Name: Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania wielu enzymów przy użyciu uniwersalnego systemu genetycznego z GFP. Technika ta umożliwia identyfikację lipaz, celulaz i fosfataz alkalicznych w inżynierii enzymów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 oraz KRIBB Research Initiative Program.

1. Przygotowanie biblioteki metagenomicznej za pomocą pNP-GESS
<ol>
	<li>Skonstruuj bibliotekę metagenomiczną w E. coli z wektorem fosmidowym przy użyciu zestawu produkcyjnego biblioteki fosmid zgodnie z protokołem producenta 5.</li>
	<li>Podwielokrotność 100 μl biblioteki do przechowywania w temperaturze -70 °C, która jest źródłem komórek biblioteki metagenomicznej. 
	Uwaga: Gęstość optyczna próbki mierzonej na długości fali 600 nm (OD600) tego zasobu bibliotecznego wynosi około 100.</li>
	<li>Rozmrozić 100 μl podstawowej biblioteki metagenomicznej na lodzie i zaszczepić w kolbie o pojemności 500 ml zawierającej 50 ml Luria-Bertani (LB) i 12,5 μg/ml chloramfenikolu, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
	<li>Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić szybko osad w 50 ml lodowatej wody destylowanej (DW) i ponownie odwirować przy 1.000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl lodowatego DW z 10% (v/v) glicerolem. Do elektroporacji należy użyć 50 μl tej podwielokrotności ogniwa.</li>
	<li>Umieścić mieszaninę elektrokompetentnych komórek 50 μl i pGESS(E135K)5 DNA (100ng) w lodowatej kuwecie do elektroporacji i elektroporować (1,8 kV/cm, 25 μF) mieszaninę.</li>
	<li>Szybko dodaj 1 ml super optymalnego bulionu z pożywką do represji katabolitycznej (SOC) i delikatnie zawieś komórki.</li>
	<li>Przenieść komórki do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Rozprowadzić 500 μl odzyskanych komórek na kwadratowej płytce LB 20 x 20 cm zawierającej 12,5 μg/ml chloramfenikolu i 50 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę w temperaturze 30 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Zeskrob kolonie za pomocą skrobaka do komórek i zbierz komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą lodowatego podłoża do przechowywania komórek.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 10 ml lodowatego podłoża do przechowywania komórek, aby osiągnąć OD600 100.</li>
	<li>Podwielokrotność 20 μl komórek do przechowywania w temperaturze -70 °C.</li>
</ol>
2. Usuwanie fałszywych alarmów z biblioteki metagenomicznej
<ol>
	<li>Rozmrozić podstawowe komórki biblioteki metagenomicznej (z kroku 1.13) zawierające metagenomiczne DNA fosmid i pGESS(E135K) na lodzie.</li>
	<li>Zaszczepić 10 μl komórek w 2 ml LB zawierającym 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w 14-mililitrowej probówce okrągłodennej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 4 godziny.</li>
	<li>W międzyczasie włącz komputer FACS i otwórz domyślne oprogramowanie FACS. Użyj następujących ustawień: średnica końcówki dyszy, 70 μm; Czułość FSC-A (Forward Scatter Area), wzmocnienie logarytmiczne 300 V; Czułość bocznego obszaru rozproszenia (SSC-A), wzmocnienie logarytmiczne 350 V; Czułość obszaru izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC-A), amplifikacja logarytmiczna 450 V; parametr progowy, wartość FSC-A 5, 
	Uwaga: Typowe ustawienia są podane dla urządzenia FACS wymienionego w Tabeli materiałów. Dostosuj ustawienia dla innych urządzeń FACS.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki biblioteki metagenomicznej z kroku 2.2, dodając 5 μl próbki do 5-mililitrowej probówki z okrągłym dnem zawierającej 1 ml PBS.</li>
	<li>Umieść rozcieńczoną próbkę biblioteki w porcie ładowania instrumentu FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS.</li>
	<li>Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 1 500 zdarzeń na sekundę, klikając i kontrolując przyciski Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.</li>
	<li>Utwórz wykres punktowy SSC-A skalowany logarytmicznie i SSC-A skalowany logarytmicznie w arkuszu globalnym, klikając przycisk Wykres punktowy na pasku narzędzi. Dostosuj bramkę punktową R1, aby objąć zdarzenia singlet (populację bakterii) za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi.</li>
	<li>Narysuj histogram z liczbą komórek w porównaniu ze skalą logarytmiczną FITC-A w arkuszu, klikając przycisk Histogram. Następnie dostosuj napięcie FITC z zakładki Ustawienia cytometru w oknie Inspector Control tak, aby szczyt rozkładu w kształcie dzwonu był mniejszy niż 102 FITC-A.</li>
	<li>Utwórz wykres FSC-A skalowany logarytmicznie w stosunku do wykresu logarytmicznego FITC-A, klikając przycisk Wykres punktowy w arkuszu globalnym. Ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi tak, aby bramka znajdowała się między komórkami od +5% do -5% od środka rozkładu (łącznie 10% komórek wokół szczytu krzywej w kształcie dzwonu).</li>
	<li>Umieścić probówkę zbiorczą zawierającą 1,2 ml LB zawierającą 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu na wylocie przyrządu FACS i posortować 106 komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2.</li>
	<li>Zdejmij probówkę zbiorczą, nakrętkę i delikatnie odwiruj.</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe enzymów metagenomicznych
<ol>
	<li>Inkubować posortowane komórki (od etapu 2.11) w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,5.</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu indukującego kopiowanie, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidu. Inkubować komórki przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
	<li>Aby przygotować komórki do sortowania, dodać 0,5 ml hodowanych komórek i odpowiedni substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd lub fosforan fenylu) do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej o końcowym stężeniu 100 μM.
	<ol>
		<li>W przypadku próbki kontrolnej dodać 0,5 ml hodowanych komórek z kroku 3.2 do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej. Dodaj tę samą objętość PBS, co objętość substratu w kroku 3.3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować obie próbki w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min przez 3 godziny.</li>
	<li>W międzyczasie przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami, co w kroku 2.3.</li>
