Name: Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj wysokowydajny test do przesiewowego badania małych cząsteczek modulujących poziom c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda umożliwia testowanie ponad 3500 związków w ciągu 48 godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy laboratorium Tolkera-Nielsena za hojne przekazanie konstruktów reporterskich użytych do stworzenia ekranu. Dziękujemy również członkom laboratorium Ryana za ich pomocne komentarze i krytyczną lekturę manuskryptu. Praca autorów została częściowo wsparta grantami przyznanymi przez Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant dla R.P.R. oraz stypendium doktoranckie 093714/Z/10/Z dla K.N.R.).

Uwaga: Procedury klonowania i transformacji oczyszczonego plazmidu reporterowego c-di-GMP zostały omówione w innym opracowaniu12.
1. Generowanie szczepu P. aeruginosa będącego reporterem c-di-GMP z tagiem GFP
<ol>
	<li>Zaszczep jedną kolonię do 5 ml pożywki LB (lysogeny broth) P. aeruginosa i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 obr./min.</li>
	<li>Przenieś 2 ml kultury nocnej do 200 ml świeżej pożywki LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubuj w 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Monitoruj gęstość optyczną przy 600 nm (OD600)600) co 30 min, pobierając z kolby próbkę o objętości 1 ml i analizując ją za pomocą spektrofotometru (zgodnie z wcześniejszym opisem12).</li>
	<li>Gdy wartość OD600 po osiągnięciu wartości od 0,3 do 0,5, przenieść 40 ml hodowli do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki, wirując z prędkością 8 000 obr./min przez 10 min w temperaturze 4 °Codrzucić nadsącz i zawiesić komórki ponownie w 40 ml lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy.</li>
	<li>Ponownie osadź komórki poprzez wirowanie zgodnie z opisem w kroku 1.5, a następnie zawieś je w 20 ml lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy.</li>
	<li>Ostatni raz zwirować komórki w celu otrzymania osadu, zgodnie z opisem w punkcie 1.5, a następnie zawiesić je ponownie w 400 µl lodowatego, sterylnego, 300 mM roztworu sacharozy. 
	Uwaga: Gęstość komórek w tym momencie powinna wynosić około 1 x 1011 jednostki tworzące kolonie na mililitr (CFU/ml).</li>
	<li>Schłodzić komórki na lodzie przez 30 min, po czym będą one gotowe do elektroporacji.</li>
	<li>Dodaj 1 µl z 0.2 µg/µl pCdrA::gfpC plazmid 12 rozwiązanie dla 40 µl z P. aeruginosa komórki elektrokompetentne przygotowane powyżej w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, uprzednio schłodzonej na lodzie. Wymieszać zawiesinę i przenieść do uprzednio schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą międzyelektrodową 2 mm. 
	Uwaga: pCdrA::gfpCpUCP22Not-PcdrA-RBSII-gfp(Mut3)-T0-T1, AmpProszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. GmProszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia., co pozwala na fluorescencyjny odczyt wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP w P. aeruginosa szczepy, została opracowana i zwalidowana przez Rybtke i wsp.12.</li>
	<li>Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą ręcznika papierowego i umieść kuwetę w komorze próbkowej elektroporatora. Wykonaj impuls przy napięciu 2,5 kV i pojemności 25 µF oraz opornością 200 Ω.</li>
	<li>Wyjmij kuwetę i dodaj 1 ml pożywki LB. Następnie przenieś komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i inkubuj przez 2 h w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Rozprzestrzenianie 10 µl, 50 µl i 100 µl alikwoty hodowli na sterylne płytki z agarem LB z dodatkiem ampicyliny (w stężeniu 100 µg/ml), a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Potwierdzić ekspresję GFP (wzbudzenie przy 485 nm, emisja przy 520 nm), badając płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym z zastosowaniem standardowego kanału GFP, a następnie pobrać pojedynczą kolonię do zaszczepienia 5 ml pożywki LB. Inkubować przez noc zgodnie z opisem w kroku 1.1. W probówce z nakrętką o pojemności 2 ml zmieszać 0,5 ml nocnej kultury z 0,5 ml 50% glicerolu i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kultury startowej do inokulacji
<ol>
	<li>Na dwa dni przed przesiewaniem, wysejati szczep P. aeruginosa (zawierający plazmid pCdrA::gfpC) z mrożonki -80 °C na płytkę z agarem LB (uzupełnionym ampicyliną w stężeniu 100 µg/ml), delikatnie rozprowadzając bakterie po powierzchni płytki za pomocą sterylnej pętli szczepiącej. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wieczorem przed przesiewaniem, zaszczepić pojedynczą kolonię P. aeruginosa z płytki do 10 ml pożywki LB (uzupełnionej ampicyliną w stężeniu 100 µg/ml) w probówce i inkubować prekulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.</li>
	<li>W dniu przesiewania, przygotować subkulturę z nocnej prekultury, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do OD600 wynoszącej 1,0, a następnie dalej rozcieńczając 5% LB do OD600 wynoszącej 0,04 (stosunek 1:25). 
	Uwaga: Całkowita objętość zaszczepionej pożywki zależy od liczby płytek przeznaczonych do testów. 5% LB przygotowuje się poprzez rozcieńczenie 100% LB w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do wymaganego stężenia. Co ważne, pożywka (5% LB) umożliwia konstytutywną aktywację pCdrA::gfpC u P. aeruginosa.</li>
	<li>Włożyć sterylny mieszadło magnetyczne do naczynia i mieszać kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 min w temperaturze pokojowej, aby umożliwić bakteriom aklimatyzację do pożywki przed ich rozniesieniem do płytek 384-dołkowych.</li>
</ol>
3. Inokulacja i inkubacja płytek 384-dołkowych zawierających małe cząsteczki
Uwaga: Sterylność i stosowanie prawidłowych technik aseptycznych są kluczowe w poniższych krokach.
