Name: Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj technikę FISH z sondami PNA do analizy telomerów w Caenorhabditis elegans. Metoda umożliwia wizualizację i kwantyfikację powtarzających się sekwencji telomerowych w czasie krótszym niż 24 godziny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Zmutowane szczepy robaków zostały dzięki uprzejmości Centrum Genetyki Caenorhabditis. Badania te zostały wsparte grantem Korea Health Technology R&D Project za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowotnego (KHIDI), finansowanym przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI14C1277).

1. Etykietowanie sond za pomocą digoksygeniny-dUTP metodą PCR
<ol>
	<li>Wykonaj znakowanie PCR za pomocą 10-krotnej mieszanki dNTP zawierającej digoksygeninę-dUTP, jak opisano wcześniej13.</li>
	<li>Oczyść produkt PCR za pomocą oczyszczania z kolumną wirową zgodnie z instrukcją producenta.
	<ol>
		<li>Jeżeli sonda jest krótsza niż 200 pz, należy usunąć z mieszaniny reakcyjnej wolną digoksygeninę-dUTP za pomocą chromatografii kolumny spinowej, a nie oczyszczania w kolumnie spinowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie preparatów pokrytych polilizyną
Uwaga: Cała procedura trwa około 2 godzin. Większość kroków odbywa się w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem etapu suszenia.
<ol>
	<li>Czyszczenie szkiełek
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka w plastikowym pojemniku i krótko spłucz je wodą destylowaną (DW). Usuń wodę i napełnij pojemnik DW zawierającym 1% środka do czyszczenia szkła.</li>
		<li>Mieszać szkiełka przez 15 minut przy 50 obr./min w temperaturze pokojowej (RT). Umyj szkiełka DW 3 razy po 5 minut w temperaturze RT.</li>
		<li>Myć szkiełka 70% etanolem przez 15 minut z mieszaniem. Wyrzuć 70% etanolu i umieść szkiełka na suchym bloku o temperaturze 65 °C i susz na powietrzu przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powłoka polilizynowa szkiełek wielodołkowych 
	Uwaga: Powłoka polilizynowa szkła szkiełkowego jest ważnym krokiem, ponieważ zapewnia przyczepność próbki podczas całej procedury barwienia. Źle pokryty szkiełko spowoduje utratę próbki.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć podstawowy roztwór polilizyny do 0,01% (w/v) w wodzie destylowanej. Dodać 20 μl rozcieńczonego 0,01% (m/v) polilizyny do studzienek czystego szkiełka podstawowego.</li>
		<li>Inkubować szkiełko podstawowe przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść szkiełka na suchym bloku w temperaturze 65 °C i susz na powietrzu przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przechowuj szkiełka polilizynowe w pudełku bezpyłowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalenie robaków na szkle szkiełka (Rysunek 1)
<ol>
	<li>Przygotowanie zarodków dla FISH 
	Uwaga: Zbierz robaki przed spożyciem całego pokarmu bakteryjnego, obserwując pożywkę wzrostową pod mikroskopem. Głód zmniejsza produkcję jaj przez dorosłe robaki i zwiększa wylęganie się jaj. Szczegółowe metody opisano w 14,15.
	<ol>
		<li>Hoduj robaki na szalce Petriego o średnicy 50 mm zgodnie ze standardowymi metodami14.</li>
		<li>Po spożyciu całego pokarmu bakteryjnego przetnij podłoże agarowe na ćwiartkę szpatułką. Wysterylizuj szpatułkę przed cięciem, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
		<li>Umieść cały kawałek agaru na 100 mm pożywce do hodowli nicieni (NGM). Odwróć kawałek agaru do góry nogami, aby robaki dotarły do świeżego pokarmu bakteryjnego.</li>
		<li>Po 48 do 72 godzinach zbierz robaki za pomocą bufora M9. Dodać 3 - 5 ml buforu M9 na płytkę NGM. Odpipetuj bufor M9 na powierzchni NGM, aby umyć robaki.</li>
		<li>Zebrać płyn z robakami i dodać do probówki o pojemności 15 ml. 
		Uwaga: Jeśli po zbiorach pozostaną resztki agaru, odwiruj robaki w 30% roztworze sacharozy. Podczas gdy szczątki są granulowane, robaki unoszą się na powierzchni.</li>
		<li>Dodać bufor M9 do uzupełnienia objętości do 15 ml. Osadzać robaki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty i usunąć większość buforu M9. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy. 
		Uwaga: Jeśli robaki nadal unoszą się na wodzie po odwirowaniu, ustaw poziom hamowania wirówki na wartość = 1.</li>
		<li>Zassać bufor M9. Dodaj roztwór wybielający do robaków. Na 0,5 ml robaków dodać 6,5 ml DW, 2 ml podchlorynu, 1 ml 5 M KOH.</li>
