Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie dużej liczby zakażonych zarodków danio pręgowanego do wysokoprzepustowych testów związków, które umożliwią odkrycie leków. Osiąga się to poprzez użycie najpierw dużego statku hodowlanego w celu uzyskania dużej liczby synchronicznych jaj danio pręgowanego w jednym zdarzeniu. Następnie jaja są ustawiane w siatkę aros i zakażane bakteriami w żółtku za pomocą automatycznego mikrowtryskiwacza.

Gdy infekcja rozprzestrzeni się przez zarodki, są one wstępnie posortowane za pomocą cytometrii przepływu dużych cząstek przed leczeniem lekami. Na koniec analizuje się poziom obciążenia bakteryjnego w zakażonych zarodkach po leczeniu złożonym. Ostatecznie, analiza w wysokiej rozdzielczości za pomocą kręgu mikroskopii konfokalnej.

Zautomatyzowane badania przesiewowe i pobieranie próbek dużych cząstek są wykorzystywane do bardziej szczegółowego pokazania wpływu związków chemicznych na infekcję. Główną przewagą tej metody nad istniejącymi technikami, takimi jak ręczne iniekcje lub analiza skanu PIX, jest to, że dzięki niej możemy wygenerować dużą ilość jednorodnie dotkniętych zarodków, które możemy analizować w sposób wysokoprzepustowy. Aby przygotować inokulum naskórka S, wyizolować kilka pojedynczych kolonii z płytki szczepu naskórka S, O 47 zawierającego wektor ekspresyjny M wiśni A PW VW 180 9 i zaszczepić.

25 mililitrów LB uzupełnione 10 mikrogramami na mililitr. Chloramfenikol inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza do etapu midlock następnego dnia, odwirować jeden mililitr kultury w temperaturze 12 000 GS przez jedną minutę i użyć jednego mililitra sterylnego PBS o 0,3% objętości na objętość między 80 a trzykrotnie przemyć osad. Zmierz gęstość optyczną przy OD 600 i użyj 2% wagowo na objętość, poliwinylu perone 40 lub PVP 40 w PBS, aby rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do OD 600 równego 0,3 lub jeden razy 10 do ośmiu CFU na mililitr.

Aby przygotować inokulum aminowe, wyizoluj kilka pojedynczych kolonii ze szczepu M Meum M lub E 11, stabilnie wyrażając wektor wiśni PS MT 3M z napowietrzacza Middlebrook seven H 10 i zaszczepij 10 mililitrów bulionu Middlebrook seven H nine zawierającego 10% objętości na objętość. Middlebrook Wzbogacenie DC uzupełnione 50 mikrogramami na mililitr higromycyny inkubować przez noc w temperaturze 28 stopni Celsjusza następnego dnia. Odwirować jeden mililitr kultury w temperaturze 12 000 GS przez jedną minutę i użyć jednego mililitra sterylnego PBS o objętości 0,3% objętości między 80, aby trzykrotnie przemyć osad.

Zmierz OD 600 zawiesiny bakteryjnej i z 2% masy na objętość. PVP 40 w PBS rozcieńczony do OD 600 0,3 lub 0,3 razy 10 do ośmiu CFU na mililitr w celu uzyskania ikry danio pręgowanego w noc poprzedzającą zebranie, umieścić maksymalnie 50 samic danio pręgowanego w dolnej komorze dużego statku hodowlanego i 70 samców w górnej części statku. Następnego ranka wyjmij separator z naczynia Po około godzinie przez pojemnik na jaja na dnie naczynia hodowlanego, zbierz jaja do 50-mililitrowej rurki wypełnionej wodą jajeczną

Po przygotowaniu płytek iniekcyjnych, zgodnie z protokołem tekstowym na zautomatyzowanym oprogramowaniu operacyjnym mikrowtryskiwacza, kliknij na etap kalibracji, a następnie kliknij na 10 24. Dobrze zakratuj i umieść płytkę aros w mikrowtryskiwaczu, skalibruj płytkę, klikając ekran w środkowej pozycji studzienki. Następnie przejdź do menu igły i kliknij na kalibruj uchwyt igły.

Za pomocą końcówki do mikroładowarki napełnij igłę do wstrzykiwań końcówki o średnicy 10 mikronów 10 mikrolitrami PVP 40 zawierającymi 100 CFU na nanolitr naskórka S, 30 CFU na nanolitr naskórka S lub samym PVP 40 do pozorowanych wstrzyknięć, umieść igłę w automatycznym mikrowtryskiwaczu i skalibruj pozycję XY, opuszczając lub przesuwając igłę w górę i klikając na ekranie w pozycji igły. Następnie skalibruj pozycję Z igły, klikając na ekranie w pozycji końcówki igły. Następnie użyj plastikowej pipety transferowej, aby rozprowadzić jajka na siatce aros i usunąć nadmiar wody z jaj.

