Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie dużej liczby zainfekowanych zarodków ryb zebrafish w celu przeprowadzenia wysokoprzepustowych testów związków umożliwiających odkrywanie leków. Cel ten osiąga się poprzez zastosowanie dużego naczynia hodowlanego w celu uzyskania znacznej liczby synchronicznych jaj zebrafish w ramach jednego zdarzenia. Następnie jaja są ustawiane w siatce aros i infekowane bakteriami w żółtku za pomocą zautomatyzowanego mikroinjektora.

Gdy infekcja rozprzestrzeni się w embrionach, są one wstępnie sortowane za pomocą przepływowej cytometrii dużych cząstek przed podaniem leków. Na koniec analizuje się poziom obciążenia bakteryjnego w zainfekowanych embrionach po zastosowaniu związków. Ostatecznie przeprowadzana jest analiza o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopii konfokalnej kręgów.

Zautomatyzowany screening oraz pobieranie próbek dużych cząsteczek są wykorzystywane do bardziej szczegółowego ukazania wpływu związków na przebieg infekcji. Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak iniekcje ręczne czy analiza skanowania PIX, jest możliwość wygenerowania dużej liczby jednorodnie zainfekowanych embrionów, które można analizować metodą wysokoprzepustową. Aby przygotować inokulum S epiderm, należy wyizolować kilka pojedynczych kolonii z płytki ze szczepem S epiderm O 47 zawierającym wektor ekspresyjny M cherry pochodzący z A PW VW 180 9, a następnie zaszczepić.

25 ml LB uzupełnionego o 10 µg/ml chlorampenykolu inkubować przez noc w temperaturze 37 °C do osiągnięcia fazy średnio-logarytmicznej. Następnego dnia odwirować 1 ml hodowli przy 12 000 ×g przez jedną minutę i użyć 1 ml sterylnego PBS z 0,3% v/v beta-merkaptoetanolu do trzykrotnego przemycia osadu. Zmierzyć gęstość optyczną przy OD 600 i użyć 2% w/v poliwinylopirolonu 40 (PVP 40) w PBS do rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej do OD 600 równej 0,3 lub 1 × 10⁸ CFU/ml.

Aby przygotować inokulum, należy wyizolować kilka pojedynczych kolonii szczepu M. tuberculosis H557 lub E 11 stabilnie wykazującego ekspresję wektora PS MT 3M cherry z podłoża Middlebrook 7H10, a następnie zaszczepić 10 ml bulionu Middlebrook 7H9 zawierającego 10% obj. obj. wzbogacenia Middlebrook ADC z dodatkiem 50 µg/ml hygromycyny i inkubować przez noc w temperaturze 28 °C. Następnego dnia należy odwirować 1 ml kultury przy 12 000 ×g przez jedną minutę i użyć 1 ml sterylnego PBS z 0,3% obj. obj. Tween 80, aby trzykrotnie przemyć osad.

Zmierz OD 600 zawiesiny bakteryjnej i rozcieńcz ją w PBS z dodatkiem 2% masowych PVP 40 do uzyskania OD 600 równej 0,3 lub 0,3 × 10⁸ CFU/ml. Aby uzyskać jaja danio-pręgawki, wieczorem przed ich pobraniem umieść maksymalnie 50 samic danio-pręgawki w dolnej komorze dużego naczynia hodowlanego, a 70 samców w górnej części naczynia. Następnego dnia rano wyjmij separator z naczynia. Po około jednej godzinie, poprzez kolektor jaj znajdujący się na dnie naczynia hodowlanego, zbierz jaja do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej wodą do jaj.

Po przygotowaniu płytek do wstrzykiwania, zgodnie z protokołem tekstowym w oprogramowaniu sterującym automatycznym mikroinjektorem, kliknij kalibruj stół (calibrate stage), a następnie kliknij siatkę studzienek 10 24 (10 24 Well grid) i umieść płytkę AROS w mikroinjektorze. Skalibruj płytkę, klikając na ekranie w pozycji centralnej studzienki. Następnie przejdź do menu igieł (needle menu) i kliknij kalibruj uchwyt igły (calibrate needle holder).

Używając końcówki mikro-loadera, należy napełnić igłę wstrzykującą o średnicy 10 mikronów albo 10 mikrolitrami PVP 40 zawierającego 100 CFUs na nanolitr S epiderm, 30 CFUs na nanolitr erum, albo samym PVP 40 w przypadku wstrzykiwań pozornych, umieścić igłę w automatycznym mikroinżektorze i skalibrować pozycję XY, obniżając lub przesuwając igłę w górę i klikając na ekranie w miejscu położenia igły. Następnie należy skalibrować pozycję Z igły, klikając na ekranie w miejscu położenia jej czubka. Dalej, za pomocą plastikowej pipety transferowej, należy rozmieścić jaja na siatce aros i usunąć nadmiar wody z jaj.

