Opracowanie wysokowydajnego zestawu do badań przesiewowych małych cząsteczek, które modulują sygnalizację c-di-GMP u Pseudomonas aeruginosa

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie małych cząsteczek modulujących wewnątrzkomórkowe poziomy drugiego przekaźnika cyklicznego di-GMP u oportunistycznego patogenu Pseudomonas aeruginosa za pomocą wysokoprzepustowego przesiewu z wykorzystaniem bioreportera. Metoda ta może pomóc w odkryciu małych cząsteczek oraz innych cząstek, które zakłócają przepływ bioinformacji u Pseudomonas aeruginosa poprzez modulację poziomu cyklicznego di-GMP. Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka odporność i wszechstronność, co pozwala na przesiewanie ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.

Implikacje tej techniki rozciągają się na opracowanie nowych terapii, które potencjalnie zwiększyłyby wrażliwość Pseudomonas aeruginosa na układ odpornościowy lub istniejące antybiotyki, wywierając jednocześnie mniejszą, selektywną presję na bakterie. Zaszczepić 5 mL bulionu lizogennego (podłoża LB) pojedynczą kolonią P.aeruginosa, w temperaturze 37 °C, przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. Następnie przenieść 2 mL kultury nocnej do 200 mL świeżego podłoża LB w kolbie o pojemności 1 l i inkubować w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm.

Monitoruj gęstość optyczną przy 600 nanometrach lub OD 600 co 30 minut, pobierając próbkę o objętości 1 mililitra z kolby i badając ją za pomocą spektrofotometru. Gdy OD 600 osiągnie wartość między 0,3 a 0,5, przenieś 40 mililitrów hodowli do stożkowej probówki do wirowania o pojemności 50 mililitrów. Osadź komórki poprzez wirowanie przy 8000 rpm przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odlej supernatant i resuspenduj komórki w 40 mililitrach lodowatego, sterylnego 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Po ponownym odwirowaniu komórek resuspenduj je w 20 mililitrach lodowatego, sterylnego 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Ponownie odwirowaj komórki i resuspenduj je w 400 mikrolitrach 300 milimolarnego roztworu sacharozy. Schładzaj komórki na lodzie przez 30 minut, po czym będą one gotowe do elektroporacji.

Następnie do 40 µL przygotowanych elektrokompetentnych komórek P.Aeruginosa w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL, uprzednio schłodzonej na lodzie, dodaj 1 µL roztworu plazmidu kodującego promotor CdrA z genem kodującym zielone białko fluorescencyjne o stężeniu 0,2 µg/µL. Wymieszaj zawiesinę i przenieś ją do uprzednio schłodzonej kuwety do elektroporacji z przerwą międzyelektrodową 2 mm. Usuń wilgoć z zewnętrznej strony kuwety za pomocą ręcznika papierowego i umieść kuwetę w komorze próbkowej elektroporatora.

Przetraktuj roztwór impulsem elektrycznym o napięciu 2,5 kilovolts, pojemności 25 microfarad i oporności 200 ohms. Wyjmij kuwetę i dodaj jeden mililitr pożywki LB. Następnie przenieś komórki do sterylnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitr i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 degrees Celsius przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm.

Po inkubacji nanieś alikwoty hodowli o objętości 10 µL, 50 µL i 100 µL na sterylne szalki z agarem LB z dodatkiem ampicyliny i inkubuj szalki w temperaturze 37 °C przez noc. Potwierdź ekspresję GFP, badając szalkę pod mikroskopem fluorescencyjnym z wykorzystaniem standardowego kanału GFP. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep ją w 5 mL LB. Po inkubacji przez noc zmieszaj 0,5 mL nocnej hodowli z 0,5 mL 50% glicerolu w probówce z nakrętką o pojemności 2 mL i przechowuj w temperaturze -80 °C.

Na dwa dni przed przesiewaniem wysiej przygotowany szczep P.aeruginosa z banku w temperaturze -80°C na płytkę z agarem LB, delikatnie rozprowadzając bakterie po powierzchni płytki za pomocą sterylnej pętli szczepiącej. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Wieczorem przed przesiewaniem przenieś pojedynczą kolonię P.aeruginosa z płytki do probówki zawierającej 10 ml pożywki LB.

Inkubuj prekulturę przez noc w temperaturze 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 rpm. W dniu przesiewania przygotuj subkulturę z nocnej prekultury, rozcieńczając ją najpierw świeżą pożywką LB do wartości OD 600 wynoszącej 1,0, a następnie rozcieńczając ją dalej 5% LB do wartości OD 600 wynoszącej 0,4. Do naczynia dodaj sterylny mieszadło magnetyczne i mieszaj kulturę z minimalną prędkością na mieszadle magnetycznym przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Pozwala to bakteriom na aklimatyzację do pożywki przed ich rozniesieniem do płytek 384-dołkowych. Aby przygotować kontrolę dodatnią, należy dodać 20 µL siarczanu tobramycyny do 10 mL przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszać. Do dołków od A23 do P23 należy nanieść pipetą 40 µL kultury kontrolnej dodatniej.

