Name: Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę przesiewu biblioteki peptydów aktywujących receptor MRGPRX2 przy użyciu zmodyfikowanych komórek HEK293 z zastosowaniem barwnika Fura-2 AM.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SR i LDU pragną podziękować Alberta Innovates Strategic Research Project, NRC i grantowi NSERC-Discovery za ten projekt.

1. Projektowanie i opracowanie biblioteki peptydów
<ol>
	<li>Aby zidentyfikować ligandy receptora MRGPRX2 komórek tucznych na podstawie znanego liganda, tj. PAMP-1213, należy wykonać poniższe kroki.
	<ol>
		<li>Przygotować bibliotekę peptydów z uciętym końcem N poprzez sukcesywne usuwanie aminokwasowych reszt końca N-końcowego liganda za pomocą syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS).</li>
		<li>Przygotować bibliotekę peptydów z uciętym końcem C poprzez sukcesywne usuwanie aminokwasowych reszt końca C-końcowego znanego liganda za pomocą SPPS.</li>
		<li>Na podstawie wyników z kroków 1.1.1 i 1.1.2, przygotować bibliotekę peptydów z uciętymi końcami N+C, wykorzystując SPPS do usunięcia odpowiednich reszt odpowiednio z końca N i C.</li>
		<li>Zastosować syntezę peptydów w fazie stałej w celu syntezy peptydów13.</li>
		<li>Zmodyfikować koniec N poprzez dodanie grupy acetylowej (Ac), a koniec C poprzez dodanie grupy amidowej.</li>
		<li>Określić czystość peptydu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz jego masę za pomocą spektrometru masowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zbadać znaczenie konkretnych aminokwasów w cząsteczce macierzystej PAMP-12, należy wykonać poniższe kroki.
	<ol>
		<li>Przygotować bibliotekę peptydów do skanowania alaniną poprzez zastępowanie poszczególnych reszt aminokwasowych w cząsteczce peptydu alaniną, pojedynczo, przy użyciu SPPS. Zmodyfikować koniec N poprzez dodanie grupy acetylowej (Ac), a koniec C poprzez dodanie grupy amidowej.</li>
		<li>Określić czystość peptydu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz jego masę za pomocą spektrometru masowego. 
		UWAGA: Należy upewnić się, że zsyntetyzowane peptydy charakteryzują się wysoką czystością. Scharakteryzować peptydy za pomocą spektrometrii mas i HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2.  Hodowla komórkowa in vitro
<ol>
	<li>Hoduj komórki HEK-X2 i HEK-WT zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM z wysoką zawartością glukozy o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, 100 U/mL penicyliny i 100 µg/mL streptomycyny.</li>
		<li>Przesiej komórki do kolbek hodowlanych T-75 traktowanych do hodowli tkanek (TC) i hoduj w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aż osiągną 75-80% konfluencji.</li>
		<li>Po osiągnięciu 75% konfluencji przemyj komórki i dodaj 2-3 mL trypsyny na 2-3 min. Inkubuj w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 , aby odlepić komórki.</li>
		<li>Po odlepieniu komórek zbierz je wraz z trypsyną. Dodaj 6-9 mL świeżej pożywki.</li>
		<li>Odwiruj komórki przy 1620 x g przez 3-5 min.</li>
		<li>Po wirowaniu odlej nadsącz, aby otrzymać osad. Resuspenduj komórki w świeżej pożywce hodowlanej. Rozcieńcz komórki do pożądanego stężenia. 
		UWAGA: Komórki HEK rosną szybko, dlatego należy zoptymalizować dodatki do pożywki. Komórki HEK są komórkami adherentnymi; przesiewaj je do kolbek traktowanych TC, aby wspomóc adhezję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 96-dołkową płytkę analityczną do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Dodaj 200 µL zawiesiny komórkowej o stężeniu 200 000 komórek/mL do każdego dołka, aby zasiać 40 000 komórek/dołek.</li>
		<li>Hoduj komórki przez 24 h w inkubatorze w 37 °C, 5% CO2 . 
		UWAGA: Zoptymalizuj gęstość komórek na dołek w zależności od rozmiaru płytki i szczepu komórkowego. Przeprowadź eksperyment w trzech powtórzeniach w czarnej, traktowanej TC płytce 96-dołkowej z płaskim, przezroczystym dnem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza poziomu wapnia z użyciem Fura-2 AM
<ol>
	<li>Przygotuj barwnik, postępując zgodnie z poniższymi krokami.
	<ol>
		<li>Do przeprowadzenia eksperymentu należy użyć barwnika Fura-2 AM.</li>
		<li>Przygotować bufor HEPES-Tyrode'a (HTB) zawierający 25 mM buforu HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mg/ml glukozy, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz świeżo dodane 1,8 mM CaCl22 woda wysterylizowana w autoklawie.</li>