<ol>
	<li>Aby przygotować kontrolę pozytywną (100% inhibicji), dodać 20 µl siarczanu tobramycyny (25 mg/ml) do 10 ml (ilość wystarczająca na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Nanieść pipetą 40 µl kultury kontroli pozytywnej do dołków A23 - P23 (Rysunek 2).</li>
	<li>Aby przygotować kontrolę negatywną (0% inhibicji), dodać 30 µl dimetylosulfotlenku (DMSO) do 10 ml (ilość wystarczająca na maksymalnie 12 płytek) subkultury przygotowanej w kroku 2.3 i delikatnie wymieszać. Nanieść pipetą 40 µl kultury kontroli negatywnej do dołków A24 - P24 (Rysunek 2).</li>
	<li>W przypadku każdej z płytek z naniesionymi małymi cząsteczkami, zaszczepić objętość 40 µl rozcieńczonych kultur nocnych (opisanych w kroku 2.3) do dołków A1 - P22 (Rysunek 2). 
	Uwaga: Można to wykonać przy użyciu robota do obsługi cieczy. Ze względu na heterogeniczne właściwości kultur bakteryjnych, ważne jest utrzymanie ciągłego i umiarkowanego mieszania, aby bakterie były równomiernie rozłożone w pożywce podczas dozowania. W tym celu należy stale mieszać magnetycznie zaklimatyzowaną kulturę z kroku 2.4 podczas dozowania.</li>
	<li>Uszczelnić płytki przepuszczalną powietrznie folią uszczelniającą i inkubować przez 6 hr w temperaturze 37 °C. 
	Uwaga: Przepuszczalna powietrznie folia jest kluczowa dla utrzymania niezmiennych warunków we wszystkich 384 dołkach i zapobiegania potencjalnemu powstawaniu gradientów tlenu na całej płytce.</li>
</ol>
4. Pomiar wzrostu (OD600) i wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP (GFP)
<ol>
	<li>Około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym wstępnie podgrzej czytnik płytek do 37 °C, aby uniknąć kondensacji.</li>
	<li>Przed odczytem ostrożnie usuń przepuszczalną dla powietrza membranę uszczelniającą. Zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm, ustawiając 10 błysków na dołek i czas stabilizacji 0,2 sec.</li>
	<li>Przed pomiarem fluorescencji wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia i ogniskowania w oparciu o dołek A24 (kontrola negatywna) i ustaw docelową wartość wzmocnienia na 75% (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu sterującym czytnikiem płytek kliknij „start measurement” i przejdź do karty „Focus and Gain Adjustment/Plate IDs”.</li>
		<li>Po prawej stronie okna wybierz „Focus Adjustment” oraz „Channel A”.</li>
		<li>Wybierz „Gain Adjustment” i „Selected well”, a następnie wpisz „75” jako „Target value”. Na koniec wybierz dołek A24 w układzie płytek przed kliknięciem „Start Adjustment”. Po przeprowadzeniu regulacji kliknij „Start measurement”.</li>
		<li>Zmierz fluorescencję reportera GFP przy maksimach wzbudzenia/emisji 485/520 nm, ustawiając 10 błysków na dołek i czas stabilizacji 0,2 sec.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz dane ze wszystkich badanych płytek. Uwaga: Odczyty danych są automatycznie zapisywane domyślnie przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek.
	<ol>
		<li>Przejrzyj odczyty, klikając ikonę „Mars” w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.</li>
		<li>Pobierz dane, wykonując „podwójne kliknięcie” na numer interesującej Cię płytki, aby uzyskać dostęp do danych do analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Oceń jednorodność i powtarzalność testu za pomocą analizy robust z', która jest najczęściej raportowanym wskaźnikiem jakości w badaniach wysokoprzepustowych. Oblicz robust z' korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór na wskaźnik robust z', mediana odchylenia bezwzględnego, metoda analizy statystycznej, równanie." src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 
	Gdzie MAD (Median Absolute Deviation) jest szacunkiem odchylenia standardowego, p to kontrola dodatnia (100% inhibicji), a n to kontrola ujemna (0% inhibicji) zarówno dla wartości OD600, jak i GFP. Uwaga: Test z wartością robust z' (obliczoną dla surowych danych OD600 i GFP) większą niż lub równą 0,5 jest uważany za test doskonały.</li>
	<li>Oblicz % inhibicji wzrostu korzystając ze wzoru: 
	<img alt="Wzór na inhibicję dla OD600 w analizie danych eksperymentalnych, przedstawiający obliczenia procentowe." src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 2"> 
	Gdzie XiOD600 to iterowana wartość OD600 dla każdej studzienki z próbką. % InhibicjiOD600 &gt; 0 oznacza inhibitor wzrostu; % InhibicjiOD600 &lt; 0 oznacza promotor wzrostu.</li>
	<li>Oceń % inhibicji wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP korzystając ze wzoru (zmiany w arbitralnych jednostkach intensywności fluorescencji są korygowane o zmianę gęstości komórek): 
	<img alt="Wzór na % inhibicji GFP, obraz statyczny, stosowany w analizach biochemicznych i badaniach naukowych." src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 3"> <img alt="Równanie procesu chromatograficznego, obliczanie frakcji, schemat analizy badawczej, badanie ekspresji GFP." src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 4"> 
	Gdzie XiGFP to iterowana wartość GFP dla każdej studzienki z próbką. % InhibicjiGFP &gt; 0 oznacza inhibitor c-di-GMP; % InhibicjiGFP &lt; 0 oznacza promotor c-di-GMP.</li>
	<li>Ustal próg detekcji hitów na poziomie 3 MAD od mediany (mediana ±3 MAD), obliczony z odczytów studzienek z próbkami dla każdej płytki, zakładając normalny rozkład punktów danych. Uwaga: W razie potrzeby, dla bardziej powtarzalnych i dokładnych testów zależności dawka-odpowiedź, można wybrać próg odcięcia inhibicji ±50%.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recover+the+lost+art+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recover the lost art of drug discovery.</a> Nature. 485, 439-440 (2012).</li>
<li>Caly, D. L., Bellini, D., Walsh, M. A., Dow, J. M., Ryan, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cyclic+di-GMP+Signaling%3A+A+Strategy+to+Control+Biofilm+Formation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Targeting Cyclic di-GMP Signaling: A Strategy to Control Biofilm Formation?</a> Curr Pharm Design. 21, 12-24 (2015).</li>
<li>Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+c-di-GMP+signaling+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Principles of c-di-GMP signaling in bacteria.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 263-273 (2009).</li>
<li>Ryan, R. P., Tolker-Nielsen, T., Dow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+the+PilZ+don%27t+work%3A+effectors+for+cyclic+di-GMP+action+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Microbiol%22%5BJournal%5D)">When the PilZ don't work: effectors for cyclic di-GMP action in bacteria.</a> Trend Microbiol. 20, 235-242 (2012).</li>
<li>Romling, U., Galperin, M. Y., Gomelsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+di-GMP%3A+the+First+25+Years+of+a+Universal+Bacterial+Second+Messenger%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cyclic di-GMP: the First 25 Years of a Universal Bacterial Second Messenger.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 77, 1-52 (2013).</li>
<li>Boyd, C. D., GA, O. 'T. oole <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+Messenger+Regulation+of+Biofilm+Formation%3A+Breakthroughs+in+Understanding+c-di-GMP+Effector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Second Messenger Regulation of Biofilm Formation: Breakthroughs in Understanding c-di-GMP Effector Systems.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 28, 439-462 (2012).</li>
<li>Ryan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HD-GYP+domain+proteins+regulate+biofilm+formation+and+virulence+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">HD-GYP domain proteins regulate biofilm formation and virulence in Pseudomonas aeruginosa.</a> Environ Microbiol. 11, 1126-1136 (2009).</li>
<li>Christensen, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Foreign-Body+Biofilm+Infections+through+Reduction+of+the+Cyclic+Di-GMP+Level+in+the+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Clearance of Pseudomonas aeruginosa Foreign-Body Biofilm Infections through Reduction of the Cyclic Di-GMP Level in the Bacteria.</a> Infection and Immunity. 81, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Chua, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+cells+represent+a+distinct+stage+in+the+transition+from+bacterial+biofilm+to+planktonic+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles.</a> Nat Comm. 5, (2014).</li>
<li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Small+Molecules+That+Antagonize+Diguanylate+Cyclase+Enzymes+To+Inhibit+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Identification of Small Molecules That Antagonize Diguanylate Cyclase Enzymes To Inhibit Biofilm Formation.</a> Antimicrob Agents Chemother. 56, 5202-5211 (2012).</li>
<li>Sambanthamoorthy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+molecules+inhibiting+diguanylate+cyclases+to+control+bacterial+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Identification of small molecules inhibiting diguanylate cyclases to control bacterial biofilm development.</a> Biofouling. 30, 17-28 (2014).</li>
<li>Rybtke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-Based+Reporter+for+Gauging+Cyclic+Di-GMP+Levels+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22App+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-Based Reporter for Gauging Cyclic Di-GMP Levels in Pseudomonas aeruginosa.</a> App Environ Microbiol. 78, 5060-5069 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oczywiste jest, że aby poprawić leczenie zakażeń bakteryjnych, konieczne jest lepsze zrozumienie zachowania bakterii na molekularnym poziomie regulacyjnym. Opisana tutaj procedura będzie korzystna dla mikrobiologów, biochemików i klinicystów, którzy chcą odkryć małe cząsteczki, które mogą manipulować lub zakłócać stężenie komórkowe c-di-GMP w bakteriach. Metoda wykorzystuje niedawno opracowany bioreporter GFP do monitorowania komórkowych poziomów c-di-GMP w P. aeruginosa12. Ten bioreporter został zwalidowany i wykazano, co ważne, że nie wpływa na wzrost używanego szczepu, gdy jest hodowany w 5% LB w PBS. Zastosowanie badania przesiewowego całej komórki do identyfikacji małych cząsteczek, które zmieniają poziomy c-di-GMP in vivo , pozwala przezwyciężyć główne trudności związane z odkrywaniem leków na podstawie celów w zakresie przenikania cząsteczek przez błony bakteryjne, w szczególności przez błony bakterii Gram-ujemnych. Co ważne, test wydaje się bardzo solidny, ponieważ we wszystkich dotychczasowych badaniach przesiewowych zaobserwowano solidną wartość z' stale powyżej 0,5. Badania przesiewowe przy użyciu tego protokołu ujawnią szereg małych cząsteczek, które hamują i/lub promują wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP u P. aeruginosa. Co więcej, test ten ma również potencjał do identyfikacji związków bakteriobójczych lub bakteriostatycznych powodujących zmniejszenie odczytu OD600 .
Chociaż nie zostało to omówione w sekcji dotyczącej protokołu, istnieje kilka ważnych kwestii związanych z przygotowaniem eksperymentu. Należy pamiętać, że bioreporter GFP jest oparty na plazmidzie. Chociaż wiadomo, że plazmid reporterowy jest bardzo stabilny u P. aeruginosa, może zostać utracony po ciągłym ponownym posiewaniu, stąd potrzeba użycia świeżo posianych szczepów z glicerolu o temperaturze -80 °C, a sprawdzenie ekspresji fluorescencji ma kluczowe znaczenie. Bardzo cenne jest również utrzymanie jednolitych warunków wzrostu na całym ekranie, ponieważ wszelkie wahania tych warunków mogą mieć efekt domina na ekranie. Obejmowałoby to upewnienie się, że pożywki i antybiotyki są wstępnie przygotowane w partiach i stosowane przez cały czas trwania badania. Kultury bakterii, które nie rosną w sposób jednolity (na podstawie odczytów OD600 ) są częstym problemem w przypadku większości tego rodzaju przesiewaczy o wysokiej przepustowości. Może to być spowodowane efektami krawędzi lub dozowaniem niejednorodnej kultury bakteryjnej do płytek. W pierwszym przypadku niezbędne jest upewnienie się, że podczas inkubacji używana jest uszczelka przepuszczająca gaz. Natomiast w przypadku tych ostatnich zaleca się zalewanie rurki do obsługi cieczy objętością kultury co najmniej trzykrotnie większą niż objętość martwa samego przewodu. Bardzo ważne jest, aby mieszadło magnetyczne działało na minimalnej prędkości podczas dozowania. Podczas gdy monitorowanie i przechowywanie płytek 384-dołkowych w celu stałego wzrostu w trakcie eksperymentów jest najważniejsze, sytuacją, której należy unikać, jest układanie płytek w stosy podczas inkubacji, ponieważ może to powodować niepożądane gradienty tlenu prowadzące do przekrzywienia wzorca wzrostu. Ważne jest również, aby upewnić się, że nośnik DMSO używany jako kontrola ujemna nie wpływa negatywnie na wzrost szczepu będącego przedmiotem zainteresowania. Wielu z tych problemów związanych ze wzrostem można uniknąć, wykonując próbne badanie przesiewowe z interesującym szczepem bakteryjnym przed badaniem przesiewowym. Interpretacja danych również zasługuje na rozważenie, biorąc pod uwagę, że wyniki hamowania c-di-GMP są obliczane na podstawie zmiany dowolnych jednostek intensywności fluorescencji, które należy skorygować o zmianę gęstości komórek. Mając to na uwadze, należy również rozważyć różne wzory matematyczne do oceny danych wyjściowych z tych eksperymentów. Na przykład związek może wydawać się inhibitorem c-di-GMP, ale w rzeczywistości być inhibitorem wzrostu lub odwrotnie, co wymaga ostrożnej interpretacji zidentyfikowanych trafień.
Istnieje kilka wad i ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania i działania tego wysokowydajnego ekranu komórkowego. Na przykład, bioreporter działa w oparciu o pośredni pomiar komórkowych poziomów c-di-GMP za pomocą sondy fluorescencyjnej, na której właściwości detekcyjne mogą potencjalnie wpływać małe cząsteczki użyte w badaniu przesiewowym. Istotną kwestią jest fakt, że test komórkowy nie dostarcza żadnych informacji na temat mechanizmu stojącego za zmianami poziomów wewnątrzkomórkowego c-di-GMP. Dlatego ważne obserwacje z eksperymentów muszą zostać potwierdzone przy użyciu podejścia opartego na wysokosprawnej chromatografii cieczowej i spektrometrii mas, która jest uważana za "złoty standard" metody pomiaru wewnątrzkomórkowych fluktuacji c-di-GMP u bakterii. Co więcej, nasza procedura może dostarczyć jedynie informacji na temat zachowania bakterii hodowanych in vitro, ponieważ komórki bakteryjne hodowane w kontekście gospodarza (in vivo) szybko modyfikują swoje działania pod wpływem tego środowiska. Co więcej, proces korzystania z bioreportera GFP oznacza, że ekran nie bierze pod uwagę stanu fizjologicznego komórek bakteryjnych. Protokół można jednak dostosować do mikroskopowego monitorowania poszczególnych studni w trakcie badania przesiewowego.
Nawet biorąc pod uwagę te rozważania i ograniczenia, ten wysokoprzepustowy test jest nadal solidnym badaniem przesiewowym dla małych cząsteczek zdolnych do zakłócania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. Ponieważ wiele gatunków drobnoustrojów, w tym wiele patogenów bakteryjnych, zostało przebadanych w celu scharakteryzowania modulacji wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP, nasz protokół może być zastosowany do różnych gatunków bakterii i rozszerzony o badanie bardziej złożonych wielogatunkowych modeli bakterii. Test można łatwo zoptymalizować pod kątem innych gatunków bakterii, zmieniając stosowane warunki wzrostu, lub można go dostosować do odczytu innych wyników przy użyciu różnych bioreporterów. W zależności od fazy wzrostu będącej przedmiotem zainteresowania można zastosować różne czasy inkubacji. Jednak przy zwiększaniu skali lub zwiększaniu przepustowości należy pamiętać, że bakterie będą nadal rosły podczas przygotowywania płytek i pomiarów odczytu. Dlatego zaleca się przesiewanie maksymalnie 15 płyt jednocześnie przy użyciu tego protokołu. Co więcej, używanie płytek z więcej niż 384 dołkami może nie pozwolić na równomierny wzrost, co wymaga dalszej optymalizacji. Przy zmniejszaniu liczby płytek bardziej odpowiednie może być ręczne zaszczepianie za pomocą pipety elektronicznej zamiast robota do obsługi płynów. Oczywiste jest, że protokół ten może być wykorzystany do badania małych cząsteczek, które rozpraszają biofilmy, biorąc pod uwagę, że związki anty-biofilmu zakłócają sygnalizację c-di-GMP. Protokół może również zostać opracowany ponownie, aby zrozumieć różne aspekty fizjologii bakterii. Biorąc pod uwagę, że sygnalizacja c-di-GMP jest powszechna u większości bakterii, badając fizjologię tych organizmów za pomocą tego protokołu, możemy zidentyfikować różne bodźce chemiczne, aby określić, czy ich mechanizmy działania wymagają sygnalizacji c-di-GMP.
Podsumowując, solidność i wszechstronność podejścia przedstawionego w tym protokole pomoże w identyfikacji chemicznych modulatorów sygnalizacji c-di-GMP w wielu systemach biologicznych.

Szybki rozwój oporności bakterii na klinicznie ważne antybiotyki jest jednym z głównych problemów, z jakimi obecnie borykają się pracownicy służby zdrowia na całym świecie. Niepowodzenie tradycyjnych antybiotyków skłoniło do nowych poszukiwań materii chemicznej, która może zakłócać procesy bakteryjne związane z wirulencją i postępem choroby1. Jeden z takich systemów regulacyjnych, który wykorzystuje wewnątrzkomórkowy drugi przekaźnik cykliczny di-GMP (c-di-GMP), stał się ostatnio celem o obiecującej trafności2-4. Ustalono, że ta globalna cząsteczka sygnałowa drugiego przekaźnika reguluje wiele funkcji, w tym oporność na antybiotyki, adhezję, tworzenie biofilmu i choroby2-4.
Teraz jest zrozumiałe, że poziom komórkowy c-di-GMP w komórce bakteryjnej jest kontrolowany przez syntezę i degradację, dzięki czemu dwie cząsteczki GTP są używane do syntezy c-di-GMP przez cyklazy diguanylanowe zawierające domenę GGDEF (DGC), podczas gdy degradacja c-di-GMP jest katalizowana przez fosfodiesterazy (PDE), które mają domenę EAL lub HD-GYP (omówione w (3, Białka zawierające te domeny często zawierają inne domeny sygnałowe, co sugeruje, że ich aktywność w obrocie c-di-GMP jest regulowana bezpośrednio lub pośrednio przez sygnały środowiskowe lub komórkowe3,5. W związku z tym sygnalizacja c-di-GMP łączy wyczuwanie różnych sygnałów środowiskowych z modyfikacjami fenotypu bakteryjnego. c-di-GMP wywiera swoje działanie regulacyjne u bakterii na poziomie transkrypcji, po transkrypcji i po translacji za pomocą różnych mechanizmów4.
Głównym wpływem c-di-GMP w wielu komórkach bakteryjnych jest określenie bakteryjnego 'stylu życia', a w szczególności kontrola przejść między ruchliwymi komórkami planktonicznymi a komórkami siedzącymi przyczepionymi do powierzchni lub zorganizowanymi w wielokomórkowe struktury biofilmów3,5. Ogólnie rzecz biorąc, wysokie poziomy komórkowe c-di-GMP są związane z tworzeniem biofilmu i siedzeniem, podczas gdy niskie poziomy komórkowe sprzyjają ruchliwości i syntezie czynników wirulencji w wielu patogenach bakteryjnych3,5. W związku z tym bardziej szczegółowa wiedza na temat działania sygnalizacji c-di-GMP może dostarczyć strategii hamowania tworzenia biofilmu i zjadliwości patogenów bakteryjnych. Jest to trudne zadanie, biorąc pod uwagę, że większość genomów bakteryjnych koduje liczne białka z domenami GGDEF, EAL i/lub HD-GYP (na przykład P. aeruginosa ma ponad 40 białek) i wieloma efektorami6,7.
Jednakże, nawet przy takiej złożoności, ostatnie dowody sugerują, że strategie manipulujące sygnalizacją c-di-GMP mogą zostać opracowane w celu zapobiegania rozwojowi infekcji opornych na antybiotyki lub uczynienia ich podatnymi na działanie układu odpornościowego lub skutecznego leczenia poprzez jednoczesne podawanie klasycznych antybiotyków2. W związku z tym wykazano eksperymentalnie, że sztuczne zmniejszenie wewnątrzkomórkowego c-di-GMP u P. aeruginosa hodowanego in vitro prowadzi do zmniejszenia tworzenia biofilmu i zwiększonej podatności na środki przeciwdrobnoustrojowe, podczas gdy biofilmy opracowane przez P. aeruginosa na implantach silikonowych, zlokalizowanych w jamie otrzewnowej myszy, mogą być rozproszone w podobny sposób8-11.
Tutaj opisujemy wysokoprzepustowy, oparty na fluorescencji test reporterowy do badania małych cząsteczek, które mogą potencjalnie modulować poziomy komórkowe c-di-GMP u P. aeruginosa (Rysunek 1). Test opiera się na pomiarze poziomów komórkowych c-di-GMP przy użyciu wcześniej opracowanego reportera GFP, którego ekspresja jest transkrypcyjnie powiązana z promotorem cdrA reagującym na c-di-GMP12. Protokół ten opisuje metodologię ekspresji konstruktu reporterowego w będącym przedmiotem zainteresowania szczepie P. aeruginosa, przygotowanie płytki złożonej, inokulację hodowli na płytkach 384-dołkowych, warunki wzrostu, a także szczegóły dotyczące gromadzenia, zarządzania i analizy danych (ryc. 1). Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten pomoże naukowcom potencjalnie zidentyfikować nowe związki ukierunkowane na sygnalizację c-di-GMP u bakterii oraz do wykorzystania w badaniach mających na celu zrozumienie biologii P. aeruginosa.

<table><tbody><tr><td>Rosół lizogeniczny (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Rosół lizogeniczny z agarem (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina sodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Buforowany fosforanem Sól fizjologiczna, pH 7,4</td><td>Technologie życiowe</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan tobramycyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sulftlenek dimetylu (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis Genesys 10S</td><td>Thermoscientific</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta elektroporatora 2 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator BioRad GenePulser XCell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny Leica</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND mieszadło magnetyczne, PTFE, cylindryczne z pierścieniem obrotowym (przed użyciem sterylizować w autoklawie)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384-dołkowe, białościenne, przezroczyste płytki</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik odczynników Multidrop Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Rurka Multidrop Combi</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II 16-kanałowa pipeta elektroniczna</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>100 ml sterylne jednorazowe zbiorniki na odczynniki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>Membrany przepuszczające powietrze AeraSeal</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>MKBQ1886</tr><tr><td>Czytnik płytek Pherastar (Wersja oprogramowania: 4.00 R4, Wersja oprogramowania: 1.13)</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-gmp u pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Oporność bakterii na tradycyjne antybiotyki napędzała próby badawcze mające na celu zidentyfikowanie nowych celów leków w niedawno odkrytych szlakach regulacyjnych. Systemy regulacyjne, które wykorzystują wewnątrzkomórkowy cykliczny di-GMP (c-di-GMP) jako drugi przekaźnik, są jedną z takich klas celów. c-di-GMP to cząsteczka sygnałowa znajdująca się w prawie wszystkich bakteriach, która reguluje szeroki zakres procesów, w tym oporność na antybiotyki, tworzenie biofilmu i zjadliwość. Zrozumienie, w jaki sposób sygnalizacja c-di-GMP kontroluje aspekty rozwoju biofilmu opornego na antybiotyki, sugeruje podejścia, dzięki którym zmiana stężeń komórkowych nukleotydu lub zakłócenie tych szlaków sygnałowych może prowadzić do zmniejszenia tworzenia biofilmu lub zwiększonej podatności biofilmów na antybiotyki. Opisujemy prosty, wysokoprzepustowy protokół bioreporterowy, oparty na białku zielonej fluorescencji (GFP), którego ekspresja jest pod kontrolą promotora reagującego na c-di-GMP cdrA, w celu szybkiego badania przesiewowego małych cząsteczek z potencjałem modulowania poziomów komórkowych c-di-GMP w Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ten prosty protokół może przebadać ponad 3500 związków w ciągu 48 godzin i ma możliwość dostosowania do wielu mikroorganizmów.

Opisana tutaj metoda pozwala jednemu badaczowi na wydajne i skuteczne przesianie średnio 3500 związków w ciągu 48 godzin. Przegląd protokołu wysokoprzepustowych przesiewów przedstawiono w formie schematu blokowego w Rycina 1W niniejszym artykule prześwietliliśmy bibliotekę związków zgodnych z regułą pięciu w poszukiwaniu potencjalnych związków modulujących c-di-GMP przy stężeniu końcowym wynoszącym 600 µMDostępnych jest jednak wiele komercyjnych zestawów związków o charakterze lekopodobnym i nielekopodobnym, które można wykorzystać w tym teście. Zestawy te mogą składać się ze związków ukierunkowanych na bakterie lub z losowo dobranych pul związków, przy czym każda biblioteka posiada przypisane przewidywane właściwości i charakterystyki fizykochemiczne, podobnie jak zestaw wykorzystany w niniejszym badaniu, który charakteryzował się obecnością polarnych grup funkcyjnych oraz wielu centrów stereogenicznych. W niniejszym protokole bakterie są inokulowane na płytkę wraz ze związkami, dodatnią kontrolą antybiotykową oraz kontrolą nośnika DMSO, zgodnie z układem przedstawionym w Rycina 2. Rycina 3 przedstawia wyniki przesiewania pierwotnego na przykładzie pojedynczej płytki bibliotecznej. Reprezentatywna wartość OD600 a surowe dane GFP przedstawiono w Rycina 3A i 3Bodpowiednio. Gradientowa mapa ciepła, w której kolory od ciepłych (czerwonych) do chłodnych (zielonych) wskazują niskie i wysokie wartości OD600wartości /GFP zostały zastosowane do wartości w dołkach. Mapy ciepła zostały wygenerowane w programie arkusza kalkulacyjnego poprzez zastosowanie formatowania warunkowego w skali 3 kolorów, obejmującej zakres od najniższej wartości OD600odczyt GFP do najwyższej wartości OD600odczyt GFP. Niska OD600 a wartości GFP w stosunku do ujemnej kontroli DMSO odpowiadają odpowiednio zahamowaniu wzrostu oraz poziomu c-di-GMP, podczas gdy wysokie wartości w stosunku do ujemnej kontroli DMSO odpowiadają odpowiednio stymulacji wzrostu oraz poziomu c-di-GMP. Niezawodne wartości z' dla OD600 oraz GFP oblicza się zgodnie z formułą podaną w protokole (5.1). Ponieważ obie wartości przekraczają 0,5 (odpowiednio 0,694 i 0,761), uznano, że jakość testu jest stabilna i przystąpiono do dalszej analizy danych. Procent hamowania wzrostu (OD600) oraz wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP (GFP) oblicza się zgodnie z formułami podanymi w protokole (5.2, 5.3). Reprezentatywne dane przedstawiono w Rycina 4A i 4B odpowiednio. Do wartości w dołkach zastosowano kolorystyczną mapę ciepła z gradientem od barw ciepłych (czerwonych) do zimnych (zielonych), wskazujących odpowiednio niski i wysoki procent inhibicji. Wykres rozrzutu procentu inhibicji(OD600/GFP) z poszczególnych dołków na podstawie przesiewu pierwotnego przedstawiono na Rycina 5A i 5B do pomiaru OD600 oraz dane GFP odpowiednio. Do wykrywania hitów wybrano próg ±50% (oznaczony liniami przerywanymi). Potencjalne hity wyznaczone na podstawie tego progu zaznaczono czerwonymi kropkami. W analizie można wyróżnić dwa rodzaje związków interesujących. Hity zidentyfikowane w Rycina 5A są związkami hamującymi wzrost bakterii, podczas gdy trafienia zidentyfikowane w Rycina 5B są związkami, które potencjalnie posiadają zdolność do modulowania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP. W ramach tego testu zidentyfikowano dwa związki jako reprezentatywne trafienia. Są to związek A, będący potencjalnym inhibitorem wzrostu, oraz związek B, będący potencjalnym inhibitorem c-di-GMP. Związek A odpowiada studzience F8 w Rysunki 3 i 4 i wykazało 72,5% zahamowania wzrostu. Odnotowano oczekiwany, odpowiadający temu spadek poziomu cyklicznego di-GMP. Związek B odpowiada studzience K3 w Rycina 3 i 4 i wykazały 61% inhibicji poziomu cyklicznego di-GMP bez wpływu na wzrost. Wybrane związki hitowe zostały poddane dalszym badaniom w 10-punktowym teście zależności dawka-odpowiedź z maksymalnym stężeniem 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. IC50 wartości są obliczane na podstawie krzywych zależności dawka-odpowiedź (Rysunek 6A i B).
<img alt="Schemat workflow przesiewania wysokoprzepustowego (HTS); od inokulacji do eksploracji danych i wyników analizy." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Przegląd: Układ wysokoprzepustowy do przesiewania małych cząsteczek pod kątem ich potencjału do modulowania wewnątrzkomórkowych poziomów c-di-GMP w P. aeruginosa. Ten przegląd przedstawia krok po kroku reprezentację protokołu zastosowanego w tym teście. Kolonię bakteryjną P. aeruginosa hoduje się przez noc w kulturze startowej LB. Przy użyciu dyspensera odczynników komórki są inokulowane do płytek 384-dołkowych zawierających wybrane związki. Płytki inkubuje się przez 6 godzin, po czym mierzy się wartości OD600 oraz GFP. Na podstawie tych odczytów można zidentyfikować związki, które wpływają na wewnątrzkomórkowe poziomy c-di-GMP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu mikropłytki do screeningu związków z zaznaczonymi kontrolami; legenda: niebieski, czerwony, zielony." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Plan płytki 384-dołkowej wykorzystanej w teście screeningu małych cząsteczek. Związki z biblioteki (jasnoniebieski) są rozdzielane do dołków A1 - P22. „Kontrolę pozytywną” (czerwony), składającą się z końcowego stężenia 50 µg/ml siarczanu tobramycyny, dodaje się do dołków A23 - P23, a „kontrolę negatywną” (zielony), zawierającą końcowe stężenie 1% DMSO, do dołków A24 - P24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapa ciepła mikropłytki, surowe dane OD600 i GFP, wyniki eksperymentu, intensywność fluorescencji." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne wyniki dla jednej 384-dołkowej płytki przesiewowej. Reprezentatywne surowe dane dla OD600 (A) oraz GFP (B). Do wartości w dołkach zastosowano kolorystyczną mapę ciepła z gradientem od barw ciepłych (Czerwony: OD600 = 0.65 lub GFP = 250,000) do zimnych (Zielony: OD600 = 0.10 lub GFP = 40,000), wskazującymi wartości od niskich do wysokich. Dołki z niższymi odczytami OD600/GFP w stosunku do negatywnej kontroli DMSO będą miały tendencję do koloru czerwonego, natomiast dołki z wyższymi odczytami OD600/GFP w stosunku do kontroli DMSO będą miały tendencję do koloru zielonego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mapy ciepła procentowego hamowania, OD600, GFP; analiza danych eksperymentalnych, wykres porównawczy." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywne wyniki obliczonego procentu hamowania dla płytki 384-dołkowej. Przedstawiono przeanalizowane dane dotyczące % hamowania dla odczytów OD600 (A) oraz GFP (B). Do wartości w dołkach zastosowano mapę ciepła z gradientem kolorów od ciepłych (czerwony: OD600 = -150% lub GFP = -20%) do zimnych (zielony: OD600 = 100% lub GFP = 100%), gdzie kolory wskazują wartości hamowania od niskich do wysokich. Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP, będą miały tendencję do barwy zielonej, natomiast małe cząsteczki, które potencjalnie promują wzrost i poziom wewnątrzkomórkowego c-di-GMP, będą miały tendencję do barwy czerwonej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza procentowego hamowania przez związki; wykresy rozrzutu hamowania w funkcji identyfikatora związku, detekcja wartości odstających." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne wykresy rozrzutu dla % hamowania(OD600/GFP) uzyskane dla każdej przetestowanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez kropkę, a przedstawiono rozkład % hamowania dla odczytów OD600 (A) oraz GFP (B). Jako próg identyfikacji hitów wybrano wartość ±50%. Potencjalne hity zostały zaznaczone na czerwono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza krzywej zależności dawka-odpowiedź; porównanie wykresów IC50; wykres stężenia względem inhibicji." src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywne wyniki testu zależności dawka-odpowiedź. Dwa związki (potencjalny inhibitor wzrostu A oraz potencjalny inhibitor c-di-GMP B) zidentyfikowane w poprzednich przesiewach zostały poddane dalszym testom w 10-punktowym badaniu zależności dawka-odpowiedź z maksymalnym stężeniem 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. Dopasowanie czteroparametrowej funkcji logistycznej do danych pozwoliło wyznaczyć wartości IC50 wynoszące odpowiednio 158 µM i 193 µM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje test o wysokiej przepustowości, który został z powodzeniem opracowany do badania dużych bibliotek małych cząsteczek pod kątem ich potencjalnej zdolności do manipulowania poziomami komórkowymi cyklicznego di-GMP u Pseudomonas aeruginosa, dostarczając nowego potężnego narzędzia do odkrywania leków przeciwbakteryjnych i testowania związków.

Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie małych cząsteczek modulujących wewnątrzkomórkowe poziomy drugiego przekaźnika cyklicznego di-GMP u oportunistycznego patogenu Pseudomonas aeruginosa za pomocą wysokoprzepustowego przesiewu z wykorzystaniem bioreportera. Metoda ta może pomóc w odkryciu małych cząsteczek oraz innych cząstek, które zakłócają przepływ bioinformacji u Pseudomonas aeruginosa poprzez modulację poziomu cyklicznego di-GMP. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka odporność i wszechstronność, co pozwala na przesiewanie ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.Implikacje tej techniki rozciągają się na opracowanie nowych terapii, które potencjalnie zwiększyłyby wrażliwość Pseudomonas aeruginosa na układ odpornościowy lub istniejące antybiotyki, wywierając jednocześnie mniejszą, selektywną presję na bakterie. Zaszczepić 5 mL bulionu lizogennego (podłoża LB) pojedynczą kolonią P.aeruginosa, w temperaturze 37 °C, przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. Następnie przenieść 2 mL kultury nocnej do 200 mL świeżego podłoża LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.Monitoruj gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 co 30 minut, pobierając próbkę o objętości 1 mililitra z kolby i badając ją za pomocą spektrofotometru. Gdy OD 600 osiągnie wartość między 0,3 a 0,5, przenieś 40 mililitrów hodowli do stożkowej probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 8000 rpm przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odlej supernatant i resuspenduj komórki w 40 mililitrach lodowatego, sterylnego 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Po ponownym odwirowaniu komórek resuspenduj je w 20 mililitrach lodowatego, sterylnego 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Ponownie odwirowaj komórki i resuspenduj je w 400 mikrolitrach 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Schładzaj komórki na lodzie przez 30 minut, po czym będą one gotowe do elektroporacji.Następnie do 40 µL przygotowanych elektrokompetentnych komórek P.Aeruginosa w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, uprzednio schłodzonej na lodzie, dodaj 1 µL roztworu plazmidu kodującego promotor CdrA z genem kodującym zielone białko fluorescencyjne o stężeniu 0,2 µg/µL. Wymieszaj zawiesinę i przenieś ją do uprzednio schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą międzyelektrodową 2 mm. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą ręcznika papierowego i umieść kuwetę w komorze próbkowej elektroporatora.Przetraktuj roztwór impulsem elektrycznym o napięciu 2,5 kilovolts, pojemności 25 microfarad i oporności 200 ohms. Wyjmij kuwetę i dodaj jeden mililitr pożywki LB. Następnie przenieś komórki do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitr i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 degrees Celsius przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.Po inkubacji nanieś alikwoty hodowli o objętości 10 µL, 50 µL i 100 µL na sterylne szalki z agarem LB z dodatkiem ampicyliny i inkubuj szalki w temperaturze 37 °C przez noc. Potwierdź ekspresję GFP, badając szalkę pod mikroskopem fluorescencyjnym z wykorzystaniem standardowego kanału GFP. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 5 mL LB. Po inkubacji przez noc zmieszaj 0,5 mL nocnej hodowli z 0,5 mL 50% glicerolu w probówce z nakrętką o pojemności 2 mL i przechowuj w temperaturze -80 °C.Na dwa dni przed przesiewaniem wysiej przygotowany szczep P.aeruginosa z banku w temperaturze -80°C na płytkę z agarem LB, delikatnie rozprowadzając bakterie po powierzchni płytki za pomocą sterylnej pętli szczepiącej. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Wieczorem przed przesiewaniem przenieś pojedynczą kolonię P.aeruginosa z płytki do probówki zawierającej 10 ml pożywki LB.Inkubuj prekulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. W dniu przesiewania przygotuj subkulturę z nocnej prekultury, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do wartości OD 600 wynoszącej 1,0, a następnie rozcieńczając ją dalej 5% LB do wartości OD 600 wynoszącej 0,4. Do naczynia dodaj sterylny mieszadło magnetyczne i mieszaj kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Pozwala to bakteriom na aklimatyzację do pożywki przed ich rozniesieniem do płytek 384-dołkowych. Aby przygotować kontrolę dodatnią, należy dodać 20 µL siarczanu tobramycyny do 10 mL przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszać. Do dołków od A23 do P23 należy nanieść pipetą 40 µL kultury kontrolnej dodatniej.Aby przygotować kontrolę negatywną, należy dodać 30 µL Dimethyl Sulfoxide do 10 mL przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszać. Do studni od A24 do P24 należy pipetować 40 µL kultury kontrolnej negatywnej. W przypadku każdej z płytek nasyconych małymi cząsteczkami, do studni od A1 do P22 należy zaszczepić 40 µL rozcieńczonych kultur nocnych.Uszczelnij płytki przepuszczalną dla powietrza folią uszczelniającą i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 °C. Na około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym podgrzej czytnik płytek do 37 °C, aby uniknąć kondensacji. Przed odczytem ostrożnie usuń przepuszczalną dla powietrza folię uszczelniającą z płytki.Następnie zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nanometrów, ustawiając 10 błysków na studzienkę oraz czas stabilizacji 0,2 sekundy. Przed pomiarem fluorescencji wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia i ostrości w oparciu o studzienkę kontrolną negatywną A24 i ustaw docelową wartość wzmocnienia na 75%. Wybierz regulację ostrości i kanał A po prawej stronie okna. Zmierz fluorescencję raportującego białka GFP przy maksymalnej długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i maksymalnej długości fali emisji 520 nanometrów, ustawiając 10 błysków na studzienkę oraz czas stabilizacji 0,2 sekundy.Zbierz dane ze wszystkich badanych płytek. Odczyty danych są automatycznie zapisywane jako domyślne przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek. Aby przeanalizować dane, wyświetl odczyty, klikając ikonę Mars w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.Pobierz dane, dwukrotnie klikając na interesujący numer płytki, aby uzyskać dostęp do danych do analizy. Oceń jednorodność i powtarzalność testu za pomocą analizy Z-prime. Następnie oblicz procent hamowania wzrostu oraz oceń procent hamowania wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym.Na tej ilustracji przedstawiono reprezentatywne surowe dane dla OD 600 oraz GFP z przesiewu wysokoprzepustowego. Do wartości w poszczególnych studzienkach zastosowano mapę ciepła z gradientem kolorystycznym od barw ciepłych do zimnych, wskazującym wartości od niskich do wysokich. Wygenerowane dane zostały poddane analizie pod kątem procentu inhibicji i są tutaj przedstawione dla obu odczytów: OD 600 oraz GFP.Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP, będą zaznaczone kolorem zielonym, natomiast małe cząsteczki potencjalnie promujące wzrost i poziomy wewnątrzkomórkowego c-di-GMP będą zaznaczone kolorem czerwonym. Wykresy rozrzutu służą do porównania procentowego hamowania uzyskanego dla każdej przetestowanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez małą kropkę, a przedstawiono rozkład procentowego hamowania dla odczytów OD 600 oraz GFP.Do identyfikacji hitów wybrano próg odcięcia wynoszący plus lub minus 50%. Potencjalne hity zaznaczono kolorem czerwonym. Dla każdego interesującego związku przeprowadzono analizy zależności dawka-odpowiedź.W ramach niniejszego badania dwa zidentyfikowane związki poddano analizie zależności dawka-odpowiedź w 10 punktach, przy maksymalnym stężeniu 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. Dopasowanie funkcji logistycznej czterech parametrów do uzyskanych danych pozwoliło wyznaczyć wartości połowicznego maksymalnego stężenia hamującego dla każdego związku, które wyniosły odpowiednio 158 µM oraz 193 µM. Po opanowaniu ta technika może zostać wykorzystana do przesiewu ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak skutecznie przeprowadzić przesiew Pseudomonas aeruginosa w celu znalezienia związków interferujących z sygnalizacją cyklicznego di-GMP. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu porównywalnych warunków przesiewania w przypadku prowadzenia badań przez kilka dni. Po przeprowadzeniu przesiewu jednopunktowego, wykonanie przesiewu odpowiedzi dawka-odpowiedź przy użyciu tego samego protokołu pozwoli na walidację otrzymanych wyników.Technika ta otwiera badaczom drogę do identyfikacji potencjalnych małych cząsteczek, które zakłócają przepływ informacji i oporność na antybiotyki u Pseudomonas aeruginosa. Co istotne, technikę tę można dostosować do zastosowania przy dowolnych interesujących badacza bakteriach oraz zmodyfikować w celu zbadania innych parametrów wyjściowych lub wejściowych, takich jak wpływ na żywotność bakterii. Na koniec należy pamiętać, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być niebezpieczna.Podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej.

establishment-high-throughput-setup-for-screening-small-molecules

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Źródło: Rugjee, KN i wsp., Ustanowienie wysokoprzepustowego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP w Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje wytwarzanie szczepu reporterowego reagującego cyklicznie na GMP u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu elektroporacji. Udana transformacja jest potwierdzana poprzez dobór antybiotyków i analizę...

Wytwarzanie fluorescencyjnego szczepu reporterowego u Pseudomonas aeruginosa

Źródło: Rugjee, K. N., et al. Opracowanie wysokoprzepustowego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film przedstawia badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP przy użyciu genetycznie zmodyfikowanych bakterii, które eksprymują białko zielonej fluorescencji (GFP) pod kontrolą promotora wrażliwego na c-di-GMP. Fluorescencję mierzy się na płytce wielodołkowej zawierającej różne badane...

Badania przesiewowe cyklicznych modulatorów di-GMP z wykorzystaniem bakterii wyrażających fluorescencyjne białko reporterowe 

Wszechobecny drugi przekaźnik c-di-GMP kontroluje wzrost i zachowanie wielu bakterii. Opracowaliśmy nowatorską technologię opartą na spektrometrii mas wychwytywania związków do biochemicznej identyfikacji i charakterystyki białek wiążących c-di-GMP u praktycznie każdego gatunku bakterii.

Spektrometria mas związków chemicznych - potężne narzędzie do identyfikacji nowych białek efektorowych c-di-GMP

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj wysokowydajny test do przesiewowego badania małych cząsteczek modulujących poziom c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa. Ta metoda umożliwia testowanie ponad 3500 związków w ciągu 48 godzin.

Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Przeglądaj więcej filmów