Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Ogólnym celem tej techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jest zwięzła analiza liczby i długości telomerów u C.Elegans. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regenezy guza, alternatywnego wydłużania telomerów i starzenia się komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedury są zwięzłe, a telomery można zwizualizować i określić ilościowo w czasie krótszym niż 24 godziny.

Zbierz grawitacyjne dorosłe robaki z niewielką ilością płynnego podłoża bez zanieczyszczeń w 15-mililitrowej tubce. Teraz umyj robaki trzy razy w następujący sposób. Dodaj bufor M9, aby uzyskać całkowitą objętość 15 mililitrów.

Następnie obracać probówkę z natężeniem 300 G przez trzy minuty i wylać roztwór powyżej osadu robaków. Następnie powtórz proces. Jeśli po odwirowaniu robaki unoszą się na wodzie, zwolnij hamulec wirówki.

Po trzecim praniu pozostaw robaki z 5 mililitrami M9. Następnie dodaj 6,5 mililitra wody destylowanej, dwa mililitry hiperchlorynu i jeden mililitr pięciomolowego wodorotlenku potasu. Pozwól robakom inkubować w tym roztworze wybielającym przez trzy minuty z mieszaniem 50 obr./min. Następnie zawiruj robaki, aby je rozciąć i uwolnić jaja.

Pod mikroskopem preparacyjnym poszukaj uwolnionych jaj. Jeśli nie zostały jeszcze uwolnione, kontynuuj inkubację lub do ośmiu minut. Jeśli robaki są w większości rozpuszczone, a jaja są wolne, napełnij probówkę do 15 mililitrów M9 i umyj jaja trzy razy, tak jak robaki były myte wcześniej.

Do umytych jaj, z usuniętą większością M9, napełnij objętość do 500 mikrolitrów PBST, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 4% PFA. Teraz załaduj 40 mikrolitrów porcji jaj w 2% PFA do studzienek szkiełek pokrytych polilizyną. Następnie przenieś szkiełka do nawilżonej komory i pozwól im inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

W przypadku tego protokołu należy przechowywać aluminiowy blok na suchym lodzie w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przechowuj również metanol i aceton w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu etapu utrwalania usuń większość roztworu PFA ze szkiełek, pozostawiając około pięciu mikrolitrów.

Następnie umieść drugie szkiełka pokryte polilizyną na każdym szkiełku z próbką, tak aby dwie powlekane powierzchnie skleiły się ze sobą, zatrzymując tkanki w studzience. Jeśli jest nadmierny utrwalacz, zetrzyj go chusteczką. Teraz zamroź szkiełka, umieszczając je na zimnym aluminiowym bloku na co najmniej 15 minut.

W międzyczasie przygotuj kąpiele metanolowe i acetonowe na lodzie na zjeżdżalniach. Po zamrożeniu szkiełek przekręć jedną, aby zamrozić próbkę. Wyrzuć górne szkiełko i zanurz dolne szkiełko w lodowatym metanolu na pięć minut.

Zrób to dla wszystkich próbek. Kraking zamrażalniczy pozwala na przenikanie sond i przeciwciał przez twardą skorupkę jaja. Jeśli jaja zostaną pomyślnie rozmrożone, można je zobaczyć na obu szkiełkach.

Po co najmniej pięciu minutach w metanolu przenieś szkiełka do zimnego acetonu na pięć minut. W ciągu kolejnych pięciu minut zanurzyć próbki w PBST trzy razy przez pięć minut na kąpiel. Po umyciu PBST szkiełka mogą być przechowywane w 100% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni.

Aby kontynuować, dodaj 20 mikrolitrów roztworu RNazy do studzienek na próbki i inkubuj je w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj szkiełka w 2x SSCT dwa razy przez 15 minut na mycie. Po dwóch płukaniach dodaj do próbek 20 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w wilgotnej komorze.

W międzyczasie przygotuj sondę na dwuniciową sondę DNA. Denaturuj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie krótko schładzaj na lodzie. Po godzinie odessać roztwór hybrydyzacyjny i dodać roztwór sondy.

Od tego kroku naprzód chroń próbkę przed światłem. Po dodaniu sondy przykryj próbki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Następnie przygotuj nawilżoną komorę na bloku grzewczym o temperaturze 80 stopni Celsjusza.

Gdy blok grzewczy ustabilizuje się z powrotem do 80 stopni Celsjusza, umieść szkiełka z próbką w ogrzewanej komorze i pozwól im ulec denaturacji przez trzy minuty. Następnie inkubuj wszystkie przetworzone szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji przemyć próbki w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

W przygotowaniu podgrzej roztwór hybrydyzacyjny do 37 stopni Celsjusza na godzinę przed praniem. Następnie załaduj szkiełka do słoika z roztworem do mycia hybrydyzacji i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby usunąć roztwór hybrydyzacyjny, przemyj próbki PBST w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Zrób to trzy razy. Po odessaniu ostatniego płukania PBST dodać 20 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej próbki i inkubować je w wilgotnych komorach w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności. Następnie odessać roztwór blokujący i zastąpić go sprzężonym roztworem przeciwciała anty-digoksygeniny FITC w ilości od jednego do 200.

Przykryj szkiełka i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez trzy godziny w ciemności. Po zabarwieniu przeciwciałami przemyć próbki dwukrotnie PBST przez 15 minut na każde przemycie w ciemności. Następnie odessać PBST i zastąpić go 10 mikrolitrami roztworu montażowego zawierającego DAPI.

Nałóż szklankę nakrywkową i wytrzyj nadmiar roztworu. Na koniec uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego lakierem do paznokci i przystąp do obserwacji próbek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za pomocą sondy PNA zaobserwowano telomery zwierząt, które przeżyły mutację wystarczającą dla telomerów.

W gonadach liczba telomerów na jądro jest policzalna. Sygnał telomerowy był kolokalizowany z sygnałem TALT1, co potwierdza pogląd, że TALT1 jest odpowiedzialny za przeżycie bez telomerów. Natężenie sygnału telomerowego porównano za pomocą oprogramowania.

Sygnał był silniejszy u osób, które przeżyły ALT, niż u szczepów rodzicielskich używanych do generowania mutantów z niedoborem telomerów. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem i formamidem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.