Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta
31 października 2016
W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.
Ogólnym celem tej techniki jest systematyczne badanie krajobrazu metylacji DNA w całym genomie w dużych kohortach pacjentów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, zwłaszcza w odniesieniu do tego, które regiony w krajobrazie metylacji DNA ulegają deregulacji u pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba pacjentów może być badana w sposób opłacalny.
Technologia ta może mieć pozytywny wpływ na terapię i diagnostykę pacjenta, ponieważ możemy badać istniejące biomarkery, a także identyfikować nowe biomarkery. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kohortę pacjentów, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak metylacja DNA w komórkach pochodzących z hodowanych linii komórkowych z próbek pochodzących od myszy. Tę procedurę wraz z dr Ya-Ting Hsu zademonstruje pan Joseph Liu, technik w naszym laboratorium.
Część sekwencjonowania zostanie zademonstrowana przez panią Dawn Garcia, która jest technikiem w naszym rdzeniu sekwencjonowania. Po wyizolowaniu genomowego DNA z guza lub normalnej tkanki zgodnie z protokołem tekstowym, dodaj 1,2 mikrograma całkowitego genomowego DNA do 96 mikrolitrów buforu TE i 24 mikrolitry 5-krotnego buforu do płukania, aby uzyskać roztwór o objętości 120 mikrolitrów. Roztworu DNA należy poddać sonizacji przez 30 sekund, a następnie pozostawić mu na 30 sekund.
Powtórz sonikację w sumie od 20 do 25 razy. Użyj systemu bioanalizatora z komercyjnym zestawem DNA o wysokiej czułości zgodnie z protokołem producenta, aby uruchomić jeden mikrolitr sonikowanego roztworu DNA w celu sprawdzenia wielkości fragmentów. Powinny mieścić się w zakresie od 150 do 350 par zasad.
Aby przeprowadzić elucję pojedynczej frakcji, należy przygotować bufor elucyjny, sporządzając roztwór jeden do jednego buforu o niskiej zawartości soli i buforu o wysokiej zawartości soli. Użyć 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do ponownego zawieszenia DNA wiążącego metyl lub kulek MBD i inkubować zawiesinę na obracającym się mieszalniku przez trzy minuty. Po inkubacji umieść probówkę na stojaku magnetycznym na jedną minutę, a następnie ostrożnie odpipetuj płyn, nie dotykając końcówki pipety na kulkach i przenieś ją do czystej, wolnej od DNaz 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Próbkę należy przechowywać na lodzie. Powtórzyć elucję dla drugiej próbki i zebrać ją w tej samej probówce, co pierwsza próbka. Do każdej niewychwyconej frakcji przemywania i rozcieńczania dodać jeden mikrolitr glikogenu, jedną dziesiątą objętości trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i dwie objętości próbki 100% etanolu.
Po dokładnym wymieszaniu roztworu inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Następnie odwirować reakcję w temperaturze 11 363 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Ostrożnie wyrzuć supernatant bez naruszania osadu i dodaj 500 mikrolitrów zimnego 70% etanolu.
Ponownie zakręć rurką przed powtórzeniem płukania etanolem. Suszyć pelety na powietrzu przez pięć minut. Następnie użyj wody lub bufora wolnego od DNaz, aby go ponownie zawiesić.
Sprawdź, czy całkowita ilość DNA przekracza 20 nanogramów zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie umieść DNA na lodzie lub przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Do przygotowania biblioteki sekwencjonowania DNA należy użyć w pełni zautomatyzowanego systemu budowy biblioteki i postępować zgodnie ze standardowym protokołem dostarczonym przez producenta.
Wybierz fragmenty DNA o długości od 200 do 400 par zasad do przygotowania biblioteki. Po przygotowaniu biblioteki sekwencjonowania DNA usuń reakcję i użyj fluorometrycznego systemu kwantyfikacji do ilościowego określenia biblioteki sekwencjonowania DNA. Aby skonfigurować reakcję amplifikacji PCR, w probówce PCR dodaj 15 mikrolitrów biblioteki sekwencjonowania DNA, 25 mikrolitrów głównej mieszanki PCR, dwa mikrolitry mieszanki starterów PCR i osiem mikrolitrów wody.
Użyj programu opisanego w protokole tekstowym, dokonując niezbędnych korekt w oparciu o zalecenia producenta mieszanki PCR. Przeprowadź wystarczającą liczbę cykli, aby wytworzyć od dwóch do 10 milimolów DNA z biblioteki. Po oczyszczeniu reakcji PCR, oznacz kreskowo każdą próbkę i połącz cztery próbki w jednym torze komory przepływowej.
Użyj standardowego protokołu pojedynczego odczytu 50 par podstawowych naszego sekwencjonowania. Przeprowadzaj bioinformatykę zgodnie z protokołem tekstowym. Korzystając z czapek MBD, staramy się zidentyfikować wyspy CpG w różnych regionach genomu, które są różnie metylowane w guzie w stosunku do normalnej tkanki, badanie to wykazało, że spośród wszystkich wysp CpG zlokalizowanych w promotorach genów, 19,5% wykazało różnicową metylację w guzach w porównaniu z normalną.
Podobnie, 55,2% badanych wewnątrzgenowych wysp CpG wykazało zróżnicowaną metylację. Promotory wewnątrzgenowe wykazały 28,1%A w przypadku promotorów genów bez wysp CpG 1,8% wykazało zróżnicowaną metylację. Ta mapa cieplna wyraźnie przedstawia zróżnicowane zmetylowane regiony w 77 guzach piersi, 10 normalnych tkankach piersi i 38 liniach komórkowych raka piersi.
Na tym rysunku metylacja jest określana ilościowo w dwóch podgrupach raka endometrium, nienawrotowego i nawrotowego, u dwóch pacjentek w różnych miejscach CpG na wyspie promotora CpG zidentyfikowanego genu docelowego SFRP1. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do pięciu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, aby najpierw przetestować jakość badanego genomowego DNA. Zgodnie z tą procedurą można zastosować dodatkowe metody, takie jak pirosekwencjonowanie, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak: jakie są dokładne CpG w zidentyfikowanych regionach wzbogaconych różnicowo, które zostały zmienione? Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się epigenetyką do badania metylacji DNA w dużych kohortach pacjentów.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać metylację DNA w całym genomie w próbkach pacjentów przy użyciu techniki sekwencjonowania kapsla MBD. Należy o tym pamiętać, że czasami może być trudno wychwycić wysoką jakość DNA z próbek takich jak FFP i DNA, dlatego zawsze przeprowadzana jest właściwa ocena genomowego DNA, gdy wykonujemy procedurę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół badania metylacji DNA w całym genomie w dużych kohortach pacjentów klinicznych z wykorzystaniem technologii MBDCap-seq. Metoda ta ma na celu dostarczenie kluczowych informacji na temat krajobrazu epigenetycznego oraz jego wpływu na diagnostykę i terapię pacjentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Epigenetyka
- Genomika
- Badania kliniczne
Wprowadzenie
- Metylacja DNA odgrywa kluczową rolę w regulacji genów.
- Zrozumienie wzorców metylacji może pozwolić na wykrycie biomarkerów chorób.
- Badania na dużą skalę mogą zwiększyć moc statystyczną uzyskanych wyników.
- MBDCap-seq jest kosztowo efektywną metodą analizy metylacji DNA.
Cel badania
- Systematyczne zbadanie profilu metylacji DNA w kohortach pacjentów.
- Identyfikacja regionów o zaburzonym poziomie metylacji.
- Poszukiwanie istniejących i nowych biomarkerów do celów terapeutycznych i diagnostycznych.
Zastosowane metody
- Sekwencjonowanie z wychwytem DNA wiążącego grupy metylowe (MBDCap-seq)
- Potok analizy bioinformatycznej
- Zastosowanie do próbek pochodzących od pacjentów oraz hodowlanych linii komórkowych
- Współpraca z technikami laboratoryjnymi w celu demonstracji protokołu
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych zmian metylacji w próbkach pacjentów.
- Wykazanie możliwości zastosowania metody w różnych systemach biologicznych.
- Potencjalne odkrycie nowych biomarkerów do zastosowań klinicznych.
- Kosztowo efektywne podejście do wielkoskalowych badań epigenetycznych.
Wnioski
- MBDCap-seq jest cennym narzędziem do analizy metylacji DNA w warunkach klinicznych.
- Metoda ta może przyczynić się do postępów w diagnostyce i leczeniu pacjentów.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć uzyskane wyniki w celu zbadania innych kontekstów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda MBDCap-seq umożliwia kosztowo efektywne, wielkoskalowe profilowanie metylacji DNA w kohortach pacjentów, wspierając odkrywanie biomarkerów i walidację celów epigenetycznych w onkologii oraz innych obszarach terapeutycznych. Metoda ta dostarcza ilościowych danych o metylacji, które mogą służyć do minimalizacji ryzyka związanego z wyborem celu oraz opracowywania strategii translacyjnych dla biomarkerów. Jej zastosowanie w setkach próbek pacjentów wykazuje użyteczność w zakresie epigenetycznego przesiewu istotnego dla portfolio oraz generowania wglądów w mechanizmy chorobowe.
Strategiczne Zastosowania w Badaniach i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dysregulacji epigenetycznej w tkankach istotnych dla przebiegu choroby w celu weryfikacji hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza danych o metylacji w całym genomie z próbek pacjentów w celu wyjaśnienia zaangażowania konkretnych szlaków i priorytetyzacji celów.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez identyfikację regionów o różnym stopniu metylacji związanych z fenotypami nowotworowymi.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty metylacji z wysp CpG w promotorach, regionach intragenicznych oraz promotorach nie-CpG w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odtwarzalne i skalowalne profilowanie metylacji, kompatybilne z badaniami dużych kohort i integracją z biobankami.
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych zestawów danych epigenetycznych do dalszych analiz przesiewowych i procesów walidacji biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy wyniki analizy metylacji z fazy odkryć z istotnością kliniczną poprzez analizę tkanek pochodzących od pacjentów.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość translacyjną, umożliwiając analizę metylacji w modelach tkanek prawidłowych, nowotworowych i liniach komórkowych.
- Wartość naukowa: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez powiązanie zmian metylacji z podgrupami chorób (np. nawrotowy vs nienawrotowy rak endometrum).
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda MBDCap-seq wpisuje się w kontinuum od odkrycia do translacji, zapewniając profilowanie epigenetyczne, które dostarcza informacji niezbędnych do walidacji punktów uchwytu, przygotowania testów oraz podejmowania decyzji na etapie przedklinicznym.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów epigenetycznych w procesach tumorigenogenezy i szlakach różnicowania.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki metylacji, umożliwiając wiarygodne porównania pomiędzy systemami modelowymi a pacjentami.
- Analityka: Generuje wskaźniki różnicowej metylacji (np. 19,5% wysp CpG w promotorach, 55,2% wysp intragenicznych) do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Łączy zmiany metylacji w tkankach pacjentów z fenotypami klinicznymi, wspierając dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania profilowania epigenetycznego, które można zastosować w różnych typach nowotworów i kontekstach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji punktów uchwytu poprzez ujawnianie zmian epigenetycznych w tkankach chorobowych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia kosztowo efektywną, wysokoprzepustową analizę metylacji w dużych kohortach pacjentów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w wyborze celów epigenetycznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka dzięki ilościowemu odkrywaniu biomarkerów w krajobrazach metylacji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu epigenetyki, biologii molekularnej i bioinformatyki w celu wykonania protokołu oraz interpretacji danych.
- Proces zależy od dostępności sonikacji, wychwytu opartego na kuleczkach magnetycznych oraz infrastruktury sekwencyjnej do przygotowania i analizy bibliotek.
- Niezbędna jest standaryzacja międzyzespołowa oceny jakości DNA, walidacji wielkości fragmentów oraz spójności elucji.
- Wymagana jest analiza możliwości adaptacji protokołu przy zastosowaniu różnych typów próbek, takich jak FFPE, hodowle komórkowe lub tkanki pochodzenia mysiego.
- Ograniczenie praktyczne: Sukces zależy od wysokiej jakości wejściowego DNA genomicznego, szczególnie w przypadku trudnych próbek klinicznych.
