Obserwacja i kwantyfikacja telomerów i powtarzających się sekwencji za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) z sondami PNA w Caenorhabditis elegans
4 sierpnia 2016
Opisujemy zwięzłą procedurę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w gonadzie i zarodkach Caenorhabditis elegans w celu obserwacji i ilościowego określenia powtarzających się sekwencji. Z powodzeniem zaobserwowaliśmy i określiliśmy ilościowo dwie różne powtarzające się sekwencje, powtórzenia telomerów i szablon alternatywnego wydłużania telomerów (TALT).
Ogólnym celem tej techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ jest zwięzła analiza liczby i długości telomerów u C.Elegans. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regenezy guza, alternatywnego wydłużania telomerów i starzenia się komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedury są zwięzłe, a telomery można zwizualizować i określić ilościowo w czasie krótszym niż 24 godziny.
Zbierz grawitacyjne dorosłe robaki z niewielką ilością płynnego podłoża bez zanieczyszczeń w 15-mililitrowej tubce. Teraz umyj robaki trzy razy w następujący sposób. Dodaj bufor M9, aby uzyskać całkowitą objętość 15 mililitrów.
Następnie obracać probówkę z natężeniem 300 G przez trzy minuty i wylać roztwór powyżej osadu robaków. Następnie powtórz proces. Jeśli po odwirowaniu robaki unoszą się na wodzie, zwolnij hamulec wirówki.
Po trzecim praniu pozostaw robaki z 5 mililitrami M9. Następnie dodaj 6,5 mililitra wody destylowanej, dwa mililitry hiperchlorynu i jeden mililitr pięciomolowego wodorotlenku potasu. Pozwól robakom inkubować w tym roztworze wybielającym przez trzy minuty z mieszaniem 50 obr./min. Następnie zawiruj robaki, aby je rozciąć i uwolnić jaja.
Pod mikroskopem preparacyjnym poszukaj uwolnionych jaj. Jeśli nie zostały jeszcze uwolnione, kontynuuj inkubację lub do ośmiu minut. Jeśli robaki są w większości rozpuszczone, a jaja są wolne, napełnij probówkę do 15 mililitrów M9 i umyj jaja trzy razy, tak jak robaki były myte wcześniej.
Do umytych jaj, z usuniętą większością M9, napełnij objętość do 500 mikrolitrów PBST, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 4% PFA. Teraz załaduj 40 mikrolitrów porcji jaj w 2% PFA do studzienek szkiełek pokrytych polilizyną. Następnie przenieś szkiełka do nawilżonej komory i pozwól im inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
W przypadku tego protokołu należy przechowywać aluminiowy blok na suchym lodzie w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przechowuj również metanol i aceton w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po zakończeniu etapu utrwalania usuń większość roztworu PFA ze szkiełek, pozostawiając około pięciu mikrolitrów.
Następnie umieść drugie szkiełka pokryte polilizyną na każdym szkiełku z próbką, tak aby dwie powlekane powierzchnie skleiły się ze sobą, zatrzymując tkanki w studzience. Jeśli jest nadmierny utrwalacz, zetrzyj go chusteczką. Teraz zamroź szkiełka, umieszczając je na zimnym aluminiowym bloku na co najmniej 15 minut.
W międzyczasie przygotuj kąpiele metanolowe i acetonowe na lodzie na zjeżdżalniach. Po zamrożeniu szkiełek przekręć jedną, aby zamrozić próbkę. Wyrzuć górne szkiełko i zanurz dolne szkiełko w lodowatym metanolu na pięć minut.
Zrób to dla wszystkich próbek. Kraking zamrażalniczy pozwala na przenikanie sond i przeciwciał przez twardą skorupkę jaja. Jeśli jaja zostaną pomyślnie rozmrożone, można je zobaczyć na obu szkiełkach.
Po co najmniej pięciu minutach w metanolu przenieś szkiełka do zimnego acetonu na pięć minut. W ciągu kolejnych pięciu minut zanurzyć próbki w PBST trzy razy przez pięć minut na kąpiel. Po umyciu PBST szkiełka mogą być przechowywane w 100% etanolu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka dni.
Aby kontynuować, dodaj 20 mikrolitrów roztworu RNazy do studzienek na próbki i inkubuj je w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie umyj szkiełka w 2x SSCT dwa razy przez 15 minut na mycie. Po dwóch płukaniach dodaj do próbek 20 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę w wilgotnej komorze.
W międzyczasie przygotuj sondę na dwuniciową sondę DNA. Denaturuj go w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie krótko schładzaj na lodzie. Po godzinie odessać roztwór hybrydyzacyjny i dodać roztwór sondy.
Od tego kroku naprzód chroń próbkę przed światłem. Po dodaniu sondy przykryj próbki szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Następnie przygotuj nawilżoną komorę na bloku grzewczym o temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Gdy blok grzewczy ustabilizuje się z powrotem do 80 stopni Celsjusza, umieść szkiełka z próbką w ogrzewanej komorze i pozwól im ulec denaturacji przez trzy minuty. Następnie inkubuj wszystkie przetworzone szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Po całonocnej inkubacji przemyć próbki w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
W przygotowaniu podgrzej roztwór hybrydyzacyjny do 37 stopni Celsjusza na godzinę przed praniem. Następnie załaduj szkiełka do słoika z roztworem do mycia hybrydyzacji i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby usunąć roztwór hybrydyzacyjny, przemyj próbki PBST w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
Zrób to trzy razy. Po odessaniu ostatniego płukania PBST dodać 20 mikrolitrów roztworu blokującego do każdej próbki i inkubować je w wilgotnych komorach w temperaturze pokojowej przez godzinę w ciemności. Następnie odessać roztwór blokujący i zastąpić go sprzężonym roztworem przeciwciała anty-digoksygeniny FITC w ilości od jednego do 200.
