Name: Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Odkryj metodę wykrywania anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia śledzenie odwracania procesu apoptozy w żywych organizmach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Darrenowi Obbardowi za zdjęcie Drosophila na rysunku 3C i w rękopisie wideo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson i Heather M. Lamb za cenną dyskusję na temat tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright Grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation (H.L.T.) oraz NCI K22 grant CA204458 (H.L.T.). W latach 2014-2017 Ho Lam Tang był stypendystą Fundacji Nauk Przyrodniczych (Shurl and Kay Curci Foundation for Life Sciences Research Foundation).

1) Przygotowanie muchówek z biosensora CaspaseTracker
<ol>
	<li>Znieczulij muchy CO2 i użyj pędzla, aby przenieść od 7 do 10 wrażliwych na kaspazę Gal4 (DQVD)19 dziewiczych samic i 7 do 10 G-Trace53 Gal4 reporter młode samce much (lub odwrotnie) w tej samej fiolce z pokarmem na muchy i świeżą pastą drożdżową. 
	nuta: Krzyżówka much wrażliwych na kaspazę (DQVD) Gal4 i G-Trace da muchy potomne CaspaseTracker. Krzyżówka wrażliwych nakaspazę (DQVA)19 Muchy Gal4 i G-Trace dostarczą muchy kontroli negatywnej (patrz dyskusja). Świeża pasta drożdżowa służy jako źródło białka w celu zwiększenia produkcji jaj, co zwiększa liczbę potomstwa. Wybierz dziewicze samice i młode samce much zgodnie z ich fenotypami54.</li>
	<li>Inkubować muchy w temperaturze 18 stopni Celsjusza (oC) podczas krzyżowania przez 3 do 7 dni, a następnie przenieść muchy do nowej fiolki, aby założyć nową krzyżówkę w temperaturze 18 °C. Kontynuować inkubację oryginalnej fiolki w temperaturze 18 °C, aż potomstwo muchy zbliżą się. 
	nuta: Przenieść muchy rodzicielskie do nowych fiolek, aby uniknąć przeludnienia potomstwa w oryginalnej fiolce. Muchy rodzicielskie mogą produkować potomstwo ze świeżym pokarmem i pastą drożdżową przy pierwszych 2 do 3 przełącznikach, a następnie wydajność znacznie spadnie z czasem. Hodowla much o temperaturze 18 °C może zmniejszyć niespecyficzny sygnał biosensora CaspaseTracker (patrz dyskusja).</li>
	<li>Wybierz potomstwo much o prawidłowych fenotypach54 do następujących eksperymentów. 
	nuta: Transgeny zarówno wrażliwego na kaspazę Gal4, jak i G-Trace znajdują się na drugim chromosomie, zrównoważonym przez równoważnik CyO. Wybierz potomstwo o skrzydłach niekędzierzawych (bez CyO), które ma zarówno transgeny wrażliwego na kaspazę Gal4, jak i G-Trace.</li>
</ol>
2) Zastosowanie przejściowej indukcji śmierci komórki do muchówek biosensora CaspaseTracker
<ol>
	<li>Przenieść od 10 do 20 nowo zamkniętych samic much do nowej fiolki ze świeżym pokarmem dla much i świeżą pastą drożdżową na 1 dzień w temperaturze 18 °C, aby umożliwić produkcję w komorze jajowej przez oogenezę. 
	nuta: Trzymanie samicy z samcami much może zwiększyć produkcję w komorze jajowej.</li>
	<li>Aby skłonić komory jajowe do apoptozy przez szok zimny, należy przenieść samice muszek do nowej pustej fiolki, którą następnie umieszcza się w temperaturze -7 °C przez 1 h. 
	UWAGA: Szok zimny uszkadza komórki, wywołując pęknięcie błony plazmatycznej55,56.</li>
	<li>Aby skłonić komory jajowe do apoptozy poprzez głód białka, przenieś samice much do nowej fiolki z 8% sacharozy i 1% pokarmem agarowym w temperaturze 18 °C przez 3 dni. 
	nuta: Głód białka (pokarm niebiałkowy) może spowodować apoptozę komór jajowych57,58,59 i autofagia60,61. Codziennie przestawiaj muchy na nową fiolkę z 8% sacharozy i 1% pokarmu agarowego, aby utrzymać optymalny stan pokarmu dla much sacharozy.</li>
	<li>Przenieść zestresowane muchy z powrotem do nowej fiolki ze świeżym pokarmem dla much i świeżą pastą drożdżową na 3 dni w temperaturze 18 °C, aby mogły dojść do siebie. Przeprowadź sekcję wygłodzonych i wygłodzonych-odzyskanych much, aby uzyskać komory jajowe w jajnikach zgodnie z opisem62. 
	nuta: Aby wypreparować Drosophila w celu uzyskania jajników, znieczulij muchy CO2 i użyj 2 par kleszczy do usunięcia głowy muchy i użyj kleszczy, aby pociągnąć podstawę brzucha, aby usunąć jajniki much.</li>
</ol>
3) Utrwalanie i barwienie wypreparowanych komór jajowych do obrazowania
<ol>
	<li>Przenieś wypreparowane komory jajowe wraz z około 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do probówek wirówkowych o pojemności 1 ml. Pozwól jajom się uspokoić. 
	nuta: Pokryj plastikowe końcówki pipet 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w wodzie lub PBS, aby zapobiec przywieraniu komór jaj do plastikowej powierzchni końcówek. Wykonaj następujące procedury w ciemności, aby uniknąć fotowybielania białka czerwonej fluorescencji (RFP, znanego również jako DsRed) i białka zielonej fluorescencji (GFP) w komorach jajowych.</li>
	<li>Usuń PBS przez pipetowanie, a następnie nałóż 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS, aby utrwalić komory jaj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 do 30 minut 
	nuta: Zastosuj delikatny obrót w tym i następnych krokach inkubacji.</li>
	<li>Usunąć paraformaldehyd za pomocą pipetowania, a następnie umyć komorę jaj 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) 3 razy. 
	nuta: Długotrwała fiksacja może zmniejszyć sygnały RFP i GFP.</li>
	<li>Komory jaj inkubować za pomocą PBST przez 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami, aby komory jaj były przepuszczalne. 
	UWAGA: PBST może również uniknąć przyklejania się komór na jajka do powierzchni z tworzywa sztucznego niepokrytego BSA.</li>
	<li>Usunąć PBST przez pipetowanie, a następnie nałożyć 0,5 ml 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst w PBST do komór jajowych na 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia jądra. 
	UWAGA 1: Unikaj długotrwałej inkubacji z barwnikiem jądrowym, ponieważ zwiększy to sygnał niespecyficzny. 
	UWAGA 2: Alternatywnym podejściem do barwienia jądra bez Hoechst jest dodanie 200 μl środka do wybielania z DAPI (patrz materiały) i inkubacja przez noc63, przed zamontowaniem tkanek na szklanym szkiełku nakrywkowym, jak opisano w protokole 3.8. 
	UWAGA3: Barwienie i poniższe procedury należy wykonywać w ciemności, aby uniknąć fotowybielania.</li>
	<li>Usunąć barwnik jądrowy przez pipetowanie, a następnie nałożyć 0,5 ml PBST, aby umyć komory jaj w probówkach wirówkowych o pojemności 1 ml 3 razy, z 10 do 20 minutową inkubacją z delikatną rotacją między każdym etapem mycia.</li>
	<li>Usunąć cały PBST za pomocą cienkiej pipety, a następnie nałożyć 200 μl środka zapobiegającego wybielaniu (patrz materiały) w celu inkubacji komór na jaja w temperaturze pokojowej przez 3 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C, aż komory jaj opadną na dno probówki. 
	UWAGA: Tkanki, które całkowicie wchłonęły środek mocujący, opadają na dno tuby.</li>
	<li>Zamontuj poplamione komory na jajka, przenosząc je z 200 μl środka wstępnego zapobiegającego wybielaniu na wstępnie oczyszczone szkiełko do obrazowania przez pipetowanie, przykryj komory jaj wstępnie oczyszczonym szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 20 x 20 mm i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, nakładając lakier do paznokci na krawędź szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA 1: Wstępnie wyczyść szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe wodą lub 70% etanolem. 
	UWAGA 2: Umieść wazelinę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć zniszczenia komór jaj przez nadmierną kompresję.</li>
	<li>Zobrazuj komory jajowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego, używając obiektywu planapochromatycznego 20x, NA 0,8, o długości fali światła wzbudzenia 405 nm do barwienia jądrowego (wykryj emisję ~461 nm), 561 nm dla sygnału RFP (trwająca lub niedawna aktywność kaspazy) (wykryj emisję ~590 nm) i 488 nm dla sygnału GFP (przeszła aktywność kaspazy) (wykryj emisję ~518 nm). 
	nuta: Zapoznaj się z naszymi opublikowanymi protokołami mikroskopii20,64.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

System podwójnych bioczujników CaspaseTracker jest nowatorskim i unikalnym narzędziem, które umożliwia wykrywanie niedawnej lub trwającej aktywności kaspazy oraz śledzenie komórek, które odwróciły proces śmierci komórkowej i przeżywają po doświadczeniu aktywności kaspazy in vivo. Podczas gdy aktywność kaspazy jest tradycyjnie uważana za cechę charakterystyczną apoptozy, coraz więcej badań ujawnia, że nieapoptotyczna aktywność kaspazy odgrywa potencjalne role w różnych normalnych ...

