Name: Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji struktur podobnych do wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji woda-w-oleju. Technika ta pozwala badać dynamikę mikrotubul i pozycjonowanie centrosomów w warunkach ograniczenia geometrycznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Dogterom za cenne dyskusje. Dziękujemy Stefanowi Diezowi i Marcelowi Jansonowi za odczynniki oraz Samarze Reck-Peterson za pomoc w oczyszczaniu dyneiny. Prace te zostały sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

<ol><li>Kotak, S., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+spindle+positioning%3A+cortical+force+generators+in+the+limelight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).</li>
<li>Williams, S. E., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oriented+divisions%2C+fate+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oriented divisions, fate decisions.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).</li>
<li>Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+centrosome+separation+and+bipolar+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly.</a> Dev Cell. 19, 797-806 (2010).</li>
<li>Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+force+generators+and+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitotic force generators and chromosome segregation.</a> Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).</li>
<li>Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microtubule+asters+in+microfabricated+chambers%3A+the+role+of+catastrophes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).</li>
<li>Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubules+is+regulated+by+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubules is regulated by force.</a> J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).</li>
<li>Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-generation+and+dynamic+instability+of+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).</li>
<li>Laan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+dynein+controls+microtubule+dynamics+to+generate+pulling+forces+that+position+microtubule+asters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters.</a> Cell. 148 (3), 502-514 (2012).</li>
<li>Dogterom, M., Yurke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+force-velocity+relation+for+growing+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules.</a> Science. 278 (5339), 856-860 (1997).</li>
<li>Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+force+balance+model+of+early+spindle+pole+separation+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos.</a> Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).</li>
<li>Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+microtubule+contacts+position+the+spindle+in+C.+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos.</a> Cell. 129 (3), 499-510 (2007).</li>
<li>Carminati, J. L., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+orient+the+mitotic+spindle+in+yeast+through+dynein-dependent+interactions+with+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex.</a> J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+cortical+dynein+and+G+alpha+proteins+mediates+spindle+positioning+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+production+by+disassembling+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force production by disassembling microtubules.</a> Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).</li>
<li>Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+hand-over-hand+mechanism+of+single+molecular+motility+of+cytoplasmic+dynein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).</li>
<li>Ten Hoopen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+astral+microtubule+capture+by+cortical+Bud6p+priming+spindle+polarity+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae.</a> Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bipolar+mitotic+kinesin+Eg5+moves+on+both+microtubules+that+it+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks.</a> Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).</li>
<li>van den Wildenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homotetrameric+kinesin-5+KLP61F+preferentially+crosslinks+microtubules+into+antiparallel+orientations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations.</a> Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+cross-linking+triggers+the+directional+motility+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5.</a> J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).</li>
<li>Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+functions+of+kinesin-5%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitotic functions of kinesin-5.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).</li>
<li>Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+function+of+Ase1p%3A+evidence+for+a+MAP-dependent+midzone-specific+spindle+matrix.+Microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins.</a> J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).</li>
<li>Loiodice, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ase1p+organizes+antiparallel+microtubule+arrays+during+interphase+and+mitosis+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast.</a> Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).</li>
<li>Kapitein, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-driven+multimerization+recruits+ase1p+onto+overlapping+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules.</a> Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).</li>
<li>Janson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinkers+and+motors+organize+dynamic+microtubules+to+form+stable+bipolar+arrays+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast.</a> Cell. 128 (2), 357-368 (2007).</li>
<li>Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+midzone+protein+module+controls+formation+and+length+of+antiparallel+microtubule+overlaps%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps.</a> Cell. 142 (3), 420-432 (2010).</li>
<li>Mollinari, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+is+a+microtubule+binding+and+bundling+protein+essential+to+maintain+the+mitotic+spindle+midzone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone.</a> J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).</li>
<li>Braun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+braking+by+Ase1+prevents+overlapping+microtubules+from+sliding+completely+apart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).</li>
<li>Lansky, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+crosslinkers+generate+directed+forces+in+microtubule+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks.</a> Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).</li>
<li>Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+fission+yeast+ase1+in+mitotic+cell+division%2C+meiotic+nuclear+oscillation%2C+and+cytokinesis+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling.</a> Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).</li>
<li>Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cortical+Dynein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cortical Dynein function.</a> Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).</li>
