Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Ogólnym celem tej procedury jest analiza globalnego profilu metylacji oraz identyfikacja regionów bogatych w CpG o różnym stopniu metylacji u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową za pomocą sekwencjonowania następnej generacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny epigenetyki, takie jak identyfikacja potencjalnych genów o sygnaturze specyficznej dla CLL, patogeneza choroby oraz rokowanie. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie pełnego, genomowego pokrycia metylacji CpG w sposób nieobciążony i niezależny od reakcji PCR.

Na początek, zgodnie z protokołem producenta, należy wykorzystać dostępny w handlu zestaw do ekstrakcji DNA w celu wyizolowania genomicznego DNA z próbek krwi pacjenta oraz normalnych mononuklearnych komórek krwi obwodowej. Po ilościowym oznaczeniu genomicznego DNA opisanym w protokole tekstowym, należy rozcieńczyć 5 µg genomicznego DNA z każdej próbki do całkowitej objętości 200 µl przy użyciu buforu TE, aby uzyskać końcowe stężenie 25 ng/µl. Następnie, przy użyciu sonikatora, należy przeprowadzić sonikację w specjalnie zaprojektowanych probówkach przez łącznie 30 cykli, składających się z 30 sekund pracy i 30 sekund przerwy.

Po każdych pięciu cyklach krótko wiruj probówki, aby zebrać próbki na dnie. Sprawdź zakres sonikacji dla wszystkich próbek za pomocą elektroforezy DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować magnetyczne kulki streptawidynowe, najpierw resuspenderuj je z probówki z zapasem dostarczonej w zestawie.

Delikatnie pipetuj kuleczki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Dla każdych 5 µg próbki fragmentowanego DNA przenieś 50 µl kuleczek do oddzielnych, czystych i oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 µl 1X buforu do przemywania kuleczek, aby uzyskać objętość końcową 100 µl.

Umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę, aby wszystkie kule magnetyczne skoncentrowały się na wewnętrznej ściance probówki od strony magnesu. Usuń ciecz za pomocą pipety 200 µL, uważając, aby nie dotknąć kulek. Następnie zdejmij probówki ze statywu magnetycznego, dodaj 250 µL buforu do mycia kulek 1X i delikatnie wymieszaj kulki za pomocą pipety.

Po powtórzeniu tych kroków co najmniej cztery razy dla wszystkich próbek, na koniec resuspenduj próbki w 250 µL buforu do płukania kulek 1X. Przechowuj próbki w lodzie. Aby związać białko MBD-biotyny z wypłukanymi kuleczkami, najpierw dodaj 35 µL białka do osobnych probówek i zwiększ całkowitą objętość do 250 µL, używając buforu do płukania kulek 1X.

Dodaj 250 µL rozcieńczonego białka MBD do 250 µL wypłukanych kulek i pozostaw je w rotacji end-to-end w temperaturze pokojowej. Po mieszaniu kulek z białkiem przez jedną godzinę, wypłucz związane z białkiem magnetyczne kulki streptawidynowe, umieszczając probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę. Usuń ciecz za pomocą pipety, uważając, aby nie dotknąć kulek.

Następnie dodaj 250 µl buforu do płukania kulek 1X i umieść probówki na mieszalniku rotacyjnym na pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap płukania jeszcze dwa razy, a następnie ponownie zawiesić wypłukane kulki MBD-biotin w 200 µl buforu do płukania kulek 1X, przygotowując je do wychwytu zmetylowanego DNA. Do czystej probówki 1,5-ml wolnej od nukleazy DNazy dodaj 100 µl buforu do płukania kulek oraz 180 µl pofragmentowanego DNA genomicznego.

Dopełnij końcową objętość do 500 µL, używając wody wolnej od DNaz. Do pozostałych 20 liters pofragmentowanego DNA genomowego dodaj 380 µL wody wolnej od DNaz. Zamroź próbki, aby móc je później poddać dalszej obróbce i wykorzystać jako kontrole wejściowego DNA.

Probieńce zawierające przemyte kulki MBD-biotin należy umieścić na statywie magnetycznym na jedną minutę, a następnie usunąć ciecz, nie naruszając kulek. Następnie należy dodać 500 µL pofragmentowanego DNA genomicznego rozcieńczonego w buforze do przemywania kulek. Wszystkie probówki należy szczelnie zamknąć folią parafinową i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end z prędkością 8 do 10 obr./min.

Po reakcji wiązania DNA z koralikami MBD, umieść probówki na statywie magnetycznym na jedną minutę, aby skoncentrować wszystkie koraliki na wewnętrznej ściance probówki. Usuń nadsącz pipetą, nie dotykając koralików, a tę frakcję niezwiązanego DNA zachowaj w lodzie. Następnie dodaj 200 µL 1X buforu do mycia koralików do koralików i umieść probówki na mieszalniku obrotowym na trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu cieczy za pomocą statywu magnetycznego, powtórz płukanie jeszcze dwa razy, aby usunąć pozostałe niezwiązane DNA. Po ostatnim płukaniu dodaj 200 µl wysokosolnego buforu elucyjnego dołączonego do zestawu, aby eluować DNA. Następnie umieść probówki na statywie rotacyjnym na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji umieść próbki na statywie magnetycznym na jedną minutę i za pomocą pipety ostrożnie przenieś nadpływ do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 200 µl buforu elucyjnego o wysokim stężeniu soli do kulek i powtórz elucję, rotując probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 15 minut. Dodaj drugą frakcję elucyjną do tej samej probówki, w której znajduje się 200 µl pierwszej frakcji elucyjnej.

Aby wyprecypitować DNA, do 400 µL eluatowanego DNA należy dodać 1 µL glikogenu, 40 µL 3 M octanu sodu (pH 5,2) oraz 800 µL lodowatego bezwodnego etanolu. Odczynniki należy dodać również do wcześniej zamrożonych 400 µL próbek kontrolnych DNA wejściowego. Probówki należy dokładnie wymieszać za pomocą wortexa, a następnie inkubować w temperaturze -80 °C przez noc.

Następnego dnia odwiruj probówki przy 12 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Ostrożnie odlej nadsącz, nie naruszając osadu. Następnie dodaj 500 µL 70% etanolu i wymieszaj zawartość probówek na wortexie.

Po ponownym odwirowaniu probówek w tych samych warunkach, ale przez 15 minut, należy ostrożnie usunąć nadnadstrawdę za pomocą pipety. Następnie wirować probówki z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć pozostały etanol za pomocą końcówki pipety. Osad należy suszyć na powietrzu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec, przed przystąpieniem do ilościowego oznaczenia zmetylowanego DNA, sekwencjonowania MBD oraz analizy opisanej w protokole tekstowym, dodaj 10 µl wody wolnej od DNaz do osadu DNA. Analiza wykazała obecność kilku obszarów różnicowo hiper- i hipometylowanych, które były wzbogacone w próbkach CLL w porównaniu z normalnymi kontrolami. Te różnicowo zmetylowane regiony zostały przypisane do różnych klas genów kodujących białka oraz genów niekodujących.

Ostatecznie analiza danych wykazała znaczną zbieżność między regionami różnicowo zmetylowanymi związanymi z CLL, uzyskanymi z dwóch różnych porównań z grupami kontrolnymi. W tym przypadku wszystkie miejsca CpG zlokalizowane w regionach docelowych dwóch genów różnicowo zmetylowanych zostały zwalidowane w dużej liczbie próbek CLL przy użyciu pirosekwencjonowania. Przedstawiono tutaj optymalny zakres sonikacji wymagany dla tej metody.

Ten zakres pofragmentowanego DNA jest optymalny i bardziej odpowiedni do celów sekwencjonowania nowej generacji. Po opanowaniu techniki, prawidłowo przeprowadzona procedura może zająć dwa dni. Podczas wykonywania tej procedury kluczowymi czynnikami wpływającymi na końcowy odzysk DNA są jakość i ilość użytego materiału wyjściowego DNA oraz zakres fragmentacji DNA po sonikacji.

Zdecydowaliśmy się na zastosowanie tej metody, ponieważ jest to pierwsze globalne badanie metylacji w CLL oparte na immunoprecypitacji w celu wzbogacenia metylowanego DNA, obejmujące wszystkie zmetylowane regiony w całym genomie. Znaczenie tej techniki rozciąga się na prognozowanie i terapię, ponieważ zidentyfikowane geny o zróżnicowanej sygnaturze metylacji mogą służyć jako globalne biomarkery prawidłowe oraz epigenetyczne cele terapeutyczne. Po wykonaniu tej procedury wzbogacone metylowane DNA może być wykorzystane w innych zastosowaniach analitycznych, takich jak hybrydyzacja lub przeprowadzanie analiz mikromacierzy, aby łatwo porównać metalomy między dwiema próbkami lub jednostkami chorobowymi, wykorzystując stały zestaw miejsc CpG obecnych na macierzach.

Wreszcie, jest to kosztowo efektywna technika analizy dużej liczby próbek pacjentów w celu wykrycia zmetylowanych sekwencji w całym genomie, w tym sekwencji adnotowanych obejmujących geny kodujące białka, a także sekwencji nieadnotowanych obejmujących elementy powtarzalne i długie niekodujące RNA.