		<li>Inkubuj robaki z kołysaniem w temperaturze RT przez 3 minuty przy 50 obr./min. Wiruj robaki przez 15 sekund, aby mechanicznie ścinać robaki i odsłaniać jaja.</li>
		<li>Obserwuj probówkę pod mikroskopem preparacyjnym podczas wybielania. Upewnij się, że robaki są przecięte na pół, a jaja uwolnione. Gdy większość dorosłego ciała zostanie rozpuszczona, dodać bufor M9 w celu uzupełnienia objętości do 15 ml.</li>
		<li>Wirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać większość M9 i dodać świeży bufor M9, aby uzupełnić objętość do 15 ml. Powtórzyć etap mycia 3 razy. 
		Uwaga: Unikaj używania nadmiernej ilości robaków, ponieważ utrudniają one proces wybielania. Całkowity czas reakcji powinien być krótszy niż 8 minut do prania. Nadmiernie wybielone jaja wytwarzają silną autofluorescencję.</li>
		<li>Dodać buforowaną fosforanem sól fizjologiczną z polisorbatem-20 (PBST) do 200 μl i 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA), aby uzyskać 2% PFA. 
		Uwaga: Ponieważ PFA jest rakotwórczy, przed użyciem PFA należy nosić odzież ochronną, rękawice i osłonę oczu.</li>
		<li>Dodać 40 μl jaj w 2% PFA do studzienki z szkiełka pokrytego polilizyną.</li>
		<li>Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Zamknij wilgotną komorę zaraz po umieszczeniu szkiełek w środku. 
		Uwaga: Jajka osiadają na dnie szkiełka podczas mocowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wypreparowanych gonad dla RYB
	<ol>
		<li>Dorosłe robaki wyhodowane na płytce NGM o średnicy 50 mm należy zebrać, pipetując 1 ml buforu M9. Zbieraj robaki, zanim wyczerpie się pokarm bakteryjny.</li>
		<li>Umyj robaki z wszelkich bakterii za pomocą buforu M9, 2 razy. 
		Uwaga: Szczątki bakterii mogą zakłócać wypreparowane gonady w wyniku przywierania do szkiełek pokrytych polilizyną.</li>
		<li>Osadzać robaki przez odwirowanie przy 300 x g. Usunąć M9 i przenieść robaki na pustą płytkę NGM za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Dodać 30 μl buforu M9 zawierającego 2 mM lewamizol do studzienki z szkiełkiem poddanym działaniu polilizyny.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu M9 do probówki o pojemności 1 ml. Użyj tego bufora, aby przenieść robaki za pomocą pipety doustnej.</li>
		<li>Napełnić końcówkę pipety doustnej buforem M9, umieszczając kapilar w probówce o pojemności 1 ml zawierającej bufor M9.</li>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym umieść końcówkę pipety ustnej tuż przed głową dorosłego robaka i przeciągnij pipetę ustną tak, aby główka robaków weszła do pipety ustnej. Gdy głowa robaka wejdzie do końcówki, całe ciało robaka zostanie wciągnięte do końcówki.</li>
		<li>Przenieś robaki do szkiełka pokrytego polilizyną za pomocą pipety doustnej.</li>
		<li>Za pomocą brzytwy odetnij głowę lub czubek ogona robaków na zjeżdżalni. Kiedy robak zostanie przecięty, gonady wyskoczą. Gonady przykleją się do slajdów.
		<ol>
			<li>Przygotuj co najmniej 30 robaków w jednym dołku. Więcej studni można wykorzystać na kolejne 30 robaków.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieścić szkiełko w wilgotnej komorze i odessać bufor M9 za pomocą pipety doustnej.</li>
		<li>Utrwalić próbkę, dodając 20 μl 2% PFA w temperaturze pokojowej przez 15 minut w wilgotnej komorze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalenie i przepuszczalność
<ol>
	<li>Umieść aluminiowy blok na suchym lodzie i przechowuj go w głębokiej zamrażarce (-80 °C). Przechowywać metanol i aceton w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Po etapie utrwalania PFA 3.1.15 lub 3.2.11 usunąć utrwalacz za pomocą mikropipety, pozostawiając ~5 μl utrwalacza</li>.
	<li>Umieść kolejny szkiełko pokryte polilizyną na szkiełku podstawowym. Usuń utrwalacz ręcznikiem papierowym, jeśli roztwór jest nadmierny. Nie przesuwaj slajdów, gdy są ze sobą sklejone.</li>
	<li>Zamrozić szkiełka na aluminiowym bloku na co najmniej 15 minut. 
	Uwaga: Próbki można przechowywać przez co najmniej 2 - 3 dni.</li>
	<li>Podczas zamrażania szkiełek umieść słoiki z zimnym metanolem i acetonem na lodzie.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka i przekręć je, aby zawiesić próbkę. Wyrzuć górny suwak. Natychmiast zanurz szkiełko w lodowatym metanolu na 5 minut.</li>
	<li>Przenieś szkiełka do lodowatego acetonu na 5 minut.</li>
