Name: Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: Odkryj metodę wykrywania anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia śledzenie odwracania procesu apoptozy w żywych organizmach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Darrenowi Obbardowi za zdjęcie Drosophila na rysunku 3C i w rękopisie wideo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson i Heather M. Lamb za cenną dyskusję na temat tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez stypendium Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright Grant 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation (H.L.T.) oraz NCI K22 grant CA204458 (H.L.T.). W latach 2014-2017 Ho Lam Tang był stypendystą Fundacji Nauk Przyrodniczych (Shurl and Kay Curci Foundation for Life Sciences Research Foundation).

1) Przygotowanie muchówek z biosensora CaspaseTracker
<ol>
	<li>Znieczulij muchy CO2 i użyj pędzla, aby przenieść od 7 do 10 wrażliwych na kaspazę Gal4 (DQVD)19 dziewiczych samic i 7 do 10 G-Trace53 Gal4 reporter młode samce much (lub odwrotnie) w tej samej fiolce z pokarmem na muchy i świeżą pastą drożdżową. 
	nuta: Krzyżówka much wrażliwych na kaspazę (DQVD) Gal4 i G-Trace da muchy potomne CaspaseTracker. Krzyżówka wrażliwych nakaspazę (DQVA)19 Muchy Gal4 i G-Trace dostarczą muchy kontroli negatywnej (patrz dyskusja). Świeża pasta drożdżowa służy jako źródło białka w celu zwiększenia produkcji jaj, co zwiększa liczbę potomstwa. Wybierz dziewicze samice i młode samce much zgodnie z ich fenotypami54.</li>
	<li>Inkubować muchy w temperaturze 18 stopni Celsjusza (oC) podczas krzyżowania przez 3 do 7 dni, a następnie przenieść muchy do nowej fiolki, aby założyć nową krzyżówkę w temperaturze 18 °C. Kontynuować inkubację oryginalnej fiolki w temperaturze 18 °C, aż potomstwo muchy zbliżą się. 
	nuta: Przenieść muchy rodzicielskie do nowych fiolek, aby uniknąć przeludnienia potomstwa w oryginalnej fiolce. Muchy rodzicielskie mogą produkować potomstwo ze świeżym pokarmem i pastą drożdżową przy pierwszych 2 do 3 przełącznikach, a następnie wydajność znacznie spadnie z czasem. Hodowla much o temperaturze 18 °C może zmniejszyć niespecyficzny sygnał biosensora CaspaseTracker (patrz dyskusja).</li>
	<li>Wybierz potomstwo much o prawidłowych fenotypach54 do następujących eksperymentów. 
	nuta: Transgeny zarówno wrażliwego na kaspazę Gal4, jak i G-Trace znajdują się na drugim chromosomie, zrównoważonym przez równoważnik CyO. Wybierz potomstwo o skrzydłach niekędzierzawych (bez CyO), które ma zarówno transgeny wrażliwego na kaspazę Gal4, jak i G-Trace.</li>
</ol>
2) Zastosowanie przejściowej indukcji śmierci komórki do muchówek biosensora CaspaseTracker
<ol>
	<li>Przenieść od 10 do 20 nowo zamkniętych samic much do nowej fiolki ze świeżym pokarmem dla much i świeżą pastą drożdżową na 1 dzień w temperaturze 18 °C, aby umożliwić produkcję w komorze jajowej przez oogenezę. 
	nuta: Trzymanie samicy z samcami much może zwiększyć produkcję w komorze jajowej.</li>
	<li>Aby skłonić komory jajowe do apoptozy przez szok zimny, należy przenieść samice muszek do nowej pustej fiolki, którą następnie umieszcza się w temperaturze -7 °C przez 1 h. 
	UWAGA: Szok zimny uszkadza komórki, wywołując pęknięcie błony plazmatycznej55,56.</li>
	<li>Aby skłonić komory jajowe do apoptozy poprzez głód białka, przenieś samice much do nowej fiolki z 8% sacharozy i 1% pokarmem agarowym w temperaturze 18 °C przez 3 dni. 
	nuta: Głód białka (pokarm niebiałkowy) może spowodować apoptozę komór jajowych57,58,59 i autofagia60,61. Codziennie przestawiaj muchy na nową fiolkę z 8% sacharozy i 1% pokarmu agarowego, aby utrzymać optymalny stan pokarmu dla much sacharozy.</li>
	<li>Przenieść zestresowane muchy z powrotem do nowej fiolki ze świeżym pokarmem dla much i świeżą pastą drożdżową na 3 dni w temperaturze 18 °C, aby mogły dojść do siebie. Przeprowadź sekcję wygłodzonych i wygłodzonych-odzyskanych much, aby uzyskać komory jajowe w jajnikach zgodnie z opisem62. 
