Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych
August 8th, 2016
Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).
Ogólnym celem tej metodologii jest ocena wielu enzymów przy użyciu jednego systemu badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikroorganizmów i bioinżynierii dotyczące metagenomicznych badań przesiewowych i inżynierii enzymatycznej. Opracowaliśmy system badań przesiewowych enzymów genetycznych, który składa się z mutanta MPL reagującego na związek fenylenu i jego dalszego reportera GFP.
Gdy dowolny gen metagenomiczny wykaże aktywność enzymatyczną, która nas interesuje, reagując z dostarczonym substratem, związek fenylenu produktu reakcji aktywuje mutanta Dmp i wyzwala ekspresję reporterową GFP, którą można łatwo wychwycić za pomocą miernika fluorescencji. Główną zaletą tej techniki jest to, że w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik przesiewowych, ta pojedyncza metoda ma zastosowanie do badań przesiewowych wielu rodzajów różnych enzymów przy użyciu odpowiedniego substratu. Tę procedurę zademonstruje Kil Koang Kwon, doktorant w naszym laboratorium.
Po skonstruowaniu biblioteki metagenomicznej w E.Coli z wektorem fosmidowym przy użyciu zestawu do produkcji biblioteki fosmid, przetransportuj DNA pGESS(E135K) do komórek biblioteki metagenomicznej. Następnie przechowuj przekształcone komórki biblioteczne w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza i 20 mikrolitrowych porcjach. Aby usunąć wyniki fałszywie dodatnie, najpierw rozmrozić podwielokrotność komórki biblioteki metagenomicznej na lodzie.
Następnie zaszczepij dziesięć mikrolitrów rozmrożonych komórek w dwóch mililitrach bulionu lizogenianowego zawierającego ampicylinę i chloramfenikol w 14-mililitrowej probówce z okrągłym dnem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez cztery godziny. W międzyczasie ustaw odpowiednie parametry na maszynie FACS do odczytu komórek biblioteki metagenomicznej w domyślnym oprogramowaniu FACS. Pod koniec inkubacji przenieś pięć mikrolitrów komórek do jednego mililitra PBS w pięciomililitrowej probówce z okrągłym dnem.
Następnie załaduj rozcieńczoną próbkę biblioteki i dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1000 do 1500 zdarzeń na sekundę. Aby wygenerować przesunięty do przodu obszar punktowy w skali logarytmicznej i wykres punktowy obszaru rozproszonego po stronie w skali logarytmicznej w arkuszu globalnym, utwórz wykres kropkowy i narysuj bramkę wielokątną wokół zdarzeń singletowych zawierających populację bakterii. Aby wykreślić liczbę komórek w porównaniu z histogramem obszaru FITC w skali logarytmicznej, otwórz histogram i dostosuj napięcie FITC tak, aby szczyt rozkładu w kształcie dzwonu był mniejszy niż dziesięć do dwóch w obszarze FITC.
Następnie otwórz kolejny wykres punktowy, aby utworzyć przeskalowany do przodu obszar punktowy w porównaniu z wykresem obszaru logarytmu FITC i ustaw bramkę sortowania R2 między plus pięć a minus pięć procent komórek od środka rozkładu. Po ustawieniu wszystkich bramek umieść probówkę zawierającą 1,2 mililitra bulionu lizogenowego uzupełnionego antybiotykiem na wylocie instrumentu FACS i posortuj jeden razy dziesięć do szóstej bramkowanych komórek do bulionu. Pod koniec sortowania zakryj probówkę zbiorczą i delikatnie wymieszaj komórki.
Aby przebadać interesujące enzymy metagenomiczne, inkubuj posortowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min, aż OD600 osiągnie 0,5, a następnie dodaj jeden mikrolitr roztworu indukcji kopiowania, aby wzmocnić wewnątrzkomórkową liczbę kopii fosmidu. Po trzech godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 250 obr./min połącz 0,5 mililitra komórek z odpowiednim substratem w 14-mililitrowej probówce okrągłodennej do końcowego stężenia 100 mikromolowego. Następnie inkubować próbki kontrolne i doświadczalne w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min przez kolejne trzy godziny.
Podczas drżenia próbek ustaw parametry maszyny FACS, jak pokazano poniżej. Następnie dodaj pięć mikrolitrów komórek z każdej próbki do pojedynczych pięciomililitrowych probówek okrągłodennych zawierających jeden mililitr PBS. Następnie załaduj komórki próbki i ustaw częstotliwość zdarzeń na 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.
Utwórz wykres punktowy obszaru punktowego bocznego obszaru rozproszonego w skali logarytmicznej i dostosuj bramkę punktową R1, aby objąć komórki bakteryjne zdarzenia singletowego. Następnie utwórz wykres punktowy obszaru FITC w skali logarytmicznej i wykres punktowy obszaru FITC w skali logarytmicznej i ustaw bramkę sortowania R2 tak, aby wykryto mniej niż 0,1% komórek ujemnych. Teraz załaduj probówkę z próbką i w razie potrzeby dostosuj częstotliwość zdarzeń do 1000 do 3000 zdarzeń na sekundę.