		<li>Dodaj 50 µL DMSO w 50 µg fiolka Fura-2 AM do przygotowania 1 mM roztworu stokowego barwnika Fura-2 AM. Dodać 1 µL barwnika Fura-2 AM w stężeniu 1 mM na 1 ml świeżej pożywki, aby przygotować pożywkę do ładowania barwnika o stężeniu 1 µM stężenie barwnika.</li>
		<li>Wyjmij płytkę 96-dołkową z inkubatora i odlej pożywkę. Zastąp pożywkę świeżą pożywką do ładowania barwnika. Dodaj 200 µL podłoża do ładowania barwnika w każdej studzience. Inkubować komórki przez 30-40 min w 37 °C, 5% CO22 inkubator.</li>
		<li>Po 40 minutach inkubacji usunąć medium. Przemyć komórki buforem HTB. Dodać 100 µL buforu HTB do pomiaru fluorescencji. Przenieś płytkę do pomiaru fluorescencji. 
		UWAGA: Należy zoptymalizować stężenie barwnika w medium do nakładania barwnika. Potencjalnymi problemami związanymi z barwnikiem mogą być wycieki barwnika oraz fotoblaknięcie. Dodać CaCl22 bezpośrednio do buforu HTB, aby uniknąć wytrącenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Aktywacja komórek i odczyt fluorescencyjny
UWAGA: Czytnik płytek fluorescencyjnych z automatycznym systemem pipetującym umożliwia automatyczny transfer związków ze źródła związków na płytkę testową bez konieczności wyjmowania płytki z czytnika.
<ol>
	<li>Podczas inkubacji komórek należy skonfigurować czytnik płytek.
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
		<li>W sekcji Ustawienia wybierz Flex.</li>
		<li>Ustaw tryb odczytu na fluorescencję i odczyt od dołu.</li>
		<li>W sekcji Długości fal ustaw liczbę długości fal na 2. Ustaw pobudzenie na 340 nm i 380 nm. Ustaw emisję na 510 nm.</li>
		<li>Pozostaw czułość w ustawieniu domyślnym.</li>
		<li>W sekcji Czas ustaw interwał na 3,9 s. Ustaw czas pomiaru na 94 s, aby uzyskać 25 odczytów.</li>
		<li>Następnie wybierz typ płytki testowej.</li>
		<li>Następnie wybierz do odczytu studzienki.</li>
		<li>W sekcji Transfer związku ustaw liczba transferów na 1 oraz objętość początkową na 100 µL. Ustaw wysokość pipety na 100 µL, objętość na 50 µL i punkt czasowy na 36 s, aby dodać związek podczas 10. odczytu.</li>
		<li>Następnie wybierz typ płytki źródła związku.</li>
		<li>Pozostaw opcję mieszanie (triturate) jako nieużywana.</li>
		<li>Wybierz końcówki w układzie końcówek pipety.</li>
		<li>W przypadku kolumn związków i końcówek upewnij się, że związki do przeniesienia znajdują się w kolumnie 1 płytki ze związkami. Ustaw kolumnę końcówki na 1 i kolumnę związku na 1.</li>
		<li>Pozostaw autokalibrację w ustawieniu WŁ.</li>
		<li>Kliknij OK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po osiągnięciu temperatury 37 °C umieść płytki w czytniku płytek.
	<ol>
		<li>Naciśnij komorę odczytu, aby włożyć płytkę testową do fluorescencyjnego czytnika płytek.</li>
		<li>Naciśnij źródło, aby włożyć płytkę ze związkami. Przygotuj płytkę ze związkami, dodając po 200 µL odpowiednich peptydów, jonomycyny oraz roztworu etylenoglikolu-bis(β-aminoetylu eteru)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA)-Tritonu X-100.</li>
		<li>Naciśnij stojak na końcówki, aby włożyć pudełko z końcówkami. Użyj czarnych końcówek, aby uniknąć autofluorescencji.</li>
		<li>Po załadowaniu płytek sprawdź ustawienia oprogramowania i naciśnij Odczytaj.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Wyznacz stężenie wapnia z powodu fluorescencji za pomocą równania Grynkiewicza - 
	<img alt="Równanie stężenia jonów wapnia, wzór analizy fluorometrycznej, reprezentacja badania naukowego." src="/files/ftp_upload/62448/62448eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Kd jest stałą dysocjacji Fura-2 AM, R jest stosunkiem emisji po wzbudzeniu przy 340 nm i 380 nm (F340/F380) dla poszczególnych peptydów, Rmax to maksymalny stosunek fluorescencji zaobserwowany po dodaniu 50 µL 30 µM jonomycyny, Rmin to minimalna fluorescencja zaobserwowana po dodaniu 50 µL 100 mM EGTA/2,5% Triton X-100, a F380min i F380max to bezwzględna intensywność fluorescencji Fura-2 AM odpowiednio w stanie wolnym od wapnia i w stanie związanym. 
	UWAGA: Urządzenie dozuje ciecz z pewną siłą. Nie ustawiaj wysokości dozowania peptydów zbyt blisko dna płytki, ponieważ może to spowodować oderwanie komórek. Używaj czarnych końcówek do pipet, aby uniknąć autofluorescencji. Odczytuj maksymalną i minimalną fluorescencję dla każdej płytki w każdym eksperymencie.</li>
</ol>

<ol><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Mas-related+G+protein-coupled+receptor+X2+on+mast+cell-mediated+host+defense%2C+pseudoallergic+drug+reactions%2C+and+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).</li>
<li>Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+isolation%2C+and+maintenance+of+human+mast+cells+and+mast+cell+lines+derived+from+peripheral+blood+or+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood.</a> Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).</li>
<li>Occhiuto, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+entry+via+STIM1+contributes+to+MRGPRX2+induced+mast+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions.</a> Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).</li>
<li>Baba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+for+the+calcium+sensor+STIM1+in+mast+cell+activation+and+anaphylactic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses.</a> Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Hoth, M., Penner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+calcium+stores+activates+a+calcium+current+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells.</a> Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).</li>
<li>Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+method+to+quantify+intraplatelet+calcium+dynamics+by+ratiometric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry.</a> PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+measurement+of+cytosolic+free+Ca2%2B+in+monolayers+and+suspensions+of+various+types+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Generation+of+Ca2+%2B+Indicators+with+Greatly+Improved+Fluorescence+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+nanoscaffold+that+activates+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).</li>
<li>Lansu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+design+of+novel+probes+for+the+atypical+opioid+receptor+MRGPRX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).</li>
<li>Navinés-Ferrer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRGPRX2-mediated+mast+cell+response+to+drugs+used+in+perioperative+procedures+and+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+store-operated+calcium+%28Ca+2%2B%29+entry+%28SOCE%29+in+HEK293+cells+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2.</a> Calcium Signalling. , 163-172 (2019).</li>
<li>Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+340%2F380+nm+light-emitting+diode+illuminator+for+Fura-2+AM+ratiometric+Ca2%2B+imaging+of+live+cells+with+better+than+5+nM+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Sygnalizacja wapniowa ma kluczowe znaczenie dla degranulacji komórek tucznych i jest szeroko stosowana w badaniach nad interakcjami receptor-ligand, identyfikacją ligandów i odkrywaniem leków14. MRGPRX2 to niedawno odkryty receptor komórek tucznych, który, jak stwierdzono, odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach zapalnych, takich jak między innymi świąd, astma i atopowe zapalenie skóry2. Ponadto wykazano, że kilka zatwierdzonych leków wywołuje reakcję zapalną poprzez recept...

