Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja małych cząsteczek, które modulują wewnątrzkomórkowe poziomy drugiego przekaźnika cyklicznego di-GMP w oportunistycznym patogenie, Pseudomonas aeruginosa, za pomocą wysokoprzepustowego badania bioreporterowego. Metoda ta może pomóc w odkryciu małych cząsteczek, które zakłócają bioinformację Pseudomonas aeruginosa i inne cząstki za pomocą cyklicznej modulacji di-GMP. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona bardzo wytrzymała i wszechstronna, co pozwala na przesiewanie ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku opracowania nowych terapii, które potencjalnie uwrażliwiają na Pseudomonas aeruginosa, na układ odpornościowy lub na istniejące antybiotyki, wywierając jednocześnie mniejszy, selektywny nacisk na bakterie. Unieszkodliwić pięć mililitrów bulionu lizogenicznego lub pożywki LB pojedynczą kolonią P.aeruginosa, siedem stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 obr./min. Następnie przenieść dwa mililitry nocnej kultury do 200 mililitrów świeżej pożywki LB w kolbie jednolitrowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min.

Monitorować gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 co 30 minut, pobierając próbkę o wielkości 1 mililitra z kolby i badając za pomocą spektrofotometru. Gdy OD 600 osiągnie od 0,3 do 0,5, umieść 40 mililetów kultury w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów. Granulować komórki, wirując z prędkością 8000 obr./min przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 40 mililitrach lodowatego sterylnego 300-milimolowego roztworu sacharozy. Po odwirowaniu komórek po raz drugi, ponownie zawieś w 20 mililitrach lodowatego sterylnego 300-milimolowego roztworu sacharozy Ponownie odwiruj komórki i ponownie zawieś w 400 mikrolitrach 300-milimolowego roztworu sacharozy. Schłodź ogniwa na lodzie przez 30 minut, po czym są gotowe do elektroporacji.

Następnie dodać jeden mikrolitr 0,2 mikrograma na mikrolitr roztworu plazmidu kodującego promotor CdrA do genu kodującego zielone białko fluorescencyjne do 40 mikrolitrów przygotowanych elektrokompetentnych komórek P.Aeruginosa w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej, która została wstępnie schłodzona na lodzie. Wymieszaj zawiesinę i przenieś ją do wstępnie schłodzonej kuwety elektroporacyjnej o średnicy 2 milimetrów. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą bibuły i umieść kuwetę w komorze na próbki elektroporatora.

Impulsuj roztwór napięciem 2,5 kilowolta, pojemnościami 25 mikrofaradów i rezystancją 200 omów. Wyjmij kuwetę i dodaj jeden mililitr pożywki LB. Następnie przenieś komórki do sterylnej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min.

Po inkubacji rozprowadzić 10 mikrolitrów, 50 mikrolitrów i 100 mikrolitrów podwielokrotności kultury na sterylnych płytkach agarowych LB zaopatrzonych w ampicylinę i inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Potwierdź ekspresję GFP, badając płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym ze standardowym kanałem GFP. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep pięć mililitrów LB. Po całonocnej inkubacji wymieszaj 0,5 mililitra nocnej kultury z 0,5 mililitra 50% glicerolu w 2-mililitrowej zakręcanej tubie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Dwa dni przed badaniem przesiewowym należy posypać przygotowany szczep P.aeruginosa z bulionu o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na płytce agarowej LB, delikatnie rozprowadzając bakterie na płytce za pomocą sterylnej pętli do zaszczepiania. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Wieczorem przed badaniem przesiewowym zaszczepić pojedynczą kolonię P.aeruginosa z płytki w 10 mililitrach pożywki LB w probówce.

Inkubuj kulturę wstępną przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 obr./min. W dniu badania przesiewowego przygotuj subkulturę z nocnej hodowli wstępnej, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do OD 600 1,0, a następnie dalej rozcieńczając 5% LB do OD 600 04. Dodaj sterylne mieszadło magnetyczne do pojemnika i mieszaj kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Dzięki temu bakterie mogą zaaklimatyzować się w pożywce przed dozowaniem do płytek 384-dołkowych. Aby przygotować kontrolę pozytywną, dodaj 20 mikrolitrów siarczanu tobramycyny do 10 mililitrów przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszaj. Odpipetować 40 mikrolitrów kultury kontroli pozytywnej do studzienek od A23 do P23.

Aby przygotować kontrolę ujemną, dodaj 30 mikrolitrów dimetylosulfotlenku do 10 mililitrów przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszaj. Odpipetować 40 mikrolitrów kultury kontroli ujemnej do studzienek od A24 do P24. Dla każdej z płytek zwilżonych małymi cząsteczkami, zaszczepić objętość 40 mikrolitrów rozcieńczonych kultur przez noc do studzienek od A1 do P22.

Uszczelnić płytki przepuszczalną dla powietrza uszczelką pokrywową i inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym należy podgrzać czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza, aby uniknąć kondensacji. Przed czytaniem delikatnie zdejmij przepuszczającą powietrze uszczelkę pokrywy z płyty.

Następnie zmierz gęstość optyczną na długości fali 600 nanometrów przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy. Przed pomiarem fluorescencji dokonaj automatycznej regulacji wzmocnienia i ogniskowej w oparciu o studzienkę kontroli ujemnej A24 i ustaw docelową wartość wzmocnienia na 75%Wybierz regulację ostrości i kanał A po prawej stronie okna. Zmierzyć fluorescencję z reportera GFP przy maksimum wzbudzenia 485 nanometrach i maksimum emisji 520 nanometrów przy ustawieniu 10 błysków na studzienkę i czasie ustalania 0,2 sekundy.

Zbierz dane ze wszystkich badanych płyt. Odczyty danych są automatycznie zapisywane jako domyślne przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek. Aby przeanalizować dane, view odczyty, klikając ikonę Marsa w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.

Pobierz dane, klikając dwukrotnie interesujący Cię numer rejestracyjny, aby uzyskać dostęp do danych do analizy. Oceń jednorodność i odtwarzalność testu za pomocą solidnej analizy Z prime. Następnie oblicz procentowe zahamowanie wzrostu i oceń procentowe zahamowanie wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP, jak wyszczególniono w protokole tekstowym.

Na tym rysunku przedstawiono reprezentatywne dane surowe dla OD 600 i GFP z ekranu o wysokiej przepustowości. Do wartości studni zastosowano mapę cieplną gradientu kolorów z gorącymi i chłodnymi kolorami wskazującymi wartości od niskich do wysokich. Wygenerowane dane są analizowane pod kątem procentowej inhibicji i są tutaj reprezentowane zarówno dla odczytów OD 600, jak i GFP.

Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowe c-di-GMP, będą zwykle wyświetlane na zielono, podczas gdy małe cząsteczki, które potencjalnie promują wzrost i wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP, będą miały tendencję do bycia na czerwono. Wykresy punktowe są wykorzystywane do porównania procentowej inhibicji uzyskanej z każdej badanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez małą kropkę i pokazany jest procentowy rozkład inhibicji dla każdego z odczytów OD 600 i GFP.

Do identyfikacji trafień wybierane jest odcięcie plus lub minus 50%. Potencjalne trafienia są wyróżnione na czerwono. Testy dawka-odpowiedź są przeprowadzane na każdym interesującym związku.

W tym przypadku dwa zidentyfikowane związki są testowane w 10-punktowym teście dawka-odpowiedź z najwyższym stężeniem dwóch milimoli i serią dwukrotnego rozcieńczenia. Dopasowanie czteroparametrowej funkcji logistycznej do danych dało połowiczne maksymalne wartości stężenia hamującego dla każdego związku wynoszące 158 mikromolowych i 193 mikromolowych. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do przesiewania ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak solidnie badać Pseudomonas aeruginosa pod kątem związków zakłócających sygnalizację cykliczną di-GMP. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby warunki przesiewowe były porównywalne w przypadku badań przesiewowych trwających kilka dni. Po jednopunktowym ekranie uruchomienie ekranu odpowiedzi dirsk przy użyciu tego samego protokołu może zweryfikować trafienia.

Technika ta toruje naukowcom drogę do identyfikacji potencjalnych małych cząsteczek, które zakłócają działanie Pseudomonas aeruginosa na informacje i oporność na antybiotyki. Co ważne, technikę tę można dostosować do stosowania w przypadku dowolnych bakterii będących przedmiotem zainteresowania i można ją modyfikować w celu zbadania innych wyników lub danych wejściowych, takich jak wpływ na żywotność bakterii. Na koniec nie zapominaj, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.