Aby przygotować kontrolę negatywną, należy dodać 30 µL Dimethyl Sulfoxide do 10 mL przygotowanej subkultury i delikatnie wymieszać. Do studni od A24 do P24 należy pipetować 40 µL kultury kontrolnej negatywnej. W przypadku każdej z płytek nasyconych małymi cząsteczkami, do studni od A1 do P22 należy zaszczepić 40 µL rozcieńczonych kultur nocnych.

Uszczelnij płytki przepuszczalną dla powietrza folią uszczelniającą i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 °C. Na około 30 minut przed pomiarem spektrofotometrycznym podgrzej czytnik płytek do 37 °C, aby uniknąć kondensacji. Przed odczytem ostrożnie usuń przepuszczalną dla powietrza folię uszczelniającą z płytki.

Następnie zmierz gęstość optyczną przy długości fali 600 nanometrów, ustawiając 10 błysków na studzienkę oraz czas stabilizacji 0,2 sekundy. Przed pomiarem fluorescencji wykonaj automatyczną regulację wzmocnienia i ostrości w oparciu o studzienkę kontrolną negatywną A24 i ustaw docelową wartość wzmocnienia na 75%. Wybierz regulację ostrości i kanał A po prawej stronie okna. Zmierz fluorescencję raportującego białka GFP przy maksymalnej długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i maksymalnej długości fali emisji 520 nanometrów, ustawiając 10 błysków na studzienkę oraz czas stabilizacji 0,2 sekundy.

Zbierz dane ze wszystkich badanych płytek. Odczyty danych są automatycznie zapisywane jako domyślne przez oprogramowanie sterujące czytnikiem płytek. Aby przeanalizować dane, wyświetl odczyty, klikając ikonę Mars w oprogramowaniu sterującym, aby otworzyć pakiet analizy statystycznej.

Pobierz dane, dwukrotnie klikając na interesujący numer płytki, aby uzyskać dostęp do danych do analizy. Oceń jednorodność i powtarzalność testu za pomocą analizy Z-prime. Następnie oblicz procent hamowania wzrostu oraz oceń procent hamowania wewnątrzkomórkowego poziomu c-di-GMP, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym.

Na tej ilustracji przedstawiono reprezentatywne surowe dane dla OD 600 oraz GFP z przesiewu wysokoprzepustowego. Do wartości w poszczególnych studzienkach zastosowano mapę ciepła z gradientem kolorystycznym od barw ciepłych do zimnych, wskazującym wartości od niskich do wysokich. Wygenerowane dane zostały poddane analizie pod kątem procentu inhibicji i są tutaj przedstawione dla obu odczytów: OD 600 oraz GFP.

Małe cząsteczki, które potencjalnie hamują wzrost i wewnątrzkomórkowy poziom c-di-GMP, będą zaznaczone kolorem zielonym, natomiast małe cząsteczki potencjalnie promujące wzrost i poziomy wewnątrzkomórkowego c-di-GMP będą zaznaczone kolorem czerwonym. Wykresy rozrzutu służą do porównania procentowego hamowania uzyskanego dla każdej przetestowanej małej cząsteczki. Każda mała cząsteczka jest reprezentowana przez małą kropkę, a przedstawiono rozkład procentowego hamowania dla odczytów OD 600 oraz GFP.

Do identyfikacji hitów wybrano próg odcięcia wynoszący plus lub minus 50%. Potencjalne hity zaznaczono kolorem czerwonym. Dla każdego interesującego związku przeprowadzono analizy zależności dawka-odpowiedź.

W ramach niniejszego badania dwa zidentyfikowane związki poddano analizie zależności dawka-odpowiedź w 10 punktach, przy maksymalnym stężeniu 2 mM i dwukrotnym szeregiem rozcieńczeń. Dopasowanie funkcji logistycznej czterech parametrów do uzyskanych danych pozwoliło wyznaczyć wartości połowicznego maksymalnego stężenia hamującego dla każdego związku, które wyniosły odpowiednio 158 µM oraz 193 µM. Po opanowaniu ta technika może zostać wykorzystana do przesiewu ponad 3 500 związków w ciągu 48 godzin.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobre wyobrażenie o tym, jak skutecznie przeprowadzić przesiew Pseudomonas aeruginosa w celu znalezienia związków interferujących z sygnalizacją cyklicznego di-GMP. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu porównywalnych warunków przesiewania w przypadku prowadzenia badań przez kilka dni. Po przeprowadzeniu przesiewu jednopunktowego, wykonanie przesiewu odpowiedzi dawka-odpowiedź przy użyciu tego samego protokołu pozwoli na walidację otrzymanych wyników.

Technika ta otwiera badaczom drogę do identyfikacji potencjalnych małych cząsteczek, które zakłócają przepływ informacji i oporność na antybiotyki u Pseudomonas aeruginosa. Co istotne, technikę tę można dostosować do zastosowania przy dowolnych interesujących badacza bakteriach oraz zmodyfikować w celu zbadania innych parametrów wyjściowych lub wejściowych, takich jak wpływ na żywotność bakterii. Na koniec należy pamiętać, że praca z Pseudomonas aeruginosa może być niebezpieczna.

Podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej.