Name: Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Poznaj metodę MBDCap-seq do analizy metylacji DNA w dużych kohortach pacjentów. Technika ta umożliwia identyfikację biomarkerów epigenetycznych i wspiera rozwój diagnostyki oraz terapii spersonalizowanej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace są wspierane przez CPRIT Research Training Award RP140105, a także częściowo wspierane przez amerykańskie National Institutes of Health (NIH) granty R01 GM114142 oraz przez William & Ella Owens Medical Research Foundation.

Wszystkie tkanki są uzyskiwane po zatwierdzeniu przez komisję Institutional Review Board i po wyrażeniu zgody przez wszystkich uczestników zarówno na analizy molekularne, jak i badania kontrolne. Protokoły są zatwierdzone przez Komitet Badań nad Ludźmi w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.
1. Wychwytywanie DNA wiążącego metyl (MBDCap)
<ol>
	<li>Pobieranie próbek i izolacja DNA
	<ol>
		<li>Pobrać masowe próbki guza lub normalnych tkanek z próbek tkanek zatopionych w parafinie pacjenta.</li>
		<li>Użyj komercyjnego mini zestawu DNA, aby wyizolować genomowe DNA z próbek tkanek zatopionych w parafinie zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Użyj zestawu do wzbogacania metylowanego DNA z opisaną tutaj procedurą zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstępne mycie ściegu 
	Uwaga: Koraliki są używane do łączenia się z białkiem MBD-biotyny, które wykrywa metylację DNA w genomie. Koraliki są zwykle zawieszone w roztworze podstawowym. Wykonaj poniższe czynności, aby zmyć ten płyn.
	<ol>
		<li>Zawiesić zapas kulek streptawidyny (patrz tabela materiałów), delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Nie mieszaj koralików przez wirowanie.</li>
		<li>Na jeden μg wejściowego DNA dodaj 10 μl kulek do probówki z 90 μl 1x buforu Bind/Wash. Obracaj przez 1 min. Nie mieszać przez wirowanie.</li>
		<li>Umieść probówkę (probówki) na stojaku magnetycznym na 1 minutę.</li>
		<li>Usuń płyn pipetą i wyrzuć płyn.</li>
		<li>Dodaj 250 μL 1x Bind/Wash Buffer do kulek i obracaj przez 1 min.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.2.3 - 1.2.5 dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzężenie białka MBD-biotyny z kulkami
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 1,2 μg wejściowego DNA, dodaj 7 μl (3,5 μg) białka MBD-Biotyny do każdej probówki.</li>
		<li>Dodaj 93 μL 1x Bind/Wash Buffer do białka, aby uzyskać końcową objętość 100 μL.</li>
		<li>Mieszaj mieszaninę kulek i białek na mieszalniku obrotowym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdrobnione DNA (dane wejściowe)
	<ol>
		<li>Sonizacja DNA poprzez dodanie 1,2 μg całkowitego genomowego DNA do 96 μl buforu TE i 24 μl 5x buforu Bind/Wash w celu uzyskania 120 μl roztworu. Użyj 30 s power ON i 30 s power off podczas sonikacji, 20 - 25 razy.</li>
		<li>Uruchom 1 μl sonikowanego roztworu DNA za pomocą systemu bioanalizatora z komercyjnym zestawem DNA o wysokiej czułości, aby sprawdzić, czy rozmiar fragmentów mieści się w zakresie 150 - 350 pz zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj koraliki MBD
	<ol>
		<li>Umieść probówkę zawierającą kulki MBD na stojaku magnetycznym na 1 minutę.</li>
		<li>Usuń i wyrzuć płyn za pomocą pipety, nie dotykając kulek.</li>
		<li>Ponownie zawiesić kulki za pomocą 250 μl 1x buforu Bind/Wash.</li>
		<li>Mieszaj koraliki na mikserze obrotowym w temperaturze RT przez 5 minut.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.5.1 - 1.5.4 dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reakcja wychwytywania fragmentarycznego DNA (1 μg wejściowego DNA)
	<ol>
		<li>Przenieść mieszaninę DNA/buforu do probówki zawierającej kulki MBD.</li>
		<li>Mieszać kulki MBD z DNA na mieszalniku obrotowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, mieszać O/N w temperaturze 4 oC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie nieprzechwyconego DNA z kulek
	<ol>
		<li>Po wymieszaniu kulek DNA i MBD umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby skoncentrować wszystkie kulki na wewnętrznej ściance probówki.</li>
		<li>Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą pipety i zachować ją w czystej probówce mikrowirówkowej bez DNaz jako niemetylowane DNA. Próbkę należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 200 μl 1x buforu Bind/Wash do kulek, aby umyć kulki.</li>
		<li>Mieszaj koraliki na mikserze obrotowym przez 3 minuty.</li>
		<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę.</li>
		<li>Usuń płyn pipetą i zachowaj go w probówce do mikrowirówki.</li>
		<li>W przypadku reakcji wychwytywania ≤1 μg wejściowego DNA należy powtórzyć kroki 1.7.3 - 1.7.6 dla łącznie 2 dodatkowych frakcji przemywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elucja jednofrakcyjna
	<ol>
		<li>Zmieszać bufor o niskiej zawartości soli z buforem o wysokiej zawartości soli (1:1), aby uzyskać bufor elucyjny (1,000 mM NaCl).</li>
		<li>Zawiesić kulki w 200 μl buforu elucyjnego (1 000 mM NaCl).</li>
		<li>Inkubuj koraliki na obrotowym mikserze przez 3 minuty.</li>
		<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 1 minutę.</li>
		<li>Trzymając probówkę na stojaku magnetycznym, usuń płyn za pomocą pipety, nie dotykając kulek końcówką pipety i zachowaj ją w czystej, wolnej od DNaz probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Próbkę należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.8.1 - 1.8.4 jeden raz, zbierając drugą próbkę do tej samej probówki (całkowita objętość wyniesie 400 μl). Zbiorczą próbkę należy przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytrącanie etanolu (oczyszczanie DNA)
	<ol>
		<li>Do każdej niewychwyconej, przemywającej i elucyjnej frakcji z poprzednich etapów dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μL, zawarty w zestawie), 1/10 objętości próbki 3M octanu sodu o pH 5,2 (np. 40 μL na 400 μL próbki) i 2 objętości próbki 100% etanolu (np. 800 μL na 400 μL próbki). Całkowita objętość wynosi 1 241 μL.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -80 oC przez co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>Odwirowywać probówkę przez 15 minut w temperaturze 11,363 x g w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.</li>
		<li>Dodaj 500 μl zimnego 70% etanolu.</li>
		<li>Odwirować probówkę przez 5 minut w temperaturze 11,363 x g w temperaturze 4 oC.</li>
		<li>Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.9.6 - 1.9.7 jeden raz i usunąć resztki supernatantu.</li>
		<li>Suszyć pellet na powietrzu przez ~5 min. Nie susz całkowicie granulatu.</li>
		<li>Zawiesić osad DNA w 37,5 μl wody wolnej od DNaz lub innej odpowiedniej objętości buforu.</li>
		<li>Umieścić DNA na lodzie lub przechowywać je w temperaturze -20 oC lub niższej do czasu dalszego użycia.</li>
		<li>Sprawdź, czy całkowita ilość DNA przekracza 20 ng (np. użyj fluorometrycznego systemu oznaczania ilościowego, patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Sekwencjonowanie
<ol>
	<li>Do sekwencjonowania należy wykorzystać fragmenty DNA odzyskane w procedurze MBDCap. Dla każdej próbki, która ma być zsekwencjonowana, wymagana jest całkowita ilość 20 - 40 ng DNA do przygotowania biblioteki.</li>
	<li>Do przygotowania biblioteki DNA-seq należy użyć w pełni zautomatyzowanego systemu budowy biblioteki (patrz tabela materiałów) i postępować zgodnie ze standardowym protokołem dostarczonym przez producenta. Do przygotowania biblioteki należy wybrać fragmenty DNA o wielkości 200 - 400 pz. Zautomatyzowany system przygotowania biblioteki pozwala na standaryzację procedury przygotowania biblioteki i zminimalizowanie różnic między próbkami spowodowanych ręcznym przygotowaniem.</li>
	<li>Użyj podkładów adaptacyjnych i rozcieńczyć do 100-krotnego stężenia. Z tego należy użyć 10 μl na każdą próbkę.</li>
	<li>Postępując zgodnie z krokiem 2.2, wyjąć reakcję i określić ilościowo bibliotekę sekwencjonowania DNA za pomocą fluorometrycznego systemu ilościowego (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ustaw procedurę amplifikacji PCR. Wybór głównej mieszanki PCR ma na celu poprawę wydajności PCR regionu genomu wzbogaconego w GC. W probówce do PCR dodaj 15 μl biblioteki sekwencyjnej DNA, 25 μl mieszanki wzorcowej PCR (patrz tabela materiałów), 2 μl mieszaniny starterów PCR (patrz tabela materiałów) i 8 μl H2O. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z zaleceniami PCR producenta mieszanki wzorcowej PCR, zmieniając czasy cykli i temperatury dla różnych materiałów wyjściowych: 98 oC przez 45 s, X cykli 98 oC przez 15 s, 65 oC przez 30 s, 72 oC przez 30 s, a następnie 72 oC przez 1 min. Przytrzymaj w 4 oC.
	<ol>
		<li>Wykonaj wystarczającą liczbę cykli, aby uzyskać 2 - 10 nM DNA biblioteki (8 - 10 cykli).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść reakcję PCR w stosunku 1:1 kulek oczyszczających PCR zgodnie z protokołem producenta (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Eluować za pomocą buforu elucyjnego o pojemności 20 - 30 μl.</li>
	<li>Oznacz kreskowo każdą próbkę i połącz 4 próbki razem w jednym torze komory przepływowej. Do sekwencjonowania należy użyć standardowego protokołu pojedynczego odczytu 50 bp (patrz tabela materiałów).</li>
</ol>
3. Analiza bioinformatyczna
Uwaga: Dalsze przetwarzanie surowych plików fastq uzyskanych z sekwencjonowania w celu przeprowadzenia kontroli jakości i mapowania krótkich sekwencji DNA (odczytów) do genomu.
<ol>
	<li>Użyj nakładki do krótkiego odczytu Bowtie, narzędzia do mapowania genomu na każdym pliku fastq próbki, aby zmapować odczyty do genomu referencyjnego. Do wykonania tego kroku dostępnych jest wiele narzędzi do mapowania odczytu, które mogą być używane w zależności od indywidualnych preferencji.
	<ol>
		<li>Zezwalaj na maksymalnie 2 niezgodności w całych odczytach podczas mapowania do genomu referencyjnego. Raportuj do 20 najlepszych wyrównań dla każdego odczytu. Na przykład użyj muszki -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt><fastqFile><alignFile>.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj LONUT9, aby odzyskać wielokrotnie zmapowane odczyty, aby poprawić wykrywanie wzbogaconych regionów. Dla każdego odczytu zostanie odzyskane co najwyżej jedno wyrównanie, gdy znajdzie się wystarczająco blisko któregokolwiek z wyżej wymienionych szczytów. Na przykład użyj: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 <alignFile><outputPath>. LONUT wykona następujące kroki.
	<ol>
		<li>Podziel wyrównania na unikatowo zamapowane odczyty i wielokrotnie zamapowane odczyty. Szczyt połączenia na unikatowo zmapowanych odczytach przy użyciu szczytowego wywołującego BELT11. Opcje -w 250 i -p 99 w przykładowym poleceniu są dla BELT.</li>
		<li>Połącz jednoznacznie zmapowane odczyty z odzyskanymi odczytami uzyskanymi z LONUT, a połączone odczyty, w formacie BED, zostaną wykorzystane w dalszej analizie. Oblicz liczbę połączonych odczytów dla przyszłej normalizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrzuć odczyty do kosza. Wyodrębnianie odczytuje w obszarze zainteresowania za pomocą skryptu perla: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile><refGeneFile> -up <upstream extending length> -dn<downstream extending length>. Dla każdego pliku łóżka wymienionego w sampleInfoFile, skrypt perla wykonuje następujące zadania. 
	Uwaga: Zobacz dodatkowy plik kodowania dla skryptu perla.
	<ol>
		<li>Odczyty z pojemnika o stałym rozmiarze, np. 100 pz, dla 24 chromosomów.</li>
		<li>Dla każdego genu określonego w refGeneFile wyodrębnij pojemniki wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji (TSS), aż do długości rozszerzenia określonej przez opcje -up i -dn. Na przykład wyodrębnij dane w regionie, który jest w górę i w dół 4 kb usług TSS. Przy rozmiarze pojemnika 100 pz wyodrębnione dane mają 81 pojemników, a środkowy pojemnik odpowiada TSS.</li>
		<li>W przypadku genu na nici antysensownej odwróć wyekstrahowany region od lewej do prawej, tak aby pojemniki nadrzędne były zawsze umieszczane po lewej stronie za pomocą skryptu perla.</li>
		<li>Dalej podziel region TSS ±4 kb na trzy podregiony: Po lewej, w górę 4 kb do w górę 2 kb; Środek, góra i dół 2 kb; Po prawej, w dół od 2 kb do 4 kb.</li>
		<li>Dla każdej próbki podzielić liczbę odczytów w każdym bloku przez całkowitą liczbę połączonych odczytów odwzorowanych obliczoną zgodnie z ppkt 3.3.3. Normalizacja wyeliminuje różnice w odczycie specyficzne dla próbki i pozwoli porównać odczyty w różnych próbkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom skrypt bash (jak wskazano w pliku skryptu), aby wykonać test statystyczny na znormalizowanych odczytach uzyskanych z lewego regionu, aby wykryć różnicową metylację między grupą normalną a grupą przypadków w regionach opisanych jako w regionie bocznym. 
	Uwaga: Zobacz dodatkowy plik kodowania dla skryptu bash. W oparciu o regiony, które są różnie metylowane, istnieje siedem kombinacji: 
	Cały region: zróżnicowana metylacja w całym regionie TSS ±4 kb 
	Środkowy po lewej: różnicowa metylacja zarówno w środkowym, jak i lewym obszarze 
	Środkowy po prawej: metylacja różnicowa zarówno w środkowym, jak i prawym obszarze 
	Bok: metylacja różnicowa zarówno w lewym, jak i prawym regionie 
	Po lewej: metylacja różnicowa tylko w lewym obszarze 
	Po prawej: metylacja różnicowa tylko w prawym obszarze 
	Środek: różnicowa metylacja tylko w środkowym regionie</li>
	<li>Użyj tego samego skryptu bash, aby zwizualizować różnicową metylację na wykresie tornada. Wykreślić geny hiper i hipometylacji na osobnym panelu i posortować w kolejności kombinacji regionów, jak opisano odpowiednio w 3.4.</li>
</ol>

<ol><li>Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenetics%3A+a+perspective+on+the+role+of+DNA+methylation+in+acquired+endocrine%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine.</a> Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).</li>
<li>Nair, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methyl-DNA+immunoprecipitation+%28MeDIP%29+and+methyl-CpG+binding+domain+%28MBD%29+protein+capture+for+genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveal+CpG+sequence+coverage+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias.</a> Epigenetics. 6, 34-44 (2011).</li>
<li>Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+DNA+methylation+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">Methods in DNA methylation profiling.</a> Epigenomics. 1, 331-345 (2009).</li>
<li>Clark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+whole+genome+approach+of+MeDIP-seq+to+the+targeted+approach+of+the+Infinium+HumanMethylation450+BeadChip%28%28R%29%29+for+methylome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling.</a> PLoS One. 7, e50233(2012).</li>
<li>Walker, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+profiling%3A+comparison+of+genome-wide+sequencing+methods+and+the+Infinium+Human+Methylation+450+Bead+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenomics%22%5BJournal%5D)">DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip.</a> Epigenomics. , 1-16 (2015).</li>
<li>Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+DNA+methylomes+from+microarray+to+genome-scale+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Technol.+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing.</a> Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).</li>
<li>Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD-isolated+Genome+Sequencing+provides+a+high-throughput+and+comprehensive+survey+of+DNA+methylation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).</li>
<li>Brinkman, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+DNA+methylation+profiling+using+MethylCap-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq.</a> Methods. 52, 232-236 (2010).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LOcating+non-unique+matched+tags+%28LONUT%29+to+improve+the+detection+of+the+enriched+regions+for+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data.</a> PLoS One. 8, e67788(2013).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CMS%3A+a+web-based+system+for+visualization+and+analysis+of+genome-wide+methylation+data+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers.</a> PLoS One. 8, e60980(2013).</li>
<li>Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((W-ChIPeaks%3A+a+comprehensive+web+application+tool+for+processing+ChIP-chip+and+ChIP-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data.</a> Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).</li>
<li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+methylation+analysis+reveals+estrogen-mediated+epigenetic+repression+of+metallothionein-1+gene+cluster+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer.</a> Clin. Epigenetics. 7, 13(2015).</li>
<li>Hsu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+hypomethylation+of+EpCAM-regulated+bone+morphogenetic+protein+gene+family+in+recurrent+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).</li>
<li>Wang, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Distal+and+Genic+Methylation+in+the+Development+of+Prostate+Tumorigenesis+Revealed+by+Genome-wide+DNA+Methylation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis.</a> Sci. Rep. , (2015).</li>
<li>Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+profiling+of+DNA+modifications%3A+cytosine+methylation+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond.</a> Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).</li>
<li>Riebler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BayMeth%3A+improved+DNA+methylation+quantification+for+affinity+capture+sequencing+data+using+a+flexible+Bayesian+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach.</a> Genome Biol. 15, R35(2014).</li>
</ol>

Protokół ten został opracowany w laboratoriach dr Tima Huanga i dr Victora Jina w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w San Antonio.

Technika MBDCap-seq jest podejściem opartym na wzbogacaniu powinowactwa3, uważanym za opłacalną alternatywę podczas badania kohort z dużą liczbą pacjentów15. Przedstawiony tutaj pipeline opisuje kompleksowe podejście od pobierania próbek po analizę i interpretację danych. Jednym z najważniejszych kroków jest ustanowienie procedury amplifikacji PCR w celu poprawy skuteczności PCR regionów wzbogaconych w GC w genomie, ponieważ to właśnie tam zachodzi metylacja DNA. Konieczne jest również upewnienie się, że po sekwencjonow...

Epigenetyczna regulacja genów poprzez metylację DNA jest jednym z podstawowych mechanizmów wymaganych do określenia losu komórki poprzez stabilne różnicowanie różnych typów tkanek w organizmie1. Wiadomo, że rozregulowanie tego procesu powoduje różne choroby, w tym raka2.
Proces ten polega głównie na dodawaniu grup metylowych do reszty cytozyny w dinukleotydach CpG DNA3. Istnieje kilka różnych technik stosowanych obecnie do badania tego mechanizmu, z których każda ma swoje zalety, jak opisano w wielu badaniach2-8. Tutaj omówimy jedną z tych technik zwaną sekwencjonowaniem wychwytywania DNA wiążącego metyl (MBDCap-seq), w której używamy techniki wzbogacania powinowactwa do identyfikacji metylowanych regionów DNA. Technika ta opiera się na zdolności białka MBD2 do wiązania metylu w celu wzbogacenia genomowych fragmentów DNA zawierających metylowane miejsca CpG. Używamy komercyjnego zestawu do wzbogacania metylowanego DNA do izolacji tych metylowanych regionów. Nasze laboratorium przebadało setki próbek pacjentów przy użyciu tej techniki i tutaj zapewniamy kompleksowy zoptymalizowany protokół, który można wykorzystać do badania dużych kohort pacjentów.
Jak widać w przypadku każdej technologii sekwencjonowania nowej generacji, MBDCap-seq wymaga również specjalnego podejścia bioinformatycznego w celu dokładnego ilościowego określenia poziomów metylacji w próbkach. W ostatnim czasie przeprowadzono wiele badań mających na celu optymalizację procesu normalizacji i analizy danych sekwencjonowania 9,10. W tym protokole demonstrujemy jedną z tych metod, w której wdraża się unikalne podejście do odzyskiwania odczytu — LONUT — po którym następuje liniowa normalizacja każdej próbki, aby umożliwić bezstronne porównania dużej liczby próbek pacjentów.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wzbogacania DNA metylominera</td><td>Invitrogen</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>112-05D</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Plus Sonication Device</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>3 M octan sodu, pH 5,2</td><td>Sigma</td><td>S7899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>SPRIworks Fragment Library System I</td><td>Beckman Coulter</td><td>A50100</td><td>W pełni zautomatyzowany system budowy biblioteki</td></tr><tr><td>Adapter Startery</td><td>Bioo Scientific 514104</td><td></td><td>Mieszanka starterów PCR</td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Fluorometryczny system ilościowy</td></tr><tr><td>PCR master mix</td><td>KAPA scientific</td><td>KK2621</td><td>PCR master mix</td></tr><tr><td>AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>PCR Kulki oczyszczające</td></tr><tr><td>EB Buffer</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>System sekwencjonowania HiSeq 2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wychwytywanie dna wiążącego metyl sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metylacja jest jedną z podstawowych modyfikacji epigenetycznych DNA, która odpowiada za precyzyjną regulację genów niezbędnych do stabilnego rozwoju i różnicowania różnych typów tkanek. Rozregulowanie tego procesu jest często cechą charakterystyczną różnych chorób, takich jak rak. W tym miejscu przedstawiamy jedną z najnowszych technik sekwencjonowania, sekwencjonowanie wychwytywania DNA wiążącego metylo (MBDCap-seq), stosowane do ilościowego określania metylacji w różnych tkankach normalnych i chorobowych dla dużych kohort pacjentów. Opisujemy szczegółowy protokół tego podejścia do wzbogacania powinowactwa wraz z potokiem bioinformatycznym w celu osiągnięcia optymalnej kwantyfikacji. Technika ta została wykorzystana do sekwencjonowania setek pacjentów z różnymi typami nowotworów w ramach projektu 1000 methylome (Cancer Methylome System).

Wykorzystaliśmy metodę MBDCap-seq do zbadania zmian metylacji DNA u licznej grupy pacjentów z różnymi typami nowotworów, w tym m.in. raka piersi12, endometrium13, prostaty14 oraz wątroby. Przedstawiamy tutaj część informacji z niedawno opublikowanego badania nad rakiem piersi12. W tym przypadku zastosowaliśmy podejście sekwencjonowania całego genomu, aby zidentyfikować wyspy CpG, które wykazują różnicową metylację w tkance nowotworowej w stosunku do prawidłowej w różnych regionach genomicznych. Bad...

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Ogólnym celem tej techniki jest systematyczne badanie krajobrazu metylacji DNA w całym genomie w dużych kohortach pacjentów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, szczególnie w odniesieniu do tego, które regiony krajobrazu metylacji DNA ulegają deregulacji u pacjentów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zbadania dużej liczby pacjentów w sposób kosztowo efektywny.Technologia ta może mieć pozytywny wpływ na terapię i diagnostykę pacjentów, ponieważ umożliwia badanie istniejących biomarkerów oraz identyfikację nowych biomarkerów. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat kohorty pacjentów, może być ona również zastosowana w innych układach, takich jak metylacja DNA w komórkach pochodzących z hodowli linii komórkowych z próbek mysich. Procedurę tę, wraz z dr Ya-Ting Hsu, zaprezentuje pan Joseph Liu, technik w naszym laboratorium.Część dotycząca sekwencjonowania zostanie zaprezentowana przez panią Dawn Garcia, która jest technikiem w naszym centrum sekwencjonowania. Po wyizolowaniu DNA genomicznego z tkanki nowotworowej lub prawidłowej zgodnie z protokołem tekstowym, należy dodać 1,2 µg całkowitego DNA genomicznego do 96 µl buforu TE oraz 24 µl buforu wiążącego i płuczącego 5X, aby otrzymać 120 µl roztworu. Roztwór DNA należy poddać sonikacji przez 30 s, a następnie pozostawić na 30 s.Powtórz sonikację łącznie od 20 do 25 razy. Użyj systemu bioanalizatora z komercyjnym zestawem do wysokoczułej analizy DNA zgodnie z protokołem producenta, aby przeanalizować 1 µL sonikowanego roztworu DNA i sprawdzić wielkość fragmentów. Powinny one mieścić się w zakresie od 150 do 350 par zasad.Aby przeprowadzić elucję w jednej frakcji, należy przygotować bufor elucyjny, sporządzając roztwór buforu niskosolowego i buforu wysokosolowego w stosunku jeden do jednego. Użyj 200 µL buforu elucyjnego, aby resuspender kulki MBD (methyl-binding DNA) i inkubuj zawiesinę na mieszalniku rotacyjnym przez trzy minuty. Po inkubacji umieść probówkę na statywie magnetycznym na jedną minutę, a następnie ostrożnie pobierz ciecz pipetą, nie dotykając końcówką kulek, i przenieś ją do czystej, wolnej od DNaz probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Próbkę tę należy przechowywać w lodzie. Powtórzyć elucję dla drugiej próbki i zebrać ją do tej samej probówki co pierwszą próbkę. Do każdej frakcji płukania i rozcieńczania, w której nie doszło do wychwytu, dodać 1 µL glikogenu, 1/10 objętości 3 M octanu sodu, pH 5.2 oraz dwie objętości próbki 100% etanolu.Po dokładnym wymieszaniu roztworu inkubować w temperaturze -80 °C przez co najmniej dwie godziny. Następnie wirować mieszaninę reakcyjną z prędkością 11 363 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Ostrożnie odpirować nadsącz, nie naruszając osadu, i dodać 500 µL zimnego 70% etanolu.Ponownie odwiruj probówkę przed powtórzeniem przemywania etanolem. Osad susz na powietrzu przez pięć minut. Następnie użyj wody wolnej od DNaz lub buforu, aby go resuspenderować.Należy sprawdzić, czy całkowita ilość DNA przekracza 20 ng, zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie DNA należy umieścić na lodzie lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. W celu przygotowania biblioteki do sekwencjonowania DNA należy użyć w pełni zautomatyzowanego systemu budowy bibliotek i postępować zgodnie ze standardowym protokołem dostarczonym przez producenta.Do przygotowania biblioteki należy wybrać fragmenty DNA o długości od 200 do 400 par zasad. Po przygotowaniu biblioteki do sekwencjonowania DNA, należy przerwać reakcję i wykorzystać fluorometryczny system ilościowy do określenia stężenia biblioteki do sekwencjonowania DNA. Aby przygotować reakcję amplifikacji PCR, do probówki PCR należy dodać 15 µL biblioteki do sekwencjonowania DNA, 25 µL mieszaniny PCR master mix, 2 µL mieszaniny starterów PCR oraz 8 µL wody.Należy zastosować program opisany w protokole tekstowym, wprowadzając w razie potrzeby korekty zgodnie z zaleceniami producenta mieszanki do PCR. Przeprowadź odpowiednią liczbę cykli, aby uzyskać od 2 do 10 millimolar DNA biblioteki. Po oczyszczeniu reakcji PCR, nadaj każdej próbce kod kreskowy i połącz cztery próbki w jednym kanale komórki przepływowej.Należy zastosować standardowy protokół sekwencjonowania pojedynczego odczytu o długości 50 par zasad. Analizę bioinformatyczną należy przeprowadzić zgodnie z protokołem tekstowym. Wykorzystując metodę MBD cap w celu zidentyfikowania wysepek CpG w różnych regionach genomicznych, które wykazują różną metylację w tkance nowotworowej w porównaniu do tkanki prawidłowej, badanie to wykazało, że spośród wszystkich wysepek CpG zlokalizowanych w promotorach genów, 19,5% wykazało różnicową metylację w guzach w porównaniu do tkanki prawidłowej.Podobnie, 55,2% badanych wewnątrgenowych wysp CpG wykazywało metylację różnicową. Promotory wewnątrgenowe wykazywały ją w 28,1%, a w przypadku promotorów genów bez wysp CpG odsetek ten wyniósł 1,8%. Niniejsza mapa ciepła wyraźnie przedstawia regiony o różnej metylacji w 77 guzach piersi, 10 prawidłowych tkankach piersi oraz 38 liniach komórkowych raka piersi.Na tej rycinie przedstawiono poziom metylacji w dwóch podgrupach raka endometrium – nie nawracającym i nawracającym – u dwóch pacjentek w różnych miejscach CpG w wyspie CpG promotora zidentyfikowanego genu docelowego SFRP1. Po opanowaniu techniki ta może zostać przeprowadzona w cztery do pięciu dni, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby w pierwszej kolejności sprawdzić jakość badanego genomowego DNA. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe metody, takie jak pirosekwencjonowanie, aby odpowiedzieć na pytania, np. które dokładnie pary CpG w zidentyfikowanych obszarach o zróżnicowanym wzbogaceniu uległy zmianie? Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny epigenetyki do analizy metylacji DNA w dużych kohortach pacjentów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat badania metylacji DNA w całym genomie w próbkach pacjentów z wykorzystaniem techniki sekwencjonowania MBD cap. Należy pamiętać, że w przypadku próbek takich jak FFP i DNA uzyskanie materiału wysokiej jakości może być utrudnione, dlatego podczas wykonywania procedury zawsze przeprowadza się właściwą ocenę genomowego DNA.

methyl-binding-dna-capture-sequencing-for-patient-tissues

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA (MeDIP). MeDIP jest dwudniową procedurą, która pozwala na selektywne wyodrębnienie zmetylowanych fragmentów DNA z próbki genomowego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla 5-metylocytozyny (anti-5 mC).

Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Przedstawiono usprawniony schemat badania metylacji DNA oraz zmian w ekspresji genów pod wpływem stresu we wczesnym okresie życia. Począwszy od separacji matczynej noworodków myszy i izolacji poszczególnych tkanek mózgowych, prezentujemy protokół jednoczesnej izolacji DNA i RNA z wycinków tkanki mózgowej w celu przeprowadzenia następującej po niej sekwencjonowania z konwersją bisulfitową oraz analizy RT-PCR.

Zoptymalizowana analiza metylacji DNA i ekspresji genów z małych, anatomicznie zdefiniowanych obszarów mózgu

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Ten film demonstruje procedurę modyfikacji wodorosiarczynu genomowego DNA z próbek raka przewodu pokarmowego. Technika ta jest korzystna dla badania związku między wzorcami metylacji genów i ustalania ich udziału w kancerogenezie.

Konwersja wodorosiarczynu genomowego DNA: metoda badania metylacji DNA w próbkach genomowego DNA z tkanki raka przewodu pokarmowego

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Tutaj prezentujemy protokół selekcji in vitro zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych (ETR) o wysokiej, długoterminowej, stabilnej skuteczności wyciszania na miejscu i niskiej aktywności w całym genomie, poza celem. Taki przepływ pracy pozwala na zredukowanie początkowego, złożonego repertuaru potencjalnych ETR do krótkiej listy, nadającej się do dalszej oceny w odpowiednich terapeutycznie warunkach.

In vitro Wybór zmodyfikowanych represorów transkrypcyjnych do ukierunkowanego wyciszania epigenetycznego

Poznaj metodę MBDCap-seq do analizy metylacji DNA w dużych kohortach pacjentów. Technika ta umożliwia identyfikację biomarkerów epigenetycznych i wspiera rozwój diagnostyki oraz terapii spersonalizowanej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Przeglądaj więcej filmów