Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Dzisiaj zademonstrujemy metodę badania przesiewowego biblioteki peptydów w stosunku do niedawno odkrytego receptora głównego, którym jest receptor białka G X2 związany z Mas, znany również jako receptor MRGPRX2. Komórki tuczne są integralną częścią układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę zarówno we wrodzonej, jak i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Komórki tuczne są aktywowane albo przez związany z antygenem receptor Fc epsilon R1, albo przez niedawno odkryty receptor X2.

Aktywacja powierzchniowego receptora X2 została powiązana z kilkoma chorobami immunologicznymi i zapalnymi, dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizm wiązania tego receptora z jego ligandami. Aby tego dokonać, opracowaliśmy bibliotekę małych cząsteczek peptydowych i przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem receptorów X2 z nadmierną ekspresją na heksysie. W badaniu skonstruowano bibliotekę peptydów przy użyciu prostych i wszechstronnych technik skanowania alaniny i obcinania aminokwasów.

Heck293 mówi, że ekspresja receptorów X2 po aktywacji peptydami i hexis szerokiego typu były używane jako kontrola. W skróceniu wydania po aktywacji monitorowano w celu zbadania aktywacji opartej na X2. Eksperymentalnie, Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye jest wzbudzany przy 340 i 380 nanometrach, podczas gdy emisja jest rejestrowana przy 510 nanometrach.

Po związaniu wapnia intensywność fluorescencji przy 340 wzrasta, podczas gdy przy 380 nanometrach maleje. Barwnik jest następnie osadzany w stosunku intensywności fluorescencji 340 do 380 nanometrów. Stosunek 340 do 380 jest proporcjonalny do wewnątrzkomórkowego wapnia, jego wartość można obliczyć za pomocą równania Grynkiewicza.

Wykrywany jest współczynnik tabbingu dwóch intensywności fluorescencji, wpływ czynników eksperymentalnych, takich jak rozcieńczanie, fotowybielanie, wyciek barwnika i gęstość zapachu. Tak więc, nie zwlekając, zacznijmy eksperyment. Aby zidentyfikować ligandy receptora MRGPR X2 komórki tucznej, generator biblioteki peptydów N-Truncated, C-Truncated i N + C-Truncated, poprzez skrócenie aminokwasów N-końcowych, C-końcowych i N+C-końcowych nieprawidłowej pam-12.

Użyj syntezy peptydów w fazie stałej do syntezy peptydów. Zmodyfikuj zacisk końcowy na ustawioną grupę pływów, a zacisk C na grupę amidową. Generuj i alaniny mogą bibliotekę peptydów, zastępując odpowiednie aminokwasy pam-12 przez alaninę, jeden po drugim.

Zmodyfikuj zacisk końcowy na grupę setydową, a zacisk C na grupę amidową. Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM o wysokim poziomie glukozy 10% płodową surowicą bydlęcą, dwumilimolową L-glutaminą, stu jednostkami na ml penicyliny i stu mikrogramami na ml streptomycyny. Oprócz komórek w kulturze tee sue cecha, kolba hodowlana 375 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, aż do 75 do 80% zlewania się.

Gdy zlewają się w 75%, umyj komórki i dodaj dwa do trzech ml Proof-C, aby odłączyć komórki. Gdy komórki się odłączą, zbierz je w Proof-C. Dodaj od sześciu do dziewięciu ml świeżego podłoża.

Odwiruj komórki o masie 1620 g przez trzy do pięciu minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant w celu zebrania osadu. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej.

Rozcieńczyć komórki zgodnie z pożądanym stężeniem. Przy 200 mikrolitrach zawiesiny komórkowej o stężeniu 200 000 komórek, wlej ambon do każdej studzienki, aby poszukać 40 000 komórek na studzienkę. Chroń komórki przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.

Do eksperymentu użyj barwnika Fura-2 AM. Dodaj 50 mikrolitrów DMSO w 50 mikrogramach Fura-2 AM, aby przygotować jeden milimolowy surowy roztwór barwnika Fura-2 AM. Dodać jeden mikrolitr jednego milimolowego barwnika Fura-2 AM na ml świeżej pożywki, aby przygotować podłoże rozcieńczające o stężeniu jednego barwnika mikromolowego.

Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i wyrzucić pożywkę. Zastąp pożywkę świeżą pożywką rozcieńczającą. Dodaj 200 mikrolitrów pożywki rozcieńczającej do każdej studzienki.

Inkubuj komórki przez 30-40 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Podczas inkubacji komórek należy ustawić czytnik płytek. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.

W ustawieniach wybierz opcję Flex. Ustaw tryb odczytu na fluorescencję i odczyt od dołu. W polu Długości fal ustaw liczbę długości fal na dwa.