<li>Moudjou, M., Bornens, M. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoudjou%2C+M+%22Cell+Biology%3A+A+laboratory+handbook%22">Cell Biology: A laboratory handbook</a>. Celis, J. E. 2, 111-119 (1998).</li>
<li>Reck-Peterson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+dynein+processivity+and+stepping+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior.</a> Cell. 126 (2), 335-348 (2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Lancaster, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+rounding+alters+cell+geometry+to+ensure+efficient+bipolar+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation.</a> Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).</li>
<li>Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+volume+modulates+spindle+size+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis.</a> Science. 342 (6160), 856-860 (2013).</li>
<li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Avidin and streptavidin.</a> Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).</li>
<li>Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+RCC1+to+chromosomes+is+required+for+proper+mitotic+spindle+assembly+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells.</a> Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).</li>
<li>Akiyoshi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+directly+stabilizes+reconstituted+kinetochore-microtubule+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments.</a> Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).</li>
<li>Lawrimore, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+loops+generate+intracentromere+tension+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA loops generate intracentromere tension in mitosis.</a> J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).</li>
<li>Minc, N., Burgess, D., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+cell+geometry+on+division-plane+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Influence of cell geometry on division-plane positioning.</a> Cell. 144 (3), 414-426 (2011).</li>
<li>Taberner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+systems+for+the+study+of+microtubule-based+cell+polarity+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast.</a> Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).</li>
<li>Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisane tu metody prezentują najnowsze wysiłki zmierzające do odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych w kropelkach emulsji typu woda w oleju. Badanie montażu wrzecion w granicach geometrycznych ma wiele zalet. Istnieją ważne mechanizmy sprzężenia zwrotnego między mikrotubulami wrzeciona mitotycznego a ograniczeniami geometrycznymi, w których są one złożone. Mikrotubule mogą generować siły pchające, gdy rosną do granic geometrycznych, co może powodować mitotyczne przemieszczenie wrzeciona. Ponadto wyrastanie na fizyczną barierę może wywołać katastrofy mikrotubul. Ponadto montaż wrzeciona w ograniczonej geometrii może prowadzić do stopniowego wyczerpywania się poszczególnych komponentów, takich jak tubulina, co z kolei bezpośrednio wpływa na tempo wzrostu mikrotubul36. Są to wszystkie podstawowe determinanty montażu wrzeciona, które można badać za pomocą opisanych tutaj testów.
Opisane testy są bardzo wrażliwe na niewielkie różnice stężeń składników kropelk. Tak jest w przypadku tubuliny, gdzie niewielkie różnice w stężeniach mogą powodować zbyt wolny lub zbyt szybki wzrost mikrotubul. W takim przypadku tempo wzrostu mikrotubul często można jeszcze skorygować, dostosowując temperaturę podczas pierwszych ~ 30 minut eksperymentu. Montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego jest również bardzo wrażliwe na zmiany stężenia generatorów siły (korowej). Prawdopodobnie zależy to od stężenia, czystości i aktywności oczyszczonych składników i musi być starannie miareczkowane dla każdego nowo oczyszczonego białka.
Ponadto należy dokonać pewnych kompromisów w ustawieniach obrazowania, w zależności od charakteru testu. Początkowo wysoki poziom rozpuszczalnych dimerów fluorescencyjnych tubuliny utrudnia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W miarę wydłużania się mikrotubul i powolnego wyczerpywania się rozpuszczalnej tubuliny, stosunek sygnału do szumu stopniowo wzrasta i umożliwia obrazowanie pojedynczych mikrotubul. W przeciwieństwie do konfiguracji z systemami otwartymi, geometryczne ograniczenie zapobiega wymianie cząsteczek fluorescencyjnych i elementów systemu pochłaniania tlenu w zbiorniku zbiorczym, co powoduje znaczne bielenie. Szczególnie w przypadku monitorowania montażu i pozycjonowania wrzeciona w czasie wymagane jest obrazowanie przy niskim natężeniu światła, nawet w obecności silnego systemu pochłaniania tlenu.
Metody te umożliwiają odtworzenie od dołu uproszczonych struktur wrzecionowatych in vitro. Oprócz przedstawionych tutaj komponentów, opisano wiele innych czynników wpływających na powstawanie, pozycjonowanie, orientację, kształtowanie wrzeciona dwubiegunowego itp.3. System ten może być dalej rozbudowywany w celu zbadania indywidualnych i łącznych efektów dodatkowych generatorów siły. Ważnymi czynnikami przyczyniającymi się do tworzenia wrzeciona, które są obecnie nieobecne w tym systemie, są chromosomy mitotyczne. Wykazano, że chromatyna mitotyczna kieruje tworzeniem wrzeciona przez (1) chromoksynyny, które mogą generować tak zwane "siły wyrzutu polarnego"3, (2) tworzenie gradientu RanGTP przez związany z chromatyną RanGEF RCC138, (3) kinetochory, które mogą wchodzić w interakcje z (depolimeryzującymi) mikrotubulami39 i (4) samą chromatynę, która może działać jako mechaniczna sprężyna pomiędzy przeciwstawnymi mikrotubulami40.
Wreszcie, opisany system zapewnia obecnie ograniczoną czasową i przestrzenną kontrolę nad aktywnością i lokalizacją wprowadzanych generatorów siły. W komórkach wiele czynników montażu wrzeciona lokalizuje się w określonych przedziałach lub jest aktywnych w ograniczonym oknie czasowym. Uderzającym przykładem jest aktywność dyneiny, która jest specjalnie wzbogacona w tylnej części jednokomórkowego zarodka C. elegans, aby promować asymetryczne pozycjonowanie wrzeciona i podział komórek. W tym systemie badamy obecnie możliwość naśladowania takiej czasowej i asymetrycznej aktywności przy użyciu metod zapożyczonych z technik optogenetycznych. Ponadto, podobnie jak w przypadku zarodka C. elegans i komórek ze sztywną ścianą komórkową, wiele komórek nie zaokrągla się w mitozie. Kształt ograniczenia geometrycznego będzie miał zasadniczy wpływ na siły działające na wrzeciono41. W związku z tym ważne będzie odtworzenie montażu i pozycjonowania wrzeciona również w kroplach niesferycznych, potencjalnie przy użyciu bardziej złożonych systemów mikroprzepływowych, które umożliwiają kształtowanie i przechowywanie kropel emulsji42,43. Wreszcie, w tkankach, sygnalizacja i przyłączanie komórka-komórka i komórka-substrat dostarczają zewnętrznych wskazówek, które można przełożyć na ukierunkowaną orientację wrzeciona, jak to często obserwuje się w komórkach nabłonkowych i komórkach macierzystych. Wszystkie te specjalistyczne aspekty nie zostały wzięte pod uwagę w obecnym badaniu i mogą stanowić przyszłe wyzwania związane z budowaniem w kierunku bardziej podobnych do in vivo rekonstrukcji mitotycznego montażu i pozycjonowania wrzeciona.