	<li>Umyj szkiełka 3 razy PBST przez 5 minut, aby usunąć resztki utrwalacza. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj szkiełka w 100% etanolu w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Próbki można przechowywać przez co najmniej 2 - 3 dni.</li>
</ol>
5. Hybrydyzacja stałych komórek
<ol>
	<li>Dodać 20 μl roztworu RNazy (PBST zawierającego 10 μg/ml RNazy A). Inkubować szkiełko w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przemyć szkiełko dwukrotnie w 2x soli fizjologicznej i cytrynianu sodu z polisorbatem-20 (2x SSCT) przez 15 min każde.</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu do hybrydyzacji i umieścić wilgotną komorę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Po upływie 1 godziny usunąć roztwór hybrydyzacyjny przez pipetowanie.</li>
	<li>Przed usunięciem roztworu hybrydyzacyjnego przygotuj sondę. Jeśli sonda jest dwuniciowym DNA, denaturuj sondy poprzez ogrzewanie w temperaturze 95 °C przez 5 minut na suchym bloku. Po podgrzaniu krótko schłodzić sondę na lodzie.</li>
	<li>Do próbki dodać 10 μl roztworu hybrydyzacyjnego zawierającego sondy. W przypadku sondy PNA należy użyć stężenia w stosunku 1: 2,000, a w przypadku sondy z oznaczeniem cyfrowym należy użyć stężenia w stosunku 1:200. Przykryj próbkę szkłem nakrywkowym.</li>
	<li>Połóż ręcznik papierowy nasączony wodą na bloku grzewczym (80 °C). Umieść plastikową osłonę pudełka na bloku grzewczym, aby zachować wilgotność i temperaturę.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu się temperatury bloku grzewczego (do 80 °C) umieścić szkiełko do próbek na rozgrzanym ręczniku papierowym i przykryć próbki plastikową pokrywą pudełka. Denaturacja próbki przez 3 minuty.</li>
	<li>Szkiełka należy inkubować przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
6. Mycie i immunofluorescencja
<ol>
	<li>Podgrzać roztwór myjący do hybrydyzacji (2x SSC, 50% formamidu) do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przemyć próbkę w PBST dwukrotnie w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Zdjąć szkło nakrywkowe.</li>
	<li>Przemyć próbkę w roztworze do przemywania hybrydyzacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Umyć szkiełko do pobierania próbek w PBST 3 razy w temperaturze pokojowej. Uwaga: Wszystkie kolejne kroki należy wykonać w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu blokującego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i dodać sprzężony z FITC roztwór przeciwciała anty-digoksygeniny (1:200) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
7. Montaż i obserwacja
<ol>
	<li>Przemyć szkiełko podstawowe za pomocą PBST 2 razy przez 15 minut każdy.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu montażowego z DAPI. Włóż szklankę nakrywkową i delikatnie dociśnij. Usuń nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym.</li>
	<li>Aby zapobiec parowaniu roztworu montażowego, uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem konfokalnym. Wyklucz zarodki z wysokim tłem. Skoncentruj się na polu z 4 - 20 jądrami.</li>
	<li>Rób zdjęcia zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą obiektywu 100x. 
	Uwaga: Wzbudz próbkę laserem 405 nm dla DAPI, laserem 555 nm dla cy3, laserem 488 nm dla FITC.</li>
</ol>
8. Kwantyfikacja sygnału telomerowego
Uwaga: Oznaczanie ilościowe przeprowadzono w sposób opisany wcześniej16. Wszystkie obrazy, które mają być porównywane, powinny być wykonane z tymi samymi ustawieniami, w tym czasem naświetlania i źródłem światła.
<ol>
	<li>Wyeksportuj obraz w .tif formacie.</li>
	<li>Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do analizy obrazu.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu i kliknij przycisk Zgadzam się.</li>
	<li>Kliknij przycisk Otwórz. Otwórz obrazy z telomerem FISH, klikając dwukrotnie plik obrazu.</li>
	<li>Kliknij [edytuj] - [wybierz region przetwarzania], wybierz interesujący Cię region, klikając lewym przyciskiem myszy i przeciągając. Wyklucz wszystkie niespecyficzne barwienia.</li>
	<li>Kliknij [pomiar] - [punktowe gęstości optyczne], wybierz kanał z sygnałem telomerowym i wprowadź nazwę pliku, aby zapisać wyniki w .txt pliku. 
	Uwaga: Kolumna wyników jest w następującej kolejności: fluorescencja plamki, intensywność tła plamki i obszar plamki.</li>
	<li>Skopiuj wartości i odejmij intensywność tła plamki od fluorescencji plamki. Wartości mogą być teraz analizowane statystycznie.</li>
</ol>