Zaprogramowana śmierć komórki, taka jak apoptoza, odgrywa istotną rolę w rozwoju embrionalnym i prawidłowej homeostazie, eliminując niechciane, uszkodzone lub niebezpieczne komórki w organizmach wielokomórkowych1,2,3. Utrata równowagi między śmiercią komórki a przeżyciem może prowadzić do śmiertelnych konsekwencji, takich jak rak, niewydolność serca, autoimmunizacja i zwyrodnienie4,5,6,7,8. Aktywacja kaspaz egzekucyjnych była tradycyjnie uważana za "punkt bez powrotu" w apoptozie9,10,11, ponieważ powoduje szybkie i masowe niszczenie komórek12,13,14,15,16. Kwestionując ten ogólny dogmat, wykazaliśmy, że hodowane umierające komórki pierwotne i komórki rakowe mogą odzyskać sprawność nie tylko po aktywacji kaspazy, ale także po ważnych cechach charakterystycznych śmierci komórki, takich jak pęcherzenie błony komórkowej, kurczenie się komórek, fragmentacja mitochondriów, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c do cytozolu, kondensacja jądra i chromatyny, uszkodzenie DNA, fragmentacja jądrowa, ekspozycja powierzchni komórki na fosfatydyloserynę (PS), i powstawanie ciał apoptotycznych17,18,19,20,21. Sugerujemy, że anastaza jest nieodłącznym zjawiskiem odzyskiwania komórek, ponieważ umierające komórki mogą się zregenerować po usunięciu bodźców śmierci komórki 17,18,19,20,21. Ukuliśmy termin "Anastasis" (Αναστάσης)18, co w języku greckim oznacza "powstanie do życia", aby opisać to nieoczekiwane zjawisko odzyskiwania komórek. Nasza obserwacja anastazy jest dodatkowo poparta ostatnimi niezależnymi badaniami, które również ujawniają odzyskiwanie komórek po eksternalizacji fosfatydyloseryny22,23,24, ograniczona przepuszczalność zewnętrznej błony mitochondrialnej25, aktywacja kinazy podobnej do mieszanej linii (MLKL) i kurczenie się komórek26.
Scharakteryzowanie mechanizmów regulujących anastazę będzie miało zmieniające paradygmat implikacje fizjologiczne, patologiczne i terapeutyczne. Anastasis może reprezentować nieznany wcześniej mechanizm cytoprotekcyjny w celu ratowania lub zachowania ważnych komórek i tkanek postmitotycznych, które są trudne do zastąpienia, i prawdopodobnie odpowiadać za odwrócenie niewydolności serca poprzez odciążenie komór za pomocą urządzeń wspomagających lewą komorę (LVAD)27,28, odzyskiwanie komórek fotoreceptorów po przejściowym narażeniu na nadmierne światło29,30,31, czyli naprawa neuronów po urazie mózgu32. Jeśli tak, promowanie anastazy może przyspieszyć regenerację komórek i tkanek. I odwrotnie, anastaza może być nieoczekiwaną taktyką ucieczki stosowaną przez komórki rakowe w celu przetrwania terapii indukującej śmierć komórki, powodując nawrót raka17,18. Dlatego tłumienie zespolenia w umierających komórkach nowotworowych w trakcie i po leczeniu raka może być nową strategią terapeutyczną leczenia nowotworów poprzez zapobieganie ich nawrotom.
Podczas procesu anastazy stwierdziliśmy, że niektóre odzyskane komórki uzyskały trwałe zmiany genetyczne i przeszły transformację onkogenną, prawdopodobnie z powodu uszkodzenia DNA powstałego podczas apoptozy18,20,21. Odwrócenie procesu śmierci komórek uszkodzonych przez DNA może być mechanizmem nowotworzenia, potencjalnie leżącym u podstaw obserwacji, że powtarzające się uszkodzenia tkanek zwiększają ryzyko raka w różnych tkankach, takich jak przewlekłe uszkodzenie termiczne przełyku wywołane spożyciem bardzo gorących napojów33,34,35, uszkodzenie wątroby spowodowane alkoholizmem36, 37, Ewolucja guza po genotoksycznej terapii przeciwnowotworowej38,39,40, oraz rozwój nowych nowotworów z normalnych tkanek, które powstają w przerwach między cyklami terapii przeciwnowotworowej41,42,43,44. Jeśli to prawda, celowanie w anastazę może zapobiec lub zatrzymać rozwój i progresję raka. Odkryliśmy, że wywołane głodem umierające komórki rozrodcze ulegają anastazie u ponownie karmionych Drosophila19. Jeśli anastaza występuje w komórkach rozrodczych z uszkodzonym DNA, można to wytłumaczyć obserwacją, że długotrwały stres środowiskowy sprzyja rozwojowi chorób genetycznych. Na przykład głód przyczynia się do rozwoju międzypokoleniowych chorób dziedzicznych, takich jak cukrzyca i choroby niedokrwienne serca45. W związku z tym zrozumienie anastazy może prowadzić do opracowania strategii zapobiegania rozwojowi chorób dziedzicznych spowodowanych tym potencjalnym mechanizmem.