	nuta: Aby wypreparować Drosophila w celu uzyskania jajników, znieczulij muchy CO2 i użyj 2 par kleszczy do usunięcia głowy muchy i użyj kleszczy, aby pociągnąć podstawę brzucha, aby usunąć jajniki much.</li>
</ol>
3) Utrwalanie i barwienie wypreparowanych komór jajowych do obrazowania
<ol>
	<li>Przenieś wypreparowane komory jajowe wraz z około 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do probówek wirówkowych o pojemności 1 ml. Pozwól jajom się uspokoić. 
	nuta: Pokryj plastikowe końcówki pipet 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) rozpuszczoną w wodzie lub PBS, aby zapobiec przywieraniu komór jaj do plastikowej powierzchni końcówek. Wykonaj następujące procedury w ciemności, aby uniknąć fotowybielania białka czerwonej fluorescencji (RFP, znanego również jako DsRed) i białka zielonej fluorescencji (GFP) w komorach jajowych.</li>
	<li>Usuń PBS przez pipetowanie, a następnie nałóż 0,5 ml 4% paraformaldehydu w PBS, aby utrwalić komory jaj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 20 do 30 minut 
	nuta: Zastosuj delikatny obrót w tym i następnych krokach inkubacji.</li>
	<li>Usunąć paraformaldehyd za pomocą pipetowania, a następnie umyć komorę jaj 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) 3 razy. 
	nuta: Długotrwała fiksacja może zmniejszyć sygnały RFP i GFP.</li>
	<li>Komory jaj inkubować za pomocą PBST przez 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnymi obrotami, aby komory jaj były przepuszczalne. 
	UWAGA: PBST może również uniknąć przyklejania się komór na jajka do powierzchni z tworzywa sztucznego niepokrytego BSA.</li>
	<li>Usunąć PBST przez pipetowanie, a następnie nałożyć 0,5 ml 10 μg/ml niebieskiego barwnika jądrowego Hoechst w PBST do komór jajowych na 1 do 2 godzin w temperaturze pokojowej w celu wybarwienia jądra. 
	UWAGA 1: Unikaj długotrwałej inkubacji z barwnikiem jądrowym, ponieważ zwiększy to sygnał niespecyficzny. 
	UWAGA 2: Alternatywnym podejściem do barwienia jądra bez Hoechst jest dodanie 200 μl środka do wybielania z DAPI (patrz materiały) i inkubacja przez noc63, przed zamontowaniem tkanek na szklanym szkiełku nakrywkowym, jak opisano w protokole 3.8. 
	UWAGA3: Barwienie i poniższe procedury należy wykonywać w ciemności, aby uniknąć fotowybielania.</li>
	<li>Usunąć barwnik jądrowy przez pipetowanie, a następnie nałożyć 0,5 ml PBST, aby umyć komory jaj w probówkach wirówkowych o pojemności 1 ml 3 razy, z 10 do 20 minutową inkubacją z delikatną rotacją między każdym etapem mycia.</li>
	<li>Usunąć cały PBST za pomocą cienkiej pipety, a następnie nałożyć 200 μl środka zapobiegającego wybielaniu (patrz materiały) w celu inkubacji komór na jaja w temperaturze pokojowej przez 3 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C, aż komory jaj opadną na dno probówki. 
	UWAGA: Tkanki, które całkowicie wchłonęły środek mocujący, opadają na dno tuby.</li>
	<li>Zamontuj poplamione komory na jajka, przenosząc je z 200 μl środka wstępnego zapobiegającego wybielaniu na wstępnie oczyszczone szkiełko do obrazowania przez pipetowanie, przykryj komory jaj wstępnie oczyszczonym szklanym szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 20 x 20 mm i uszczelnij szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, nakładając lakier do paznokci na krawędź szkiełka nakrywkowego. 
	UWAGA 1: Wstępnie wyczyść szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe wodą lub 70% etanolem. 
	UWAGA 2: Umieść wazelinę między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć zniszczenia komór jaj przez nadmierną kompresję.</li>
	<li>Zobrazuj komory jajowe za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego, używając obiektywu planapochromatycznego 20x, NA 0,8, o długości fali światła wzbudzenia 405 nm do barwienia jądrowego (wykryj emisję ~461 nm), 561 nm dla sygnału RFP (trwająca lub niedawna aktywność kaspazy) (wykryj emisję ~590 nm) i 488 nm dla sygnału GFP (przeszła aktywność kaspazy) (wykryj emisję ~518 nm). 
	nuta: Zapoznaj się z naszymi opublikowanymi protokołami mikroskopii20,64.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

System podwójnych bioczujników CaspaseTracker jest nowatorskim i unikalnym narzędziem, które umożliwia wykrywanie niedawnej lub trwającej aktywności kaspazy oraz śledzenie komórek, które odwróciły proces śmierci komórkowej i przeżywają po doświadczeniu aktywności kaspazy in vivo. Podczas gdy aktywność kaspazy jest tradycyjnie uważana za cechę charakterystyczną apoptozy, coraz więcej badań ujawnia, że nieapoptotyczna aktywność kaspazy odgrywa potencjalne role w różnych normalnych ...

Zaprogramowana śmierć komórki, taka jak apoptoza, odgrywa istotną rolę w rozwoju embrionalnym i prawidłowej homeostazie, eliminując niechciane, uszkodzone lub niebezpieczne komórki w organizmach wielokomórkowych1,2,3. Utrata równowagi między śmiercią komórki a przeżyciem może prowadzić do śmiertelnych konsekwencji, takich jak rak, niewydolność serca, autoimmunizacja i zwyrodnienie4,5,6,7,8. Aktywacja kaspaz egzekucyjnych była tradycyjnie uważana za "punkt bez powrotu" w apoptozie9,10,11, ponieważ powoduje szybkie i masowe niszczenie komórek12,13,14,15,16. Kwestionując ten ogólny dogmat, wykazaliśmy, że hodowane umierające komórki pierwotne i komórki rakowe mogą odzyskać sprawność nie tylko po aktywacji kaspazy, ale także po ważnych cechach charakterystycznych śmierci komórki, takich jak pęcherzenie błony komórkowej, kurczenie się komórek, fragmentacja mitochondriów, uwalnianie mitochondrialnego cytochromu c do cytozolu, kondensacja jądra i chromatyny, uszkodzenie DNA, fragmentacja jądrowa, ekspozycja powierzchni komórki na fosfatydyloserynę (PS), i powstawanie ciał apoptotycznych17,18,19,20,21. Sugerujemy, że anastaza jest nieodłącznym zjawiskiem odzyskiwania komórek, ponieważ umierające komórki mogą się zregenerować po usunięciu bodźców śmierci komórki 17,18,19,20,21. Ukuliśmy termin "Anastasis" (Αναστάσης)18, co w języku greckim oznacza "powstanie do życia", aby opisać to nieoczekiwane zjawisko odzyskiwania komórek. Nasza obserwacja anastazy jest dodatkowo poparta ostatnimi niezależnymi badaniami, które również ujawniają odzyskiwanie komórek po eksternalizacji fosfatydyloseryny22,23,24, ograniczona przepuszczalność zewnętrznej błony mitochondrialnej25, aktywacja kinazy podobnej do mieszanej linii (MLKL) i kurczenie się komórek26.
Scharakteryzowanie mechanizmów regulujących anastazę będzie miało zmieniające paradygmat implikacje fizjologiczne, patologiczne i terapeutyczne. Anastasis może reprezentować nieznany wcześniej mechanizm cytoprotekcyjny w celu ratowania lub zachowania ważnych komórek i tkanek postmitotycznych, które są trudne do zastąpienia, i prawdopodobnie odpowiadać za odwrócenie niewydolności serca poprzez odciążenie komór za pomocą urządzeń wspomagających lewą komorę (LVAD)27,28, odzyskiwanie komórek fotoreceptorów po przejściowym narażeniu na nadmierne światło29,30,31, czyli naprawa neuronów po urazie mózgu32. Jeśli tak, promowanie anastazy może przyspieszyć regenerację komórek i tkanek. I odwrotnie, anastaza może być nieoczekiwaną taktyką ucieczki stosowaną przez komórki rakowe w celu przetrwania terapii indukującej śmierć komórki, powodując nawrót raka17,18. Dlatego tłumienie zespolenia w umierających komórkach nowotworowych w trakcie i po leczeniu raka może być nową strategią terapeutyczną leczenia nowotworów poprzez zapobieganie ich nawrotom.
Podczas procesu anastazy stwierdziliśmy, że niektóre odzyskane komórki uzyskały trwałe zmiany genetyczne i przeszły transformację onkogenną, prawdopodobnie z powodu uszkodzenia DNA powstałego podczas apoptozy18,20,21. Odwrócenie procesu śmierci komórek uszkodzonych przez DNA może być mechanizmem nowotworzenia, potencjalnie leżącym u podstaw obserwacji, że powtarzające się uszkodzenia tkanek zwiększają ryzyko raka w różnych tkankach, takich jak przewlekłe uszkodzenie termiczne przełyku wywołane spożyciem bardzo gorących napojów33,34,35, uszkodzenie wątroby spowodowane alkoholizmem36, 37, Ewolucja guza po genotoksycznej terapii przeciwnowotworowej38,39,40, oraz rozwój nowych nowotworów z normalnych tkanek, które powstają w przerwach między cyklami terapii przeciwnowotworowej41,42,43,44. Jeśli to prawda, celowanie w anastazę może zapobiec lub zatrzymać rozwój i progresję raka. Odkryliśmy, że wywołane głodem umierające komórki rozrodcze ulegają anastazie u ponownie karmionych Drosophila19. Jeśli anastaza występuje w komórkach rozrodczych z uszkodzonym DNA, można to wytłumaczyć obserwacją, że długotrwały stres środowiskowy sprzyja rozwojowi chorób genetycznych. Na przykład głód przyczynia się do rozwoju międzypokoleniowych chorób dziedzicznych, takich jak cukrzyca i choroby niedokrwienne serca45. W związku z tym zrozumienie anastazy może prowadzić do opracowania strategii zapobiegania rozwojowi chorób dziedzicznych spowodowanych tym potencjalnym mechanizmem.
Aby wykorzystać odkrycie anastazy i skierować je do opracowania innowacyjnych terapii, konieczne jest zbadanie przyczyny i konsekwencji anastazy u żywych zwierząt. Jednak identyfikacja i śledzenie komórek anastatycznych in vivo jest technicznie trudne, ponieważ komórki, które wyzdrowiały w procesie śmierci komórkowej, wydają się morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek i nie zidentyfikowano jeszcze biomarkera anastazy17,18,21. Aby rozwiązać te problemy, niedawno opracowaliśmy nowy bioczujnik kaspazy in vivo o nazwie "CaspaseTracker"19, do identyfikacji i śledzenia komórek, które przeżywają apoptozę po aktywacji kaspazy19,46, znak rozpoznawczy apoptozy10,14. Odróżnia go od biosensorów kaspazowych "w czasie rzeczywistym", takich jak SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 oraz iCasper52 które wykrywają trwającą aktywność kaspazy, bioczujnik CaspaseTracker dodatkowo posiada zdolność do trwałego znakowania komórek, które wyrażają aktywność kaspazy nawet przejściowo. W związku z tym bioczujnik CaspaseTracker umożliwia długoterminowe śledzenie zespolenia po odwróceniu procesu śmierci komórki za pośrednictwem kaspazy in vivo.

<table><tbody><tr><td><MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE I ODCZYNNIKI > STRONG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield medium montażowe</td><td>Produkty wektorowe</td><td>H-1000</td><td>Medium montażowe Antifade</td></tr><tr><td>Medium montażowe Vectashield (z DAPI)</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>Medium montażowe Antifade z</td></tr><tr><td>kleszczami</td> DAPI <td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Pęseta Dumont klasa biologiczna, </td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie wiszące</td> ze stali nierdzewnej <td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Szkiełka szklane</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sondy molekularne</td><td>H1399</td><td>Barwienie DNA</td></tr><tr><td>Mitotracker Czerwony CMXRos&nbsp;</td><td>Sondy molekularne</td><td>M-7512</td><td>Barwienie mitochondriów</td></tr><tr><td>Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3 (Asp175)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td>#<td>9661</td><td>Barwienie aktywnego fragmentu</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej (BAS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>Środek blokujący do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem&nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>Podłoże do mycia i barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Detergent do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 mikroskop konfokalny</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Obrazowanie</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Carl Zeiss Stemi 2000&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Rozwarstwienie Drosophila</td></tr><tr><td>AmScope Podwójny oświetlacz mikroskopu światłowodowego na gęsiej szyi, 150 W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&nbsp;</td><td>Źródło światła</td></tr></tbody></table>

wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora caspasetracker

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis (po grecku "powstanie do życia") to niedawno odkryte zjawisko odzyskiwania komórek, dzięki któremu umierające komórki mogą odwrócić procesy śmierci komórkowej w późnym stadium, które są ogólnie uważane za nieodwracalne. Promowanie anastazy mogłoby w zasadzie uratować lub zachować uszkodzone komórki, które są trudne do zastąpienia, takie jak kardiomiocyty lub neurony, ułatwiając w ten sposób regenerację tkanek. I odwrotnie, tłumienie zespolenia w komórkach nowotworowych, ulegających apoptozie po terapiach przeciwnowotworowych, może zapewnić śmierć komórek rakowych i zmniejszyć ryzyko nawrotu. Badania te były jednak utrudnione przez brak narzędzi do śledzenia losu komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt. Wyzwaniem jest zidentyfikowanie komórek, które odwróciły proces śmierci komórkowej pomimo ich morfologicznie normalnego wyglądu po wyzdrowieniu. Aby przezwyciężyć tę trudność, opracowaliśmy systemy biosensorów Drosophila i CaspaseTracker dla ssaków, które mogą identyfikować i trwale śledzić komórki anastatyczne in vitro lub in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokoły in vivo dotyczące generowania i wykorzystania systemu podwójnych biosensorów CaspaseTracker do wykrywania i śledzenia zespoleń u Drosophila melanogaster po przejściowej ekspozycji na bodźce śmierci komórki. Podczas gdy konwencjonalne biosensory i protokoły mogą oznaczać komórki aktywnie przechodzące apoptozę śmierci komórki, bioczujnik CaspaseTracker może trwale oznaczać komórki, które odzyskały sprawność po aktywacji kaspazy - co jest cechą charakterystyczną apoptozy w późnym stadium, i jednocześnie identyfikować aktywne procesy apoptotyczne. Ten bioczujnik może również śledzić odzyskiwanie komórek, które próbowały innych form śmierci komórkowej, które bezpośrednio lub pośrednio wiązały się z aktywnością kaspazy. Dlatego protokół ten umożliwia nam ciągłe śledzenie losów tych komórek i ich potomstwa, ułatwiając przyszłe badania funkcji biologicznych, mechanizmów molekularnych, fizjologicznych i patologicznych konsekwencji oraz terapeutycznych implikacji anastazy. Omawiamy również odpowiednie kontrole, aby odróżnić komórki, które ulegają anastazie, od tych, które wykazują nieapoptotyczną aktywność kaspazy in vivo.

Choć mikroskopia obrazowania w odstępach czasu (time-lapse) żywych komórek jest niezawodną metodą śledzenia anastazy w hodowlach komórkowych20, trudnym zadaniem jest zidentyfikowanie, które komórki przeszły anastazę w organizmach zwierzęcych, ponieważ komórki zregenerowane są morfologicznie nieodróżnialne od normalnych zdrowych komórek, które nie podjęły procesu śmierci. Na przykład ludzkie komórki HeLa z raka szyjki macicy wykazują morfologiczne cechy charakterystyczne dla apoptozy<sup class="xre...

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) is a recently discovered cell recovery phenomenon whereby dying cells can reverse late-stage cell death ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie i śledzenie odwrócenia procesu śmierci komórki po aktywacji kaspazy u żywych zwierząt przy użyciu Drosophila melanogaster jako modelu. W odpowiedzi na bodziec śmierci komórki przechodzą zaprogramowaną śmierć komórki, taką jak apoptoza, która tradycyjnie była uważana za nieodwracalną kaskadę prowadzącą do śmierci komórki. Co jednak ciekawe, po usunięciu bodźca śmierci, niektóre umierające komórki mogą odwrócić proces śmierci komórki nawet w późnym stadium.Poprzez nowo odkryte zjawisko odzyskiwania komórek zwane anastazą. Mikroskopia żywych komórek pokazuje, że apoptotyczne umierające komórki wykazują unikalne cechy morfologiczne, takie jak pęcherzenie błony plazmidowej, kondensacja jądrowa i kurczenie się komórek. Ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że komórki te umrą.Jednak po umyciu i inkubacji umierających komórek ze świeżą pożywką ulegają one anastazie, dochodzą do siebie, a później mogą się dzielić. Trudno jest wykryć i śledzić zespolenie u żywych zwierząt, ponieważ odzyskane komórki mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od otaczających zdrowych komórek. Aby rozwiązać ten problem, opracowano system biosensorów CaspaseTracker dla ss

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Termin anastasis odnosi się do zjawiska, w którym umierające komórki odwracają proces samobójstwa komórki na późnym etapie, naprawiają się i ostatecznie przeżywają. Tutaj pokazujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które przechodzą anastazę.

Strategie śledzenia anastazy, zjawiska przeżycia komórek, które odwraca apoptozę

Egzosomy to mikropęcherzykowe struktury znajdujące się w biopłynach, które potencjalnie przenoszą ważne biomarkery dyskryminujące choroby. W tym przypadku zastosowano nowatorską metodę do specyficznej ekstrakcji egzosomów i szybkiego przetestowania ładunku egzosomalnego dla obu celów RNA/białka po rozerwaniu egzosomów za pomocą niejednorodnych elektrycznych cyklicznych fal prostokątnych.

Wykrywanie biomarkera egzosomalnego za pomocą uwalniania i pomiaru wywołanego polem elektrycznym (EFIRM)

Homeostaza wapniowa retikulum endoplazmatycznego jest zaburzona w różnych patologiach.  Reporter wydzielanego białka monitorującego wapń ER (SERCaMP) może być używany do wykrywania zakłóceń w magazynie wapnia ER.   Protokół ten opisuje zastosowanie Gaussia lucyferazy SERCaMP do badania homeostazy wapnia ER in vitro i in vivo.

Monitorowanie homeostazy wapniowej retikulum endoplazmatycznego za pomocą lucyferazy Gaussia SERCaMP

Aby wykryć zdrowe komórki u całych zwierząt, które zawierają niski poziom aktywności kaspazy, dla Drosophila wygenerowano wysoce czuły biosensor o nazwie CaspaseTracker. Aktywność biosensora zależna od kaspazy jest wykrywana w długowiecznych zdrowych komórkach w narządach wewnętrznych dorosłych zwierząt hodowanych w zoptymalizowanych warunkach przy braku bodźców śmierci.

In vivo (in vivo) Biosensor śledzi nieapoptotyczną aktywność kaspazy u Drosophila

Ten protokół opisuje dwumolekularną komplementację fluorescencji kaspazy (BiFC); metodę opartą na obrazowaniu, która może być użyta do wizualizacji indukowanej bliskości kaspaz inicjujących, co jest pierwszym krokiem w ich aktywacji.

Oświetlanie szlaków aktywacji kaspazy za pomocą bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Ten protokół opisuje wieloanalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas, który umożliwia diagnostykę raka w miejscu opieki nad pacjentem poprzez analizę ex vivo aktywności proteazy związanej z nowotworem.

Multianalitowy test syntetycznego biomarkera moczu za pośrednictwem CRISPR-Cas do przenośnej diagnostyki

Protokół przedstawiony w tym badaniu ilustruje skuteczność detektora różnic cAMP In Situ w pomiarze cAMP za pomocą dwóch metod. Jedna z metod wykorzystuje 96-dołkowy spektrofotometr do odczytu płytek z ogniwami HEK-293. Druga metoda polega na demonstracji pojedynczych komórek HASM pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Dynamika cAMP w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego detektora różnic cAMP in situ

Odkryj metodę wykrywania anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker u Drosophila melanogaster. Technika ta umożliwia śledzenie odwracania procesu apoptozy w żywych organizmach.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Przeglądaj więcej filmów