<ol><li>Reddel, R. R., Bryan, T. M., Murnane, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+cells+with+no+detectable+telomerase+activity.+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry-Moscow%22%5BJournal%5D)">Immortalized cells with no detectable telomerase activity. A review.</a> Biochemistry-Moscow. 62, 1254-1262 (1997).</li>
<li>Seo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+maintenance+through+recruitment+of+internal+genomic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomere maintenance through recruitment of internal genomic regions.</a> Nat Commun. 6, 8189(2015).</li>
<li>Cesare, A. J., Reddel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres%3A+models%2C+mechanisms+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications.</a> Nat Rev Genet. 11, 319-330 (2010).</li>
<li>Meier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((trt-1+is+the+Caenorhabditis+elegans+catalytic+subunit+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">trt-1 is the Caenorhabditis elegans catalytic subunit of telomerase.</a> Plos Genetics. 2, 187-197 (2006).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 30, 47(2002).</li>
<li>Raices, M., Maruyama, H., Dillin, A., Karlseder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+of+longevity+and+telomere+length+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Uncoupling of longevity and telomere length in C. elegans.</a> PLoS Genet. 1, 30(2005).</li>
<li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Specific+Sequences+among+DNA+Fragments+Separated+by+Gel-Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of Specific Sequences among DNA Fragments Separated by Gel-Electrophoresis.</a> Journal of Molecular Biology. 98, 503(1975).</li>
<li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+extension+by+telomerase+and+ALT+generates+variant+repeats+by+mechanistically+distinct+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere extension by telomerase and ALT generates variant repeats by mechanistically distinct processes.</a> Nucleic Acids Res. 42, 1733-1746 (2014).</li>
<li>Cheung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+telomere+length+revealed+by+single+telomere+length+analysis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-specific telomere length revealed by single telomere length analysis in Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 32, 3383-3391 (2004).</li>
<li>Shtessel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+POT-1+and+POT-2+repress+telomere+maintenance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans POT-1 and POT-2 repress telomere maintenance pathways.</a> G3. 3, Bethesda. 305-313 (2013).</li>
<li>Duerr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook+%28The+C.+elegans+Research+Community%29%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry.</a> WormBook (The C. elegans Research Community). , (2006).</li>
<li>Phillips, C. M., McDonald, K. L., Dernburg, A. F. Cytological analysis of meiosis in Caenorhabditis elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhillips%2C+CM+%22Meiosis%3A+Volume+2%2C+Cytological+Methods%22">Meiosis: Volume 2, Cytological Methods</a>. , Springer. 171-195 (2009).</li>
<li>Emanuel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+efficient+system+for+synthesis+of+non-radioactive+nucleic+acid+hybridization+probes+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Simple and efficient system for synthesis of non-radioactive nucleic acid hybridization probes using PCR.</a> Nucleic acids research. 19, 2790(1991).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J Vis Exp. , e4019(2012).</li>
<li>Poon, S. S. S., Martens, U. M., Ward, R. K., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurements+using+digital+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurements using digital fluorescence microscopy.</a> Cytometry. 36, 267-278 (1999).</li>
<li>Ferreira, H. C., Towbin, B. D., Jegou, T., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shelterin+protein+POT-1+anchors+Caenorhabditis+elegans+telomeres+through+SUN-1+at+the+nuclear+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The shelterin protein POT-1 anchors Caenorhabditis elegans telomeres through SUN-1 at the nuclear periphery.</a> J Cell Biol. 203, 727-735 (2013).</li>
<li>Lee, M. H., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+of+dissected+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization of dissected gonads.</a> WormBook. , 1-7 (2006).</li>
<li>Tabara, H., Motohashi, T., Kohara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-well+version+of+in+situ+hybridization+on+whole+mount+embryos+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A multi-well version of in situ hybridization on whole mount embryos of Caenorhabditis elegans.</a> Nucleic Acids Res. 24, 2119-2124 (1996).</li>
<li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+in+situ+hybridization+%28Q-FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH).</a> Curr Protoc Cell Biol. 18, Unit 18 14(2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Główną zaletą naszego protokołu jest prostota zabiegu bez zauważalnego uszkodzenia morfologii struktury komórkowej. W tym protokole zoptymalizowano kilka kroków dla C. elegans FISH. Kluczowe kroki dla powodzenia FISH obejmują etykietowanie sond, utrwalanie zarodków i penetrację. Metoda etykietowania digoksygenina-dUTP zapewnia łatwą w użyciu metodę etykietowania za pomocą PCR lub translacji nick. Aby oznaczyć długą sekwencję docelową, preferowane jest tłumaczenie nicków. W takim przypadku sondy powinny być trawi...