Podczas mitozy, chromosomy replikowanego genomu są zorganizowane na równiku komórki, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie chromatyd siostrzanych nad nowo powstałymi komórkami potomnymi. Pozycjonowanie i segregacja chromosomów odbywa się za pośrednictwem ich przyczepiania się do wrzecionowatych mikrotubul pochodzących z dwóch przeciwstawnych centrosomów. Oprócz zapewnienia wiernej dystrybucji chromosomów, orientacja wrzeciona mitotycznego dyktuje również płaszczyznę podziału komórki1. Skoordynowana orientacja podziału komórki jest niezbędna na wielu etapach rozwoju i dla homeostazy tkanek2. W szczególności regulowane pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego może skutkować asymetrycznym rozkładem zawartości komórkowej, a nawet wytwarzać komórki potomne o różnych rozmiarach2. Montaż i orientacja wrzeciona mitotycznego rozpoczyna się w profazie i jest koordynowana przez złożoną interakcję między współpracującymi i antagonizującymi generatorami sił3,4. Generowane siły składają się zarówno z sił ciągnących, jak i pchających. Siły te pochodzą zarówno z kontaktów wrzeciona z korą komórkową, jak i z wnętrza wrzeciona i mogą być generowane przez dynamikę mikrotubul, a także przez silniki molekularne i środki sieciujące (ryc. 1).
Siły nacisku mogą być generowane, gdy mikrotubule rosną na sztywnych strukturach, takich jak kora komórkowa. W zależności od całkowitej siły oporu generowanej w systemie, może to spowodować przemieszczenie wrzeciona mitotycznego (małe siły) lub wywołanie wyboczenia mikrotubul lub katastrofę (duże siły)5-8. Wielkość siły, która może być generowana przez pchanie, zależy od długości mikrotubul, ponieważ długość jest silnym wyznacznikiem wyboczenia mikrotubuli9. Ponadto mikrotubule pochodzące z jednego centrosomu mogą napierać na drugi centrosom, co sugeruje mechanizm napędzający separację centrosomów we wczesnej fazieprofazy 3,10.
Oprócz sił nacisku generowanych przez rosnące mikrotubule, końce mikrotubul stykające się z korą komórkową mogą również pośredniczyć w siłach ciągnących11. Badania przeprowadzone w wielu laboratoriach wykazały, że kontrolowana aktywność generatorów siły korowej jest wymagana do asymetrycznego pozycjonowania wrzecion mitotycznych in vivo1. Zasadnicze znaczenie dla tych sił ciągnących ma zlokalizowana w korze cytoplazmatyczna dyneina (zwana dalej "dyneiną"), białko motoryczne mikrotubul skierowane na minusend 8,12,13. Na przykład u pączkujących drożdży boczne oddziaływania dyneiny korowej z siatką mikrotubul powodują przesuwanie się mikrotubul zależnych od motoryki wzdłuż kory14. Jednak korowe siły ciągnące mogą być również generowane przez zdolność dyneiny do tworzenia przyczepów końcowych do depolimeryzujących mikrotubul8. Energia generowana przez skurcz mikrotubul może prowadzić do sił, które są na ogół o rząd wielkości wyższe (~50 pN (odniesienie15)) niż siły generowane przez pojedyncze białka motoryczne (~7-8 pN (odnośnik 16)). Końcowe przyłączenie dyneiny korowej do mikrotubul depolimeryzujących sprzyja pozycjonowaniu wrzeciona u pączkujących drożdży17 i C. elegans13. Obecnie nie wiadomo, czy zarówno zależne od silnika siły ciągnące, jak i siły ciągnące napędzane depolimeryzacją mikrotubul mogą ze sobą współpracować, czy też wzajemnie się wykluczają in vivo.
Oprócz sił nacisku mikrotubul i sił ciągnących kory mózgowej za pośrednictwem dyneiny, pozycjonowanie centrosomów jest kontrolowane z wnętrza wrzeciona mitotycznego przez wiele innych białek. Na przykład silniki Kinesin-5 istnieją jako tetramery, które mogą sieciować antyrównoległe mikrotubule międzybiegunowe, co powoduje generowanie sił poślizgowych na zewnątrz18-20. Członkowie rodziny motorycznej kinezyny-5 są wymagani do separacji centrosomów i montażu wrzeciona dwubiegunowego u wszystkich badanych eukariontów, z wyjątkiem C. elegans (przegląd w odnośniku21).
Ponadto, dyfuzyjne sieciery z rodziny Ase1/PRC1 są również znane z lokalizacji w nakładających się na siebie obszarach mikrotubul mikrotubul międzypolarnych in vivo i in vitro22-27. Siły generowane przez napędzaną przez Ase1 ekspansję nakładającego się obszaru mikrotubuli są wystarczająco duże, aby zrównoważyć siły ślizgowe za pośrednictwem kinezyny-14 in vitro28,29. W komórkach Ase1 / PRC1 jest wymagany do stabilnego tworzenia nakładających się regionów mikrotubul w strefie środkowej wrzeciona25-27,30, co sugeruje, że siły generowane przez dyfuzyjne środki sieciujące mogą znacząco przyczyniać się do organizacji wrzeciona. Wreszcie, siły z chromatyny mitotycznej i kinetochorów wpływają na montaż i pozycjonowanie wrzeciona mitotycznego poprzez różne szlaki3. Ponieważ składniki te nie są częścią opisanych tutaj testów rekonstytucji, nie będą one szczegółowo omawiane.
Istnieją różne teorie na temat tego, jak różne składniki molekularne i siły opisane powyżej współpracują przy montażu i pozycjonowaniu wrzeciona, ale wciąż jesteśmy daleko od ilościowego zrozumienia. Oprócz eksperymentów na żywych komórkach, eksperymenty in vitro z oczyszczonymi składnikami stanowią skuteczną drogę do osiągnięcia tego celu. Poniżej przedstawiamy wizualny przewodnik po zaadaptowanej i rozszerzonej wersji ostatnio opublikowanych metod (Roth i wsp.31), w którym podstawowe wrzeciona są odtwarzane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, zaczynając od minimalnej liczby komponentów. Korzystając z technik mikroprzepływowych, generowane są kuliste kropelki o rozmiarach porównywalnych z komórkami mitotycznymi. W obrębie tych kropelek oczyszczone centrosomy i tubulina mogą być łączone w celu zbadania dynamiki asteru mikrotubul, generowania sił i interakcji aster-aster. Wprowadzając korowe (takie jak dyneina) i międzybiegunowe (takie jak kinezyna-5/Ase1) generatory siły, odtwarzamy coraz bardziej złożone struktury wrzecionowate, które zaczynają przypominać sytuację in vivo.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Przygotowanie chipów mikroprzepływowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Fotomaska na podłożu filmowym)</td><td>Selba S.A. Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy (4-calowy wafel krzemowy p/Bor < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, z 2 płaskimi)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS prepolimer RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Obróbka koronowa</td><td>Produkty elektrotechniczne</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Zestaw mikroprzepływowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-seryna)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-( biotynyl)))Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Pipety</td><td></td><td></td><td></td>szklane</tr><tr><td>Rurki szklane Pompa próżniowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Komora próżniowa</td><td>Kartell</td><td>Polipropylen Eksykator</td><td></td>próżniowy</tr><tr><td>Olej</td> <td>mineralnySigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfaktant (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td> nakrywkowe <td>24 mm x 60 mm, grubość 1,5</td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td><td>podstawowe 26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Dziurkacz</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelnienie laboratoryjne Film</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (wazelina, lanolina, wosk parafinowy stopiony w równych stężeniach)</td><td></td><td></td><td>Domowy</td></tr><tr><td>mikroskop Brightfield</td><td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Wystarczyłoby dowolne odwrócone jasne pole</td></tr><tr><td>Regulator ciśnienia</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Rurka</td><td>Cluzeau Info. Labo, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki mikrofluidyki (probówki Micrew 0,5 ml i 1 ml)</td><td>VWR, Holandia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Odtwarzanie formowania i pozycjonowania wrzeciona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10 000 MW, Anionowy, Fixable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glukoza (D-(+)-Glukoza)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa (Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ditioltheitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza (katalaza z wątroby bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina (tubulina z mózgu bydlęcego)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulina-488/561 (tubulina znakowana HiLyte-488/rodaminą z mózgu świni)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (guanozyno-'5-trifosforan, hydrat soli sodowej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-kazeina (&kappa;-kazeina z surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (ultrawirówka napędzana powietrzem)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><<tr><td>strong>4. Przedstawiamy czynniki montażowe wrzeciona</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (adenozyno-'5-trifosforan, sól disodowa hydrat sodowy)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Sól monosodowa kwasu fosfo(enol)pirogronowego, hydrat &ge; 97% (enzymatyczny))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Kinaza pirogronianowa/enzymy dehydrogenazy mlekowej z mięśni królika)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