Aby wykorzystać odkrycie anastazy i skierować je do opracowania innowacyjnych terapii, konieczne jest zbadanie przyczyny i konsekwencji anastazy u żywych zwierząt. Jednak identyfikacja i śledzenie komórek anastatycznych in vivo jest technicznie trudne, ponieważ komórki, które wyzdrowiały w procesie śmierci komórkowej, wydają się morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek i nie zidentyfikowano jeszcze biomarkera anastazy17,18,21. Aby rozwiązać te problemy, niedawno opracowaliśmy nowy bioczujnik kaspazy in vivo o nazwie "CaspaseTracker"19, do identyfikacji i śledzenia komórek, które przeżywają apoptozę po aktywacji kaspazy19,46, znak rozpoznawczy apoptozy10,14. Odróżnia go od biosensorów kaspazowych "w czasie rzeczywistym", takich jak SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 oraz iCasper52 które wykrywają trwającą aktywność kaspazy, bioczujnik CaspaseTracker dodatkowo posiada zdolność do trwałego znakowania komórek, które wyrażają aktywność kaspazy nawet przejściowo. W związku z tym bioczujnik CaspaseTracker umożliwia długoterminowe śledzenie zespolenia po odwróceniu procesu śmierci komórki za pośrednictwem kaspazy in vivo.

<table><tbody><tr><td><MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE I ODCZYNNIKI > STRONG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medium montażowe</td><td>Produkty wektorowe</td><td>H-1000</td><td>Medium montażowe Antifade</td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield (z DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Medium montażowe Antifade z</td></tr><tr><td>kleszczami</td> DAPI <td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pęseta Dumont klasa biologiczna, </td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie wiszące</td> ze stali nierdzewnej <td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondy molekularne</td><td>H1399</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Mitotracker Czerwony CMXRos&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>M-7512</td><td>Barwienie mitochondriów</td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 (Asp175)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>9661</td><td>Barwienie aktywnego fragmentu</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Środek blokujący do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Podłoże do mycia i barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Carl Zeiss Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Rozwarstwienie Drosophila</td></tr><tr><td>AmScope Podwójny oświetlacz mikroskopu światłowodowego na gęsiej szyi, 150 W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>Źródło światła</td></tr></tbody></table>

wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora caspasetracker

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (po grecku "powstanie do życia") to niedawno odkryte zjawisko odzyskiwania komórek, dzięki któremu umierające komórki mogą odwrócić procesy śmierci komórkowej w późnym stadium, które są ogólnie uważane za nieodwracalne. Promowanie anastazy mogłoby w zasadzie uratować lub zachować uszkodzone komórki, które są trudne do zastąpienia, takie jak kardiomiocyty lub neurony, ułatwiając w ten sposób regenerację tkanek. I odwrotnie, tłumienie zespolenia w komórkach nowotworowych, ulegających apoptozie po terapiach przeciwnowotworowych, może zapewnić śmierć komórek rakowych i zmniejszyć ryzyko nawrotu. Badania te były jednak utrudnione przez brak narzędzi do śledzenia losu komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt. Wyzwaniem jest zidentyfikowanie komórek, które odwróciły proces śmierci komórkowej pomimo ich morfologicznie normalnego wyglądu po wyzdrowieniu. Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowaliśmy systemy biosensorów Drosophila i CaspaseTracker dla ssaków, które mogą identyfikować i trwale śledzić komórki anastatyczne in vitro lub in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokoły in vivo dotyczące generowania i wykorzystania systemu podwójnych biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia zespoleń u Drosophila melanogaster po przejściowej ekspozycji na bodźce śmierci komórki. Podczas gdy konwencjonalne biosensory i protokoły mogą oznaczać komórki aktywnie przechodzące apoptozę śmierci komórki, bioczujnik CaspaseTracker może trwale oznaczać komórki, które odzyskały sprawność po aktywacji kaspazy - co jest cechą charakterystyczną apoptozy w późnym stadium, i jednocześnie identyfikować aktywne procesy apoptotyczne. Ten bioczujnik może również śledzić odzyskiwanie komórek, które próbowały innych form śmierci komórkowej, które bezpośrednio lub pośrednio wiązały się z aktywnością kaspazy. Dlatego protokół ten umożliwia nam ciągłe śledzenie losów tych komórek i ich potomstwa, ułatwiając przyszłe badania funkcji biologicznych, mechanizmów molekularnych, fizjologicznych i patologicznych konsekwencji oraz terapeutycznych implikacji anastazy. Omawiamy również odpowiednie kontrole, aby odróżnić komórki, które ulegają anastazie, od tych, które wykazują nieapoptotyczną aktywność kaspazy in vivo.