Telomer chroni końcówki chromosomów przed nieprawidłowym fuzją i degradacją. Telomer ssaków składa się z bogatych w G powtórzeń heksamerycznych, TTAGGG i kompleksów schronienia. Sekwencja powtórzeń telomerów nicienia jest podobna do sekwencji ssaków (TTAGGC). Większość eukariontów wykorzystuje telomerazę do dodawania powtórzeń telomerów do swoich chromosomalnych końców. Jednak 10-15% komórek nowotworowych wykorzystuje mechanizm niezależny od telomerazy, znany jako alternatywne wydłużanie telomerów (ALT)3. Wcześniej informowaliśmy, że powtórzenia telomerów i związane z nimi sekwencje, nazwane jako TALT, były amplifikowane w telomerach zmutowanych linii telomerazy, które przetrwały krytyczną sterylność2.
Długość telomerów została zmierzona za pomocą ilościowego PCR lub Southern blot, co daje średnią długość całkowitych telomerów4,5,6,7. Odczyt liczby powtórzeń telomerów w danych sekwencjonowania całego genomu jest również wskaźnikiem całkowitej zawartości telomerów8. Chociaż analiza długości pojedynczego telomeru (STELA) może dostarczyć długości pojedynczego telomeru, nie może dostarczyć informacji przestrzennych o telomerach9. Podczas gdy białko reporterowe POT-1::mCherry dostarcza informacji przestrzennej telomerów in vivo, nie może reprezentować długości telomerów dwuniciowych, ponieważ POT-1 jest białkiem wiążącym telomeryjednoniciowe 10.
Podczas gdy wyżej wymienione metody dostarczają uśrednionych informacji o powtarzających się sekwencjach, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) pozwala obserwować ilość i przestrzenny wzór poszczególnych interesujących sekwencji na skali chromosomalnej. Zamiast oczyszczania DNA, tkanki lub komórki są utrwalane w celu zachowania natywnej informacji przestrzennej w FISH. W związku z tym FISH jest zarówno ilościowym, jak i jakościowym narzędziem do obserwacji pojedynczych sekwencji powtórzeń, takich jak powtórzenia telomerów.
Ten protokół zapewnia skuteczną metodę jednoczesnego wykrywania zarówno telomerów, jak i innych powtórzeń, opartą na ulepszeniach od wcześniej opisanych metod 11,12. Larwy lub dorosłe osobniki C. elegans to organizmy wielokomórkowe o wysoce zróżnicowanych komórkach. Niejednorodność komórek utrudnia analizę ilościową dużej liczby plamek telomerowych. Aby zmaksymalizować liczbę analizowanych komórek, zarodki są izolowane i rozprowadzane na szkiełkach pokrytych polilizyną dla FISH. Ponadto protokół ten można również łączyć z immunofluorescencją.
Jako dowód, że protokół działa, pokazujemy, że możliwe jest obserwowanie i ilościowe określanie dwóch różnych powtarzających się sekwencji. Sonda DNA przeciwko TALT1 została wygenerowana za pomocą prostego PCR zawierającego digoksygeninę-dUTP. Następnie ta sonda TALT1 i znakowana fluorescencyjnie sonda telomerowa PNA zostały jednocześnie zhybrydyzowane. Następnie digoksygeninę wykryto za pomocą kanonicznych metod immunofluorescencji. Przedstawiamy tutaj reprezentatywne obrazy, w których TALT1 kolokalizował się z telomerem u osób, które przeżyły trt-1.

<table><tbody><tr><td>Sonda PNA</td><td>PANAGENE</td><td>na zamówienie</td><td></td>niestandardowe</tr><tr><td>Anty-Digoxigenin-Fluoresceina, fragmenty Fab</td><td>Roche</td><td>11207741910</td><td>użycia 1:200 rozcieńczony w PBST</td></tr><tr><td>Digoxigenin-dUTP</td><td>Roche</td><td>11573152910</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-6148</td><td>przygotować 4% paraformaldehydu przez ogrzewanie w DW z kilkoma kroplami NaOH. dodaj 0,1 objętości 10x PBS.</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Hybrydowy roztwór</td><td></td><td></td><td>3x SSC, 50% formamidu, 10% (w/v) siarczan dekstranu, 50 &#956; g/ml heparyny, 100 i #956; g/ml drożdżowego tRNA , 100 &#956; g/ml sonikowane plemniki łososia DNA</td></tr><tr><td>Hybrydizaiton roztwór</td><td></td><td></td> płuczący <td>2x SSC, 50% formamid</td></tr><tr><td></td><td>Formamid BIONEER</td><td>C-9012</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carlo Erba</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H3393</td><td>zrobić 10 mg/ml dla roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Siarczan</td> <td>dekstranuSIGMA-ALDRICH</td><td>67578</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td></td><td></td><td>Dla 1 L DW : 80 g NaCl, 2,0 g KCl, 27 g Na2HPO4&#8226; 7H2O, 2,4 g KH2PO</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>Polisorbat 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-2287</td><td>Nazwa handlowa to Tween-20</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (0,1% w/v)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P-8920</td><td>przed użyciem przygotować świeży roztwór 0,01% w/v</td></tr><tr><td>M9</td><td></td><td></td><td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O do 1 l</td></tr><tr><td>roztworu</td><td></td><td></td> wybielającego <td>20% podchlorynu sodu, 0,5 M KOH</td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> przeciwciał <td>1x PBST, 1 mM EDTA, 0,1% BSA, 0,05% Azydek sodu (toksyczny)</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> blokujący <td>Bufor przeciwciał z 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)</td></tr><tr><td>ilustracja Microspin G-50</td><td>GE healthcare</td><td>27-53310-01</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td></td><td></td><td>Aby uzyskać 1 L, 175,3 g NaCl, 88,2 g cytrynianu sodu, H2O do 1 L, dostosować pH do 7,0</td></tr><tr><td>2x SSCT</td><td></td><td></td><td>2x SSC, 0,1% tween-20</td></tr><tr><td>10x mieszanka</td><td></td><td></td> digoksygeniny i dUTP <td>1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0,65 mM dTTP, 0,35 mM Kolumny oczyszczające DIG-11-dUTP</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Cosmo genetech</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>Płyn do mycia szyb / ULTRA CLEAN</td><td>Dukssan czyste chemikalia</td><td>8AV721</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko wielodołkowe</td><td>MP biomedyczne</td><td></td><td></td>96041205</tr><tr><td>Pożywki</td><td></td><td></td> hodowlane nicieni <td>Przygotować 1 l, 3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu, H2O do 974 ml. Autoklaw i schłodzić kolbę. Dodać 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 4 mg/ml cholesterolu w etanolu, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KPO4.</td></tr>Jako soczewkę obiektywową zastosowano <tr><td>lewamizol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>196142</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>Feather</td><td>blade No. 11</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Enzynomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>EC Plan-Neofluar 100X.</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> wilgotna <td>Plastikowe pudełko wypełnione ręcznikiem papierowym nasączonym</td></tr><tr><td>oprogramowaniem do analizy obrazu DW&nbsp;</td><td>Dr. Peter Landsdorp</td><td>TFL-telo</td><td><a href="http://www.flintbox.com/public/project/502">http://www.flintbox.com/public/project/502</a></td></tr></tbody></table>

obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (fish) z sondami pna w caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomer to struktura rybonukleoproteinowa, która chroni końce chromosomów przed nieprawidłowym fuzją i degradacją. Długość telomerów jest utrzymywana przez telomerazę lub alternatywny szlak, znany jako alternatywne wydłużanie telomerów (ALT)1. Ostatnio C. elegans pojawił się jako wielokomórkowy organizm modelowy do badania telomerów i ALT2. Wizualizacja powtarzających się sekwencji w genomie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologii telomerów. Chociaż długość telomerów można zmierzyć za pomocą testu fragmentów restrykcyjnych telomerów lub ilościowego PCR, metody te zapewniają tylko uśrednioną długość telomerów. Wręcz przeciwnie, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) może dostarczyć informacji o poszczególnych telomerach w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokoły i reprezentatywne wyniki metody określania długości telomerów C. elegans za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Ta metoda zapewnia prostą, ale potężną procedurę in situ, która nie powoduje zauważalnych uszkodzeń morfologii. Używając znakowanego fluorescencyjnie peptydowego kwasu nukleinowego (PNA) i sondy znakowanej digoksygeniną-dUTP, byliśmy w stanie zwizualizować dwie różne powtarzalne sekwencje: powtórzenia telomerów i matrycę ALT (TALT) w zarodkach i gonadach C. elegans.

