Name: Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Poznaj metodę MBD-seq do analizy metylacji DNA u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową. Technika zapewnia pełne pokrycie genomu CpG w sposób niezależny od PCR i pozwala identyfikować różnicowo zmetylowane regiony.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych, Szwedzkie Towarzystwo Onkologiczne, Fundację Knuta i Alice Wallenbergów (KAW) oraz FoU VästraGötalandsregionen.

Etyczna zgoda na pobieranie próbek CLL pochodzi z 2007-05-21, z następującym numerem rejestracyjnym: EPN Gbg dnr 239/07. Wszyscy pacjenci z PBL zostali zdiagnozowani zgodnie z niedawno zmienionymi kryteriami8, a próbki zostały pobrane w momencie diagnozy. Do badania włączono pacjentów z różnych oddziałów hematologii w zachodniej części Szwecji po uzyskaniu pisemnej zgody. W tym badaniu wybrano tylko próbki komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z procentem komórek białaczkowych w guzie ≥70%.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Wyizolować PBMC do ekstrakcji DNA z PBL i normalnych, zdrowych próbek krwi obwodowej za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Autoklaw w probówkach 1,5 ml. Rozmrozić wszystkie odczynniki w zestawie do wiązania metylowanego DNA (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Użyj wody wolnej od DNaz, aby przygotować 10 ml 1x buforu do płukania kulek z 5x bufora do płukania dostarczonego przez zestaw, aby umyć kulki i rozcieńczyć białko MBD dostarczone przez zestaw.</li>
	<li>Zaopatrz się lub przygotuj wcześniej następujące elementy: 3 M octan sodu, etanol absolutny i 70% etanol do wytrącania DNA (tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Ekstrakcja genomowego DNA i sonikacja
<ol>
	<li>Użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA (tabela materiałów), aby wyizolować genomowe DNA z próbek pacjenta i normalnych PBMC zgodnie z protokołem producenta. Określić ilościowo genomowe DNA za pomocą spektrofotometru przy 260 nm. 
	UWAGA: Pojemność kolumny do ekstrakcji DNA wynosi maksymalnie 5-6 milionów komórek; Dlatego ważne jest, aby używać więcej niż jednej kolumny dla próbek zawierających więcej niż 5 milionów komórek. Eluować DNA dwukrotnie w równych objętościach, co daje łącznie 100 μl 10 mM buforu Tris EDTA (TE). Białko MBD-biotyny stosowane w zestawie do wydobywania metylu do sekwencjonowania MBD nie wiąże się z jednoniciowym DNA. Dlatego bardzo ważne jest, aby wymywane DNA było zamrożone lub w temperaturze 4 °C, aby zachować jego dwuniciowy charakter.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5 μg genomowego DNA z każdej próbki do łącznej objętości 200 μl przy użyciu buforu TE (pH 8), uzyskując końcowe stężenie 25 ng/μl.</li>
	<li>Wykonaj sonikację w specjalnie zaprojektowanych probówkach za pomocą sonikatora (Tabela Materiałów) przez łącznie 30 cykli (30 s na cykl i 30 s na cykl; po każdych 5 cyklach krótko zakręć probówkami, aby zebrać próbki na dno). 
	UWAGA: W ten sposób powstanie fragmentaryczne DNA o gęstości od 150 pz do 300 pz, co jest optymalne dla tego protokołu.</li>
	<li>Sprawdź zakres sonikacji dla wszystkich próbek przed przejściem do następnego etapu sekwencjonowania MBD, uruchamiając 1 μl rozdrobnionych próbek DNA i drabinkę wielkości DNA na dostępnym na rynku, wstępnie odlanym 2% żelu agarozowym przy użyciu sprzętu do obrazowania elektroforezy DNA. Wizualizacja DNA za pomocą standardowego transiluminatora UV.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kulek przed wiązaniem z białkiem MBD-biotyny
<ol>
	<li>Zawiesić magnetyczne kulki streptawidyny z rurki dołączonej do zestawu, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Nie obracaj koralików wirami ani nie pozwól im wyschnąć.</li>
	<li>Umieść 50 μl kulek (na każde 5 μg rozdrobnionej próbki DNA) w oddzielnych, czystych i oznakowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl 1x bufor do płukania kulek, aby osiągnąć końcową objętość 100 μL. 
	UWAGA: W przypadku używania małych pasków reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o pojemności 0,5 ml do prania kulek stosuje się około 150-200 μl buforu do płukania na probówkę, jak wspomniano w protokole zestawu. Natomiast w przypadku probówek o pojemności 1,5 ml należy dodać co najmniej 250 μl do 300 μl buforu do przemywania na probówkę do płukania kulek.</li>
	<li>Umieść rurki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby wszystkie kulki magnetyczne skoncentrowały się na wewnętrznej ściance rurki skierowanej w stronę magnesu. Usunąć płyn, nie dotykając kulek, za pomocą pipety o pojemności 200 μl.</li>
	<li>Wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, dodaj 250 μl 1x buforu do płukania kulek i delikatnie wymieszaj kulki za pomocą pipety.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.3 i 3.4 co najmniej 4-5 razy dla wszystkich próbek, a na koniec ponownie zawiesić w 250 μl 1x bufor do płukania kulek. Trzymaj je na lodzie.</li>
</ol>
4. Wiązanie białka MBD-biotyny z umytymi kulkami
<ol>
	<li>Dodaj 35 μl białka MBD (7 μl na 1 μg próbki DNA) do oddzielnych probówek i zwiększ całkowitą objętość do 250 μl za pomocą 1x bufor do płukania kulek.</li>
	<li>Do 250 μl umytych kulek dodać 250 μl rozcieńczonego białka MBD i pozostawić je na obrotów od końca do końca w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.</li>
	<li>Po mieszaniu kulek i białka przez 1 godzinę należy przemyć biotynę białkową MBD związaną z magnetycznymi kulkami streptawidyny.
	<ol>