	<li>Dodać 5 μl komórek (do sortowania) i komórek kontrolnych do dwóch probówek okrągłodennych o pojemności 5 ml zawierających odpowiednio 1 ml PBS.</li>
	<li>Umieść rurkę zawierającą komórki kontrolne w porcie ładowania FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę, kontrolując przyciski natężenia przepływu na pulpicie nawigacyjnym.</li>
	<li>Utwórz wykres punktowy SSC-A skalowany logarytmicznie i logarytmicznie skalowany SSC-A, klikając przycisk Dot Plot w globalnym arkuszu oprogramowania i dostosuj bramkę punktową R1, aby objąć zdarzenia singlet (populację bakterii) za pomocą przycisku Polygon Gate na pasku narzędzi.</li>
	<li>Utwórz wykres punktowy FITC-A w skali logarytmicznej i logarytmicznej FITC-A, klikając przycisk Wykres punktowy w arkuszu roboczym i ustaw bramkę sortowania R2 na wykresie za pomocą przycisku Bramka wielokątna na pasku narzędzi, tak aby mniej niż 0,1% komórek ujemnych zostało wykrytych w bramce R2.</li>
	<li>Zastąp probówkę do pobierania próbek kontrolnych probówką do sortowania próbek i dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę, kontrolując przyciski natężenia przepływu na desce rozdzielczej.</li>
	<li>Umieścić probówkę zbiorczą zawierającą 0,5 ml LB na wylocie przyrządu FACS i posortować 104 komórek spełniających zarówno bramki R1, jak i R2. 
	Uwaga: Kryterium sortowania może wynosić od 0,1% do 5% FITC-A w bramce R2. W tym protokole górny 1% komórek zebrano jako dodatnie.</li>
	<li>Zdejmij probówkę zbiorczą, nakrętkę i delikatnie odwiruj.</li>
	<li>Pobrane próbki o wielkości 0,5 ml rozprowadzić na dwóch płytkach agarowych (szalki Petriego o średnicy 90 mm) zawierających LB, 50 μg/ml ampicyliny, 12,5 μg/ml chloramfenikolu i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>W razie potrzeby wykonaj dodatkowe rundy sortowania w celu wzbogacenia FITC-A, powtarzając kroki 3.1-3.14.</li>
</ol>
4. Wybór trafień i potwierdzenie aktywności enzymu
<ol>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Z inkubowanej płytki w kroku 3.14 wybierz kolonię niewykazującą fluorescencji za pomocą selektora kolonii pod obserwacją długości fali 488 nm oświetlacza LED.</li>
		<li>Zaszczepić wybraną kolonię w 14-mililitrowej probówce okrągłodennej zawierającej 2 ml LB zawierającej 50 μg/ml ampicyliny i 12,5 μg/ml chloramfenikolu w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min, aż jej OD600 osiągnie 0,5.</li>
		<li>Dodać 2 μl roztworu indukcji kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidu. Inkubować komórki przez dodatkowe 3 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.</li>
		<li>Przygotować probówkę okrągłodenną o pojemności 14 ml i dodać 1 ml hodowanych komórek (etap 4.1.3). Dodać odpowiedni substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd lub fosforan fenylu) o końcowym stężeniu 100 μM. 
		<ol>
			<li>Dla kontroli, dodać 1 ml hodowanych komórek z kroku 4.1.3 do 14 ml probówki okrągłodennej i dodać taką samą objętość PBS, jak objętość substratu w kroku 4.1.4.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować obie próbki w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 200 obr./min przez 3 godziny.</li>
		<li>W międzyczasie przygotuj maszynę FACS z tymi samymi konfiguracjami, co w kroku 2.3.</li>
		<li>Dodać 5 μl komórek kontrolnych i komórek poddanych działaniu substratu do 5 ml probówek okrągłodennych zawierających odpowiednio 1 ml PBS.</li>
		<li>Umieść rurkę zawierającą komórki kontrolne w porcie ładowania urządzenia FACS i kliknij przycisk Załaduj na pulpicie nawigacyjnym akwizycji oprogramowania FACS. Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę za pomocą przycisków Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.</li>
		<li>Kliknij przycisk Akwizycja, aby zmierzyć FITC-A.</li>
		<li>Zastąp probówkę z próbką kontrolną probówką z próbką poddaną działaniu substratu. Dostosuj szybkość zdarzeń do 1 000 - 3 000 zdarzeń na sekundę za pomocą przycisków Natężenie przepływu na pulpicie nawigacyjnym.</li>
		<li>Kliknij przycisk Akwizycja, aby zmierzyć FITC-A.</li>
		<li>Porównaj fluorescencję dwóch grup komórek, wykreślając histogram liczby komórek w porównaniu z logarytmicznie skalowanym FITC-A.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inne testy potwierdzające aktywność enzymu
	<ol>
		<li>W celu dalszej identyfikacji wybranych kandydatów na enzymy, należy wyekstrahować fosmidowe DNA przy użyciu standardowych procedur ekstrakcji z dostępnych na rynku zestawów ekstrakcyjnych i przeanalizować sekwencję nukleotydów lub przetestować aktywność enzymu in vitro 6,7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+screening+methods-biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li>
<li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li>
<li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li>
<li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40(2012).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li>
<li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li>
<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li>
<li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts%3A+application+and+engineering+for+industrial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Crc.+Cr.+Rev.+Biotechn%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li>
<li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-induced+gene+expression%2C+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li>
<li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+bio-transformations+with+%C3%A0+la+carte+genetic+traps%3A+translating+dehydrochlorination+of+lindane+%28gamma-hexachlorocyclohexane%29+into+lacZ-based+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li>
<li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li>
<li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zwiększenie wydajności produkcji biokatalizatorów jest kluczem do sukcesu przemysłu opartego na biochemii9 , a metagenom jest uważany za jedno z najlepszych naturalnych źródeł enzymów. W tym sensie niezbędne jest badanie przesiewowe nowych enzymów z metagenomu, w którym większość zasobów genetycznych nie została zbadana10. Opracowano kilka metod badań przesiewowych, które bezpośrednio wykrywają produkty enzymatyczne za pomocą aktywatorów transkrypcji11, 12 , ale techniki te wymagają specy...

Niedawno opracowana technika wysokoprzepustowego testu jednokomórkowego pozwala na badanie przesiewowe nowych enzymów z dużej biblioteki genetycznej na podstawie ich aktywności funkcjonalnej1. Na poziomie pojedynczej komórki białka regulujące transkrypcję są wykorzystywane do wyzwalania ekspresji genu reporterowego poprzez wykrywanie małych cząsteczek, które są wytwarzane w wyniku aktywności docelowego enzymu. Jedno z wczesnych podejść polegało na wyizolowaniu operonu rozkładającego fenole z Ralstonia eutropha E2 przy użyciu metody przesiewowej ekspresji genetycznej indukowanej substratem (SIGEX), w której substrat indukuje ekspresję białka reporterowego2. NhaR Pseudomonas putida wykorzystano do wyselekcjonowania dehydrogenazy benzaldehydowej3, a LysG z Corynebacterium glutamicum wykorzystano do wysokoprzepustowych badań przesiewowych nowego szczepu wytwarzającego L-lizynę z różnych zmutowanych bibliotek4.
Poprzednio, system badań przesiewowych enzymów genetycznych (GESS) był proponowany jako ogólnie stosowana platforma przesiewowa5. System ten wykorzystuje regulator dimetylofenolu rozpoznający fenole, DmpR, P. putida. DmpR(E135K) i mutant DmpR mogą być również stosowane w GESS (pNP-GESS) do wykrywania p-nitrofenolu (pNP). W obecności docelowych enzymów wytwarzających związki fenolowe, GESS w komórkach E. coli emituje sygnał fluorescencyjny, umożliwiając szybką izolację pojedynczych komórek za pomocą aktywowanego fluorescencją sortera komórek (FACS). Ale ekspresja enzymu metagenomicznego wydaje się być słabsza niż w przypadku konwencjonalnych enzymów rekombinowanych; W związku z tym GESS zaprojektowano do wykrywania związków fenolowych z maksymalną czułością poprzez badanie kombinacji rybosomalnego miejsca wiązania (RBS) i sekwencji terminatora wraz z optymalnymi warunkami pracy5.
Jedną z podstawowych zalet GESS jest to, że ta pojedyncza metoda teoretycznie pozwala na badanie przesiewowe ponad 200 różnych typów enzymów w bazie danych BRENDA (Tabela 1, http:// www.brenda-enzymes.info, 2013.7) poprzez proste zastosowanie różnych substratów. Wykazano, że celulazę, lipazę i hydrolazę parationu metylowego (MPH) można wykryć za pomocą pNP-GESS z odpowiednimi substratami odpowiednio p-nitrofenylomaślanu, p-nitrofenylo-cellotriozydu i parationu metylowego5. Niedawno udowodniono, że fosfataza alkaliczna (AP), która jest jednym z nowych enzymów zidentyfikowanych za pomocą pNP-GESS, jest pierwszym termolabilnym AP znalezionym w metagenomach morskich przystosowanych do zimna6.
Tutaj przedstawiono szczegóły procesu przesiewowego, w którym pNP-GESS wykrywa aktywność trzech różnych typów enzymów - lipazy, celulazy i fosfatazy alkalicznej - i szybko identyfikuje nowe enzymy kandydujące z biblioteki metagenomicznej5,6. Procesy obejmują wstępne przetwarzanie metagenomu za pomocą pNP-GESS oraz obsługę sortera cytometrii przepływowej. Podczas gdy uzyskane trafienia będą musiały zostać zsekwencjonowane w celu dalszej identyfikacji, protokół ten obejmuje procedurę aż do etapów potwierdzania aktywności enzymu za pomocą cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>Zestaw produkcyjny biblioteki CopyControl</td><td></td><td>Epicentre CCFOS110</td><td>Fosmid&nbsp;</td></tr><tr><td>Rozwiązanie indukcyjne CopyControl</td><td>Epicentrum</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid Rozwiązanie do indukcji kopiowania</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentrum</td><td>EC300110</td><td>Elektrokompetentna</td></tr><tr><td>komórka pCC1FOS</td><td>Epicentrum</td><td>CCFOS110</td><td>wektor Fosmid</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Kuweta i system elektroporacji</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Cytometria przepływowa (maszyna FACS)</td></tr><tr>Mikroskop <td>Nikon</td><td></td> <td>AZ100M</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&nbsp;</td><td>Oświetlacz Maestrogen</td><td></td><td></td> LED</tr><tr><td>50-ml tuba stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml tuba okrągłodenna&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml probówka okrągłodenna</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenyl fosforan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Podłoże</td></tr><tr><td>p-nitrofenyl &beta;-D-celobiozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Podłoże</td></tr><tr><td>p-butylan nitrofenylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& nbsp;</td><td>substrat</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Trypton 10 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L, Chlorek sodu 10 g/L</td></tr><tr><td>Super Optimal Rosół (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Trypton 20 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L, Chlorek sodu 0,5 g/L, Siarczan magnezu 2,4 g/L, Chlorek potasu 186 mg/L</td></tr><tr><td>Super Optymalny bulion z represją katabolitu (SOC)</td><td></td><td>SOB, 0,4 % glukozy</td><td></td></tr><tr><td>2x Ekstrakt drożdżowy Trypton (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Trawienie kazeiny przez trzustkę 16 g/L, Ekstrakt drożdżowy 10 g/L, Ekstrakt drożdżowy 5 g/L</td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td> do przechowywania komórek <td>2x bulion YT, 15% Glicerol, 2% Glukoza</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>Wektor DNA zawierający geny dmpR, egfp wraz z odpowiednimi promotorami, RBS i terminator. Zobacz odnośnik 5 w manuskrypcie, aby uzyskać informacje Więcej szczegółów.</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Cytometria przepływowa Wersja oprogramowania 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