Choć mikroskopia obrazowania w odstępach czasu (time-lapse) żywych komórek jest niezawodną metodą śledzenia anastazy w hodowlach komórkowych20, trudnym zadaniem jest zidentyfikowanie, które komórki przeszły anastazę w organizmach zwierzęcych, ponieważ komórki zregenerowane są morfologicznie nieodróżnialne od normalnych zdrowych komórek, które nie podjęły procesu śmierci. Na przykład ludzkie komórki HeLa z raka szyjki macicy wykazują morfologiczne cechy charakterystyczne dla apoptozy<sup class="xre...

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i śledzenie odwrócenia procesu śmierci komórki po aktywacji kaspazy u żywych zwierząt przy użyciu Drosophila melanogaster jako modelu. W odpowiedzi na bodziec śmierci komórki przechodzą zaprogramowaną śmierć komórki, taką jak apoptoza, która tradycyjnie była uważana za nieodwracalną kaskadę prowadzącą do śmierci komórki. Co jednak ciekawe, po usunięciu bodźca śmierci, niektóre umierające komórki mogą odwrócić proces śmierci komórki nawet w późnym stadium.Poprzez nowo odkryte zjawisko odzyskiwania komórek zwane anastazą. Mikroskopia żywych komórek pokazuje, że apoptotyczne umierające komórki wykazują unikalne cechy morfologiczne, takie jak pęcherzenie błony plazmidowej, kondensacja jądrowa i kurczenie się komórek. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że komórki te umrą.Jednak po umyciu i inkubacji umierających komórek ze świeżą pożywką ulegają one anastazie, dochodzą do siebie, a później mogą się dzielić. Trudno jest wykryć i śledzić zespolenie u żywych zwierząt, ponieważ odzyskane komórki mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od otaczających zdrowych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowano system biosensorów CaspaseTracker dla ssaków, który identyfikuje i śledzi komórki, które odwracają proces śmierci komórki po wykonaniu lub aktywacji kaspazy, co jest cechą charakterystyczną apoptozy.Ten system biosensorów składa się z dwóch komponentów: transaktywatora aktywowanego kaspazą, rtTA i reportera aktywności rtTA opartego na Cre LoxP. W zdrowych komórkach, bez aktywności kaspazy, rtTA jest przywiązana do kotwicy błony plazmatycznej za pomocą łącznika DEVD rozszczepialnego przez kaspazę. Ponieważ rtTA na uwięzi nie może przemieszczać się z cytozolu do jądra, reporter rtTA pozostaje nieaktywny.Jednak po aktywacji w odpowiedzi na indukcję śmierci komórki, kaspazy rozszczepiają łącznik DEVD, uwalniając rtTA do translokacji do jądra w celu aktywacji reportera rtTA. Po dostaniu się do jądra rtTA wiąże się z elementem odpowiedzi tet lub TRE i wyzwala przejściową ekspresję rekombinazy Cre, co prowadzi do nieodwracalnego zdarzenia rekombinacji, które usuwa kasetę kodonu stop między promotorem CAG a sekwencjami kodującymi czerwone białko fluorescencyjne DsRed. Powoduje to trwałą ekspresję DsRed, który służy jako trwały marker fluorescencyjny dla komórek, które mogą pozostać przy życiu po doświadczeniu aktywności kaspazy, a także ich potomstwa.Mikroskopia konfokalna żywych komórek pokazuje, że po przejściowej indukcji śmierci komórki komórki biosensora CaspaseTracker wyrażają DsRed w trakcie i po ich odzyskaniu, a zatem odróżniają je od komórek nieodzyskanych, oznaczonych białymi strzałkami, a także komórek biosensora kontrolnego, które nie były narażone na bodziec śmierci komórki. Na ogół zakłada się, że zaprogramowana śmierć komórki, taka jak apoptoza, jest nieodwracalna, ponieważ jest wykonywana przez szalejące i masowe niszczenie komórek. Okazuje się jednak, że ta umierająca komórka może faktycznie wyzdrowieć nawet na późnym etapie, który został uznany za punkt bez powrotu, na przykład po uwolnieniu cytochromu c, aktywacji kaspazy-3, uszkodzeniu DNA, pęcherzeniu błony plazmatycznej, kurczeniu się komórek i tworzeniu ciał apoptotycznych.Nazwaliśmy je odwróceniem procesu śmierci komórki anastasis, co po grecku oznacza powstanie do życia. Za pomocą mikroskopii żywych komórek możemy zaobserwować anastazę w hodowanych komórkach. Jednak zaobserwowanie zespolenia u żywych zwierząt jest technicznie trudne, ponieważ odzyskana komórka śmierci może wyglądać jak normalne, zdrowe komórki, które w ogóle nie próbowały umrzeć komórki.W związku z tym opracowaliśmy system biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia anastazy u żywych zwierząt. Wersja systemu CaspaseTracker dla Drosophila to podwójny bioczujnik, który składa się z dwóch komponentów: czynnika transkrypcyjnego GAL4 aktywowanego kaspazą oraz reportera aktywności GAL4, znanego jako G-TRACE. W komórkach bez aktywności kaspazy czynnik transkrypcyjny drożdży, GAL4, jest przywiązany do domeny kotwiczącej błony plazmatycznej za pomocą łącznika DQVD rozszczepialnego przez kaspazę.Po aktywacji kaspazy, aktywowane kaspazy rozszczepiają łącznik DQVD, aby uwolnić GAL4, który następnie przemieszcza się do jądra, aby aktywować reporter G-TRACE. Jądrowy GAL4 wiąże się ze specyficznymi sekwencjami aktywującymi, w skrócie UAS, w celu wyzwolenia przejściowej ekspresji RFP, która służy jako reporter niedawnej lub bieżącej aktywności kaspazy, dopóki aktywność kaspazy i GAL4 nie ustanie i białko RFP nie zostanie zdegradowane. GAL4 wyzwala również ekspresję rekombinazy FLP, co prowadzi do zdarzenia rekombinacji, które usuwa kasetę zatrzymującą między ubikwityną, w skrócie Ubi, promotorem a sekwencjami powlekającymi GFP ukierunkowaną na energię jądrową.Powoduje to trwałą ekspresję jądrowej GFP, która służy jako trwały marker dla komórek, które doświadczyły aktywności kaspazy, ale pozostają żywe, a także ich potomstwo. Dlatego system ten może identyfikować komórki z trwającą lub niedawną aktywnością kaspazy na podstawie przejściowego sygnału RFP i przeszłą aktywność kaspazy za pomocą stałego sygnału GFP. Bioczujnik kontrolny ma mutację DQVA w miejscu cięcia kaspazy, która jest niewrażliwa na aktywność kaspazy.Wrażliwe na kaspazę dziewicze samice much GAL4 skrzyżowano z młodymi samcami much G-TRACE lub odwrotnie, aby wygenerować muchy CaspaseTracker. Aby przetestować odwracalność procesu śmierci komórki po aktywacji kaspazy, muszki są najpierw wystawione na przejściowy, wywołujący śmierć komórki stres środowiskowy, taki jak szok zimna lub głód białek. Następnie zestresowane muchy są przenoszone z powrotem do normalnych warunków hodowli w celu odzyskania.Tkanki pobrano z komór jajowych w jajnikach od muszek kontrolnych, zestresowanych lub wyleczonych. Próbki poddano mikroskopii konfokalnej w celu wykrycia sygnałów fluorescencyjnych biosensora CaspaseTracker. Na początek znieczulony, niedawno zamknięty, wrażliwy na kaspazę DQVD GAL4 leci za pomocą dwutlenku węgla i za pomocą pędzla przenosi 7 do 10 dziewiczych samic do fiolki ze świeżą żywnością z małą porcją pasty drożdżowej.Samiec samice z 7 do 10 młodymi samcami reporterowymi G-TRACE GAL4. Nowo zamknięte dziewicze muchy wykazują ciemnozieloną smółkę, oznaczoną strzałkami, które są pozostałościami pokarmu larwalnego. Nowo zamknięte muchy są zwykle większe niż dojrzałe muchy.Samce mają ciemniejszy brzuch, oznaczony okręgami i są zwykle mniejsze niż samice. Ustaw krzyżówkę w temperaturze 18 stopni Celsjusza, aby zredukować niespecyficzne sygnały z biosensora CaspaseTracker w potomstwie, ponieważ aktywność GAL4 wzrasta wraz z temperaturą. Co trzy do siedmiu dni przenieś dorosłe osobniki do nowej fiolki z pastą drożdżową, aż ich produktywność spadnie.Po zamknięciu potomstwa połącz muchy z obydwoma transgenami wrażliwego na kaspazę GAL4 i G-TRACE, które będą działać jako muchy potomne CaspaseTracker. Oba wstawki są równoważone przez Curly-O. Tak więc muchy bez kędzierzawych skrzydeł będą miały oba transgeny.W celu kontroli ujemnej należy pobrać podwójne potomstwo transgenu ze skrzyżowania niewrażliwych na kaspazę samic DQVA GAL4 i samców reporterowych G-TRACE GAL4 lub odwrotnie. Z krzyżówek eksperymentalnych przenieś kohorty od 10 do 20 nowo zamkniętych samic much do nowych fiolek z pastą drożdżową. Dodanie kilku samców pomoże samicom w produkcji jaj.Przenieś dobrze odżywione muchy do 18 stopni Celsjusza na jeden dzień, aby ich jajniki wytworzyły komory jajowe poprzez OO-genezę. Następnie, aby zaindukować ich komory jajowe do poddania się apoptozie, użyj szoku zimnego. Przenieś muchy do nowej fiolki bez jedzenia i zamroź je w temperaturze 7 stopni Celsjusza na godzinę.Alternatywną metodą wywołania apoptozy w komorze jajowej jest zastosowanie głodu białkowego poprzez trzymanie much na 8-procentowym spożyciu sacharozy i 1-procentowego agaru w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez trzy dni. Podczas korzystania z tej metody codziennie zmieniaj fiolki z pokarmem bezbiałkowym. Po zestresowaniu muszek którąkolwiek metodą, przywróć je do normalnych warunków utrzymania i jedz pastą drożdżową przez trzy dni, aby umożliwić im powrót do zdrowia.Później należy przeprowadzić sekcję tych much, aby wyizolować ich komory jajowe i jajniki. Po znieczuleniu ich użyj dwóch par kleszczy, aby usunąć ich głowy. Następnie pociągnij muchy u podstawy brzucha, aby usunąć ich jajniki.Przygotuj się do pobrania jajników, pokrywając plastikowe końcówki pipet 1% BSA rozpuszczonego w wodzie lub PBS, aby komory na jajka nie przyklejały się do końcówek pipet. Po wypreparowaniu komór na jajka zbierz je w przygotowane końcówki z około pół mililitra PBS. Następnie przenieś je do jednomililitrowej probówki wirówkowej i pozwól jajom osiąść.Kontynuuj procedurę w warunkach słabego oświetlenia lub całkowitej ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu znaczników fluorescencyjnych. Odessać PBS i załadować 500 mikrolitrów czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS do probówki wirówkowej. Pozwól jajom zastygnąć przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem.Unikaj długotrwałego utrwalania, ponieważ zużyje to sygnał białek fluorescencyjnych w komorach jajowych. Po zamocowaniu usuń PFA i umyj komory na jajka trzykrotnie 500 mikrolitrami PBS-T. Następnie inkubuj komory jajowe z PBS-T przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem, aby przepuszczalność komór jajowych.Następnego ranka dodaj 500 mikrolitrów PBS-T z 5 mikrogramami niebieskiego barwnika jądrowego, takiego jak Hoechst, do komór jajowych. Pozwól im inkubować z delikatną rotacją w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin, ale nie dłużej, w przeciwnym razie sygnały staną się niespecyficzne. Następnie umyj komorę na jajka PBS-T trzy razy przez 10 minut na pranie.Następnie, za pomocą cienkiej pipety, odessać cały PBS-T i nałożyć 200 mikrolitrów środka mocującego zapobiegającego wybielaniu. Tkanki unoszą się na wierzchu, zanim w pełni wchłoną środek mocujący. Inkubować komorę jajową w środku w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez trzy godziny do nocy.Po całkowitym wchłonięciu środka montażowego, chusteczki opadają na dno probówek i są gotowe do montażu. Na początek nałóż wazelinę na szkiełko podstawowe lub szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia komór jaj przez nadmierną kompresję. Aby zamontować barwione komory na jajka, przenieś je z 200 mikrolitrami środka montażowego na szklane szkiełko i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym o grubości 20 milimetrów kwadratowych.Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i kontynuuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. W komorach jajowych jajnika u zdrowych muszek CaspaseTracker nie stwierdzono aktywności biosensora CaspaseTracker, na co wskazuje brak zielonej i czerwonej fluorescencji. Jednak po poddaniu muszek stresowi środowiskowemu indukującemu śmierć komórki, takiemu jak głód białka przez trzy dni, komory jajowe przeszły proces śmierci komórki z aktywacją kaspazy, która indukowała sygnały biosensorów RFP i GFP.W przeciwieństwie do tego, mutacja miejsca cięcia kaspazy u kontrolnych niewrażliwych na kaspazę much DQVA zniosła czułość bioczujnika, co wskazuje, że sygnały biosensora zależą od aktywności kaspazy. Następnie wygłodzonemu, wrażliwemu na kaspazę muchom z biosensora podawano pokarm białkowy przez trzy dni. Komory jajowe odzyskanych muszek nie wyrażały przejściowego reportera kaspazy RFP, co wskazuje na brak niedawnej lub trwającej aktywności kaspazy.Co ważne, odzyskane komory jajowe wyrażały tylko GFP, co wskazuje, że odwróciły proces śmierci komórki po aktywacji kaspazy. Anastazę obserwuje się również in vivo po przejściowym stresie temperaturowym wywołującym śmierć komórki. W odpowiedzi na szok termiczny komory umierających jaj wyrażają markery biosensora RFP i GFP, wskazujące na niedawną lub trwającą aktywność kaspazy, reprezentowaną przez sygnał RFP, oraz przeszłą aktywność kaspazy, reprezentowaną przez sygnał GFP.Jednak po złagodzeniu stresu poprzez powrót do normalnych warunków hodowli przez trzy dni, komory jajowe u wyleczonych muszek wykazywały tylko reporter kaspazy GFP, co wskazuje, że komórki w tych komorach jajowych uległy anastazie w momencie po aktywacji kaspazy. Warto zauważyć, że sygnał GFP CaspaseTracker ujawnia, że wiele typów komórek w komorach jajowych jest zdolnych do odwrócenia procesu śmierci komórki i naprawy uszkodzeń spowodowanych przez kaspazy, w tym komórki rozrodcze, takie jak oocyty i komórki pielęgniarskie oraz komórki pęcherzyków somatycznych. Co ciekawe, GFP oznaczył również komórki w germarium, które zawierają komórki macierzyste, wraz z powiązanymi z nimi komorami jajowymi w tym samym łańcuchu jajników.W związku z tym te komory jajowe GFP-dodatnie mogły pochodzić z komórek macierzystych, które przeszły anastazę. Oto zdjęcia przedstawiające tkanki, które wykazują aktywność biosensora CaspaseTracker bez narażenia na stres środowiskowy. Są to części gębowe, jelito przednie, crop, jelito środkowe, jelito tylne, kanaliki Malpighiego, odbyt, jajowód i jajniki z wypreparowanej, nowo zamkniętej samicy muchy dnia 0.Mikroskopia konfokalna ujawnia niedawną aktywność kaspazy, na co wskazuje RFP, oraz aktywność kaspazy w przeszłości, wskazywaną przez GFP. Powiększone obrazy pokazują niedawną lub trwającą i przeszłą aktywność kaspazy w płacie wzrokowym, wpustie, kanalikach Malpighiego, jelicie tylnym i ścianach mięśni w komorach jajowych, które współlokalizowały się z barwieniem F-aktyną. Niektóre tkanki, takie jak jajowód, wykazują tylko aktywność kaspazy w przeszłości.Te działania biosensorów sugerują potencjalną aktywność znieczulenia podczas rozwoju embrionalnego lub prawidłowej homeostazy. Może również wskazywać na obecną lub przeszłą nieapoptotyczną aktywność kaspazy. Więcej szczegółów można znaleźć w manuskrypcie.Biosensor CaspaseTracker in vivo konkretnie raportuje aktywność kaspazy, ponieważ niewrażliwy CaspaseTracker z sekwencją nierozszczepialną kaspazą DQVA nie ma aktywności biosensora. Jedynym sygnałem jest tutaj niespecyficzny sygnał autofluorescencji z pigmentów, naskórka i ciał tłuszczowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć ogólne zrozumienie tego, w jaki sposób możemy wykorzystać system biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia anastazy u żywych zwierząt.Te bioczujniki mogą ułatwić badania nad walutą i znaną funkcją anastazy. Ich identyfikacja zasięgu ma szeroki zakres zastosowań fizjologicznych, patologicznych i terapeutycznych. Podczas gdy te bioczujniki mogą wykryć odwrócenie apoptozy po aktywacji kaspazy, mogą również wykryć odzyskiwanie komórek po próbie innych form śmierci komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z aktywnością kaspazy.Podczas projektowania eksperymentu bardzo ważne jest uwzględnienie wzajemnych kontroli w celu odróżnienia sygnału fluorescencyjnego biosensora, który śledzi komórki znieczulające od umierających komórek z trwającą aktywnością kaspazy. Zdrowe komórki z obecnymi lub w przeszłości znanymi aktywnościami kaspazy apoptotycznej i niespecyficznym sygnałem autofluorescencji z pigmentu, tłuszczu i krytycznego. Szczegółowe omówienie znajduje się w wersji PDF tego manuskryptu.

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wykazano, że Wykazano, że alternatywna regulacja splicingu przyczynia się do przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego (EMT), niezbędnego programu komórkowego w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę wykorzystującą indukowalny model EMT do wykrywania alternatywnego splicingu podczas EMT.

Wykrywanie alternatywnego splicingu podczas przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Odkryj metodę wykrywania anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia śledzenie odwracania procesu apoptozy w żywych organizmach.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Przeglądaj więcej filmów