Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans
4 sierpnia 2016
Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).
Ogólnym celem tej techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jest zwięzła analiza liczby i długości telomerów w C. elegans. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące regeneracji guzów, alternatywnego wydłużania telomerów oraz starzenia się komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedury są zwięzłe, a telomery można zwizualizować i skwantyfikować w czasie krótszym niż 24 godziny.
Zebrać dorosłe zapłodnione nicienie wraz z niewielką ilością czystego pożywki ciekłej do probówki o pojemności 15 ml. Następnie trzykrotnie przemyć nicienie w następujący sposób. Dodać bufor M9 do uzyskania całkowitej objętości 15 ml.
Następnie wirować probówkę przy 300 G przez trzy minuty i odlać roztwór znajdujący się nad pelletem nicieni. Następnie powtórzyć ten proces. Jeśli po wirowaniu nicienie pływają, należy zmniejszyć siłę hamowania wirówki.
Po trzecim przemyciu pozostaw robaki w 5 ml M9. Następnie dodaj 6,5 ml wody destylowanej, dwa mililitry nadchlorynu oraz jeden mililitr pięciomolarnego wodorotlenku potasu. Pozostaw robaki do inkubacji w tym roztworze wybielającym przez trzy minuty przy mieszaniu z prędkością 50 RPM. Następnie poddaj robaki działaniu vortexa, aby je rozbić i uwolnić jaja.
Pod mikroskopem stereoskopowym sprawdź, czy jaja zostały uwolnione. Jeśli jeszcze nie zostały uwolnione, kontynuuj inkubację przez kolejne osiem minut. Jeśli nicienie zostały w większości rozpuszczone, a jaja są wolne, dopełnij objętość w probówce do 15 mililitrów za pomocą buforu M9 i przemyj jaja trzy razy w ten sam sposób, w jaki wcześniej przemywano nicienie.
Do wypłukanych jaj, z których usunięto większość medium M9, dolać PBST do osiągnięcia objętości 500 microliters, a następnie dodać 500 microliters 4%PFA. Następnie nałożyć do dołków szkiełek pokrytych polilizyną alikwoty jaj w 2%PFA o objętości 40 microliter. Po tym przenieść szkiełka do komory nawilżonej i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Do tego protokołu należy przygotować blok aluminiowy umieszczony w suchym lodzie w temperaturze 80 °C. Należy również przygotować metanol i aceton przechowywane w temperaturze 20 °C. Po zakończeniu etapu fiksacji usunąć większość roztworu PFA z szkiełek, pozostawiając około 5 µL.
Następnie na każde szkiełko z próbką połóż drugie szkiełko pokryte polilizyną w taki sposób, aby obie pokryte powierzchnie przywarły do siebie, więżąc tkanki w zagłębieniu. Jeśli znajduje się nadmiar utrwalacza, należy go odsączyć chusteczką. Teraz zamroź szkiełka, umieszczając je na zimnym bloku aluminiowym przez co najmniej 15 minut.
W międzyczasie przygotować kąpiele z metanolu i acetonu w lodu dla szkiełek. Po zamrożeniu szkiełek, przekręcić jedno z nich, aby doprowadzić do pęknięcia mrożonego preparatu. Usunąć górne szkiełko, a szkiełko dolne zanurzyć w lodowatym metanolu na pięć minut.
Powtórz tę czynność dla wszystkich próbek. Rozmrażanie w celu spękania pozwala na przenikanie sond i przeciwciał przez twardą skorupę jaja. Jeśli jaja zostały pomyślnie spękane w procesie rozmrażania, powinny być widoczne na obu szkiełkach.
Po co najmniej pięciu minutach w metanolu przenieś preparaty do zimnego acetonu na pięć minut. Następnie namaczaj próbki w PBST trzykrotnie przez pięć minut podczas każdej kąpieli. Po przemyciach w PBST preparaty można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni.
Aby kontynuować, dodaj 20 µL roztworu RNazy do dołków z próbkami i inkubuj je w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Następnie przemyj preparaty w 2x SSCT dwukrotnie, po 15 minut każdego płukania. Po dwóch przemyciach dodaj 20 µL roztworu do hybrydyzacji do próbek i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę w wilgotnej komorze.
W międzyczasie przygotuj sondę dwuniciowego DNA. Denaturuj ją w temperaturze 95 °C przez pięć minut, a następnie krótko schłodź na lodzie. Po godzinie odessij roztwór hybrydyzacyjny i dodaj roztwór sondy.
Od tego etapu próbkę należy chronić przed światłem. Po dodaniu sondy próbki należy przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Następnie należy przygotować komorę wilgotną na bloku grzewczym o temperaturze 80 °C.
Gdy blok grzewczy ponownie ustabilizuje temperaturę na poziomie 80°C, umieść preparaty na szkiełkach w ogrzanej komorze i pozostaw je do denaturacji przez trzy minuty. Następnie inkubuj wszystkie przetworzone szkiełka w komorze nawilżonej w temperaturze 37°C przez noc. Po nocnej inkubacji przemyj próbki w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
W ramach przygotowania, jedną godzinę przed płukaniem podgrzej roztwór do hybrydyzacji do 37°C. Następnie umieść szkiełka w naczyniu z roztworem do płukania po hybrydyzacji i inkubuj je w temperaturze 37°C przez 30 minut. Aby usunąć roztwór do hybrydyzacji, przemyj próbki buforem PBST w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Powtórz tę czynność trzy razy. Po odessaniu ostatniej porcji PBST do przemycia, dodaj 20 µL roztworu blokującego do każdej próbki i inkubuj je w komorach nawilżanych w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę w ciemności. Następnie odessaj roztwór blokujący i zastąp go roztworem przeciwciał anty-digoksygenin koniugowanych z FITC w rozcieńczeniu 1:200.
Przykryj preparaty i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez trzy godziny w ciemności. Po barwieniu przeciwciałami przemyj próbki dwukrotnie roztworem PBST przez 15 minut podczas każdego mycia w ciemności. Następnie odessij PBST i zastąp go 10 µL medium montażowego zawierającego DAPI.
Nałóż szkiełko nakrywkę i odsącz nadmiar roztworu. Następnie zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywki lakierem do paznokci i przystąp do obserwacji próbek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przy użyciu sondy PNA zaobserwowano telomery zwierząt, które przeżyły mutację zapewniającą wystarczającą długość telomerów.
W gonadach liczba telomerów na jądro jest mierzalna. Sygnał telomerowy współlokalizował z sygnałem TALT1, co potwierdza tezę, że TALT1 odpowiada za przeżywalność bez telomerów. Intensywność sygnału telomerowego była porównywana za pomocą oprogramowania.
Sygnał był silniejszy w komórkach przeżywających dzięki mechanizmowi ALT niż w szczepach rodzicielskich wykorzystanych do wytworzenia mutantów z niedoborem telomerów. Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem i formamidem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zwięzłą technikę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) służącą do analizy długości i liczby telomerów u Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia wizualizację i kwantyfikację powtórzeń telomerowych oraz alternatywnego wydłużania telomerów (TALT) w czasie krótszym niż 24 godziny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Genetyka
Wprowadzenie
- Telomery chronią końce chromosomów i odgrywają kluczową rolę w starzeniu się komórek.
- Zrozumienie dynamiki telomerów jest istotne w badaniach nad rakiem.
- Hybrydyzacja in situ fluorescencyjna (FISH) jest potężnym narzędziem do wizualizacji materiału genetycznego.
- Caenorhabditis elegans służy jako organizm modelowy w badaniach genetycznych.
Cel badania
- Opracowanie zwięzłej procedury FISH dla C. elegans.
- Ilościowe określenie długości i liczby telomerów w krótkim czasie.
- Zbadanie roli telomerów w regeneracji guzów i starzeniu się komórek.
Zastosowane Metody
- Zbieranie ciążnych dorosłych osobników C. elegans w medium ciekłym.