Następnie umieść siatkę agros wypełnioną jajami w automatycznym mikroinjektorze w menu iniekcji, ustaw ciśnienie iniekcji na 200 hPa, czas iniekcji na 0,2 s oraz ciśnienie kompensacyjne na 15 hPa, co w menu ustawień FemtoJet odpowiada 1 nl. Kliknij „inject all” i przeprowadź iniekcję wszystkich embrionów na płytce. Zbierz jaja, płucząc je w szalce Petriego, i inkubuj w temperaturze 28 °C.

Po skonfigurowaniu cytometru przepływowego do dużych cząstek, wejdź w menu PMT i ustaw kanał czerwony na 650 V, a kanały zielony i żółty na 0 V. Następnie w menu progów (thresholds) ustaw sygnał progu gęstości optycznej na 50, co odpowiada 975 mV, oraz minimalny czas przelotu (time of flight) na 800, co odpowiada 320 µs. Aby zmniejszyć wpływ zanieczyszczeń, umieść embriony w naczyniu z próbką, a w menu sortowania ustaw maksymalną liczbę 70 embrionów na płytkę do sortowania, wpisując wartość 70.

Umieść pustą szalkę Petriego pod sorterem i kliknij opcję manual sort. Po zapełnieniu szalki Petriego zapisz dane, klikając store. Jeśli wymagana jest analiza o wysokiej rozdzielczości lub obrazowanie, zarodki można sortować indywidualnie do dołków płytki 96-dołkowej.

Umieść embriony w naczyniu z próbką i zdefiniuj maksymalnie jeden embrion na dołek do sortowania. Następnie umieść pustą płytkę 96-dołkową w lewym uchwycie na płytki i kliknij „fill plate” (wypełnij płytkę). Po wypełnieniu płytki zapisz dane, klikając „store” (zapisz), aby przeanalizować embriony poddane działaniu leku w trzeciej dobie po wstrzyknięciu erum.

Jedną grupę embrionów potraktuj związkami badanymi rozpuszczonymi w rozpuszczalniku, a drugą grupę samym rozpuszczalnikiem. Umieść potraktowane embriony w czwartym i piątym dniu po zapłodnieniu w kubku próbkowym cytometru przepływowego. Po znieczuleniu embrionów w tricainie oraz skonfigurowaniu zautomatyzowanego systemu przesiewowego dla kręgowców i próbnika dużych cząstek, ustaw sortowanie na 70 embrionów na płytkę. Zgodnie z protokołem tekstowym z menu konfiguracji detekcji obiektów obrazowania, wybierz obrazy referencyjne odpowiadające wiekowi embrionów w menu automatycznego zapisywania obrazów, a następnie określ liczbę zdjęć do wykonania oraz zastosowaną orientację.

Umieść płytkę 96-dołkową wypełnioną embrionami w lewym uchwycie na płytki próbnika dużych cząstek i kliknij przycisk run plate. Gdy embrion zostanie prawidłowo wypozycjonowany, użyj obiektywu 10x plain dry i wykonaj oddzielnie zdjęcia głowy oraz ogona. Następnie użyj oprogramowania do przetwarzania obrazów, aby połączyć zdjęcia w celu oceny, który etap rozwoju jest najodpowiedniejszy do infekcji żółtka.

Iniekcje z dermitis i marum przeprowadzono na wszystkich różnych etapach rozwoju, od stadium jednej komórki do 512 komórek. Jak tu widać, iniekcje 100 CFU dermitis wykonane między stadium 16 a 128 komórek zapewniły najlepszy obraz infekcji. Bakterie namnażały się wewnątrz żółtka przez trzy dni, a od trzeciego dnia po infekcji zaczęły rozprzestrzeniać się do organizmu.

Wysoko wydajne oznaczanie ilości bakterii przeprowadzono poprzez analizę intensywności fluorescencji z wykorzystaniem cytometru przepływowego do dużych cząstek. Jak tutaj pokazano, ilość żywych bakterii obecnych wewnątrz zarodka bardzo dobrze odpowiada zmierzonemu sygnałowi fluorescencyjnemu. Rycina ta wykazuje, że optymalnym etapem rozwoju dla wstrzyknięcia 30 CFU aminum jest stadium od 16 do 128 komórek dla szczepu E 11 oraz stadium od 16 do 64 komórek.

W przypadku bardziej zjadliwego szczepu EM zarodki poddane wtryskiwaniu na tych etapach wykazały wzrost bakterii wewnątrz jądra oraz rozprzestrzenianie się bakterii w całym zarodku. Przedwstępna obróbka zarodków zainfekowanych emeryną przy użyciu różnych stężeń ryfampicyny wykazała redukcję infekcji prątkami w sposób zależny od dawki. Zastosowanie leku w dawce 200 micromolar wykazało, że skutecznie zatrzymuje on progresję bakteryjną M mein E 11 od 24 godzin po rozpoczęciu leczenia i w dalszym czasie po jego rozwoju.

Techniki te utorowały drogę badaczom z zakresu testowania związków i opracowywania leków, poszukującym nowych metod leczenia chorób zakaźnych, takich jak gruźlica lub zakażenia związane z biomateriałami.