Montaż, pozycjonowanie i orientacja wrzeciona mitotycznego zależą od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne mikrotubul i środki sieciujące. Rosnące mikrotubule mogą generować siły pchające, podczas gdy mikrotubule depolimeryzujące mogą przekształcać energię skurczu mikrotubul w siły ciągnące, gdy są przyłączone, na przykład, do dyneiny korowej lub chromosomów. Ponadto białka motoryczne i dyfuzyjne środki sieciujące w obrębie wrzeciona przyczyniają się do architektury wrzeciona poprzez łączenie i przesuwanie antyrównoległych mikrotubul. In vivo okazało się, że trudno jest ustalić względny wkład poszczególnych graczy w ogólny układ sił. Poniżej przedstawiamy metody, które niedawno opracowaliśmy w naszych wysiłkach na rzecz odtworzenia podstawowych wrzecion mitotycznych od dołu do góry in vitro. Stosując techniki mikroprzepływowe, centrosomy i tubulina są kapsułkowane w kropelkach emulsji typu woda w oleju, co prowadzi do powstania geometrycznie ograniczonych (podwójnych) astry mikrotubul. Poprzez dodatkowe wprowadzenie dyneiny zakotwiczonej w korze mózgowej, silników mikrotubul ukierunkowanych na plusie i dyfuzyjnych środków sieciujących, system ten jest używany do odtwarzania struktur przypominających wrzeciona. Przedstawione tutaj metody stanowią punkt wyjścia do odtworzenia bardziej kompletnych wrzecion mitotycznych, co pozwala na szczegółowe badanie udziału każdego pojedynczego składnika oraz na uzyskanie zintegrowanego ilościowego obrazu równowagi sił w wrzecionie mitotycznym.

