>Plamić WBC uchwycone na chipie. Po wychwyceniu CTC na chipie dodać 25 μl roztworu przeciwciała anty-CD45 (5 μl roztworu anty-CD45 w 20 μl PBS) do chipa i pozostawić do barwienia przez 30 minut. Przemyj PBS i zidentyfikuj komórki nabłonka za pomocą niebieskiej i zielonej fluorescencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj identyfikację immunofluorescencyjną za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano poniżej.
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu fluorescencyjnego i wzbudz próbkę niebieskim laserem. Znajdź komórki emitujące niebieską fluorescencję, które są komórkami jądrzastymi. Użyj jednego z następujących powiększeń: 10x, 20x lub 40x. Znajdź czyste pole dla komórki nowotworowej. W przypadku źródła niebieskiego lasera należy użyć płytki wzbudzenia o długości fali 420-485 nm i długości fali płyty emisyjnej o długości 515 nm.</li>
		<li>Nie przesuwając próbek, użyj innego źródła lasera. Obróć mikroskop fluorescencyjny i wzbudz próbkę zielonym laserem. Znajdź komórki emitujące zieloną fluorescencję, która wskazuje na komórki nowotworowe. Rób zdjęcia tego samego pola z tym samym powiększeniem za pomocą tego zielonego źródła laserowego. Komórki, które emitują zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję, są rozpoznawane jako komórki nowotworowe. W przypadku źródła zielonego lasera należy użyć fali płyty wzbudzenia o długości 460-550 nm i długości fali płyty emisyjnej o długości 590 nm</li>
		<li>Nie przesuwając próbek, użyj innego źródła lasera. Obróć mikroskop fluorescencyjny i wzbudz próbkę czerwonym laserem. Znajdź komórki emitujące czerwoną fluorescencję. Rób zdjęcia tego samego pola z tym samym powiększeniem za pomocą tego czerwonego źródła lasera. Komórki, które emitują zarówno niebieską, jak i czerwoną fluorescencję, są rozpoznawane jako białe krwinki.</li>
		<li>Zapisz obraz do uzyskania przy użyciu każdego z powyższych źródeł lasera. Zrób kilka zdjęć tego samego pola z różnymi kolorowymi światłami.</li>
		<li>Użyj światła ultrafioletowego o długości fali płytki wzbudzenia 330-400 nm i długości fali płyty emisyjnej 425 nm. Użyj światła fioletowego o długości fali płytki wzbudzenia 395-415 nm i długości fali płyty emisyjnej 455 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć skuteczność wychwytywania jak w kroku 1.2.1.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-sensitive+capture+of+circulating+tumor+cells+using+micro-ellipse+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters.</a> Scientific Reports. 7 (1), 610(2017).</li>
<li>World Health Organization Cancer report. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer">https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer</a> (2022).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).</li>
<li>Mehlen, P., Puisieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+A+question+of+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: A question of life or death.</a> Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).</li>
<li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-selective+collection+of+circulating+tumor+cells+using+Vortex+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+patients+with+localized+and+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer.</a> Science Translational Medicine. 2 (25), 23(2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a+microvortex-generating+herringbone-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumor+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Murlidhar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radial+flow+microfluidic+device+for+ultra-high-throughput+affinity-based+isolation+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells.</a> Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).</li>
<li>Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdevice+for+the+isolation+and+enumeration+of+cancer+cells+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood.</a> Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).</li>
<li>Preira, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+circulating+cell+sorting+by+deformability+using+a+microfluidic+gradual+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter.</a> Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).</li>
<li>Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+microfluidics+combined+with+active+and+passive+approaches+for+continuous+cell+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation.</a> Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).</li>
<li>Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumour+cells+by+physical+means+in+a+microfluidic+device%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review.</a> RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).</li>
<li>Kumeria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoswitchable+membranes+based+on+peptide-modified+nanoporous+anodic+alumina%3A+Toward+smart+membranes+for+on-demand+molecular+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport.</a> Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).</li>
<li>Mahesh, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+microfluidic+platform+for+physical+and+immunological+detection+and+capture+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells.</a> Biosensors. 12 (4), 220(2022).</li>
<li>Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+antibody-coated%2C+physical-based+microfluidic+chip+with+wave-shaped+arrays+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells.</a> Biomedical Microdevices. 19 (3), 66(2017).</li>
<li>Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+circulating+tumour+cell+enrichment+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A review of circulating tumour cell enrichment technologies.</a> Cancers. 13 (5), 970(2021).</li>
<li>Chen, H., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inertia-deformability+hybrid+CTC+chip%3A+Design%2C+clinical+test+and+numerical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Devices%22%5BJournal%5D)">An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study.</a> Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004(2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rokowanie i wczesna diagnoza raka mają znaczący wpływ na leczenie nowotworów1. Izolacja CTC za pomocą chipów mikroprzepływowych zapewnia płynną biopsję bez inwazji. Jednak CTC są niezwykle rzadkie i niejednorodne we krwi1, co sprawia, że wyizolowanie CTC jest trudne. CTC mają podobne właściwości do pierwotnych źródeł nowotworów, z których pochodzą. W związku z tym CTC odgrywają istotną rolę w przerzutach raka1. 
Proponowan...