		<li>Umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń płyn bez dotykania kulek za pomocą pipety. Dodaj 250 μl 1x bufor do płukania kulek i umieść probówki na mieszalniku rotacyjnym na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 4.3.1 jeszcze dwa razy i na koniec ponownie zawieś umyte kulki MBD-biotyny w 200 μl 1x bufora do płukania kulek, przygotowując kulki do wychwytywania metylowanego DNA. 
	UWAGA: Mycie 2-3 razy w ten sposób usuwa całe tło niezwiązanych kulek białkowych MBD i poprawia efektywne wiązanie kulek sprzężonych z białkiem MBD z pofragmentowanym genomowym DNA.</li>
</ol>
5. Wiązanie koralików MBD-biotyny z fragmentarycznym genomowym DNA
<ol>
	<li>W czystej probówce o pojemności 1,5 ml wolnej od DNaz dodać 100 μl 5x buforu do płukania kulek i 180 μl rozdrobnionego genomowego DNA (krok 2.3). Doprowadzić końcową objętość do 500 μl za pomocą wody wolnej od DNazy.</li>
	<li>Dodaj 380 μl wody wolnej od DNaz do pozostałych 20 μl rozdrobnionego genomowego DNA i zamroź je. Próbki te należy wykorzystać jako wejściowe kontrole DNA i wytrącić je później wraz z końcowymi eluowanymi próbkami metylowanego DNA (patrz krok 7.1).</li>
	<li>Umieść probówki zawierające umyte kulki MBD-biotyny (krok 4.4) na stojaku magnetycznym na 1 minutę i usuń płyn bez naruszania kulek. Dodać 500 μl rozdrobnionego genomowego DNA rozcieńczonego w buforze do płukania kulek.</li>
	<li>Szczelnie uszczelnić wszystkie probówki folią parafinową i pozostawić je na noc w temperaturze 4 °C na stojaku obrotowym od końca do końca z prędkością 8-10 obr. 
	UWAGA: Reakcję wiązania DNA i kulek biotyny można przeprowadzać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, ale pozostawienie jej na noc w temperaturze 4 °C może poprawić odzyskiwanie końcowego metylowanego DNA.</li>
</ol>
6. Usuwanie niezwiązanego DNA i wymywanie metylowanego DNA z koralików
<ol>
	<li>Po reakcji wiązania DNA i kulek MBD umieść probówki na stojaku magnetycznym na 1 minutę, aby skoncentrować wszystkie kulki na wewnętrznej ściance probówki.</li>
	<li>Usunąć ciekłość sklarowaną nad osadem za pomocą pipety, nie dotykając kulek i zachować tę niezwiązaną frakcję próbki DNA na lodzie.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 1x buforu do płukania kulek do kulek i umieść probówki na obrotowym stojaku na 3 minuty w temperaturze pokojowej. Umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń płyn. Powtórz pranie jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki niezwiązanego DNA.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu dodać 200 μl buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli (2 000 mM NaCl), znajdującego się w zestawie w celu elucji DNA.</li>
	<li>Umieść probówki na obrotowym stojaku na 15 minut w temperaturze pokojowej. Umieść je na stojaku magnetycznym na 1 minutę i za pomocą pipety ostrożnie przenieś supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli i powtórzyć elucję, obracając probówki w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Dodać drugą elucję do tej samej probówki zawierającej 200 μl pierwszej elucji. 
	UWAGA: Końcowe 400 μl całkowitego wymytego DNA jest teraz gotowe do wytrącania etanolem w celu ekstrakcji oczyszczonego DNA nadającego się do sekwencjonowania nowej generacji.</li>
</ol>
7. Wytrącanie etanolu i wzbogacanie metylowanego DNA
<ol>
	<li>Dodać 1 μl glikogenu (20 μg/μl; zawarte w zestawie), 40 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 800 μl lodowatego etanolu absolutnego do 400 μl eluowanego DNA, a także do 400 μl wejściowych próbek DNA przygotowanych w kroku 5.2.</li>
	<li>Dobrze wymieszać probówki przez wirowanie i inkubować je w temperaturze -80 °C przez noc.</li>
	<li>Odwirować probówki przy 12 000 x g (maksymalna prędkość) i temperaturze 4 °C. Sklarowany sklarat należy ostrożnie wyrzucić, nie naruszając osadu, dodać 500 μl 70% etanolu i przemieszać probówki.</li>
	<li>Ponownie odwirować z maksymalną prędkością przez 15 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Odwirować probówki z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć resztki etanolu za pomocą końcówki pipety.</li>
	<li>Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Do osadu DNA dodać 10 μl wody wolnej od DNaz. Przejdź do kwantyfikacji metylowanego DNA (krok 7.6), sekwencjonowania MBD (krok 7.7) i analizy (sekcje 8 i 9).</li>
	<li>Określić ilościowo końcowe odzyskane próbki metylowanego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do fluorometrycznego oznaczania ilościowego (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Uwaga: Korzystając z tego protokołu, z każdej próbki odzyskano 30-50 ng końcowego DNA. Próbki DNA są gotowe do wysłania na suchym lodzie w celu budowy biblioteki i sekwencjonowania MBD o wysokiej przepustowości</li>
	<li>Wykonaj budowę biblioteki DNA i wysokoprzepustowe sekwencjonowanie MBD przy użyciu platformy komercyjnej (Tabela materiałów), zgodnie z opisem w reference9. 
	UWAGA: W celu wstępnej kontroli jakości końcowego metylowanego DNA należy przeprowadzić przygotowania biblioteczne przy użyciu sekwencjonowania par końców 50 pz dla wszystkich próbek. Przetwarzaj surowe dane do kontroli jakości po sekwencjonowaniu, jak opisano w kroku 8.1, a następnie przetwarzaj je przy użyciu podejść bioinformatycznych i metod statystycznych, jak opisano poniżej (kroki 8.2-9.6).</li>
</ol>
8. Metoda analizy bioinformatycznej 1: Identyfikacja regionów o zróżnicowanej metylacji związanych z CLL (cllDMR)
<ol>
	<li>Wyczyść uzyskane odczyty 49 pz (format FASTQ) dla adapterów za pomocą dostępnych narzędzi do kontroli jakości, takich jak Trimmomatic10 lub Cutadapt. Sprawdź jakość przyciętych odczytów za pomocą zestawu narzędzi FastQC: 