Metody przedstawione w poprzednich sekcjach umożliwiają rekonstytucję struktur przypominających wrzeciona o rosnącym stopniu złożoności, wykorzystując geometryczne ograniczenie kropli emulsji woda w oleju. W tej sekcji opisano reprezentatywne wyniki, które jakościowo demonstrują możliwości tych analiz.
Podczas mitozy, w momencie formowania się dwubiegunowego wrzeciona, komórki zaokrąglają się, tworząc sfery o średnicy około 15 µm, jak zmierzono dla komórek ludzkich. Ta charakterystyczna budowa komórki w stanie mitozy wyznacza granicę geometryczną, która zarówno ogranicza, jak i kieruje rozmiarem oraz orientacją wrzeciona.35,36Techniki mikroprzepływowe zapewniają stopień ograniczenia geometrycznego, który wiernie odzwierciedla sytuację obserwowaną w żywych komórkach, a tym samym umożliwiają rekonstrukcję wrzecion mitotycznych metodą oddolną (bottom-up). in vitro.
Astery mikrotubul same w sobie są zdolne do wykazania złożonych zachowań, gdy wzrost mikrotubul jest ograniczony przez bariery geometryczne. Wraz ze wzrostem mikrotubul siły pchające generowane przez wbudowywanie nowych dimerów tubuliny przesuwają dwa centrosomy na przeciwległe strony kropli emulsji. Początkowo centrosomy swobodnie dyfundują w ograniczonej objętości (Rysunek 4a, lewy panel). Po około 20-30 min stają się widoczne pierwsze mikrotubule, a dyfuzja centrosomów zostaje ograniczona, ponieważ mikrotubule rosną w stronę kory we wszystkich kierunkach. Astery z mikrotubulami o średniej długości (około 50% średnicy kropli) mogą (sterycznie) odpychać się nawzajem, przy czym mikrotubule napierają na siebie, na pozostałe centrosomy oraz na korę. Prowadzi to do typowego „bipolarnego” układu przypominającego wrzeciono, w którym dwa centrosomy znajdują się naprzeciw siebie (Rysunek 4a, środkowy panel). Gdy mikrotubule przekroczą długość ~50% średnicy kropli, centrosomy zostają przesunięte dalej do przeciwległych krawędzi kropli, a mikrotubule rosną wzdłuż kory kropli (Rysunek 4a, prawy panel). Należy zauważyć, że szybkość wzrostu mikrotubul w tych testach jest bardzo wrażliwa zarówno na temperaturę, jak i na stężenie tubuliny. Parametry te będą zatem w dużym stopniu wpływać na czas pierwszego zaobserwowania nukleacji oraz moment osiągnięcia stanu stacjonarnego pozycji asterów.
W komórkach siły ciągnące kory są generowane poprzez tworzenie nośnych połączeń między końcami plus mikrotubul a dyneiną związaną z korą. W komórkach zwierzęcych powiązanie to zależy od kompleksu Gαi/LGN/NuMA, który jest kierowany do błony plazmatycznej poprzez mirystoilację N-końca Gαi1. W tych testach rekonstrukcyjnych wymóg obecności kompleksu Gαi/LGN/NuMA jest pomijany poprzez bezpośrednie sprzężenie dyneiny z biotynilowanymi lipidami za pomocą tworzenia kompleksów biotyna-streptawidyna-biotyna. Wiązania te są stosunkowo stabilne (KD ~10-14 M)37 i tworzą się szybko (zazwyczaj w ciągu 10 min po utworzeniu kropli emulsji, zanim stanie się widoczna nukleacja mikrotubul) (Rysunek 4b). W obecności dyneiny korowej centrosomy zazwyczaj zachowują bardziej centralną pozycję, podczas gdy w przypadku braku dyneiny centrosomy są wypychane na przeciwległe strony kory kropli (Rysunek 4c). Uważamy, że jest to wynik dwóch efektów, które zapobiegają siłom pchającym mikrotubul i przeciwdziałają im. (1) Dyneina bezpośrednio promuje katastrofy mikrotubul, ograniczając tym samym ich długość i zapobiegając nadmiernemu wyginaniu mikrotubul, oraz (2) siły ciągnące kory prowadzą do wypadkowych sił centrujących działających na poszczególne astry8, które przeciwdziałają siłom odpychania między astrami.
Dyfuzyjny łącznik sieciujący Ase1 indukuje siły, które dążą do zwiększenia regionu nakładania się antyrównoległych mikrotubul29. Zgodnie z tym, w obecności Ase1 (i przy braku dyneiny) centrosomy znajdują się blisko siebie, a Ase1 lokalizuje się w wiązkach mikrotubul interpolarnych (Ryc. 4d). Białka z rodziny kinezyny-5 napędzają separację centrosomów, generując siły pchające wewnątrz wrzeciona (patrz wstęp). W obecności Cut7 (ortologu kinezyny-5 u S. pombe) centrosomy są spychane na przeciwległe strony kropli emulsji, nawet w obecności Ase1 (Ryc. 4e). Dzięki połączeniu generatorów sił kortykalnych i interpolarnych, stopień złożoności w tych eksperymentach może zostać dalej zwiększony, co w rezultacie doprowadzi do kompleksowego zrozumienia procesu montażu bipolarnego wrzeciona mitotycznego. Szczegółowy opis ilościowy tych wyników będzie dostępny w przyszłości (Roth et al., rękopis w przygotowaniu).
Oprócz obserwacji pozycji centrosomów w stałych momentach czasu i wiązania ich zachowania z obserwowaną długością mikrotubul, cenne informacje można uzyskać poprzez śledzenie procesu pozycjonowania w czasie. Dzięki skróceniu czasu ekspozycji i zmniejszeniu intensywności laserów możliwe jest obecnie śledzenie pozycjonowania asterów w odstępach 2 min przez co najmniej 1 hr, przy fotobleachingu wynoszącym jedynie ~30%. Pozwala to na monitorowanie składania i pozycjonowania asterów, zaczynając od swobodnie dyfundujących centrosomów (0 min.), poprzez astery scentralizowane (12 min.), aż po astery zdecentralizowane (36 min i dalej) (Rycina 5c). Ułatwia to badanie zarówno zachowania w stanie stacjonarnym, jak i kinetyki składania wrzeciona. Poprzez łączenie kropli o różnej zawartości w tej samej próbce możliwe jest, na przykład, bezpośrednie porównanie pozycjonowania centrosomów i kinetyki składania wrzecion w kroplach z generatorami sił korowych oraz bez nich (Rycina 5b).