Niedawny rozwój techniki wysokoprzepustowego testu jednokomórkowego umożliwia badanie przesiewowe nowych enzymów w oparciu o funkcjonalne działania z dużej biblioteki metagenomicznej1. Wcześniej zaproponowaliśmy system badań przesiewowych enzymów genetycznych (GESS), który wykorzystuje regulator dimetylofenolu aktywowany przez fenol lub p-nitrofenol. Ponieważ ogromna liczba naturalnych reakcji enzymatycznych wytwarza te związki fenolowe z substratów pochodzących z fenolu, ten pojedynczy genetyczny system przesiewowy może być teoretycznie zastosowany do badań przesiewowych ponad 200 różnych enzymów w bazie danych BRENDA. Pomimo ogólnego zastosowania GESS, zastosowanie procesu przesiewowego wymaga określonej procedury w celu osiągnięcia maksymalnych sygnałów cytometrii przepływowej. W tym miejscu szczegółowo opisujemy opracowany proces badań przesiewowych, który obejmuje wstępne przetwarzanie metagenomu za pomocą GESS oraz działanie sortera cytometrii przepływowej. Trzy różne substraty fenolowe (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu) z GESS wykorzystano do badań przesiewowych i identyfikacji trzech różnych enzymów (odpowiednio lipazy, celulazy i fosfatazy alkalicznej). Wybrane aktywności enzymów metagenomicznych potwierdzono jedynie za pomocą cytometrii przepływowej, ale sekwencjonowanie DNA i różnorodne analizy in vitro mogą być wykorzystane do dalszej identyfikacji genów.