Ustaw wzbudzenie na 340 nanometrów i 380 nanometrów. Ustaw emisję na 510 nanometrów. Pozostaw czułość na Domyślna.

W polu Timing (Pomiar czasu) ustaw interwał na 3,9 sekundy. Ustaw czas wykonywania na 94 sekundy, aby uzyskać 25 liczb odczytów. Następnie wybierz typ płytki testowej.

Następnie wybierz studnie do odczytania. W Transferze złożonym ustaw transfery na jeden, a Objętość początkową na sto mikrolitrów. Ustaw wysokość pipety na sto mikrolitrów, objętość na 50 mikrolitrów, a punkt czasu na 36 sekund, aby dodać związek i poprawić odczyt.

Następnie wybierz typ blachy źródłowej złożonej. Pozostaw Triturate do nieużywania. Wybierz układ końcówek i końcówek do pipet.

W przypadku kolumn złożonych i końcówek związek zostanie przeniesiony w pierwszej kolumnie płyty złożonej. Ustaw kolumnę Porada na jeden, a kolumnę złożoną na jeden. Pozostaw opcję Autokalibracja na Włączone.Kliknij przycisk OK. Po 40 minutach inkubacji usuń pożywkę.

Umyj komórki za pomocą bufora XDB. Dodaj sto mikrolitrów bufora XDB do odczytu fluorescencji. Weź płytkę do odczytu fluorescencji.

Gdy Pritchett osiągnie 37 stopni Celsjusza, naciśnij komorę odczytu, aby włożyć płytkę testową do czytnika płytek fluorescencyjnych. Naciśnij źródło, aby umieścić płytkę złożoną. Przygotuj płytkę złożoną, dodając 200 mikrolitrów szanowanych peptydów, jonomysyny i EGTA, aby obrócić roztwory X.

Naciśnij końcówkę, aby umieścić pudełko na końcówki. Użyj czarnej końcówki, aby uniknąć autofluorescencji końcówki. Po zachowaniu tabliczek i jeśli korzystasz z ustawień oprogramowania i naciśnij Odczyt.

Określić stężenie wapnia na podstawie współczynnika fluorescencji za pomocą równania Grynkiewicza. Pokazano dane fluorescencji dobrego peptydu pam. Jak widać, po dodaniu peptydu w 36 sekundzie, fluorescencja w 340 nanometrach, czyli luker wzrasta o 380 nanometrów rekord spada.

Dane są reprezentowane jako stosunek 340 do sygnału 380. Pokazują one, że sygnały wzrastają po dodaniu peptydu. Liczba ta jest reprezentatywnymi danymi dla peptydu aktywującego.

Rysunek A przedstawia sygnały fluorescencyjne dla peptydu aktywującego. Dane reprezentatywne odpowiadające peptydowi cram12 zostały dodane po utworzeniu linii bazowej dla cykli przetargowych, jak pokazano w ado. Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu na długości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu na długości 380 nanometrów.

Ta liczba jest danymi reprezentatywnymi dla ślepej próby. Rysunek A przedstawia sygnały fluorescencyjne dla ślepej próby. HTB dodano po rozcieńczeniu linii bazowej przez 10 cykli karmienia, jak pokazano w ado.

Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 380 nanometrów. Liczba ta jest reprezentatywnymi danymi dla wzorców do kalibracji barwników. Rysunek A pokazuje, że jonomycyna została dodana przy 10. odczycie, jak pokazano w ado, aby uzyskać maksymalną fluorescencję w stanie związanym z kaszem.

EGPA Triton X hundred został dodany po 20 odczytach, jak pokazano przez ado, którzy otrzymują minimalny sygnał. Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 380 nanometrów. Wartości te są następnie umieszczane w równaniu Grynkiewicza, aby uzyskać wewnątrzkomórkową pamięć podręczną stężenia.

Rysunek ten przedstawia charakterystykę reprezentatywnego peptydu w celu potwierdzenia sekwencji i czystości. Rysunek A przedstawia pionową masę reprezentatywnej sekwencji peptydowej WNK WAL wynoszącą 857,90 rozcieńczenia barwnika. Co pokazuje stosunek N do Zed w spektroskopii mas.

Rysunek B przedstawia czystość peptydu na poziomie 99%, potwierdzoną przez HPLC. Peptyd ten należy do biblioteki peptydów skróconych N + C. Podsumowując, opisana tutaj metoda jest łatwa i wszechstronna, która może być skuteczna i jasna w przypadku badań przesiewowych na bazie wapnia w ostatniej skali.

Istnieje jednak kilka czynników, które decydują o jakości danych, a co za tym idzie, skład musi być zoptymalizowany dla danego systemu instrumentów komórkowych. Dziękuję.