	java -jar trimmomatic.jar SE SAMPLE_uncleaned.fastq SAMPLE.fastq ILLUMINACLIP:adapters.fasta:2:30:10</li>
	<li>Dopasuj oczyszczone pliki FASTQ za pomocą wyrównywacza genomu z krótkim odczytem Bowtie do referencyjnego genome11. Określ parametry jak poniżej:
	<ol>
		<li>Zezwalaj na maksymalnie dwie niezgodności (parametr muszki: -v 2).</li>
		<li>Ogranicz raportowanie do sześciu najlepszych wyrównań na odczyt (parametr Bowtie: -m 6), aby kontrolować odczyty z wieloma mapowaniami. 
		muszka -v 2 -a -m 6 HG19_INDEX -S PRÓBKA.fastq > PRÓBKA.sam 
		UWAGA: Przekonwertuj pliki SAM wygenerowane dla poszczególnych próbek po wyrównaniu na BAM za pomocą SAMtools. 
		samtools view -bS -o PRÓBKA.BAM PRÓBKA.sam</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj opartej na modelu analizy szczytowego wywołania ChIP-Seq (MACS) na wyrównanych próbkach (BAM), aby przewidzieć wzbogacone/zmetylowane regiony z podgrup CLL12. 
	UWAGA: Porównanie I: Użyj próbki wejściowej jako grupy kontrolnej oraz próbek pacjentów w kolorze normalnym i PBL jako grup leczonych. Ten krok polega na zebraniu wszystkich ujemnych pików (pików wzbogaconych w Input/background). Porównanie II: Użyj normalnej grupy próbnej jako grupy kontrolnej i grupy próbnej pacjentów z PBL jako grupy leczonej. Uzyskane dodatnie piki to hipermetylowane regiony CLL, a ujemne piki to hipometylowane regiony CLL nad normalnymi lub różnicowo metylowanymi regionami (DMR). 
	macs14 -t powiedział: SAMPLE_TREATMENT.bam -c SAMPLE_CONTROL.bam --format BAM -g hs</li>
	<li>Usuń piki tła porównania I z różnicowo metylowanych regionów (DMR) za pomocą BEDtools13. 
	narzędzia do łóżek odejmują -a <CLL_enriched_regions> -b <Input_enriched_regions></li>
	<li>Przewiduj procentową zawartość pierwiastków powtórzeniowych (SINE-Alu, LINE itp.) wzbogaconych w DMR.
	<ol>
		<li>Użyj fastacmd, aby wyodrębnić sekwencję FASTA DMR za pomocą współrzędnych chromosomowych z genomu referencyjnego HG19. 
		fastacmd -d HG19_genome.fa -s Chromosom -L Początek,Koniec -l 50000 > DMRs.fasta</li>
		<li>Użyj narzędzia wiersza poleceń RepeatMasker, aby przewidzieć procent powtarzających się elementów obecnych w sekwencji FASTA DMRs. 
		RepeatMasker -gc -gccalc -s -species human -html DMRs.fasta</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opisz przewidywane DMR za pomocą "annotatePeaks.pl" Homera z dostępną adnotacją transkryptu Ensembl [PMC4919035] lub Gencode [PMID 22955987] (transkrypty kodujące białka i niekodujące). 
	annotatePeaks.pl DMRs.bed <GENOME> -gtf <Ensembl lub Gencode GTF> 
	UWAGA: Dostarcza informacji na temat rozkładu pików w różnych regionach genowych (tj. promotorze, eksonie, intronie, 3' UTR i 5' UTR) i regionach międzygenowych. Transkrypty lub geny związane z DMR nazywane są genami zróżnicowanie metylowanymi (DMG).</li>
	<li>Użyj narzędzia do wzbogacania ze zaktualizowaną lub aktualną funkcjonalną bazą danych, aby znaleźć funkcje wzbogacone o CLL DMG (tylko geny kodujące białka)14. 
	UWAGA: Grupowanie zestawów genów w oparciu o adnotację funkcjonalną (GeneSCF)14 to narzędzie do analizy wzbogacania funkcjonalnego w czasie rzeczywistym, które wykorzystuje zaktualizowane KEGG i Gene Ontology jako referencyjną bazę danych.</li>
</ol>
9. Metoda analizy bioinformatycznej 2: Identyfikacja znacząco zróżnicowanych regionów metylowanych związanych z CLL (cll sigDMR)
<ol>
	<li>Wykonaj kroki 8.1-8.5 z metody I (sekcja 8) i użyj analizy wzbogacania różnicowego opartej na zliczaniu odczytu, wykorzystując dostępne narzędzia, jak opisano w krokach 9.2 - 9.6, aby dodać jeszcze jeden poziom statystyk do potoku analizy.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę odczytów odwzorowanych na poszczególne piki lub DMR w próbkach pacjentów w normie i PBL, używając "featureCounts" z pakietu "Subread"15. 
	subread/bin/featureCounts -Q 30 -F SAF -a DMRs.SAF -o DMRs_counts.table SAMPLE_TREATMENT.bam SAMPLE_CONTROL.bam 
	UWAGA: Można wprowadzić filtr jakości mapowania, aby uniknąć ilościowego określania odczytów o złej jakości (np. -Q 30). Na potrzeby tego kroku należy przygotować pliki SAF dla uzyskanych DMR-ów. Aby uzyskać więcej informacji na temat formatu pliku SAF, skorzystaj z tego linku http://bioinf.wehi.edu.au/featureCounts/.</li>
	<li>Użyj tabeli odczytów RAW zawierającej liczbę odczytów dla poszczególnych pików w grupach próbek pacjentów z prawidłową i PBL w edgeR jako input16. 
	UWAGA: Porównaj grupy próbek pacjentów normalnych i pacjentów z PBL, aby znaleźć sigDMR. W przypadku analizy wzbogacania różnicowego postępuj zgodnie z przewodnikiem edgeR, aby uzyskać szczegółowe instrukcje krok po kroku (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/edgeR/inst/doc/edgeRUsersGuide.pdf).</li>
	<li>Filtruj sigDMR przy użyciu współczynnika fałszywych wykryć (FDR) i zmiany logarytmicznie przewidywanej przez edgeR16.</li>
	<li>Opisz przewidywane sigDMR za pomocą "annotatePeaks.pl" Homera z dostępną adnotacją transkryptu Ensembl lub Gencode (transkrypty kodujące białka i niekodujące). 
	annotatePeaks.pl sigDMRs.bed HG19_genome.fa -gtf <Ensembl lub Gencode GTF> -CpG 
	UWAGA: Dostarcza informacji na temat rozkładu pików w różnych regionach genowych (tj. promotorze, eksonie, intronie, 3' UTR i 5' UTR) i regionach międzygenowych. Transkrypty lub geny związane z sigDMR nazywane są sigDMG.</li>
	<li>Użyj narzędzia do wzbogacania ze zaktualizowaną lub aktualną funkcjonalną bazą danych, aby znaleźć funkcje wzbogacone o CLL sigDMG (tylko geny kodujące białka)14. 
	UWAGA: GeneSCF, jedno z narzędzi do analizy wzbogacenia funkcjonalnego w czasie rzeczywistym, wykorzystuje KEGG i Gene Ontology jako referencyjne bazy danych.</li>
</ol>

<ol><li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+array-based+methylation+profiles+in+prognostic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 115 (2), 296-305 (2010).</li>
<li>Cahill, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((450K-array+analysis+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+reveals+global+DNA+methylation+to+be+relatively+stable+over+time+and+similar+in+resting+and+proliferative+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments.</a> Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).</li>
<li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transcriptional+control+in+major+immunogenetic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+exhibiting+subset-biased+global+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles.</a> Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).</li>
<li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+analysis+detects+widespread+gene-body+DNA+hypomethylation+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).</li>
<li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine+at+single-base+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution.</a> Science. 336 (6083), 934-937 (2012).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+analysis+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome.</a> Cell. 149 (6), 1368-1380 (2012).</li>
<li>Subhash, S., Andersson, P. O., Kosalai, S. T., Kanduri, C., Kanduri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+DNA+methylation+profiling+reveals+new+insights+into+epigenetically+deregulated+protein+coding+and+long+noncoding+RNAs+in+CLL%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL.</a> Clin Epigenetics. 8, 106(2016).</li>
<li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+lymphocytic+leukemia%3A+a+report+from+the+International+Workshop+on+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+updating+the+National+Cancer+Institute-Working+Group+1996+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines.</a> Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).</li>
<li>De Meyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+evaluation+of+methyl+binding+domain+based+kits+for+enrichment+DNA-methylation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing.</a> PLoS One. 8 (3), e59068(2013).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25(2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Subhash, S., Kanduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneSCF%3A+a+real-time+based+functional+enrichment+tool+with+support+for+multiple+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneSCF: a real-time based functional enrichment tool with support for multiple organisms.</a> BMC Bioinformatics. 17 (1), 365(2016).</li>
<li>Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((featureCounts%3A+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Martinelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGPT2+promoter+methylation+is+strongly+associated+with+gene+expression+and+prognosis+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">ANGPT2 promoter methylation is strongly associated with gene expression and prognosis in chronic lymphocytic leukemia.</a> Epigenetics. 8 (7), 720-729 (2013).</li>
<li>Kopparapu, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+miR-26A1+in+chronic+lymphocytic+leukemia+and+mantle+cell+lymphoma%3A+Impact+on+EZH2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression.</a> Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).</li>
<li>Robinson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+affinity-based+genome-wide+DNA+methylation+data%3A+effects+of+CpG+density%2C+amplification+bias%2C+and+copy+number+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation.</a> Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

MBD-seq to opłacalna technika oparta na immunoprecypitacji, którą można wykorzystać do badania wzorców metylacji z pełnym pokryciem całego genomu. Zarówno sekwencja MeDIP (immunoprecypitacja metylowanego DNA, a następnie sekwencjonowanie), jak i sekwencjonowanie MBD powodują wzbogacenie metylowanego DNA bogatego w CpG. Jednak MBD-seq wykazuje większe powinowactwo do wiązania się z regionami o wysokiej zawartości CpG w porównaniu z MeDIP seq19. Za pomocą zestawu do wzbogacania wiązań metylowych moż...

Wykorzystanie technik sekwencjonowania nowej generacji do analizy globalnych profili metylacji DNA stało się w ostatnich latach coraz bardziej popularne. Testy metylacji całego genomu, w tym metody oparte na mikromacierzach i bez mikromacierzy, opracowano w oparciu o: konwersję wodorosiarczynu genomowego DNA, trawienie enzymem restrykcyjnym wrażliwym na metylację oraz immunoprecypitację metylowanego DNA przy użyciu przeciwciał specyficznych dla metylu CpG.
Nieprawidłowa metylacja DNA jest jedną z cech charakterystycznych białaczki i chłoniaków, w tym przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL). Wcześniej kilka grup, w tym nasza, scharakteryzowało profile metylacji DNA różnych podgrup prognostycznych PBL i normalnych, zdrowych kontroli komórek B za pomocą konwersji wodorosiarczynowej genomowego DNA, a następnie metod opartych na mikromacierzach lub sekwencjonowania całego genomu1,2,3,4. Konwersja wodorosiarczynowa genomowego DNA prowadzi do deaminacji niezmodyfikowanych cytozyn do uracylu, pozostawiając zmodyfikowane metylowane cytozyny w genomie. Po przekształceniu status metylacji DNA można określić za pomocą amplifikacji i sekwencjonowania PCR przy użyciu różnych metod ilościowych lub jakościowych, takich jak sekwencjonowanie wodorosiarczynowe oparte na mikromacierzach lub całego genomu (WGBS). Chociaż metody oparte na konwersji wodorosiarczynów mają wiele zalet i są szeroko stosowane w różnych typach nowotworów do analizy poziomów metylacji DNA, istnieje kilka wad związanych z tą techniką. Sekwencjonowanie WGBS umożliwia rozdzielczość pojedynczej pary zasad przy mniejszych ilościach DNA i jest najlepszą opcją do analizy dużej liczby próbek. Jednak ta metoda nie jest w stanie rozróżnić modyfikacji między poziomami 5 mC i 5 hmC w genomie5,6. Ponadto metody oparte na mikromacierzach nie zapewniają pełnego pokrycia genomu.
W niedawnym badaniu z naszego laboratorium7, metody oparte na immunoprecypitacji, a nie konwersji wodorosiarczynów, zostały użyte do identyfikacji wysoce bogatych w CpG, różnicowo metylowanych regionów w skali globalnej u pacjentów z PBL i normalnych zdrowych osób z grupy kontrolnej. Sekwencjonowanie nowej generacji domeny wiążącej inmetylo-CpG (MBD) (MBD-seq), wzbogacenie dwuniciowego fragmentarycznego DNA zależy od stopnia metylacji CpG. Metoda ta może przezwyciężyć wady metody konwersji wodorosiarczynu, a także może zapewnić pokrycie całego genomu metylacją CpG w sposób bezstronny i niezależny od PCR. Dodatkowo, w przeciwieństwie do metod mikromacierzy opartych na konwersji wodorosiarczynu, MBD-seq może być używany do analizy stanu metylacji powtarzających się elementów, takich jak długie przeplatane elementy jądrowe (LINE), krótkie przeplatane elementy jądrowe (SINE), długie powtórzenia końcowe (LTRS) itp. Jednak w porównaniu z metodami konwersji wodorosiarczynów, protokół MBD-seq wymaga stosunkowo dużej ilości wejściowego DNA. Ponadto jakość odczytów sekwencjonowania i danych zależy od swoistości, powinowactwa i jakości zastosowanych przeciwciał.
Obecne badanie wyjaśnia szczegółowy protokół MBD-seq do wzbogacania metylowanego DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Wykorzystuje komercyjny zestaw do wzbogacania wiązania metylowanego DNA (wymieniony w tabeli materiałów), a także potok obliczeniowy do wizualizacji i interpretacji danych sekwencjonowania metylacji w celu identyfikacji specyficznych dla CLL regionów hiper- i hipometylowanych w porównaniu z normalnymi zdrowymi kontrolami. Zasadniczo metoda ta wykorzystuje zdolność MBD ludzkiego białka MBD2 do interakcji z metylowanymi CpG do ekstrakcji DNA wzbogaconego metylowanymi CpG, a następnie następuje wysokoprzepustowe sekwencjonowanie metylowanego DNA.