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są istotne w prognozowaniu, diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej. Liczenie CTC jest niezbędne, ponieważ CTC są rzadkie i niejednorodne. Enumeracja, modyfikacja powinowactwa i kliniczne barwienie immunofluorescencyjne rzadkich CTC są potężnymi technikami izolacji CTC, ponieważ oferują niezbędne elementy o wysokiej czułości1. Rzadka liczba komórek nowotworowych zmieszanych z normalną krwią ściśle naśladuje prawdziwą krew pacjenta, ponieważ 2-3 ml prawdziwej krwi pacjenta zawiera tylko 1-10 CTC. Aby rozwiązać krytyczny problem eksperymentalny, zamiast używać dużej liczby komórek nowotworowych wprowadzonych do PBS lub zmieszanych z normalną krwią, użycie rzadkiej liczby komórek nowotworowych zapewnia nam niską liczbę komórek krwi, co jest bliższe rzeczywistości podczas wykonywania eksperymentu.
Rak jest główną przyczyną zgonów na świecie2. CTC to komórki nowotworowe wydalane z pierwotnego guza, które krążą w układzie krążenia krwi i limfatycznego3. Kiedy CTC przenoszą się do nowego, możliwego do przeżycia środowiska, rosną jako drugi nowotwór. Nazywa się to przerzutami i jest odpowiedzialne za 90% zgonów u pacjentów z rakiem4. CTC są niezbędne do rokowania, wczesnej diagnozy i zrozumienia mechanizmów raka. Jednak CTC są niezwykle rzadkie i niejednorodne u pacjentów we krwi 5,6.
Mikroprzepływowe chipy oferują płynną biopsję, która nie atakuje guza. Ich zaletą jest to, że są przenośne, tanie i mają wagę dopasowaną do komórek. Izolacja CTC za pomocą chipów mikroprzepływowych dzieli się głównie na dwa typy: oparta na powinowactwie, która opiera się na wiązaniu antygenu z przeciwciałem7,8,9 i jest oryginalną i najczęściej stosowaną metodą izolacji CTC; oraz chipy oparte na fizyce, które wykorzystują różnice w wielkości i odkształcalności między komórkami nowotworowymi a komórkami krwi10,11,12,13,14,15, nie zawierają etykiet i są łatwe w obsłudze. Przewaga chipów mikroprzepływowych nad alternatywnymi technikami polega na tym, że oparte na fizyce podejście mikrofiltrów o dużej elipcie mocno wychwytuje CTC z wysoką wydajnością wychwytywania. Powodem tego jest to, że mikrosłupy elipsy są zorganizowane w cienkie tunele odstępów między linią. Odstępy między liniami różnią się od tradycyjnych odstępów punkt-punkt utworzonych przez mikrosłupki, takie jak mikrosłupki rombowe. Przechwytywanie CTC za pomocą chipów falowych łączy w sobie zarówno izolację opartą na właściwościach fizycznych, jak i na powinowactwie. Wychwytywanie fal w oparciu o chipy obejmuje 30 matryc w kształcie fali z przeciwciałem anty-EpCAM pokrytym na okrągłych mikrosłupkach. CTC są wychwytywane przez małe szczeliny, a duże luki są wykorzystywane do przyspieszenia natężenia przepływu. Pominięte CTC muszą przejść przez małe luki w następnej tablicy i są przechwytywane przez izolację opartą na powinowactwie zintegrowaną wewnątrz chip16.
Celem protokołu jest pokazanie liczenia rzadkich ilości komórek nowotworowych oraz klinicznej analizy CTC za pomocą mikroprzepływowych chipów. Protokół opisuje etapy izolacji CTC, sposób uzyskania małej liczby komórek nowotworowych, kliniczną fizyczną separację filtrów o małej elipsie, filtrów o dużej elipsie i filtrów trapezowych, modyfikację powinowactwa i wzbogacanie17.