Komórki tuczne są integralną częścią układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę zarówno w wrodzonych, jak i nabytych odpowiedziach immunologicznych. Komórki tuczne są przede wszystkim aktywowane albo przez wiązanie antygenu z kompleksem receptora immunoglobuliny E (IgE) - FcεRI, albo przez niedawno odkryty receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas, 1. MRGPRX2 aktywacja została powiązana z kilkoma chorobami immunologicznymi i zapalnymi, dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizm wiązania receptora z jego ligandami2. W tym celu opracowano bibliotekę małych cząsteczek peptydowych i przebadano je pod kątem receptorów MRGPRX2, które ulegały nadekspresji w komórkach HEK. W badaniu biblioteka peptydów została skonstruowana przy użyciu prostych i wszechstronnych technik skanowania alaniny i obcinania aminokwasów. Skanowanie alaniny polega na zastąpieniu określonych aminokwasów resztą alaniny. Alanina, będąc małą i obojętną, pozbawia peptyd specyficznych właściwości nadawanych przez zastąpioną resztę i kolejno podkreśla znaczenie odpowiednich właściwości fizykochemicznych aminokwasu w oddziaływaniach receptorowych. Wręcz przeciwnie, w przypadku skracania aminokwasów sekwencje peptydowe są zaprojektowane w taki sposób, że brakuje jednej lub więcej reszt aminokwasowych z N-końca, końca C lub obu. Ten zestaw peptydów został wykorzystany do identyfikacji sekwencji aminokwasów kluczowych dla wiązania MRGPRX2.
Doświadczenie z liniami ludzkich komórek tucznych (LAD-2) pokazało, że te komórki są trudne do hodowli i utrzymania in vitro: czas podwojenia wynoszący dwa tygodnie, drogie średnie suplementy i wymagana bezpośrednia uwaga podczas pasażu3. Te cechy sprawiają, że komórki nie nadają się do badań przesiewowych potencjalnych ligandów na dużą skalę. W tym przypadku stabilnie transfekowane komórki HEK eksprymujące receptor MRGPRX2 (HEK-X2) zostały użyte do badania przesiewowego biblioteki peptydów1. Komórki HEK-293 są szeroko stosowane i badane pod kątem heterologicznej ekspresji receptorów powierzchniowych ze względu na ich wysoką wydajność transfekcji, szybszy wskaźnik podwajania i potrzebę niedrogich suplementów pożywki do hodowli w laboratorium4. Protokół transfekcji linii komórkowej HEK-293 został zademonstrowany i jest dobrze znany5. Komórki HEK-293 stabilnie eksprymujące receptor MRGPRX2 (pasaż 13-19) były aktywowane peptydami generowanymi przez N-skrócenie, C-skrócenie, N+C-skrócenie i skanowanie alaniny1. Jako kontrolę użyto komórek HEK typu dzikiego (HEK-WT) (pasaż 16-21). Wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia po aktywacji monitorowano w celu zbadania aktywacji opartej na MRGPRX2.
Aktywacja komórek przez MRGPRX2 następuje cytozolowa mobilizacja wapnia. To regulowane wewnątrzkomórkowe uwalnianie wapnia w komórkach tucznych jest regulowane przez wejście wapnia obsługiwane przez magazyn (SOCE), koordynowane przez cząsteczkę interakcji zrębowej 1 (STIM1); i ma kluczowe znaczenie dla kaskady odpowiedzi immunologicznej6,7. Do wykrywania wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia zastosowano różne metody, w tym patch-clampy i barwniki fluorescencyjne8. Spośród wszystkich dostępnych technik, powszechnie stosowane są fluorometryczne barwniki wapniowe w połączeniu z różnymi technikami wykrywania9. Dwa rodzaje barwników fluorometrycznych, które zyskały zainteresowanie, to mianowicie barwniki o pojedynczej długości fali, takie jak Fluo-4, i barwniki ratiometryczne o podwójnej długości fali, takie jak Indo-1 i Fura-2. Zaletą barwników ratiometrycznych o podwójnej długości fali w porównaniu z barwnikami o pojedynczej długości fali jest to, że barwniki ratiometryczne korygują błędy eksperymentalne, takie jak ładowanie barwnika, wybielanie zdjęć i ustawianie ostrości10,11.
Ester acetoksymetylowy fura-2 (Fura-2 AM) jest przenikającym komórki, zielonym barwnikiem fluorescencyjnym, którego wzbudzenie zmienia się na niższą długość fali po związaniu wapnia. Eksperymentalnie Fura-2 jest wzbudzana przy 340 i 380 nm, podczas gdy emisja jest rejestrowana przy 510 nm. Po związaniu wapnia intensywność fluorescencji przy 340 nm wzrasta, podczas gdy intensywność 380 nm maleje, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Dane są reprezentowane jako stosunek intensywności fluorescencji po wzbudzeniu przy 340 nm (F340) do intensywności po wzbudzeniu przy 380 nm (F380), tj. F340/F380. Stosunek F340/F380 jest proporcjonalny do wewnątrzkomórkowego wapnia, którego wartość można obliczyć za pomocą równania Grynkiewicza12. Ponieważ sygnał fluorescencyjny uzyskuje się ze wzbudzenia barwnika na dwóch długościach fal (340 nm i 380 nm), stosunek sygnałów fluorescencyjnych koryguje się o czynniki eksperymentalne, takie jak obciążenie barwnikiem, wyciek barwnika, fotowybielanie i gęstość komórek.

<table><tbody><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>793939</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>polistyrenowa mikropłytka</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer</td><td>11995065</td><td>Wysoka zawartość glukozy</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fischer</td><td>D12345</td><td>Sterylny, biologiczny EGTA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Thermo Fischer</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation 3</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>FV06060</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fischer</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Bufor</td><td>Thermo Fischer</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamina</td><td>Thermo Fischer</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptydy</td><td>RS Syntehsis</td><td>Custom</td><td>&ge; 95% czysty; Końcówka N - grupa acetylowa Końcówka C - grupa amidowa Chlorek</td></tr><tr><td>potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DOW Chemical</td><td>166704</td><td></td></tr></tbody></table>

peptydy przesiewowe, które aktywują mrgprx2 za pomocą zmodyfikowanych komórek hek

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

Identyfikacja ligandów specyficznych dla terapeutycznie istotnych receptorów komórkowych jest kluczowa dla wielu zastosowań, w tym projektowania i rozwoju nowych terapii. Receptor białka G-X2 (MRGPRX2) związany z mas jest ważnym receptorem, który reguluje aktywację komórek tucznych, a tym samym kieruje ogólną odpowiedzią immunologiczną. Zidentyfikowano liczne ligandy dla MRGPRX2, które obejmują endogenne peptydy, takie jak PAMP, defensyny, LL-37 i inne fragmenty białek (tj. Zdegradowane albuminy). Dalsza identyfikacja MRGPRX2 specyficznych ligandów wymaga badań przesiewowych dużej liczby peptydów (tj. biblioteki peptydów); Jednak komórki tuczne są trudne i kosztowne w utrzymaniu in vitro, a zatem nie są ekonomiczne w użyciu do badań przesiewowych dużej liczby cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiono metodę projektowania, opracowywania i badania przesiewowego biblioteki małych cząsteczek peptydowych wykorzystujących MRGPRX2 ekspresji komórek HEK. Ta linia komórkowa jest stosunkowo łatwa i niedroga w utrzymaniu i może być wykorzystywana do wysokoprzepustowej analizy in vitro. Do monitorowania aktywacji użyto wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego Fura-2 do oznaczania wewnątrzkomórkowego strumienia wapnia po aktywacji. Do obliczenia stężenia wapnia wykorzystano stosunek intensywności fluorescencji Fura-2 przy długości fali 510 nm do długości fal wzbudzenia 340 i 380 nm. Biblioteka peptydów użyta do weryfikacji tego systemu była oparta na endogennym sekretagogu N-końca 12 proadrenomedulliny (PAMP-12), o którym wiadomo, że wiąże MRGPRX2 z wysoką swoistością i powinowactwem. Kolejne peptydy zostały wygenerowane za pomocą technik skracania aminokwasów i skanowania alaniny zastosowanych do PAMP-12. Opisana tutaj metoda jest prosta i niedroga, a jednocześnie solidna do badań przesiewowych dużej biblioteki związków w celu identyfikacji domen wiążących i innych ważnych parametrów, które odgrywają ważną rolę w aktywacji receptora.

Tabela 1 zawiera sekwencje peptydów otrzymane poprzez trunkację aminokwasów terminalnych oraz skanowanie alaniną. Jak pokazano w Tabeli 1, sekwencja peptydowa RKKWNKWALSR nie posiada fenyloalaniny (F) na końcu N-terminalnym w stosunku do macierzystego PAMP-12, i tym samym jest reprezentatywnym peptydem w bibliotece N-trunkowanych. Podobnie, w FRKKWNKWALS usunięto serynę C-terminalną PAMP-12, co reprezentuje bibliotekę peptydów C-trunkowanych pochodnych od PAMP-12. W bibliotece peptydów N...