<table><tbody><tr><td>Dneasy Zestaw do krwi i tkanek</td><td>Qaigen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przygotowania limfatycznego</td><td>A X I S-S H I E L D</td><td></td><td></td></tr> 1114544 <tr><td>Nano kropla 2000</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TE bufor pH 8</td><td>Sigma aldrich</td><td>93283</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe urządzenie soniczne Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200</td><td></td></tr><tr><td>Probówki biologiczne TPX 1,5 ml</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-300</td><td></td></tr><tr><td>3 M octan sodu</td><td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>E-gel iBase bezpieczny zestaw do obrazowania</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G6465EU</td><td></td></tr><tr><td>E-gel 2% Żele agarozowe</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>G441002</td><td></td></tr><tr><td>Methylminer Zestaw do wzbogacania metylowanego DNA</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>ME10025</td><td></td></tr><tr><td>Labquake Tube Shaker/Rotatory</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>415110</td><td></td></tr><tr><td>Dynal MPC-S</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy</td><td>VWR</td><td>12620-848</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanool</td><td>Dowolna firma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od DNA</td><td>Milli Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Środek strącający DNA (octan sodu 3M)</td> <td>Diagenode</td><td>C03030002</td><td></td></tr><tr><td>Bezpieczne uszczelnienie 1,5 ml probówek eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>4036-3204</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów dsDNA HS</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Probówki kubitowe 0,5 ml</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kubit</td><td>Thermo Fischersceintific</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Platforma Illumina Hiseq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water&nbsp; Kąpiel</td><td>Grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok ciepła</td><td>grant</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obracacz rurki</td><td>Labquake</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa analiza metylacji dna przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-cpg u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

Rola długich niekodujących RNA (lncRNA) w raku wysuwa się na pierwszy plan ze względu na rosnące zainteresowanie zrozumieniem ich mechanistycznych funkcji podczas rozwoju i progresji raka. Mimo to globalna regulacja epigenetyczna lncRNA i powtarzających się sekwencji w nowotworach nie została dobrze zbadana, szczególnie w przewlekłej białaczce limfocytowej (CLL). Badanie to koncentruje się na unikalnym podejściu: opartym na immunoprecypitacji wychwytywaniu dwuniciowych, metylowanych fragmentów DNA przy użyciu białek domeny wiążącej metyl (MBD), a następnie sekwencjonowaniu nowej generacji (MBD-seq). W badaniu wykorzystano próbki pacjentów z PBL należące do dwóch podgrup prognostycznych: (5 próbek z mutacją IGVH + 5 próbek niezmutowanych IGVH). Analiza wykazała 5 800 hipermetylowanych i 12 570 hipometylowanych genów specyficznych dla CLL (cllDMG) w porównaniu z normalnymi zdrowymi grupą kontrolną. Co ważne, wyniki te zidentyfikowały kilka specyficznych dla CLL, różnicowo metylowanych lncRNA, powtarzających się elementów i genów kodujących białka o potencjalnej wartości prognostycznej. W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół dla sekwencyjnego MBD i bioinformatycznego potoku opracowanego w celu kompleksowej analizy globalnych profili metylacji w regionach o wysokiej zawartości CpG przy użyciu próbek pacjentów z CLL. Na koniec gen kodujący białko i lncRNA poddano walidacji za pomocą pirosekwencjonowania, które jest wysoce ilościową metodą analizy poziomów metylacji CpG w celu dalszego potwierdzenia ustaleń z protokołu MBD-seq.

Metodę MBD-seq przeprowadzono niedawno u pacjentów z CLL oraz dopasowanych, normalnych, zdrowych kontroli w celu zidentyfikowania specyficznych dla CLL genów różnicowo hiper- i hipometylowanych7. Potok eksperymentalny i bioinformatyczny wykorzystany do analizy danych uzyskanych z próbek CLL i zdrowych próbek kontrolnych przedstawiono na Rysunku 1A oraz 1B. Analizy te pozwoliły zidentyfikować kilka specyficznych dla CLL...

Ta praca opisuje zoptymalizowany protokół sekwencjonowania domeny wiążącej metylo-CpG (MBD) oraz potok obliczeniowy do identyfikacji różnie metylowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL).

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza globalnego profilu metylacji oraz identyfikacja regionów bogatych w CpG o różnym stopniu metylacji u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową za pomocą sekwencjonowania następnej generacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny epigenetyki, takie jak identyfikacja potencjalnych genów o sygnaturze specyficznej dla CLL, patogeneza choroby oraz rokowanie. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie pełnego, genomowego pokrycia metylacji CpG w sposób nieobciążony i niezależny od reakcji PCR.Na początek, zgodnie z protokołem producenta, należy wykorzystać dostępny w handlu zestaw do ekstrakcji DNA w celu wyizolowania genomicznego DNA z próbek krwi pacjenta oraz normalnych mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Po ilościowym oznaczeniu genomicznego DNA opisanym w protokole tekstowym, należy rozcieńczyć 5 µg genomicznego DNA z każdej próbki do całkowitej objętości 200 µl przy użyciu buforu TE, aby uzyskać końcowe stężenie 25 ng/µl. Następnie, przy użyciu sonikatora, należy przeprowadzić sonikację w specjalnie zaprojektowanych probówkach przez łącznie 30 cykli, składających się z 30 sekund pracy i 30 sekund przerwy.Po każdych pięciu cyklach krótko wiruj probówki, aby zebrać próbki na dnie. Sprawdź zakres sonikacji dla wszystkich próbek za pomocą elektroforezy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować magnetyczne kulki streptawidynowe, najpierw resuspenderuj je z probówki z zapasem dostarczonej w zestawie.Delikatnie pipetuj kuleczki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Dla każdych 5 µg próbki fragmentowanego DNA przenieś 50 µl kuleczek do oddzielnych, czystych i oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 µl 1X buforu do przemywania kuleczek, aby uzyskać objętość końcową 100 µl.Umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę, aby wszystkie kule magnetyczne skoncentrowały się na wewnętrznej ściance probówki od strony magnesu. Usuń ciecz za pomocą pipety 200 µL, uważając, aby nie dotknąć kulek. Następnie zdejmij probówki ze statywu magnetycznego, dodaj 250 µL buforu do mycia kulek 1X i delikatnie wymieszaj kulki za pomocą pipety.Po powtórzeniu tych kroków co najmniej cztery razy dla wszystkich próbek, na koniec resuspenduj próbki w 250 µL buforu do płukania kulek 1X. Przechowuj próbki w lodzie. Aby związać białko MBD-biotyny z wypłukanymi kuleczkami, najpierw dodaj 35 µL białka do osobnych probówek i zwiększ całkowitą objętość do 250 µL, używając buforu do płukania kulek 1X.Dodaj 250 µL rozcieńczonego białka MBD do 250 µL wypłukanych kulek i pozostaw je w rotacji end-to-end w temperaturze pokojowej. Po mieszaniu kulek z białkiem przez jedną godzinę, wypłucz związane z białkiem magnetyczne kulki streptawidynowe, umieszczając probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę. Usuń ciecz za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć kulek.Następnie dodaj 250 µl buforu do płukania kulek 1X i umieść probówki na mieszalniku rotacyjnym na pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawiesić wypłukane kulki MBD-biotin w 200 µl buforu do płukania kulek 1X, przygotowując je do wychwytu zmetylowanego DNA. Do czystej probówki 1,5-ml wolnej od nukleazy DNazy dodaj 100 µl buforu do płukania kulek oraz 180 µl pofragmentowanego DNA genomicznego.Dopełnij końcową objętość do 500 µL, używając wody wolnej od DNaz. Do pozostałych 20 liters pofragmentowanego DNA genomowego dodaj 380 µL wody wolnej od DNaz. Zamroź próbki, aby móc je później poddać dalszej obróbce i wykorzystać jako kontrole wejściowego DNA.Probieńce zawierające przemyte kulki MBD-biotin należy umieścić na statywie magnetycznym na jedną minutę, a następnie usunąć ciecz, nie naruszając kulek. Następnie należy dodać 500 µL pofragmentowanego DNA genomicznego rozcieńczonego w buforze do przemywania kulek. Wszystkie probówki należy szczelnie zamknąć folią parafinową i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end z prędkością 8 do 10 obr./min.Po reakcji wiązania DNA z koralikami MBD, umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę, aby skoncentrować wszystkie koraliki na wewnętrznej ściance probówki. Usuń nadsącz pipetą, nie dotykając koralików, a tę frakcję niezwiązanego DNA zachowaj w lodzie. Następnie dodaj 200 µL 1X buforu do mycia koralików do koralików i umieść probówki na mieszalniku obrotowym na trzy minuty w temperaturze pokojowej.Po usunięciu cieczy za pomocą statywu magnetycznego, powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby usunąć pozostałe niezwiązane DNA. Po ostatnim płukaniu dodaj 200 µl wysokosolnego buforu elucyjnego dołączonego do zestawu, aby eluować DNA. Następnie umieść probówki na statywie rotacyjnym na 15 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji umieść próbki na statywie magnetycznym na jedną minutę i za pomocą pipety ostrożnie przenieś nadpływ do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 200 µl buforu elucyjnego o wysokim stężeniu soli do kulek i powtórz elucję, rotując probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 15 minut. Dodaj drugą frakcję elucyjną do tej samej probówki, w której znajduje się 200 µl pierwszej frakcji elucyjnej.Aby wyprecypitować DNA, do 400 µL eluatowanego DNA należy dodać 1 µL glikogenu, 40 µL 3 M octanu sodu (pH 5,2) oraz 800 µL lodowatego bezwodnego etanolu. Odczynniki należy dodać również do wcześniej zamrożonych 400 µL próbek kontrolnych DNA wejściowego. Probówki należy dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, a następnie inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.Następnego dnia odwiruj probówki przy 12 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ostrożnie odlej nadsącz, nie naruszając osadu. Następnie dodaj 500 µL 70% etanolu i wymieszaj zawartość probówek na wortexie.Po ponownym odwirowaniu probówek w tych samych warunkach, ale przez 15 minut, należy ostrożnie usunąć nadnadstrawdę za pomocą pipety. Następnie wirować probówki z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć pozostały etanol za pomocą końcówki pipety. Osad należy suszyć na powietrzu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Na koniec, przed przystąpieniem do ilościowego oznaczenia zmetylowanego DNA, sekwencjonowania MBD oraz analizy opisanej w protokole tekstowym, dodaj 10 µl wody wolnej od DNaz do osadu DNA. Analiza wykazała obecność kilku obszarów różnicowo hiper- i hipometylowanych, które były wzbogacone w próbkach CLL w porównaniu z normalnymi kontrolami. Te różnicowo zmetylowane regiony zostały przypisane do różnych klas genów kodujących białka oraz genów niekodujących.Ostatecznie analiza danych wykazała znaczną zbieżność między regionami różnicowo zmetylowanymi związanymi z CLL, uzyskanymi z dwóch różnych porównań z grupami kontrolnymi. W tym przypadku wszystkie miejsca CpG zlokalizowane w regionach docelowych dwóch genów różnicowo zmetylowanych zostały zwalidowane w dużej liczbie próbek CLL przy użyciu pirosekwencjonowania. Przedstawiono tutaj optymalny zakres sonikacji wymagany dla tej metody.Ten zakres pofragmentowanego DNA jest optymalny i bardziej odpowiedni do celów sekwencjonowania nowej generacji. Po opanowaniu techniki, prawidłowo przeprowadzona procedura może zająć dwa dni. Podczas wykonywania tej procedury kluczowymi czynnikami wpływającymi na końcowy odzysk DNA są jakość i ilość użytego materiału wyjściowego DNA oraz zakres fragmentacji DNA po sonikacji.Zdecydowaliśmy się na zastosowanie tej metody, ponieważ jest to pierwsze globalne badanie metylacji w CLL oparte na immunoprecypitacji w celu wzbogacenia metylowanego DNA, obejmujące wszystkie zmetylowane regiony w całym genomie. Znaczenie tej techniki rozciąga się na prognozowanie i terapię, ponieważ zidentyfikowane geny o zróżnicowanej sygnaturze metylacji mogą służyć jako globalne biomarkery prawidłowe oraz epigenetyczne cele terapeutyczne. Po wykonaniu tej procedury wzbogacone metylowane DNA może być wykorzystane w innych zastosowaniach analitycznych, takich jak hybrydyzacja lub przeprowadzanie analiz mikromacierzy, aby łatwo porównać metalomy między dwiema próbkami lub jednostkami chorobowymi, wykorzystując stały zestaw miejsc CpG obecnych na macierzach.Wreszcie, jest to kosztowo efektywna technika analizy dużej liczby próbek pacjentów w celu wykrycia zmetylowanych sekwencji w całym genomie, w tym sekwencji adnotowanych obejmujących geny kodujące białka, a także sekwencji nieadnotowanych obejmujących elementy powtarzalne i długie niekodujące RNA.

comprehensive-dna-methylation-analysis-using-methyl-cpg-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Złotym standardem analizy metylacji DNA jest sekwencjonowanie genomowe DNA poddanego konwersji pirosiarczynowej. Metoda ta wykorzystuje zwiększoną wrażliwość cytozyny w porównaniu z 5-metylocytozyną (5-MeC) na deaminację pirosiarczynową w warunkach kwasowych. Niezmetylowane cytozyny można odróżnić od cytozyn zmetylowanych po amplifikacji PCR docelowego DNA genomowego.

Metylacja DNA: modyfikacja i analiza pirosiarczynowa

Ten film demonstruje technikę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej multipleksowej do jednoczesnej kwantyfikacji regionów metylowanego DNA w różnych populacjach białych krwinek jako wczesnego biomarkera dla diagnozy klinicznej i prognozowania.

Reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej Multiplex w celu wykrycia metylacji DNA w leukocytach

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing to metoda przygotowania bibliotek sekwencjonowania do analizy metylacji DNA opartej na trawieniu enzymem restrykcyjnym połączonym z konwersją wodorosiarczynu cytozyny. Protokół ten wymaga 50 ng materiału wyjściowego i daje dane o rozdzielczości par zasad w regionach genomowych bogatych w GC.

Ulepszone sekwencjonowanie wodorosiarczynów o zmniejszonej reprezentacji do oceny metylacji DNA w rozdzielczości par zasad

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

Tutaj opisujemy procedurę analizy całego genomu metylacji DNA w nowotworach przewodu pokarmowego. Procedura ta ma znaczenie dla badań, które badają związki między wzorcami metylacji genów a czynnikami przyczyniającymi się do kancerogenezy w nowotworach przewodu pokarmowego.

Analiza całego genomu metylacji DNA w raku przewodu pokarmowego

Markery epigenetyczne są używane do podtypowania białych krwinek (WBC) poprzez kwantyfikację wzorców metylacji DNA. Protokół ten przedstawia metodę reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (mdPCR) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego na bazie elastomeru termoplastycznego (TPE) do generowania kropel, co pozwala na precyzyjną i specyficzną dla metylacji multipleksową docelową kwantyfikację różnic WBC.

Specyficzny dla metylacji multipleksowy PCR kropelkowy przy użyciu generatora kropel polimerowych do diagnostyki hematologicznej

Niniejsze badanie opisuje proces zarządzania danymi metylacji DNA uzyskanymi za pomocą technologii mikromacierzy. Protokół przedstawia kroki od przygotowania próbki do analizy danych. Wszystkie procedury są szczegółowo opisane, a film pokazuje istotne kroki.

Przygotowanie próbki do bioinformatycznej analizy metylacji DNA: strategia asocjacyjna dla otyłości i powiązane badania cech

Poznaj metodę MBD-seq do analizy metylacji DNA u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową. Technika zapewnia pełne pokrycie genomu CpG w sposób niezależny od PCR i pozwala identyfikować różnicowo zmetylowane regiony.

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (Wideo) | JoVE Journal

Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Przeglądaj więcej filmów