<img alt="Schemat podziału komórki przedstawiający dynamikę mikrotubul, dyneiny, kinezyny i kinetochorów." src="/files/ftp_upload/54278/54278fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Siły działające na wrzeciono mitotyczne. Kilka cząsteczek generujących siłę działa na mikrotubule wrzeciona mitotycznego, aby wspomagać formowanie i pozycjonowanie wrzeciona. Mikrotubule wrastające w korę komórkową generują siłę pchającą działającą na centrosom. Dyneina korowa (fioletowa) przechwytuje depolimeryzujące mikrotubule i generuje siłę ciągnącą działającą na centrosomy. W obrębie wrzeciona białka motorowe Kinesin-5/Cut7 zapewniają siłę poślizgu skierowaną na zewnątrz w przypadku mikrotubul antyrównoległych, podczas gdy białka sieciujące z rodziny PRC1/Ase1 generują przeciwną siłę poślizgu skierowaną na zewnątrz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat urządzenia mikroprzepływowego z kanałami rozcieńczającymi, wymiarami i układem chipa do zastosowań lab-on-a-chip." src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Projekt chipa mikroprzepływowego. (A) Projekt 4-calowej fotomaski zawierającej 4 chipy mikroprzepływowe. (B) Szczegółowa reprezentacja pojedynczego chipa. Chipy zawierają jeden kanał wylotowy i trzy kanały wlotowe, za którymi znajduje się filtr przeciwpyłowy. Kanał wlotowy 1 zawiera fazę wodną, kanał 2 fazę lipidową/olejową, a kanał 3 może być wykorzystany do rozcieńczania utworzonych kropel dodatkową fazą lipidową/olejową. (C) Szczegółowa reprezentacja złącza, w którym faza lipidowa/olejowa (nadchodząca z góry i z dołu) spotyka się z fazą wodną (nadchodzącą z lewej strony). W złączu powstaną krople, które będą przepływać w kierunku kanału wylotowego po prawej stronie. (D) Szczegółowa reprezentacja filtra przeciwpyłowego z kanałami o rozmiarze 2 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat chipa mikrofluidycznego: szkiełka powlekane PDMS, dynamika mikrotubul, centrosom, oddziaływanie dyneiny." src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Metodyka tworzenia kropel emulsji woda w oleju. (A) Chip mikrofluidyczny i przewody mikrofluidyczne w mikroskopie w świetle przechodzącym. Przewody fazy wodnej oraz fazy lipidowej/olejowej są podłączone odpowiednio do wlotów chipa 1 i 2. (B) Zwężenie na chipie mikrofluidycznym, w którym spotykają się fazy wodna i lipidowa/olejowa. Poprzez zmianę ciśnień można kontrolować rozmiar kropel. (C) Konstrukcja komór przepływowych powlekanych PDMS. Po wprowadzeniu kropel do komory przepływowej, otwarte końce zamyka się dodatkową warstwą Valap. (D) Schemat tworzenia kropel. Krople są wykorzystywane do enkapsulacji centrosomów, tubuliny i dodatkowych komponentów niezbędnych do tworzenia wrzeciona mitotycznego. (E) Schemat ukierunkowania dyneiny kortykalnej. Biotynilowana (Bio) dyneina jest kierowana do biotynilowanych lipidów za pomocą streptawidyny (Strp). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna oddziaływań tubuliny i dyneiny; lokalizacja białek Ase1 i Cut7." src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki rekonstrukcji wrzeciona o rosnącym stopniu złożoności. (A) Maksymalne projekcje intensywności kropli zawierających dwa centrosomy, pokazujące przykłady krótkich, średnich i długich mikrotubul. Centrosomy i mikrotubule są wizualizowane poprzez dodanie 10% tubuliny znakowanej HiLyte-488. Paski skali = 10 µm. (B) Lokalizacja GFP-biotyny-dyneiny-TMR w przypadku braku (-, lewo) i obecności (+, prawo) streptawidyny (Strp). (C) Pozycjonowanie aster mikrotubul w przypadku braku (-, lewo) lub obecności (+, prawo) kortykalnej GFP-biotyny-dyneiny-TMR. (D) Pozycjonowanie aster mikrotubul (panel lewy, zielony) w obecności Ase1 (panel środkowy, czerwony). (E) Pozycjonowanie aster mikrotubul (panel lewy, zielony) w obecności Ase1 i Cut7 (kinezyna-5) (panel środkowy, czerwony). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu PDMS; mikroskopia z oświetleniem 641 nm; analiza dyfuzji w czasie na szkiełku nakrywnym." src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Obrazowanie dynamiki pozycjonowania asterów in vitro. (A) Projekt naczynia z PDMS, który umożliwia obrazowanie kropli przez okres do kilku godzin. (B) Generowanie, przechowywanie i obrazowanie (w świetle przechodzącym) kropli o różnej zawartości, zilustrowane brakiem (lewo) lub obecnością (prawo) fluorescencyjnego dekstranu (Alexa 647). (C) Obrazy z pojedynczej płaszczyzny z sekwencji time-lapse trwającej 60 min (interwały 2 min), pobrane ze stosu z-stack (odstępy 2 µm) kropli zawierającej pojedynczy centrosom. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Montaż i ustawienie wrzeciona mitotycznego zależy od połączonych sił generowanych przez dynamikę mikrotubul, białka motoryczne i sieciery. Tutaj przedstawiamy nasze ostatnio opracowane metody, w których geometryczne uwięzienie sferycznych kropelek emulsji jest wykorzystywane do odtworzenia od dołu do góry podstawowych wrzecion mitotycznych.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rekonstrukcja struktur przypominających wrzeciono mitotyczne w ograniczonej przestrzeni geometrycznej kropel emulsji woda w oleju. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie montażu wrzecion mitotycznych, takie jak: w jaki sposób wrzeciona są pozycjonowane i montowane oraz jaki jest specyficzny wkład poszczególnych komponentów w te procesy? Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie podejścia oddolnego (bottom-up) do rekonstrukcji struktur przypominających wrzeciona w ograniczeniu geometrycznym, które naśladuje kształt komórki mitotycznej.Tę metodę można również wykorzystać do badania innych procesów zależnych od ograniczenia przestrzennego komórek. Wymieszaj 10 części prepolimeru PDMS z jedną częścią czynnika sieciującego, tak aby całkowita masa wynosiła około 40 gramów. Następnie umieść mieszaninę w komorze próżniowej na około 30 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.W międzyczasie owiń formę folią aluminiową, aby stworzyć wgłębienie o głębokości 1 cm i średnicy 4 cali. Po przygotowaniu wlej do formy około 3/4 mieszanki PDMS. Następnie umieść PDMS ponownie w komorze próżniowej na kolejne 30 minut.Po odgazowaniu utwardzaj PDMS przez godzinę w temperaturze 100 °C. W międzyczasie przygotuj szkiełka przedmiotowe do powlekania wirowego, oczyszczając je sprężonym powietrzem. Następnie nanieś pozostałą mieszaninę PDMS na szkiełka metodą powlekania wirowego.Utwardzaj te preparaty przez godzinę w temperaturze 100 °C, aby utwardzić PDMS. Następnie ostrożnie oddziel PDMS za pomocą żyletki i wybij w paskach PDMS wymagane otwory, aby stworzyć chipy mikroprzepływowe. Teraz poddaj chip mikroprzepływowy oraz szkiełko przedmiotowe pokryte PDMS działaniu wyładowań koronowych przez kilka sekund.Na koniec umieść chip mikrofluidyczny na każdym szkiełku przedmiotowym kanałami do dołu i wypalaj chipy przez noc w temperaturze 100 °C. Najpierw, używając szklanych naczyń przemytych chloroformem, przygotuj około 250 µg lipidów rozpuszczonych w chloroformie. Ostrożnie osusz mieszaninę lipidową gazem obojętnym.Następnie umieść go w komorze próżniowej na godzinę. Potem rozpuść lipidy w oleju mineralnym i 2,5% surfaktancie do stężenia 0,5 mg/mL, co odpowiada objętości około 500 µL. Aby całkowicie rozpuścić lipidy, poddaj mieszaninę sonikacji przez 30 minut przy częstotliwości 40 kHz.Następnie nanieś PDMS metodą spin-coatingu na szkiełka nakrywki, tak aby grubość warstwy była dopasowana do obiektywu mikroskopu. Następnie nanieś PDMS metodą spin-coatingu na szkiełka przedmiotowe. Teraz utwardzaj pokryte PDMS szkiełka nakrywki i szkiełka przedmiotowe przez godzinę w temperaturze 100 °C.Następnie przygotuj komory przepływowe, układając w niewielkich odstępach cienkie paski laboratoryjnej folii uszczelniającej na szkiełkach przedmiotowych pokrytych PDMS. Rozmieść paski o szerokości 3 mm w odstępach około 2 mm. Następnie przykryj komory przepływowe szkiełkiem nakrywką pokrytym PDMS i uszczelnij cały układ, topiąc folię w temperaturze 100 °C przez krótką chwilę.Po podgrzaniu delikatnie dociśnij szkiełko nakrywką i zabezpiecz je Valapem. Następnie przygotuj uchwyt z PDMS do obrazowania długoterminowego. Wymień otwór o średnicy 4 mm w plastrze PDMS o grubości 3 mm.Następnie poddaj obróbce koronowej plaster PDMS oraz szkiełko nakrywkę pokrytą PDMS. Po obróbce umieść je jedno na drugim i wypalaj tak przygotowany zestaw przez noc w temperaturze 100 °C. Monitoruj tworzenie się kropel za pomocą odwróconego mikroskopu w jasnym polu.Podłącz fazę olejową lipidową do kontrolera ciśnienia i zwiększaj ciśnienie, aż z rurki peak wypłynie kropla oleju. Podłącz rurkę peak do wlotu drugiego chipa mikroprzepływowego. Następnie całkowicie wypełnij chipy mikroprzepływowe fazą olejową lipidową poprzez wlot drugi.Następnie wprowadź fazę wodną opartą na MRB-80 z pierwszego wlotu. Kontroluj rozmiar kropli poprzez zmianę ciśnień fazy olejowej z lipidami oraz fazy wodnej, aby utworzyć krople o średnicy około 15 mikronów. Dobrym punktem wyjścia jest ustawienie około 800 millibar dla fazy olejowej z lipidami oraz 200 millibar dla fazy wodnej.Po uzyskaniu pożądanego rozmiaru kropel, należy całkowicie wypełnić komórkę przepływową kroplami. Krople te są tworzone przy użyciu małych objętości fazy wodnej. Oznacza to, że układ mikroprzepływowy musi pracować szybko, aby nie zużyć całej fazy wodnej przed sformowaniem kropel o prawidłowym rozmiarze.Po napełnieniu ostrożnie zamknij końce celi przepływowej za pomocą Valapu. Jeśli krople nie przestaną się poruszać, oznacza to, że uszczelnienie jest niepełne lub do środka dostały się pęcherzyki powietrza. W przypadku obrazowania długoterminowego przenieś krople do naczynia z PDMS i pokryj je warstwą mieszaniny lipidowo-olejowej.Odzamróź centrosomy w temperaturze pokojowej, a następnie pozostaw je w temperaturze 37°C przez 20 minut, aby zapewnić prawidłową nukleację mikrotubul. W tym czasie przygotuj na lodzie mieszaninę do analizy. Powinna ona zawierać tubulinę, GTP, układ usuwania tlenu, molekularne generatory siły, takie jak sieciujące mikrotubule, ATP oraz układ regenerujący ATP.Po wymieszaniu odwiruj próbkę w schłodzonym rotorze Airfuge przy ciśnieniu 30 psi przez trzy minuty. Następnie dodaj do mieszaniny wstępnie podgrzane centrosomy. Zoptymalizuj ilość dodawanych centrosomów tak, aby uzyskać jeden lub dwa centrosomy na kropelkę.Następnie wykorzystaj tę mieszaninę do wytworzenia kropli emulsji zgodnie z wcześniejszym opisem. Aby zrekrutować dyneinę do biotynilowanych lipidów w korze kropli, dodaj do fazy wodnej GFP-dynein TMR oraz streptawidynę. Na konfokalnym mikroskopie z dyskiem wirującym zwizualizuj wzrost mikrotubul po 30 minutach w temperaturze 26 °C.Podczas obrazowania wzrost mikrotubul można przyspieszyć, zwiększając temperaturę do 28 lub nawet 30 stopni Celsjusza. W celu wykonania projekcji Z należy pobrać serie obrazów w odstępach jednego mikrona, co powinno wymagać około 20 obrazów na kropelkę. Przejdź do głównego panelu kamery, kliknij Edit Z i ustaw Z Step na 1.0.Kliknij Dalej, aby zapisać ustawienia. Następnie ustaw maksymalne liniowe wzmocnienie EM Gain, klikając kartę Camera w panelu Acquisition i przesuwając suwak EM Gain do wartości 300. Następnie w tej samej karcie ustaw czas ekspozycji Exposure Time na 200 milisekund.Kliknij Record, aby zapisać ustawienia. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem na żywo, wykonuj projekcje Z (Z Projections) co dwie minuty przez dwie godziny, zmniejszając czas ekspozycji do około 100 milisekund i zwiększając interwały Z do dwóch mikronów. W eksperymentach z obrazowaniem na żywo, zamiast zwykłej celi przepływowej, użyj kubka PDMS, aby zapewnić maksymalną immobilizację próbki.Z wykorzystaniem opisanych protokołów badano tworzenie asterów w kropelkach emulsji wodno-olejowej zawierających centrosomy. Początkowo centrosomy swobodnie dyfundują w ograniczonej objętości. Po około 20 do 30 minutach stają się widoczne pierwsze mikrotubule, a dyfuzja centrosomów zostaje ograniczona w miarę wzrostu mikrotubul we wszystkich kierunkach w stronę kory.Gdy mikrotubule stają się dłuższe niż połowa średnicy kropelki, centrosomy zostają wypchnięte do przeciwległych granic, a mikrotubule rosną wzdłuż kory kropelki. Bez streptawidyny dyneina jest rozproszona wewnątrz kropelki. Jednak w obecności streptawidyny, w ciągu około 10 minut od powstania kropelki, dyneina zostaje powiązana z biotynilowanymi lipidami.Podczas obserwacji fluorescencyjnej tubuliny w obecności dyneiny korowej wyraźnie widać, że centrosomy znajdują się w pozycji centralnej. Natomiast w przypadku braku dyneiny centrosomy zostają wypchnięte na przeciwległe strony kropli. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że dyneina promuje katastrofy mikrotubul oraz generuje siły ciągnące od strony kory, co prowadzi do scentrowania asterów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać technologie mikroprzepływowe do tworzenia struktur przypominających wrzeciona w sferycznych kroplach emulsji. Po opanowaniu tej metody, formowanie kropli i obrazowanie mogą zostać wykonane w ciągu dwóch do trzech godzin przy prawidłowym przeprowadzeniu procedury. Stosując tę metodę, można enkapsulować inne czynniki montażu wrzeciona w celu zbadania ich wpływu na morfologię i pozycjonowanie wrzeciona.Podczas korzystania z chloroformu lub PDMS należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek.

reconstitution-basic-mitotic-spindles-spherical-emulsion

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę badania składania białek septyny na mikrosferach pokrytych dwuwarstwami lipidowymi. Technika ta pomaga w zrozumieniu zależnych od krzywizny zespołów białek na zakrzywionych powierzchniach.

Test dwuwarstwowy lipidów ze sferycznym wsparciem: technika obserwacji składania się septyny na mikrosferach

Gigantyczne pęcherzyki zawierające wysoko upakowane składniki o rozmiarach mikrometrów są użytecznymi modelami komórek. Metoda wirowania emulsji typu woda w oleju jest prostym, ale potężnym narzędziem do przygotowywania gigantycznych pęcherzyków z zamkniętymi materiałami.

Otrzymywanie gigantycznych pęcherzyków otaczających mikrosfery przez odwirowanie emulsji typu woda w oleju

Niniejsza praca opisuje metodę wytwarzania nanokryształów micelarnych, wyłaniającej się głównej klasy nanobiomateriałów. Ta metoda łączy w sobie elektronatryskiwanie od góry do dołu, samoorganizację od dołu do góry i kontrolę struktury na bazie rozpuszczalnika. Metoda wytwarzania jest w dużej mierze ciągła, może wytwarzać produkty wysokiej jakości i posiada niedrogie środki kontroli struktury.

Wytwarzanie sferycznych i ślimakowatych nanokryształów micelarnych poprzez połączenie elektrorozpylania, samoorganizacji i kontroli struktury na bazie rozpuszczalnika

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia protokół tworzenia zespołów mikrotubul w kształcie taktoidów przy użyciu MAP65, roślinnego środka sieciującego mikrotubul, oraz PEG jako czynnika tłumiącego.

Samodzielny montaż taktoidów mikrotubul

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

Poznaj metodę rekonstytucji struktur podobnych do wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji woda-w-oleju. Technika ta pozwala badać dynamikę mikrotubul i pozycjonowanie centrosomów w warunkach ograniczenia geometrycznego.

Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Przeglądaj więcej filmów