- Przemywanie nicieni buforem M9 w celu przygotowania do metody FISH.
- Zastosowanie metody FISH w celu wizualizacji sekwencji telomerowych.
- Kwantyfikacja powtórzeń telomerowych oraz TALT.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja powtórzeń telomerowych u C. elegans.
- Osiągnięto kwantyfikację dwóch różnych sekwencji powtórzeniowych.
- Wykazano skuteczność techniki FISH w krótkim czasie.
- Uzyskano wgląd w biologię telomerów istotny dla badań nad rakiem.
Wnioski
- Opracowana metoda FISH jest efektywna w badaniu telomerów u C. elegans.
- Technika ta może ułatwić badania nad chorobami związanymi z telomerami.
- Przyszłe badania mogą rozwinąć kwestię implikacji dynamiki telomerów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda FISH umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację dynamiki telomerów w modelu wielokomórkowym, wspierając walidację celów w biologii telomerów oraz alternatywnych ścieżek wydłużania. Dzięki zapewnieniu rozdzielczości pojedynczych komórek dla sekwencji powtarzalnych, zwiększa ona pewność prognostyczną w badaniach mechanistycznych nad stabilnością genomiczną i starzeniem się komórek. Podejście to oferuje szybki, zachowujący morfologię test, odpowiedni dla wczesnych etapów procesów odkrywczych koncentrujących się na celach związanych z telomerami.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów utrzymania telomerów, w tym aktywności szlaku ALT, w celu weryfikacji hipotez terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ilościowe wyniki liczby i długości telomerów na jądro komórkowe do oceny funkcjonalnej celów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ocenę niestabilności genomicznej w systemach istotnych dla przebiegu choroby, opartą na biomarkerach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje standaryzowane, powtarzalne sygnały FISH dla sekwencji telomerów i TALT, umożliwiając przygotowanie do analizy.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowe wyniki obrazowania zgodne z potokami analizy wysokoprzepustowej (high-content analysis).
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszego screeningu związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Powiązana wizualizacja telomerów z aktywnością ALT, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w modelach przedklinicznych.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia korelację sygnałów telomerowych z ko-lokalizacją TALT1 w celu walidacji szlaku.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dynamikę telomerów w kontekstach istotnych dla danej choroby.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając ilościowe oznaczenie telomerów, co pozwala na określenie wiarygodności celu oraz walidację szlaków przed optymalizacją wiodących związków.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących regulacji długości telomerów i mechanizmu ALT u C. elegans.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych, powtarzalnych sygnałów telomerowych służących do standaryzacji testów i oceny związków.
- Analityka: Umożliwia porównywanie intensywności sygnałów telomerowych przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu w celu uzyskania obiektywnych wyników.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę telomerów z aktywnością szlaku ALT poprzez ko-lokalizację TALT1 w celu uzyskania wglądu w mechanizmy działania.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia możliwość ponownego wykorzystania metody FISH do analizy telomerów i sekwencji powtórzonych w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w biologii telomerów, walidacja celów oraz zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w mechanizmach ALT.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność kwantyfikacji telomerów w próbkach utrwalonych.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach programów celujących w telomery.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko na podstawie walidacji mechanizmu utrzymania telomerów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza z zakresu mikroskopii fluorescencyjnej, hybrydyzacji sond oraz przygotowania próbek dla całych organizmów C. elegans.
- Wymagane są szkiełka pokryte polilizyną, komory nawilżające oraz systemy inkubacji z kontrolą temperatury.
- Konieczność pracy z sondami PNA, traktowania RNazą oraz przeprowadzenia etapów wzmacniania sygnału z użyciem przeciwciał.
- Uwagi dotyczące adaptacji metody do różnych systemów modelowych lub typów tkanek poza embrionami i gonadami.
- Ograniczenia praktyczne obejmują obchodzenie się z niebezpiecznymi odczynnikami (paraformaldehyd, formamid) oraz wymóg ochrony przed światłem podczas hybrydyzacji.