Przykryj szkiełka i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez trzy godziny w ciemności. Po zabarwieniu przeciwciałami przemyć próbki dwukrotnie PBST przez 15 minut na każde przemycie w ciemności. Następnie odessać PBST i zastąpić go 10 mikrolitrami roztworu montażowego zawierającego DAPI.
Nałóż szklankę nakrywkową i wytrzyj nadmiar roztworu. Na koniec uszczelnij krawędzie szkła nakrywkowego lakierem do paznokci i przystąp do obserwacji próbek pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za pomocą sondy PNA zaobserwowano telomery zwierząt, które przeżyły mutację wystarczającą dla telomerów.
W gonadach liczba telomerów na jądro jest policzalna. Sygnał telomerowy był kolokalizowany z sygnałem TALT1, co potwierdza pogląd, że TALT1 jest odpowiedzialny za przeżycie bez telomerów. Natężenie sygnału telomerowego porównano za pomocą oprogramowania.
Sygnał był silniejszy u osób, które przeżyły ALT, niż u szczepów rodzicielskich używanych do generowania mutantów z niedoborem telomerów. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem i formamidem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zwięzłą technikę hybrydyzacji in situ z fluorescencyjnym znacznikiem (FISH) do analizy długości i liczby telomerów u Caenorhabditis elegans. Metoda ta umożliwia wizualizację i ilościową ocenę powtórzeń telomerów oraz alternatywne przedłużanie telomerów (TALT) w mniej niż 24 godziny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Genetyka
Tło
- Telomery chronią końce chromosomów i mają kluczowe znaczenie dla starzenia komórek.
- Rozumienie dynamiki telomerów jest ważne dla badań nad rakiem.
- Hybrydyzacja in situ z fluorescencyjnym znacznikiem (FISH) jest potężnym narzędziem do wizualizowania materiału genetycznego.
- Caenorhabditis elegans służy jako organizm modelowy do badań genetycznych.
Cel badania
- Rozwój zwięzłej procedury FISH dla C. elegans.
- Ilościowa ocena długości i liczby telomerów w krótkim czasie.
- Badanie roli telomerów w regeneracji nowotworów i starzeniu się komórek.
Stosowane metody
- Zbieranie ciężarnych dorosłych C. elegans w płynnym podłożu.
- Płukanie robaków buforem M9 w celu przygotowania do FISH.
- Zastosowanie FISH do wizualizowania sekwencji telomerów.
- Ilościowa ocena powtórzeń telomerów i TALT.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja powtórzeń telomerów u C. elegans.
- Osiągnięto ilościową ocenę dwóch różnych sekwencji powtarzających się.
- Wykazano skuteczność techniki FISH w krótkim czasie.
- Dostarczono informacji na temat biologii telomerów istotnych dla badań nad rakiem.
Wnioski
- Rozwojona metoda FISH jest efektywna do badania telomerów u C. elegans.
- Ta technika może ułatwić badania nad chorobami związanymi z telomerem.
- Przyszłe badania mogą rozwijać implikacje dynamiki telomerów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This FISH method enables direct visualization and quantification of telomere dynamics in a multicellular model, supporting target validation in telomere biology and alternative lengthening pathways. By providing single-cell resolution of repetitive sequences, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of genomic stability and cellular senescence. The approach offers a rapid, morphology-preserving assay suitable for early discovery workflows focused on telomere-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of telomere maintenance mechanisms, including ALT pathway activity, to validate therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Provides quantitative readouts of telomere number and length per nucleus for functional target assessment.
- Predictive Value: Supports biomarker-aligned evaluation of genomic instability in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible FISH signals for telomere and TALT sequences to enable assay readiness.
- Operational Value: Delivers quantitative imaging outputs compatible with high-content analysis pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links telomere visualization to ALT activity, supporting mechanistic de-risking in preclinical models.
- Translational Continuity: Enables correlation of telomere signals with TALT1 co-localization for pathway validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on telomere dynamics in disease-relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows by providing telomere quantification that informs target confidence and pathway validation before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of telomere length regulation and ALT mechanism in C. elegans.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible telomere signals for assay standardization and compound evaluation.
- Analytics: Enables intensity-based comparison of telomere signals using image analysis software for objective readouts.
- Translational Research: Connects telomere dynamics to ALT pathway activity via TALT1 co-localization for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable FISH capability for telomere and repetitive sequence analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in telomere biology, target validation, and reduction of mechanistic ambiguity in ALT mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of telomere quantification in fixed samples.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in telomere-targeted programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on telomere maintenance mechanism validation.
Implementation Considerations
- Expertise in fluorescence microscopy, probe hybridization, and sample preparation for whole-mount C. elegans.
- Requirement for polylysine-coated slides, humidified chambers, and temperature-controlled incubation systems.
- Need for PNA probe handling, RNase treatment, and antibody-based signal amplification steps.
- Adaptation considerations for different model systems or tissue types beyond embryos and gonads.
- Practical limitations include hazardous reagent handling (paraformaldehyde, formamide) and requirement for light protection during hybridization.