Trzy substraty fenolowe zostały poddane badaniu w celu zidentyfikowania nowych enzymów metagenomicznych z biblioteki metagenomicznej osadów z płycizn pływowych w Taean, Korea Południowa, zgodnie z proponowanym protokołem. Do konstrukcji biblioteki sekwencje metagenomiczne o średniej długości 30 - 40 kb wstawiono do fosmidów, które opierają się na replikonie czynnika F E. coli i występują w komórce jako pojedyncza kopia. Należy odnotować, że fosmidy są powszechnie stosowane do two...

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest ocena wielu enzymów przy użyciu jednego systemu wysokoprzepustowego przesiewania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikroorganizmów i bioinżynierii dotyczące przesiewania metagenomicznego oraz inżynierii enzymatycznej. Opracowaliśmy genetyczny system przesiewania enzymów, który składa się z mutanta MPL reagującego na związek fenylowy oraz powiązanego z nim reportera GFP.Gdy jakikolwiek gen metagenomiczny wykaże interesującą nas aktywność enzymatyczną poprzez reakcję z dostarczonym substratem, związek fenylowy będący produktem reakcji aktywuje mutant Dmp i wyzwala ekspresję reportera GFP, którą można łatwo zarejestrować za pomocą fluorometru. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych metod przesiewowych, ta jedna metoda pozwala na screening wielu różnych typów enzymów poprzez zastosowanie odpowiedniego substratu. Procedurę tę zaprezentuje Kil Koang Kwon, doktorant w naszym laboratorium.Po skonstruowaniu biblioteki metagenomicznej w E.Coli z użyciem wektora fosmidowego oraz zestawu do produkcji bibliotek fosmidowych, wprowadź DNA pGESS(E135K) do komórek biblioteki metagenomicznej. Następnie przechowuj przetransformowane komórki biblioteki w temperaturze -70°C w alikwotach po 20 µL. Aby usunąć wyniki fałszywie dodatnie, najpierw rozmroź alikwot komórek biblioteki metagenomicznej na lodzie.Następnie zaszczep dziesięć µL rozmrożonych komórek w dwóch mL bulionu lysogenate zawierającego ampicylinę i chloramfenikol w 14 mL probówce z okrągłym dnem w temperaturze 37 °C i przy 200 RPM przez cztery godziny. W międzyczasie ustaw w domyślnym oprogramowaniu FACS odpowiednie parametry urządzenia FACS do odczytu komórek biblioteki metagenomicznej. Po zakończeniu inkubacji przenieś pięć µL komórek do jednego mL PBS w 5 mL probówce z okrągłym dnem.Następnie należy załadować rozcieńczoną próbkę biblioteki i ustawić szybkość rejestracji zdarzeń na 1000 do 1500 zdarzeń na sekundę. Aby wygenerować na arkuszu Global Worksheet wykres kropkowy (scatter plot) przedstawiający logarytmiczną skalę powierzchni rozproszenia przedniego (forward scatter area) względem logarytmicznej skali powierzchni rozproszenia bocznego (side scattered area), należy utworzyć dot-plot i wyznaczyć bramkę wielokąta (polygon gate) wokół zdarzeń pojedynczych (singlet events) zawierających populację bakterii. Aby wykreślić histogram liczby komórek względem logarytmicznej skali powierzchni FITC (FITC-area), należy otworzyć histogram i dostosować napięcie dla kanału FITC w taki sposób, aby szczyt rozkładu dzwonowatego znajdował się poniżej wartości 10² dla FITC-area.Następnie otwórz kolejny wykres kropkowy, aby utworzyć wykres logarytmicznej powierzchni rozproszenia przedniego w funkcji logarytmicznej powierzchni FITC, i ustaw bramkę sortowania R2 obejmującą od plus pięciu do minus pięciu procent komórek względem centrum rozkładu. Po ustawieniu wszystkich bramek umieść probówkę zbiorczą zawierającą 1,2 milliliters pożywki lysogenate z dodatkiem antybiotyku przy wylocie instrumentu FACS i posortuj 1 × 10⁶ wybranych komórek do pożywki. Po zakończeniu sortowania zamknij probówkę zbiorczą i delikatnie wymieszaj komórki w wortexie.Aby przeprowadzić przesiew enzymów metagenomicznych, inkubuj posortowane komórki w temperaturze 37°C przy 200 RPM, aż OD600 osiągnie wartość 0,5, a następnie dodaj jeden µL roztworu indukującego kopiowanie w celu zwiększenia wewnątrzkomórkowej liczby kopii fosmidów. Po trzech godzinach w temperaturze 37°C przy 250 RPM połącz 0,5 mL komórek z odpowiednim substratem w probówce o dnie okrągłym o pojemności 14 mL, tak aby uzyskać końcowe stężenie 100 µM. Następnie inkubuj próbki kontrolne i eksperymentalne w temperaturze 37°C przy 200 RPM przez kolejne trzy godziny.Podczas wstrząsania próbek ustaw parametry urządzenia FACS zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie dodaj pięć mikrolitrów komórek z każdej próbki do oddzielnych probówek o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów zawierających jeden mililitr PBS. Następnie załaduj komórki z próbek i ustaw częstotliwość zdarzeń na 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.Utwórz wykres punktowy obszaru rozproszenia przedniego (forward scatter area) względem obszaru rozproszenia bocznego (side scatter area) w skali logarytmicznej i dostosuj bramkę R1 tak, aby objęła zdarzenia pojedynczych komórek bakteryjnych. Następnie utwórz wykres punktowy rozproszenia przedniego względem obszaru FITC w skali logarytmicznej i ustaw bramkę sortowania R2 w taki sposób, aby wykryto mniej niż 0,1% komórek negatywnych. Następnie wgraj probówkę z próbką i w razie potrzeby ponownie dostosuj szybkość rejestracji zdarzeń do poziomu od 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.Następnie umieść probówkę odbiorczą zawierającą 0,5 ml pożywki lysogenate przy wylocie analizatora FACS i zbierz 1×10⁴ komórek z bramek R1 i R2. Po wyizolowaniu wszystkich komórek zakręć probówkę odbiorczą i delikatnie wymieszaj komórki na wortexie. Następnie rozsiej 0,5 ml zebranych próbek na dwie 90 mm płytki z agarem zawierającym pożywkę lysogenate z dodatkiem antybiotyków, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C.Na tej rycinie przedstawiono zastosowany protokół przesiewowy, obejmujący usuwanie wyników fałszywie dodatnich poprzez sortowanie negatywne oraz wybór pozytywnych hitów przy użyciu bramek sortujących R1 i R2. Hity mogą być następnie oceniane poprzez porównanie fluorescencji próbek z dodatkiem substratu i bez niego. W tym reprezentatywnym przesiewie z użyciem p-nitrofenylooctanu fluorescencja komórek traktowanych substratem była wyższa niż w przypadku komórek kontrolnych, co pozwoliło na potwierdzenie pięciu kandydatów na lipazę w tym eksperymencie.Mimo szerokiego rozkładu tych trzech kandydatów celulozowych, obserwuje się wyraźne różnice w średniej intensywności sygnału FITC w poszczególnych populacjach. Te cztery kandydatki na fosfatazy wykazują również wysoki poziom fluorescencji w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Co więcej, aktywność fosfatazy alkalicznej wektorów z wstawionym orf może zostać potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej, przy czym dla enzymu wybranego jako hit zaobserwowano silniejszy sygnał fluorescencji niż w przypadku komórek niosących pusty plazmid.Ważne jest, aby pamiętać, że technikę tę można zastosować do przesiewania szerokiego zakresu enzymów poprzez wybór odpowiedniego substratu i stężenia w stosunku. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie następnej generacji, aby w sposób wysokoprzepustowy odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące identyfikacji i charakterystyki kandydowanego enzymu. Po opracowaniu, ta wysokoprzepustowa technika przesiewania enzymów utorowała drogę badaczom w dziedzinie inżynierii enzymatycznej do badania różnych enzymów metagenomicznych bez konieczności znajomości specyficzności enzymu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak korzystać z systemu wysokoprzepustowego przesiewu opartego na obwodach metogennych w odniesieniu do szerokiej gamy enzymów docelowych.

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

W tym filmie demonstrujemy wysokoprzepustowy test do badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanowo przy użyciu nierozpuszczalnych chromogennych substratów polimerowo-hydrożelowych. Enzym rozkłada te substraty do rozpuszczalnego kolorowego produktu, który można określić ilościowo, mierząc intensywność koloru produktu.

Test przesiewowy enzymów na bazie hydrożelu polimerowego chromogenicznego: wysokoprzepustowa metoda badania przesiewowego enzymów aktywnych węglowodanami przy użyciu substratów syntetycznych

Prezentujemy szybką i tanią metodę przesiewową do identyfikacji regulatorów transkrypcji za pomocą wysokoprzepustowych transfekcji robotycznych i domowego testu lucyferazy o podwójnym świeceniu.  Protokół ten szybko generuje bezpośrednie dane funkcjonalne dla tysięcy genów i można go łatwo modyfikować w celu ukierunkowania na dowolny gen będący przedmiotem zainteresowania.

Wysokoprzepustowe funkcjonalne badania przesiewowe przy użyciu domowego testu lucyferazy o podwójnym blasku

Tutaj opisujemy komórkowy test genu reporterowego jako cenne narzędzie do badania bibliotek chemicznych pod kątem związków modulujących mechanizmy kontroli potranskrypcyjnej wywieranej przez 3' UTR.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem chemicznych modulatorów genów regulowanych potranskrypcyjnie

Fosforylacja białek jest główną cechą tego, jak komórki interpretują i reagują na informacje w swoim środowisku zewnątrzkomórkowym. W tym miejscu przedstawiamy wysokoprzepustowy protokół badań przesiewowych wykorzystujący kinazy oczyszczone z komórek ssaków w celu szybkiej identyfikacji kinaz, które fosforylują substrat (substraty) będący przedmiotem zainteresowania.

Identyfikacja par kinaza-substrat za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Opisano procedurę hodowli w środowisku ciekłym oraz rozdziału szczepów C. elegans wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek reporterowych, która nie wymaga użycia kosztownego sprzętu do sortowania. Podejście to można zastosować w przypadku licznych indukowalnych genów C. elegans w celu odkrywania leków lub biosensingu zanieczyszczeń.

Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

Poznaj metodę wysokoprzepustowego przesiewania wielu enzymów przy użyciu uniwersalnego systemu genetycznego z GFP. Technika ta umożliwia identyfikację lipaz, celulaz i fosfataz alkalicznych w inżynierii enzymów.

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Przeglądaj więcej filmów