Następnie umieść probówkę zawierającą 0,5 mililitra bulionu lizonianowego na wylocie instrumentu FACS i zbierz jedną razy dziesięć do czwartej komórek w bramach R1 i R2. Gdy wszystkie komórki zostaną odizolowane, zakryj probówkę zbiorczą i delikatnie przekręć komórki wirowo. Następnie rozprowadź 0,5 mililitra pobranych próbek na dwóch 90-milimetrowych płytkach agarowych zawierających bulion lizogenianowy uzupełniony antybiotykami, a następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Na tym rysunku przedstawiono zademonstrowany protokół przesiewowy, w tym usuwanie wyników fałszywie dodatnich przez sortowanie ujemne oraz selekcję trafień dodatnich przy użyciu bramek sortowania R1 i R2. Trafienia można następnie ocenić, porównując kwiatostan próbki z podłożem i bez niego. W tym reprezentatywnym badaniu przesiewowym za pośrednictwem octanu p-azotu kwiatostan komórek traktowanych substratem był wyższy niż w komórkach kontrolnych, co potwierdza pięciu kandydatów na lipazę w tym eksperymencie.
Pomimo szerokiego rozpowszechnienia tych trzech potencjalnych substancji celulozowych, obserwuje się wyraźne różnice w średniej intensywności FITC w populacjach. Te cztery kandydaci na fosfatazy wykazują również wysoki poziom kwiatostanu w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Co więcej, aktywność fosfatazy alkalicznej wektorów wstawionych przez orf można potwierdzić za pomocą cytometrii przepływowej z silniejszym sygnałem florescencji obserwowanym dla uderzenia enzymu niż dla komórek przenoszących pusty plazmid.
Ważne jest, aby pamiętać, że technikę tę można zastosować do badań przesiewowych szerokiej gamy enzymów, wybierając odpowiedni substrat i stężenie dawki pokarmowej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące identyfikacji i charakterystyki kandydata na enzym w sposób wysokoprzepustowy. Po opracowaniu, ta wysokoprzepustowa technika przesiewowych enzymów utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią enzymatyczną do badania różnych enzymów metagenomicznych bez konieczności badania swoistości enzymatycznej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych opartego na obwodzie metogenicznym z szerokim zakresem docelowych enzymów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie wprowadza metodę wysokowydajnego przesiewania wykorzystującą uniwersalny genetyczny system przesiewania enzymów, zdolny do oceny ponad 200 enzymów. System identyfikuje różne enzymy, w tym lipazę, celulazę i alkaliczną fosfatazę, poprzez zmianę stosowanego substratu.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Inżynieria enzymatyczna
- Biotechnologia mikrobiologiczna
- Przeszywanie metagenomowe
Tło
- Przeszywanie wysokowydajne jest niezbędne do oceny aktywności enzymatycznej.
- Tradycyjne metody często wymagają oddzielnych systemów dla różnych enzymów.
- To badanie ma na celu usprawnienie procesu przesiewania.
- Wykorzystanie pojedynczego systemu może zwiększyć efektywność w badaniach nad enzymami.
Cel badania
- Opracowanie metody do przesiewania wielu enzymów jednocześnie.
- Ułatwienie badań nad inżynierią enzymów i metagenomiką.
- Zapewnienie bardziej efektywnej alternatywy dla konwencjonalnych technik przesiewania.
Stosowane metody
- Opracowanie genetycznego systemu przesiewania enzymów.
- Wykorzystanie związku fenylenu i reportera GFP do wykrywania.
- Przeszywanie enzymów poprzez zmianę dostarczanego substratu.
- Pomiar fluorescencji w celu oceny aktywności enzymatycznej.
Główne wyniki
- Pomyślna identyfikacja lipazy, celulazy i alkalicznej fosfatazy.
- Wykazanie wszechstronności systemu przesiewania.
- Pokazano, że metoda może być stosowana do różnych enzymów.
- Zweryfikowano skuteczność stosowania pojedynczego systemu dla wielu enzymów.
Wnioski
- Opracowany system znacząco poprawia efektywność przesiewania enzymów.
- To podejście może postępować z badaniami nad inżynierią enzymów.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować szersze badania metagenomowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput genetic enzyme screening enables rapid functional interrogation of metagenomic libraries, supporting early-stage discovery and target validation in enzyme engineering. The universal applicability of the GESS platform streamlines the identification of diverse enzymatic activities, reducing biological ambiguity and accelerating portfolio triage. This approach enhances predictive confidence at the inflection point between discovery and lead identification for biocatalyst development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional screening of metagenomic libraries for novel enzyme activities.
- Supports biological de-risking by linking substrate conversion to quantifiable fluorescence signals.
- Facilitates rapid triage of candidate enzymes for downstream validation.
- Improves predictive confidence in target selection by isolating active clones based on substrate specificity.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, high-throughput workflow for multi-enzyme screening using flow cytometry.
- Delivers reproducible, quantitative readouts via GFP fluorescence linked to enzymatic activity.
- Enables scalable screening of large metagenomic libraries with minimal assay redesign.
- Prepares validated enzyme candidates for further biochemical and genetic characterization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enzyme discovery with translational workflows by enabling rapid identification of biocatalysts for industrial or therapeutic applications.
- Supports continuity from functional screening to gene identification and in vitro validation.
- Reduces risk of late-stage failure by confirming activity in relevant biological systems early.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening system integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless progression from metagenomic library construction to candidate selection and downstream validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening by linking substrate turnover to fluorescence-based detection.
- Screening: Delivers robust, quantitative outputs suitable for comparative analysis across enzyme classes.
- Analytics: Provides flow cytometry-based statistical outputs for confident hit selection and false positive exclusion.
- Translational Research: Facilitates rapid transition from discovery to preclinical enzyme characterization when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to a wide range of enzyme targets by substrate selection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enzyme target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales enzyme screening workflows for reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation in enzyme discovery portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme candidates for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in metagenomic library construction and flow cytometry operation.
- Demands access to FACS instrumentation and fluorescence detection infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and substrate selection.
- Adaptable to diverse enzyme classes by modifying substrate inputs and detection thresholds.
- Dependent on robust negative and positive control design to minimize false positives.