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

Dzisiaj zademonstrujemy metodę badania przesiewowego biblioteki peptydów w stosunku do niedawno odkrytego receptora głównego, którym jest receptor białka G X2 związany z Mas, znany również jako receptor MRGPRX2. Komórki tuczne są integralną częścią układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę zarówno we wrodzonej, jak i nabytej odpowiedzi immunologicznej. Komórki tuczne są aktywowane albo przez związany z antygenem receptor Fc epsilon R1, albo przez niedawno odkryty receptor X2.Aktywacja powierzchniowego receptora X2 została powiązana z kilkoma chorobami immunologicznymi i zapalnymi, dlatego ważne jest, aby zrozumieć mechanizm wiązania tego receptora z jego ligandami. Aby tego dokonać, opracowaliśmy bibliotekę małych cząsteczek peptydowych i przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem receptorów X2 z nadmierną ekspresją na heksysie. W badaniu skonstruowano bibliotekę peptydów przy użyciu prostych i wszechstronnych technik skanowania alaniny i obcinania aminokwasów.Heck293 mówi, że ekspresja receptorów X2 po aktywacji peptydami i hexis szerokiego typu były używane jako kontrola. W skróceniu wydania po aktywacji monitorowano w celu zbadania aktywacji opartej na X2. Eksperymentalnie, Fura-2 AM Calcium Sensitive Dye jest wzbudzany przy 340 i 380 nanometrach, podczas gdy emisja jest rejestrowana przy 510 nanometrach.Po związaniu wapnia intensywność fluorescencji przy 340 wzrasta, podczas gdy przy 380 nanometrach maleje. Barwnik jest następnie osadzany w stosunku intensywności fluorescencji 340 do 380 nanometrów. Stosunek 340 do 380 jest proporcjonalny do wewnątrzkomórkowego wapnia, jego wartość można obliczyć za pomocą równania Grynkiewicza.Wykrywany jest współczynnik tabbingu dwóch intensywności fluorescencji, wpływ czynników eksperymentalnych, takich jak rozcieńczanie, fotowybielanie, wyciek barwnika i gęstość zapachu. Tak więc, nie zwlekając, zacznijmy eksperyment. Aby zidentyfikować ligandy receptora MRGPR X2 komórki tucznej, generator biblioteki peptydów N-Truncated, C-Truncated i N + C-Truncated, poprzez skrócenie aminokwasów N-końcowych, C-końcowych i N+C-końcowych nieprawidłowej pam-12.Użyj syntezy peptydów w fazie stałej do syntezy peptydów. Zmodyfikuj zacisk końcowy na ustawioną grupę pływów, a zacisk C na grupę amidową. Generuj i alaniny mogą bibliotekę peptydów, zastępując odpowiednie aminokwasy pam-12 przez alaninę, jeden po drugim.Zmodyfikuj zacisk końcowy na grupę setydową, a zacisk C na grupę amidową. Przygotować pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM o wysokim poziomie glukozy 10% płodową surowicą bydlęcą, dwumilimolową L-glutaminą, stu jednostkami na ml penicyliny i stu mikrogramami na ml streptomycyny. Oprócz komórek w kulturze tee sue cecha, kolba hodowlana 375 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2, aż do 75 do 80% zlewania się.Gdy zlewają się w 75%, umyj komórki i dodaj dwa do trzech ml Proof-C, aby odłączyć komórki. Gdy komórki się odłączą, zbierz je w Proof-C. Dodaj od sześciu do dziewięciu ml świeżego podłoża.Odwiruj komórki o masie 1620 g przez trzy do pięciu minut. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant w celu zebrania osadu. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej.Rozcieńczyć komórki zgodnie z pożądanym stężeniem. Przy 200 mikrolitrach zawiesiny komórkowej o stężeniu 200 000 komórek, wlej ambon do każdej studzienki, aby poszukać 40 000 komórek na studzienkę. Chroń komórki przez 24 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2.Do eksperymentu użyj barwnika Fura-2 AM. Dodaj 50 mikrolitrów DMSO w 50 mikrogramach Fura-2 AM, aby przygotować jeden milimolowy surowy roztwór barwnika Fura-2 AM. Dodać jeden mikrolitr jednego milimolowego barwnika Fura-2 AM na ml świeżej pożywki, aby przygotować podłoże rozcieńczające o stężeniu jednego barwnika mikromolowego.Wyjąć 96-dołkową płytkę z inkubatora i wyrzucić pożywkę. Zastąp pożywkę świeżą pożywką rozcieńczającą. Dodaj 200 mikrolitrów pożywki rozcieńczającej do każdej studzienki.Inkubuj komórki przez 30-40 minut w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2. Podczas inkubacji komórek należy ustawić czytnik płytek. Ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.W ustawieniach wybierz opcję Flex. Ustaw tryb odczytu na fluorescencję i odczyt od dołu. W polu Długości fal ustaw liczbę długości fal na dwa.Ustaw wzbudzenie na 340 nanometrów i 380 nanometrów. Ustaw emisję na 510 nanometrów. Pozostaw czułość na Domyślna.W polu Timing (Pomiar czasu) ustaw interwał na 3,9 sekundy. Ustaw czas wykonywania na 94 sekundy, aby uzyskać 25 liczb odczytów. Następnie wybierz typ płytki testowej.Następnie wybierz studnie do odczytania. W Transferze złożonym ustaw transfery na jeden, a Objętość początkową na sto mikrolitrów. Ustaw wysokość pipety na sto mikrolitrów, objętość na 50 mikrolitrów, a punkt czasu na 36 sekund, aby dodać związek i poprawić odczyt.Następnie wybierz typ blachy źródłowej złożonej. Pozostaw Triturate do nieużywania. Wybierz układ końcówek i końcówek do pipet.W przypadku kolumn złożonych i końcówek związek zostanie przeniesiony w pierwszej kolumnie płyty złożonej. Ustaw kolumnę Porada na jeden, a kolumnę złożoną na jeden. Pozostaw opcję Autokalibracja na Włączone.Kliknij przycisk OK. Po 40 minutach inkubacji usuń pożywkę.Umyj komórki za pomocą bufora XDB. Dodaj sto mikrolitrów bufora XDB do odczytu fluorescencji. Weź płytkę do odczytu fluorescencji.Gdy Pritchett osiągnie 37 stopni Celsjusza, naciśnij komorę odczytu, aby włożyć płytkę testową do czytnika płytek fluorescencyjnych. Naciśnij źródło, aby umieścić płytkę złożoną. Przygotuj płytkę złożoną, dodając 200 mikrolitrów szanowanych peptydów, jonomysyny i EGTA, aby obrócić roztwory X.Naciśnij końcówkę, aby umieścić pudełko na końcówki. Użyj czarnej końcówki, aby uniknąć autofluorescencji końcówki. Po zachowaniu tabliczek i jeśli korzystasz z ustawień oprogramowania i naciśnij Odczyt.Określić stężenie wapnia na podstawie współczynnika fluorescencji za pomocą równania Grynkiewicza. Pokazano dane fluorescencji dobrego peptydu pam. Jak widać, po dodaniu peptydu w 36 sekundzie, fluorescencja w 340 nanometrach, czyli luker wzrasta o 380 nanometrów rekord spada.Dane są reprezentowane jako stosunek 340 do sygnału 380. Pokazują one, że sygnały wzrastają po dodaniu peptydu. Liczba ta jest reprezentatywnymi danymi dla peptydu aktywującego.Rysunek A przedstawia sygnały fluorescencyjne dla peptydu aktywującego. Dane reprezentatywne odpowiadające peptydowi cram12 zostały dodane po utworzeniu linii bazowej dla cykli przetargowych, jak pokazano w ado. Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu na długości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu na długości 380 nanometrów.Ta liczba jest danymi reprezentatywnymi dla ślepej próby. Rysunek A przedstawia sygnały fluorescencyjne dla ślepej próby. HTB dodano po rozcieńczeniu linii bazowej przez 10 cykli karmienia, jak pokazano w ado.Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 380 nanometrów. Liczba ta jest reprezentatywnymi danymi dla wzorców do kalibracji barwników. Rysunek A pokazuje, że jonomycyna została dodana przy 10. odczycie, jak pokazano w ado, aby uzyskać maksymalną fluorescencję w stanie związanym z kaszem.EGPA Triton X hundred został dodany po 20 odczytach, jak pokazano przez ado, którzy otrzymują minimalny sygnał. Rysunek B przedstawia stosunek emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 340 nanometrów do emisji fluorescencji po wzbudzeniu w odległości 380 nanometrów. Wartości te są następnie umieszczane w równaniu Grynkiewicza, aby uzyskać wewnątrzkomórkową pamięć podręczną stężenia.Rysunek ten przedstawia charakterystykę reprezentatywnego peptydu w celu potwierdzenia sekwencji i czystości. Rysunek A przedstawia pionową masę reprezentatywnej sekwencji peptydowej WNK WAL wynoszącą 857,90 rozcieńczenia barwnika. Co pokazuje stosunek N do Zed w spektroskopii mas.Rysunek B przedstawia czystość peptydu na poziomie 99%, potwierdzoną przez HPLC. Peptyd ten należy do biblioteki peptydów skróconych N + C. Podsumowując, opisana tutaj metoda jest łatwa i wszechstronna, która może być skuteczna i jasna w przypadku badań przesiewowych na bazie wapnia w ostatniej skali.Istnieje jednak kilka czynników, które decydują o jakości danych, a co za tym idzie, skład musi być zoptymalizowany dla danego systemu instrumentów komórkowych. Dziękuję.