Wcześniej zgłoszono, że osobniki typu ALT survivor mogą pojawić się u mutantów z niedoborem telomerazy, trt-1(ok410), z niską częstotliwością poprzez replikację wewnętrznie zlokalizowanych sekwencji „szablonu ALT” (TALT) w celu utrzymania telomerów2. Wykorzystując sondę PNA, udało nam się zwizualizować telomery w wypreparowanych gonadach (Rycina 2A). Słaby sygnał telomerowy wykryto zarówno u trt-1(ok410), jak i u ALT survivor. Rozmyty sygnał n...

Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Ogólnym celem tej techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jest zwięzła analiza liczby i długości telomerów w C. elegans. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji guzów, alternatywnego wydłużania telomerów oraz starzenia się komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedury są zwięzłe, a telomery można zwizualizować i skwantyfikować w czasie krótszym niż 24 godziny.Zebrać dorosłe zapłodnione nicienie wraz z niewielką ilością czystego pożywki ciekłej do probówki o pojemności 15 ml. Następnie trzykrotnie przemyć nicienie w następujący sposób. Dodać bufor M9 do uzyskania całkowitej objętości 15 ml.Następnie wirować probówkę przy 300 G przez trzy minuty i odlać roztwór znajdujący się nad pelletem nicieni. Następnie powtórzyć ten proces. Jeśli po wirowaniu nicienie pływają, należy zmniejszyć siłę hamowania wirówki.Po trzecim przemyciu pozostaw robaki w 5 ml M9. Następnie dodaj 6,5 ml wody destylowanej, dwa mililitry nadchlorynu oraz jeden mililitr pięciomolarnego wodorotlenku potasu. Pozostaw robaki do inkubacji w tym roztworze wybielającym przez trzy minuty przy mieszaniu z prędkością 50 RPM. Następnie poddaj robaki działaniu vortexa, ab

observation-quantification-telomere-repetitive-sequences-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zarodek C. elegans jest potężnym systemem do badania biologii komórki i rozwoju. Przedstawiamy protokół obrazowania na żywo zarodków C. elegans z wykorzystaniem optyki DIC lub fluorescencji, przy użyciu powszechnie dostępnych mikroskopów epifluorescencyjnych oraz oprogramowania otwartoźródłowego.

Obrazowanie zarodków C. elegans przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego i oprogramowania otwartoźródłowego

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Tutaj opisujemy technikę używaną do wizualizacji genomowego DNA u stałych, nienaruszonych nicieni. Film zawiera przykładowy protokół liczenia chromatyny w niezapłodnionych oocytach C. elegans.

Utrwalanie etanolu i barwienie DAPI: metoda wizualizacji DNA u C. elegans

Źródło: Pigazzini, M. L., et. al. Charakterystyka struktur amyloidowych w starzeniu się C. Elegans Korzystanie z obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. exp. (2020). Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM) do oceny agregacji białek polyQ w neuronach C. elegans, porównując robaki kontrolne i robaki z niedoborem białka opiekuńczego. Zwiększona agregacja u robaków z niedoborem białka opiekuńczego sprzyja przenoszeniu energii między...

Obrazowanie czasu życia fluorescencji agregacji białka PolyQ w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj pokazano, jak śledzić i określać ilościowo procesy rozwojowe u C. elegans. Przedstawione metody oparte są na narzędziach open-source, które można łatwo wdrożyć. Pokazano, jak rekonstruować modele 3D w kształcie komórki, jak ręcznie śledzić struktury subkomórkowe i jak analizować korowy przepływ skurczowy.

Śledzenie i ilościowe określanie procesów rozwojowych u C. elegans przy użyciu narzędzi open source

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje interferencję RNA i test ChIP w celu zbadania epigenetycznego dziedziczenia indukowanego przez RNAi wyciszania i związanych z nim modyfikacji chromatyny u C. elegans.

Analiza międzypokoleniowego dziedziczenia epigenetycznego u C. elegans przy użyciu fluorescencyjnego reportera i immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Poznaj technikę FISH z sondami PNA do analizy telomerów w Caenorhabditis elegans. Metoda umożliwia wizualizację i kwantyfikację powtarzających się sekwencji telomerowych w czasie krótszym niż 24 godziny.

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal

Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów