Kompleksowa analiza metylacji DNA przy użyciu metody opartej na wychwytywaniu domeny wiążącej metylo-CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie globalnego profilowania metylacji i identyfikacja zróżnicowanych regionów bogatych w CpG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie epigenetyki, takie jak identyfikacja potencjalnych genów sygnaturowych specyficznych dla CLL, patogeneza choroby i rokowanie. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona pełne pokrycie całego genomu metylacji CpG w sposób bezstronny i niezależny od PCR.

Na początek użyj dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji DNA, aby wyizolować genomowe DNA od pacjenta i normalne próbki komórek jednojądrzastych krwi obwodowej zgodnie z protokołem producenta. Po ilościowym określeniu genomowego DNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym, rozcieńczyć 5 mikrogramów genomowego DNA z każdej próbki, do łącznej objętości 200 mikrolitrów, używając buforu TE, uzyskując końcowe stężenie 25 nanogramów na mikrolitr. Następnie wykonaj sonikację w specjalnie zaprojektowanych probówkach, używając sonikatora, w sumie 30 cykli po 30 sekund włączenia i 30 sekund wyłączenia.

Po każdych pięciu cyklach należy krótko obrócić probówki, aby zebrać próbki na dno. Sprawdź zakres sonikacji dla wszystkich próbek za pomocą elektroforezy DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Aby przygotować magnetyczne kulki streptawidyny, najpierw ponownie zawieś je na rurce dostarczonej z zestawem.

Delikatnie pipetować kulki w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Na każde pięć mikrogramów rozdrobnionej próbki DNA umieść 50 mikrolitrów kulek w oddzielnych, czystych i oznakowanych 1,5-mililitrowych probówkach. Dodaj 50 mikrolitrów bufora do płukania kulek 1X, aby osiągnąć końcową objętość 100 mikrolitrów.

Umieść rurki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby wszystkie kulki magnetyczne skoncentrowały się na wewnętrznej ściance rurki skierowanej w stronę magnesu. Usuń płyn bez dotykania kulek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Następnie wyjmij probówki ze stojaka magnetycznego, dodaj 250 mikrolitrów buforu do płukania kulek 1X i delikatnie wymieszaj kulki za pomocą pipety.

Po powtórzeniu tych kroków co najmniej cztery razy dla wszystkich próbek, na koniec ponownie zawieś próbki w 250 mikrolitrach 1X buforu do płukania kulek. Próbki należy przechowywać na lodzie. Aby związać białko MBD-biotyny z przemytymi kulkami, najpierw dodaj 35 mikrolitrów białka do oddzielnych probówek i zwiększ całkowitą objętość do 250 mikrolitrów za pomocą bufora do płukania kulek 1X.

Dodaj 250 mikrolitrów rozcieńczonego białka MBD do 250 mikrolitrów umytych kulek i pozostaw je na rotacji od końca do końca w temperaturze pokojowej. Po mieszaniu kulek w białku przez godzinę, umyj magnetyczne kulki streptawidyny związane z białkiem, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę. Usuń płyn bez dotykania kulek za pomocą pipety.

Następnie dodaj 250 mikrolitrów bufora do mycia kulek 1X i umieść probówki na mikserze rotacyjnym na pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz etap prania jeszcze dwa razy przed ponownym zawiesieniem umytych kulek MBD-biotyny w 200 mikrolitrach bufora do płukania kulek 1X, dzięki czemu kulki są gotowe do wychwytywania metylowanego DNA. W czystej 1,5-mililitrowej probówce wolnej od DNaz dodaj 100 mikrolitrów mililitrowego buforu do płukania kulek i 180 mikrolitrów rozdrobnionego genomowego DNA.

Doprowadź końcową objętość do 500 mikrolitrów za pomocą wody wolnej od DNaz. Dodaj 380 mikrolitrów wody wolnej od DNaz do pozostałych 20 litrów rozdrobnionego genomowego DNA. Zamroź próbki, aby później je przetworzyć i wykorzystać jako wejściowe kontrole DNA.

Umieść probówki zawierające umyte kulki MBD-biotyny na stojaku magnetycznym na jedną minutę i usuń płyn, nie naruszając kulek. Następnie dodaj 500 mikrolitrów rozdrobnionego genomowego DNA rozcieńczonego w buforze do płukania kulek. Szczelnie uszczelnij wszystkie probówki folią parafinową i pozostaw je na noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza na stojaku obrotowym od końca do końca z prędkością od 8 do 10 obrotów na minutę.

Po reakcji wiązania kulek DNA i MBD umieść probówki na stojaku magnetycznym na jedną minutę, aby skoncentrować wszystkie kulki na wewnętrznej ściance probówki. Usunąć cieczy sklarowanej nad osadem za pomocą pipety, nie dotykając kulek, i zachować tę niezwiązaną frakcję próbki DNA na lodzie. Następnie dodaj 200 mikrolitrów bufora do płukania kulek 1X do kulek i umieść probówki na obrotowym stojaku na trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu płynu za pomocą podstawki magnetycznej powtórz mycie jeszcze dwa razy, aby usunąć resztki niezwiązanego DNA. Po ostatnim płukaniu dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli dostarczonego w zestawie, aby wymyć DNA. Następnie umieść probówki na obrotowym stojaku na 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji umieść je na stojaku magnetycznym na jedną minutę i za pomocą pipety ostrożnie przenieś supernatant do nowej, czystej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu elucyjnego o wysokiej zawartości soli do kulek i powtórz elucję, obracając probówki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 15 minut. Dodaj drugą elucję do tej samej probówki zawierającej 200 mikrolitrów pierwszej elucji.

Aby wytrącić DNA, dodaj jeden mikrolitr glikogenu, 40 mikrolitrów trzech molowych octanu sodu o pH 5,2 i 800 mikrolitrów lodowatego absolutnego etanolu do 400 mikrolitrów wymytego DNA. Dodaj również odczynniki do wcześniej zamrożonych 400 mikrolitrów wejściowych próbek kontrolnych DNA. Dobrze wymieszaj probówki, wirując, a następnie inkubuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia odwiruj probówki w temperaturze 12 000 g i 4 stopni Celsjusza przez 30 minut. Sklarowany osad należy wyrzucić ostrożnie, nie naruszając osadu. Następnie dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu i wymieszaj rurki.

Po ponownym odwirowaniu probówek w tych samych warunkach, ale przez 15 minut, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Następnie odwirować probówki z maksymalną prędkością przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i całkowicie usunąć resztki etanolu za pomocą końcówki pipety. Suszyć granulki na powietrzu przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Na koniec dodaj 10 mikrolitrów wody wolnej od DNaz do osadu DNA przed przystąpieniem do kwantyfikacji metylowanego DNA, sekwencjonowania MBD i analizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Analiza zidentyfikowała kilka różnie hiper- i hipometylowanych regionów wzbogaconych w próbkach PBL w porównaniu z normalnymi kontrolami. Te różnie zmetylowane regiony zmapowano do różnych klas genów kodujących i niekodujących białek.

Wreszcie, analiza danych wykazała znaczne nakładanie się na siebie zróżnicowanych regionów metylowanych związanych z PBL uzyskanych z dwóch różnych porównań kontroli normalnej. W tym przypadku wszystkie miejsca CpG zlokalizowane w regionach docelowych dwóch różnie metylowanych genów zostały zwalidowane w dużej liczbie próbek CLL za pomocą pirosekwencjonowania. Optymalny zakres sonikacji wymagany dla tej metody jest zilustrowany tutaj.

Ten zakres rozdrobnionego DNA jest idealny i bardziej odpowiedni do celów sekwencjonowania nowej generacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury, kluczowymi czynnikami, które wpływają na ostateczne odzyskanie DNA, są jakość i ilość użytego wejściowego DNA oraz zakres pofragmentowanego DNA po sonikacji.

Zdecydowaliśmy się na zastosowanie tej metody, ponieważ jest to pierwsze globalne badanie metylacji CLL, które opiera się na immunoprecypitacji w celu wzbogacenia metylowanego DNA obejmującego wszystkie metylowane regiony w całym genomie. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku prognozowania lub terapii, ponieważ zidentyfikowane geny o zróżnicowanej metylacji sygnatury mogą służyć jako globalne normalne biomarkery i cele epigenetyczne terapii. Po tej procedurze wzbogacone metylowane DNA może być wykorzystane do innych dalszych zastosowań, takich jak hybrydyzacja lub wykonywanie mikromacierzy, aby łatwo porównać metalomy między dwiema próbkami lub jednostkami chorobowymi przy użyciu ustalonego zestawu miejsc CpG obecnych na matrycach.

Wreszcie, jest to opłacalna technika analizy dużej liczby próbek pacjentów pod kątem sekwencji metylowych w całym genomie, w tym sekwencji z adnotacjami obejmujących geny kodujące białka, a także sekwencji bez adnotacji obejmujących powtarzające się elementy i długie niekodujące RNA.