screening-peptides-that-activate-mrgprx2-using-engineered-hek-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy wykorzystujemy ludzką bibliotekę pulową LentiPlex oraz tradycyjne metody sekwencjonowania w celu identyfikacji genów docelowych sprzyjających przeżyciu komórek. Przedstawiamy sposób przygotowania i dekonwolucji screeningu LentiPlex oraz walidacji uzyskanych wyników.

Przesiewanie biblioteki połączonej shRNA MISSION LentiPlex w komórkach ssaków

Zmodyfikowaliśmy konwencjonalny screening dwuhybrydowy drożdżowy, który jest skutecznym narzędziem genetycznym w identyfikacji oddziaływań białkowych. Modyfikacja ta znacznie skraca cały proces, zmniejsza nakład pracy i, co najważniejsze, redukuje liczbę wyników fałszywie dodatnich. Ponadto podejście to jest powtarzalne i wiarygodne.

Zmodyfikowany system dwuhybrydowy drożdżowy do identyfikacji białek oddziałujących z czynnikiem wzrostu progranuliną

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

Przedstawiono łatwy test fluorescencyjny w celu oceny skuteczności par syntetazy amino-acyl-tRNA/tRNA zawierających niekanoniczne aminokwasy (ncAA) do białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków. Opisano zastosowanie ncAA do badania receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), w tym fotosieciowanie miejsc wiązania i bioortogonalne znakowanie GPCR na żywych komórkach.

Optymalizacja genetycznego włączenia sond chemicznych do GPCR w celu mapowania fotosieciowania i chemii bioortogonalnej w żywych komórkach ssaków

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania przesiewowego małych peptydów, które wiążą się z FGFR2, przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi. Dalej analizujemy powinowactwo wybranych peptydów do FGFR2 in vitro i jego zdolność do hamowania proliferacji komórek.

Badania przesiewowe i identyfikacja małych peptydów ukierunkowanych na receptor czynnika wzrostu fibroblastów2 przy użyciu biblioteki peptydów wyświetlających fagi

Ten raport opisuje badanie przesiewowe różnych detergentów do przygotowania wizualnego GPCR, rodopsyny i jej kompleksu z mini-Go. Przedstawiono metody biochemiczne charakteryzujące jakość kompleksu na różnych etapach oczyszczania. Protokół ten można uogólnić na inne kompleksy białek błonowych dla ich przyszłych badań strukturalnych.

Strategiczne badania przesiewowe i charakterystyka wizualnego kompleksu sygnalizacji białkowej GPCR-mini-G w celu pomyślnej krystalizacji

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

W tej pracy opisano wysokoprzepustowy, wewnątrzkomórkowy test fluorescencji wapnia dla 384-dołkowych płytek do badania bibliotek małych cząsteczek na rekombinowanych receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR). Cel, receptor kininowy kleszcza pomoru bydła, Rhipicephalus microplus, ulega ekspresji w komórkach CHO-K1. Ten test identyfikuje agonistów i antagonistów przy użyciu tych samych komórek w jednym teście "podwójnej addycji".

Test fluorescencji wapnia z "podwójnym dodaniem" do wysokoprzepustowych badań przesiewowych rekombinowanych receptorów sprzężonych z białkiem G

Poznaj metodę przesiewu biblioteki peptydów aktywujących receptor MRGPRX2 przy użyciu zmodyfikowanych komórek HEK293 z zastosowaniem barwnika Fura-2 AM.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Przeglądaj więcej filmów