Następnie umieść siatkę agros wypełnioną jajkami w automatycznym mikro wtryskiwaczu w menu wtrysku, dostosuj ustawienie ciśnienia wtrysku na 200 hektarów paskala, czas wtrysku na 0,2 sekundy, a ciśnienie kompensacyjne na 15 hektorów paskalów, co odpowiada jednemu nanolitrowi w menu ustawień strumienia Femto. Kliknij wstrzyknąć wszystko i wstrzyknąć całą płytkę z zarodkami po wstrzyknięciu. Zbierz jaja, myjąc je na szalce Petriego i inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Po skonfigurowaniu cytometru przepływu dużych cząstek wejdź do menu PMT i ustaw kanał czerwony na 650 woltów, a kanały zielony i żółty na zero woltów. Następnie w menu progów ustaw sygnał progowy gęstości optycznej na 50, co odpowiada 975 miliwoltom i minimalny czas lotu na 800, co odpowiada 320 mikrosekundom. W celu zmniejszenia wpływu zanieczyszczeń, należy umieścić zarodki w pojemniku na próbkę i w menu sortowania, aby znaleźć maksymalną liczbę 70 zarodków na płytkę do sortowania, wpisując liczbę 70.

Umieść pustą szalkę Petriego pod sorterem i kliknij sortowanie ręczne. Gdy szalka Petriego zostanie wypełniona, zapisz dane, klikając sklep. Jeśli wymagana jest analiza lub obrazowanie w wysokiej rozdzielczości, zarodki można sortować pojedynczo do dołków z 96-dołkową płytką.

Umieścić zarodki w pojemniku na próbkę i określić maksymalną liczbę zarodków na studzienkę, która ma zostać posortowana. Następnie umieść pustą 96-dołkową płytkę w lewym uchwycie płytki i kliknij płytkę napełniającą. Po napełnieniu płytki zapisz dane, klikając na sklep, aby przeanalizować zarodki leczone lekami po trzech dniach od wstrzyknięcia erum.

Jedną grupę zarodków należy traktować związkiem będącym przedmiotem zainteresowania w rozpuszczalniku, a drugą grupę samym rozpuszczalnikiem. Umieść leczone zarodki po czterech i pięciu dniach od zapłodnienia w kubku na próbkę na cytometrze przepływowym i ustaw sortowanie na 70 zarodków na płytkę po znieczuleniu zarodków in trica i skonfigurowaniu automatycznego systemu badań przesiewowych kręgowców i próbnika dużych cząstek. Zgodnie z protokołem tekstowym z menu ustawień wykrywania obiektów obrazowania, wybierz obrazy referencyjne odpowiadające wiekowi zarodków w menu obrazów automatycznego przechowywania obrazowania, wybierz liczbę zdjęć do utworzenia i orientację, która ma być użyta.

Umieścić 96-dołkową płytkę wypełnioną zarodkami w lewym uchwycie płytki próbnika do dużych cząstek i kliknąć na płytkę run. Gdy zarodek jest prawidłowo ustawiony, użyj 10-krotnego suchego obiektywu i zobrazuj osobno głowę i ogon. Następnie użyj oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby połączyć obrazy, aby ocenić, który etap rozwoju jest najlepszy dla infekcji żółtkiem.

Iniekcje z zapaleniem skóry właściwej i marum wykonywano na wszystkich różnych etapach od stadium od jednej do 512 komórek. Jak widać tutaj, wstrzyknięcia z zapaleniem skóry o wielkości 100 CFU wykonane między 16 a 128 komórkami zapewniły najlepszy wzorzec infekcji. Bakterie namnażały się w żółtku przez trzy dni i rozprzestrzeniały się w organizmie od trzech dni po zakażeniu.

Wysokoprzepustową kwantyfikację obciążenia bakteryjnego przeprowadzono za pomocą analizy intensywności fluorescencji przy użyciu cytometru przepływu dużych cząstek. Jak pokazano tutaj, ilość żywych bakterii obecnych wewnątrz zarodka bardzo dobrze odpowiada zmierzonemu sygnałowi fluorescencyjnemu. Rysunek ten pokazuje, że optymalnym etapem rozwoju dla wstrzyknięcia 30 jtk aminu jest stadium od 16 do 128 komórek dla szczepu E 11 oraz między stadium 16 a 64 komórek.

W przypadku bardziej zjadliwego szczepu EM, zarodki wstrzyknięte na tych etapach wykazywały rozwój bakterii wewnątrz dębu i rozprzestrzenianie się bakterii przez zarodek. Po wstępnym leczeniu zarodków zakażonych emeryną różnymi stężeniami ryfampicyny wykazano zmniejszenie zakażenia prątkami w sposób zależny od dawki. Stosowanie leku w dawce 200 mikromolowych wykazało, że skutecznie hamuje on progresję bakteryjną M mein E 11, 24 godziny i dalej po leczeniu Po jego rozwinięciu.

Techniki te utorowały drogę naukowcom zajmującym się testowaniem związków chemicznych i opracowywaniem leków, poszukującym nowych metod leczenia chorób zakaźnych, takich jak gruźlica lub zakażenia związane z biomateriałem.