<table><tbody><tr><td>Kalibrowane pipety mikrokapilarne</td><td></td><td></td> Calcein AM BIOTIUM 80011 Sigma- Aldrich P0799 <td></td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CK-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>347653</td><td>cytokeratyna przeciwciało monoklonalne</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30081.05</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> płodowa surowica bydlęca (FBS)<td></td></tr><tr><td></td><td>GIBCO, USA</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondy molekularne, Solarbio Corp., Chiny</td><td>C0031</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Ying Niezawodna biotechnologia, Chiny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liza czerwonych krwinek (RBCL)</td><td>Solarbio, Pekin</td><td>R1010</td><td></td></tr></tbody></table>

kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Clinical Microfluidic Chip Platform for the Isolation of Versatile Circulating Tumor Cells

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są istotne w prognozowaniu, diagnostyce i terapii przeciwnowotworowej. Liczenie CTC ma zasadnicze znaczenie w określaniu choroby pacjenta, ponieważ CTC są rzadkie i niejednorodne. CTC są odłączane od guza pierwotnego, dostają się do układu krążenia krwi i potencjalnie rosną w odległych miejscach, dając w ten sposób przerzuty do guza. Ponieważ CTC przenoszą podobne informacje do guza pierwotnego, izolacja CTC i późniejsza charakterystyka mogą mieć kluczowe znaczenie w monitorowaniu i diagnozowaniu raka. Enumeracja, modyfikacja powinowactwa i kliniczne barwienie immunofluorescencyjne rzadkich CTC są skutecznymi metodami izolacji CTC, ponieważ dostarczają niezbędnych elementów o wysokiej czułości. Chipy mikroprzepływowe oferują metodę płynnej biopsji, która jest wolna od bólu u pacjentów. W niniejszej pracy przedstawiamy listę protokołów klinicznych chipów mikroprzepływowych, wszechstronnej platformy izolującej CTC, która obejmuje zestaw funkcji i usług wymaganych do separacji, analizy i wczesnej diagnozy CTC, ułatwiając w ten sposób analizę biomolekularną i leczenie raka. Program obejmuje zliczanie rzadkich komórek nowotworowych, kliniczne wstępne przetwarzanie krwi pacjenta, które obejmuje lizę czerwonych krwinek, oraz izolację i rozpoznawanie CTC in situ na chipach mikroprzepływowych. Program umożliwia precyzyjne zliczanie komórek nowotworowych lub CTC. Dodatkowo program zawiera narzędzie, które obejmuje izolację CTC za pomocą wszechstronnych chipów mikroprzepływowych i identyfikację immunofluorescencyjną in situ na chipach, a następnie analizę biomolekularną.

Cały układ obejmuje pompę strzykawkową, strzykawkę oraz chip mikroprzepływowy. Zawiesina komórkowa w strzykawce jest połączona z pompą strzykawkową, a następnie wprowadzana do chipu mikroprzepływowego w celu wychwycenia komórek. Wydajność wychwytywania dla wszystkich zastosowanych chipów mikroprzepływowych wynosiła około 90% lub więcej. W przypadku chipu falowego zaprojektowano mikrostruktury o zróżnicowanej szerokości szczelin. Małe szczeliny służą do wychwytywania CTC, natomiast duże szczeliny służą do przyspieszenia p...

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Circulating tumor cells (CTCs) are significant in cancer prognosis, diagnosis, and anti-cancer therapy. CTC enumeration is vital in determining patient ...

Protokół ten opisywał metodę liczenia czerwonych komórek nowotworowych i klinicznej izolacji CTC. Na początek hoduj komórki nowotworowe MCF-7, MDA-MB-231 i HeLa w kolbie do hodowli komórkowej raz 10 do jednej piątej w jednym milimetrze DMEM, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Gdy linie komórkowe wyrosną jako przylegające monowarstwy do 95% konfluencji, odłącz je od naczynia hodowlanego z 0,25% roztworem trypsyny na dwie minuty. Wybarwić komórki nowotworowe, dodając trzy mikrolitry Calceiny AM i umieścić naczynie w inkubatorze na 30 minut. Pod koniec inkubacji trawić wszystkie komórki trypsyną.Policz hodowlę komórek nowotworowych w PBS za pomocą komory do liczenia komórek i rozcieńcz do uzyskania 100 komórek nowotworowych na jeden mililitr PBS. Następnie wprowadzić rozcieńczoną zawiesinę komórkową do chipa mikroprzepływowego za pomocą strzykawki z pompką strzykawkową przy różnych prędkościach przepływu. Uzyskaj wydajność wychwytywania dla różnych natężeń przepływu i określ optymalne natężenie przepływu.Policz liczbę komórek nowotworowych przechwyconych na chipie i wypływających z ujścia. Oblicz skuteczność wychwytywania przy użyciu podanego wzoru. Powtórz procedurę, aby uzyskać skuteczność wychwytywania dla różnej liczby komórek nowotworowych, od 10 do 100.Przetestuj i zweryfikuj chip mikroprzepływowy pod kątem rzadkiej liczby komórek nowotworowych. Wstrzyknij te 10 zawiesin próbek do chipów mikroprzepływowych za pomocą wydrążonej igły wykonanej za pomocą ściągacza do mikropipet w celu odessania rozcieńczonych komórek nowotworowych. Wykryj i policz liczbę komórek nowotworowych dla każdej próbki po ich przechwyceniu na chipie.Następnie wybarwić komórki nowotworowe kalceiną AM i wyliczyć 100 komórek nowotworowych w pięciu mikrolitrach PBS. Zwiększ te komórki do jednego mililitra całej, normalnej próbki krwi. Wprowadź te komórki do chipa i policz liczbę komórek nowotworowych uchwyconych na chipie za pomocą zielonej immunofluorescencji.Przeprowadzić wyliczenie in vivo zgodnie z opisem i obliczyć skuteczność wychwytywania po schwytaniu. Wymień od jednej do 10 komórek nowotworowych bez barwienia. Zwiększ te komórki do jednego mililitra pełnej, normalnej krwi.Wprowadź te próbki do chipa mikroprzepływowego i przechwyć komórki nowotworowe. Dodaj trzy do pięciu mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego do 20 do 30 mikrolitrów PBS i wprowadź ten roztwór do chipa za pomocą strzykawki. Wylicz liczbę komórek nowotworowych wychwyconych na chipie za pomocą immunofluorescencji niebieskiej i zielonej, aby określić skuteczność wychwytywania.Następnie zmodyfikuj powierzchnię chipa za pomocą 100 mikrolitrów 4%3-merkaptopropylotrimetoksysilanu i etanolu w temperaturze pokojowej przez 45 minut w celu wychwycenia cząsteczki adhezji komórek antynabłonkowych na podstawie powinowactwa. Pod koniec inkubacji umyj chip trzykrotnie etanolem. Następnie dodaj 100 mikrolitrów środka sprzęgającego GMBS i pozwól mu oddziaływać przez 30 minut.Pod koniec inkubacji za pomocą strzykawki umyć chip jednym mililitrem PBS. Potraktuj chip 30 do 40 mikrolitrami 10 mikrogramów na mililitr neutrawaryny w temperaturze pokojowej przez 30 minut, prowadząc do unieruchomienia komórek na GMBS, a następnie przepłucz PBS w celu usunięcia nadmiaru awidyny. Zmodyfikuj chip za pomocą trzech mikrolitrów przeciwciała przeciwko biotynylowanej cząsteczce adhezyjnej komórek nabłonka i inkubuj przez noc.Wszystkie komórki nowotworowe zostały uchwycone wokół układu chipa falowego bez brakujących komórek, co wskazuje na wysoką skuteczność wychwytywania chipa mikroprzepływowego. Komórki nowotworowe barwione Hoechst i Calcein AM są pokazane tutaj. Pokazano tutaj CTC od pacjenta z rakiem żołądka uchwyconego za pomocą mikrofiltrów z małą elipsą.Pokazano również CTC od pacjenta z rakiem jelita grubego uchwyconego za pomocą mikrofiltrów trapezowych i emitujących zarówno niebieską, jak i zieloną fluorescencję. Wysoką skuteczność wychwytywania i żywotność zaobserwowano w przypadku komórek nowotworowych wychwyconych za pomocą mikrofiltrów o dużej elipsie. Kliniczna analiza immunofluorescencyjna CTC jelita grubego uchwyconych na chipie mikroprzepływowym rozpoznała CTC jako DAPI-dodatnie, CK-dodatnie, CD45-ujemne, a WBC jako DAPI-dodatnie, CK-ujemne, CD45-dodatnie.Pokazano tutaj komórki nowotworowe jelita grubego wyhodowane na chipie dużej elipsy po schwytaniu oraz komórki nowotworowe jelita grubego uchwycone na mikrofiltrach dużej elipsy. Ta metoda modyfikacji za pomocą aptameru zapewnia nowe podejście do wzbogacania izolacji CTC.

clinical-microfluidic-chip-platform-for-isolation-versatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

W tym artykule prezentujemy mikroprzepływowy chip do analizy pojedynczych komórek. Umożliwia ilościowe oznaczanie wewnątrzkomórkowych białek, enzymów, kofaktorów i drugich przekaźników za pomocą testów fluorescencyjnych lub testów immunologicznych.

Mikroprzepływowy chip do wszechstronnej analizy chemicznej pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Charakterystyka krążących komórek nowotworowych (CTC) jest popularnym tematem w badaniach translacyjnych. Protokół ten opisuje półautomatyczny test immunofluorescencyjny (IF) do charakterystyki PD-L1 i liczenia CTC w próbkach pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC).

Półautomatyczna charakterystyka i liczenie krążących komórek nowotworowych PD-L1 od pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca za pomocą immunofluorescencji

W dobie immunoterapii i profilowania genomu pojedynczej komórki, biologia nowotworów wymaga nowatorskich narzędzi in vitro i obliczeniowych do badania interfejsu nowotworowo-immunologicznego we właściwym kontekście czasoprzestrzennym. Opisujemy protokoły wykorzystania kokultur mikroprzepływowych immunologicznych z nowotworami w warunkach 2D i 3D, kompatybilnych z dynamicznym, wieloparametrycznym monitorowaniem funkcji komórkowych.

Mikroprzepływowe modele kohodowli do analizy odpowiedzi immunologicznej w mikrośrodowiskach nowotworowych in vitro

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metodę izolacji krążących komórek nowotworowych za pomocą mikroprzepływowego chipu klinicznego. Technika ta upraszcza przetwarzanie próbek krwi i umożliwia szybką identyfikację pojedynczych CTCs.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów