Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i śledzenie odwrócenia procesu śmierci komórki po aktywacji kaspazy u żywych zwierząt przy użyciu Drosophila melanogaster jako modelu. W odpowiedzi na bodziec śmierci komórki przechodzą zaprogramowaną śmierć komórki, taką jak apoptoza, która tradycyjnie była uważana za nieodwracalną kaskadę prowadzącą do śmierci komórki. Co jednak ciekawe, po usunięciu bodźca śmierci, niektóre umierające komórki mogą odwrócić proces śmierci komórki nawet w późnym stadium.

Poprzez nowo odkryte zjawisko odzyskiwania komórek zwane anastazą. Mikroskopia żywych komórek pokazuje, że apoptotyczne umierające komórki wykazują unikalne cechy morfologiczne, takie jak pęcherzenie błony plazmidowej, kondensacja jądrowa i kurczenie się komórek. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że komórki te umrą.

Jednak po umyciu i inkubacji umierających komórek ze świeżą pożywką ulegają one anastazie, dochodzą do siebie, a później mogą się dzielić. Trudno jest wykryć i śledzić zespolenie u żywych zwierząt, ponieważ odzyskane komórki mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od otaczających zdrowych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowano system biosensorów CaspaseTracker dla ssaków, który identyfikuje i śledzi komórki, które odwracają proces śmierci komórki po wykonaniu lub aktywacji kaspazy, co jest cechą charakterystyczną apoptozy.

Ten system biosensorów składa się z dwóch komponentów: transaktywatora aktywowanego kaspazą, rtTA i reportera aktywności rtTA opartego na Cre LoxP. W zdrowych komórkach, bez aktywności kaspazy, rtTA jest przywiązana do kotwicy błony plazmatycznej za pomocą łącznika DEVD rozszczepialnego przez kaspazę. Ponieważ rtTA na uwięzi nie może przemieszczać się z cytozolu do jądra, reporter rtTA pozostaje nieaktywny.

Jednak po aktywacji w odpowiedzi na indukcję śmierci komórki, kaspazy rozszczepiają łącznik DEVD, uwalniając rtTA do translokacji do jądra w celu aktywacji reportera rtTA. Po dostaniu się do jądra rtTA wiąże się z elementem odpowiedzi tet lub TRE i wyzwala przejściową ekspresję rekombinazy Cre, co prowadzi do nieodwracalnego zdarzenia rekombinacji, które usuwa kasetę kodonu stop między promotorem CAG a sekwencjami kodującymi czerwone białko fluorescencyjne DsRed. Powoduje to trwałą ekspresję DsRed, który służy jako trwały marker fluorescencyjny dla komórek, które mogą pozostać przy życiu po doświadczeniu aktywności kaspazy, a także ich potomstwa.

Mikroskopia konfokalna żywych komórek pokazuje, że po przejściowej indukcji śmierci komórki komórki biosensora CaspaseTracker wyrażają DsRed w trakcie i po ich odzyskaniu, a zatem odróżniają je od komórek nieodzyskanych, oznaczonych białymi strzałkami, a także komórek biosensora kontrolnego, które nie były narażone na bodziec śmierci komórki. Na ogół zakłada się, że zaprogramowana śmierć komórki, taka jak apoptoza, jest nieodwracalna, ponieważ jest wykonywana przez szalejące i masowe niszczenie komórek. Okazuje się jednak, że ta umierająca komórka może faktycznie wyzdrowieć nawet na późnym etapie, który został uznany za punkt bez powrotu, na przykład po uwolnieniu cytochromu c, aktywacji kaspazy-3, uszkodzeniu DNA, pęcherzeniu błony plazmatycznej, kurczeniu się komórek i tworzeniu ciał apoptotycznych.

Nazwaliśmy je odwróceniem procesu śmierci komórki anastasis, co po grecku oznacza powstanie do życia. Za pomocą mikroskopii żywych komórek możemy zaobserwować anastazę w hodowanych komórkach. Jednak zaobserwowanie zespolenia u żywych zwierząt jest technicznie trudne, ponieważ odzyskana komórka śmierci może wyglądać jak normalne, zdrowe komórki, które w ogóle nie próbowały umrzeć komórki.

W związku z tym opracowaliśmy system biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia anastazy u żywych zwierząt. Wersja systemu CaspaseTracker dla Drosophila to podwójny bioczujnik, który składa się z dwóch komponentów: czynnika transkrypcyjnego GAL4 aktywowanego kaspazą oraz reportera aktywności GAL4, znanego jako G-TRACE. W komórkach bez aktywności kaspazy czynnik transkrypcyjny drożdży, GAL4, jest przywiązany do domeny kotwiczącej błony plazmatycznej za pomocą łącznika DQVD rozszczepialnego przez kaspazę.

Po aktywacji kaspazy, aktywowane kaspazy rozszczepiają łącznik DQVD, aby uwolnić GAL4, który następnie przemieszcza się do jądra, aby aktywować reporter G-TRACE. Jądrowy GAL4 wiąże się ze specyficznymi sekwencjami aktywującymi, w skrócie UAS, w celu wyzwolenia przejściowej ekspresji RFP, która służy jako reporter niedawnej lub bieżącej aktywności kaspazy, dopóki aktywność kaspazy i GAL4 nie ustanie i białko RFP nie zostanie zdegradowane. GAL4 wyzwala również ekspresję rekombinazy FLP, co prowadzi do zdarzenia rekombinacji, które usuwa kasetę zatrzymującą między ubikwityną, w skrócie Ubi, promotorem a sekwencjami powlekającymi GFP ukierunkowaną na energię jądrową.

Powoduje to trwałą ekspresję jądrowej GFP, która służy jako trwały marker dla komórek, które doświadczyły aktywności kaspazy, ale pozostają żywe, a także ich potomstwo. Dlatego system ten może identyfikować komórki z trwającą lub niedawną aktywnością kaspazy na podstawie przejściowego sygnału RFP i przeszłą aktywność kaspazy za pomocą stałego sygnału GFP. Bioczujnik kontrolny ma mutację DQVA w miejscu cięcia kaspazy, która jest niewrażliwa na aktywność kaspazy.

Wrażliwe na kaspazę dziewicze samice much GAL4 skrzyżowano z młodymi samcami much G-TRACE lub odwrotnie, aby wygenerować muchy CaspaseTracker. Aby przetestować odwracalność procesu śmierci komórki po aktywacji kaspazy, muszki są najpierw wystawione na przejściowy, wywołujący śmierć komórki stres środowiskowy, taki jak szok zimna lub głód białek. Następnie zestresowane muchy są przenoszone z powrotem do normalnych warunków hodowli w celu odzyskania.

Tkanki pobrano z komór jajowych w jajnikach od muszek kontrolnych, zestresowanych lub wyleczonych. Próbki poddano mikroskopii konfokalnej w celu wykrycia sygnałów fluorescencyjnych biosensora CaspaseTracker. Na początek znieczulony, niedawno zamknięty, wrażliwy na kaspazę DQVD GAL4 leci za pomocą dwutlenku węgla i za pomocą pędzla przenosi 7 do 10 dziewiczych samic do fiolki ze świeżą żywnością z małą porcją pasty drożdżowej.

Samiec samice z 7 do 10 młodymi samcami reporterowymi G-TRACE GAL4. Nowo zamknięte dziewicze muchy wykazują ciemnozieloną smółkę, oznaczoną strzałkami, które są pozostałościami pokarmu larwalnego. Nowo zamknięte muchy są zwykle większe niż dojrzałe muchy.

Samce mają ciemniejszy brzuch, oznaczony okręgami i są zwykle mniejsze niż samice. Ustaw krzyżówkę w temperaturze 18 stopni Celsjusza, aby zredukować niespecyficzne sygnały z biosensora CaspaseTracker w potomstwie, ponieważ aktywność GAL4 wzrasta wraz z temperaturą. Co trzy do siedmiu dni przenieś dorosłe osobniki do nowej fiolki z pastą drożdżową, aż ich produktywność spadnie.

Po zamknięciu potomstwa połącz muchy z obydwoma transgenami wrażliwego na kaspazę GAL4 i G-TRACE, które będą działać jako muchy potomne CaspaseTracker. Oba wstawki są równoważone przez Curly-O. Tak więc muchy bez kędzierzawych skrzydeł będą miały oba transgeny.

W celu kontroli ujemnej należy pobrać podwójne potomstwo transgenu ze skrzyżowania niewrażliwych na kaspazę samic DQVA GAL4 i samców reporterowych G-TRACE GAL4 lub odwrotnie. Z krzyżówek eksperymentalnych przenieś kohorty od 10 do 20 nowo zamkniętych samic much do nowych fiolek z pastą drożdżową. Dodanie kilku samców pomoże samicom w produkcji jaj.

Przenieś dobrze odżywione muchy do 18 stopni Celsjusza na jeden dzień, aby ich jajniki wytworzyły komory jajowe poprzez OO-genezę. Następnie, aby zaindukować ich komory jajowe do poddania się apoptozie, użyj szoku zimnego. Przenieś muchy do nowej fiolki bez jedzenia i zamroź je w temperaturze 7 stopni Celsjusza na godzinę.

Alternatywną metodą wywołania apoptozy w komorze jajowej jest zastosowanie głodu białkowego poprzez trzymanie much na 8-procentowym spożyciu sacharozy i 1-procentowego agaru w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez trzy dni. Podczas korzystania z tej metody codziennie zmieniaj fiolki z pokarmem bezbiałkowym. Po zestresowaniu muszek którąkolwiek metodą, przywróć je do normalnych warunków utrzymania i jedz pastą drożdżową przez trzy dni, aby umożliwić im powrót do zdrowia.

Później należy przeprowadzić sekcję tych much, aby wyizolować ich komory jajowe i jajniki. Po znieczuleniu ich użyj dwóch par kleszczy, aby usunąć ich głowy. Następnie pociągnij muchy u podstawy brzucha, aby usunąć ich jajniki.

Przygotuj się do pobrania jajników, pokrywając plastikowe końcówki pipet 1% BSA rozpuszczonego w wodzie lub PBS, aby komory na jajka nie przyklejały się do końcówek pipet. Po wypreparowaniu komór na jajka zbierz je w przygotowane końcówki z około pół mililitra PBS. Następnie przenieś je do jednomililitrowej probówki wirówkowej i pozwól jajom osiąść.

Kontynuuj procedurę w warunkach słabego oświetlenia lub całkowitej ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu znaczników fluorescencyjnych. Odessać PBS i załadować 500 mikrolitrów czteroprocentowego paraformaldehydu w PBS do probówki wirówkowej. Pozwól jajom zastygnąć przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym obracaniem.

Unikaj długotrwałego utrwalania, ponieważ zużyje to sygnał białek fluorescencyjnych w komorach jajowych. Po zamocowaniu usuń PFA i umyj komory na jajka trzykrotnie 500 mikrolitrami PBS-T. Następnie inkubuj komory jajowe z PBS-T przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem, aby przepuszczalność komór jajowych.

Następnego ranka dodaj 500 mikrolitrów PBS-T z 5 mikrogramami niebieskiego barwnika jądrowego, takiego jak Hoechst, do komór jajowych. Pozwól im inkubować z delikatną rotacją w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin, ale nie dłużej, w przeciwnym razie sygnały staną się niespecyficzne. Następnie umyj komorę na jajka PBS-T trzy razy przez 10 minut na pranie.

Następnie, za pomocą cienkiej pipety, odessać cały PBS-T i nałożyć 200 mikrolitrów środka mocującego zapobiegającego wybielaniu. Tkanki unoszą się na wierzchu, zanim w pełni wchłoną środek mocujący. Inkubować komorę jajową w środku w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez trzy godziny do nocy.

Po całkowitym wchłonięciu środka montażowego, chusteczki opadają na dno probówek i są gotowe do montażu. Na początek nałóż wazelinę na szkiełko podstawowe lub szkiełko nakrywkowe, aby uniknąć zniszczenia komór jaj przez nadmierną kompresję. Aby zamontować barwione komory na jajka, przenieś je z 200 mikrolitrami środka montażowego na szklane szkiełko i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym o grubości 20 milimetrów kwadratowych.

Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci i kontynuuj za pomocą mikroskopii konfokalnej. W komorach jajowych jajnika u zdrowych muszek CaspaseTracker nie stwierdzono aktywności biosensora CaspaseTracker, na co wskazuje brak zielonej i czerwonej fluorescencji. Jednak po poddaniu muszek stresowi środowiskowemu indukującemu śmierć komórki, takiemu jak głód białka przez trzy dni, komory jajowe przeszły proces śmierci komórki z aktywacją kaspazy, która indukowała sygnały biosensorów RFP i GFP.

W przeciwieństwie do tego, mutacja miejsca cięcia kaspazy u kontrolnych niewrażliwych na kaspazę much DQVA zniosła czułość bioczujnika, co wskazuje, że sygnały biosensora zależą od aktywności kaspazy. Następnie wygłodzonemu, wrażliwemu na kaspazę muchom z biosensora podawano pokarm białkowy przez trzy dni. Komory jajowe odzyskanych muszek nie wyrażały przejściowego reportera kaspazy RFP, co wskazuje na brak niedawnej lub trwającej aktywności kaspazy.

Co ważne, odzyskane komory jajowe wyrażały tylko GFP, co wskazuje, że odwróciły proces śmierci komórki po aktywacji kaspazy. Anastazę obserwuje się również in vivo po przejściowym stresie temperaturowym wywołującym śmierć komórki. W odpowiedzi na szok termiczny komory umierających jaj wyrażają markery biosensora RFP i GFP, wskazujące na niedawną lub trwającą aktywność kaspazy, reprezentowaną przez sygnał RFP, oraz przeszłą aktywność kaspazy, reprezentowaną przez sygnał GFP.

Jednak po złagodzeniu stresu poprzez powrót do normalnych warunków hodowli przez trzy dni, komory jajowe u wyleczonych muszek wykazywały tylko reporter kaspazy GFP, co wskazuje, że komórki w tych komorach jajowych uległy anastazie w momencie po aktywacji kaspazy. Warto zauważyć, że sygnał GFP CaspaseTracker ujawnia, że wiele typów komórek w komorach jajowych jest zdolnych do odwrócenia procesu śmierci komórki i naprawy uszkodzeń spowodowanych przez kaspazy, w tym komórki rozrodcze, takie jak oocyty i komórki pielęgniarskie oraz komórki pęcherzyków somatycznych. Co ciekawe, GFP oznaczył również komórki w germarium, które zawierają komórki macierzyste, wraz z powiązanymi z nimi komorami jajowymi w tym samym łańcuchu jajników.

W związku z tym te komory jajowe GFP-dodatnie mogły pochodzić z komórek macierzystych, które przeszły anastazę. Oto zdjęcia przedstawiające tkanki, które wykazują aktywność biosensora CaspaseTracker bez narażenia na stres środowiskowy. Są to części gębowe, jelito przednie, crop, jelito środkowe, jelito tylne, kanaliki Malpighiego, odbyt, jajowód i jajniki z wypreparowanej, nowo zamkniętej samicy muchy dnia 0.

Mikroskopia konfokalna ujawnia niedawną aktywność kaspazy, na co wskazuje RFP, oraz aktywność kaspazy w przeszłości, wskazywaną przez GFP. Powiększone obrazy pokazują niedawną lub trwającą i przeszłą aktywność kaspazy w płacie wzrokowym, wpustie, kanalikach Malpighiego, jelicie tylnym i ścianach mięśni w komorach jajowych, które współlokalizowały się z barwieniem F-aktyną. Niektóre tkanki, takie jak jajowód, wykazują tylko aktywność kaspazy w przeszłości.

Te działania biosensorów sugerują potencjalną aktywność znieczulenia podczas rozwoju embrionalnego lub prawidłowej homeostazy. Może również wskazywać na obecną lub przeszłą nieapoptotyczną aktywność kaspazy. Więcej szczegółów można znaleźć w manuskrypcie.

Biosensor CaspaseTracker in vivo konkretnie raportuje aktywność kaspazy, ponieważ niewrażliwy CaspaseTracker z sekwencją nierozszczepialną kaspazą DQVA nie ma aktywności biosensora. Jedynym sygnałem jest tutaj niespecyficzny sygnał autofluorescencji z pigmentów, naskórka i ciał tłuszczowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć ogólne zrozumienie tego, w jaki sposób możemy wykorzystać system biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia anastazy u żywych zwierząt.

Te bioczujniki mogą ułatwić badania nad walutą i znaną funkcją anastazy. Ich identyfikacja zasięgu ma szeroki zakres zastosowań fizjologicznych, patologicznych i terapeutycznych. Podczas gdy te bioczujniki mogą wykryć odwrócenie apoptozy po aktywacji kaspazy, mogą również wykryć odzyskiwanie komórek po próbie innych form śmierci komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się z aktywnością kaspazy.

Podczas projektowania eksperymentu bardzo ważne jest uwzględnienie wzajemnych kontroli w celu odróżnienia sygnału fluorescencyjnego biosensora, który śledzi komórki znieczulające od umierających komórek z trwającą aktywnością kaspazy. Zdrowe komórki z obecnymi lub w przeszłości znanymi aktywnościami kaspazy apoptotycznej i niespecyficznym sygnałem autofluorescencji z pigmentu, tłuszczu i krytycznego. Szczegółowe omówienie znajduje się w wersji PDF tego manuskryptu.