Rekonstytucja podstawowych wrzecion mitotycznych w sferycznych kropelkach emulsji

Ogólnym celem tej procedury jest odtworzenie mitotycznych struktur przypominających wrzeciona w geometrycznym uwięzieniu wody w kropelkach emulsji olejowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mitotycznego montażu wrzecion, takie jak to, w jaki sposób wrzeciona są ustawiane i montowane oraz jaki jest konkretny wkład poszczególnych komponentów w te procesy? Główną zaletą tej techniki jest to, że stosujemy podejście oddolne do odtworzenia struktur przypominających wrzeciono w geometrycznym zamknięciu, które naśladuje kształt komórki mitotycznej.

Metoda ta może być również wykorzystana do badania innych procesów, które są zależne od uwięzienia komórek. Wymieszaj 10 części prepolimeru PDMS z jedną częścią utwardzacza o łącznej masie około 40 gramów. Następnie umieść mieszankę w komorze próżniowej na około 30 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

W międzyczasie owiń folię aluminiową wokół formy, aby utworzyć kubek o głębokości jednego centymetra i średnicy czterech cali. Gdy będziesz gotowy, wlej około 3/4 mieszanki PDMS do formy. Następnie umieść PDMS z powrotem w komorze próżniowej na kolejne 30 minut.

Po odgazowaniu utwardź PDMS przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza. W międzyczasie przygotuj kilka szkiełek do powlekania wirowego, odkurzając je sprężonym powietrzem. Następnie odwiruj pozostałą mieszankę PDMS na szkiełkach.

Utwardzaj te szkiełka przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza, aby stwardniały PDMS. Następnie delikatnie zdejmij PDMS za pomocą żyletki i wybij wymagane otwory z pasków PDMS, aby uzyskać chipy mikroprzepływowe. Teraz przez kilka sekund poddaj koronie chip mikroprzepływowy i szkiełko pokryte PDMS.

Na koniec umieść chip mikroprzepływowy na każdym szkiełku kanałami skierowanymi w dół i piecz frytki przez noc w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Najpierw, używając szkła mytego chloroformem, przygotuj około 250 mikrogramów lipidów rozpuszczonych w chloroformie. Ostrożnie wysuszyć mieszaninę lipidów gazem obojętnym.

A następnie umieść go w komorze próżniowej na godzinę. Następnie rozpuść lipidy w oleju mineralnym i 2,5% środku powierzchniowo czynnym do 0,5 miligrama na mililitr, czyli około 500 mikrolitrów. Aby całkowicie rozpuścić lipidy, należy poddać mieszaninę sonikacji przez 30 minut w temperaturze 40 kiloherców.

Następnie odkręć powłokę PDMS na szkłach nakrywkowych o grubości dopasowanej do obiektywu mikroskopu. Następnie obróć powłokę PDMS na szkiełkach szkiełkowych. Teraz utwardź szkła nakrywkowe i szkiełka podstawowe pokryte PDMS przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza.

Następnie wykonaj komórki przepływowe, umieszczając cienkie plasterki laboratoryjnej folii uszczelniającej na szkiełkach pokrytych PDMS. Umieść trzy milimetrowe paski w odległości około dwóch milimetrów od siebie. Następnie przykryj komory przepływowe szkiełkiem nakrywkowym pokrytym PDMS i uszczelnij zespół, topiąc folię w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez krótką minutę.

Po podgrzaniu delikatnie dociśnij szkiełko pokrywy i uszczelnij je za pomocą Valap. Następnie przygotuj kubek PDMS do długotrwałego obrazowania. Wybij otwór o średnicy czterech milimetrów w plastrze PDMS o grubości trzech milimetrów.

Następnie poddaj obróbce koronowej plaster PDMS i szkło nakrywkowe pokryte PDMS. Po obróbce ułóż je jeden na drugim i piecz zestaw przez noc w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Monitoruj tworzenie się kropel pod mikroskopem w odwróconym jasnym polu.

Podłącz fazę oleju lipidowego do regulatora ciśnienia i zwiększaj ciśnienie, aż kropla oleju wydostanie się z rurki szczytowej. Podłącz rurkę szczytową do wlotu drugiego układu mikroprzepływowego. Następnie całkowicie napełnij chipy mikroprzepływowe fazą oleju lipidowego z drugiego wlotu.

Następnie wprowadź fazę wodną na bazie MRB-80 z pierwszego wlotu. Kontroluj wielkość kropel, zmieniając ciśnienie fazy olejowej lipidowej i fazy wodnej, aby utworzyć kropelki o średnicy około 15 mikronów. Około 800 milibarów dla fazy oleju lipidowego i 200 milibarów dla fazy wodnej to dobry punkt wyjścia.

Po uzyskaniu pożądanej wielkości kropli całkowicie wypełnij komorę przepływową kropelkami. Kropelki te powstają przy użyciu niewielkich objętości fazy wodnej. Oznacza to, że układ mikroprzepływowy musi działać szybko, aby nie stracić całej fazy wodnej przed utworzeniem kropelek o odpowiedniej wielkości.

Po napełnieniu ostrożnie zamknij końce komory przepływowej za pomocą Valap. Jeśli kropelki nie przestają się poruszać, oznacza to, że uszczelnienie nie jest kompletne lub mogły zostać wprowadzone pęcherzyki powietrza. W przypadku długotrwałego obrazowania przenieś kropelki do kubka PDMS i przykryj warstwą mieszaniny lipidów olejowych.

Rozmrozić centrosomy w temperaturze pokojowej i umieścić je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut, aby zapewnić prawidłowe zarodkowanie mikrotubul. Czekając, przygotuj mieszankę testową na lodzie. Powinien on zawierać tubulinę, GTP, system pochłaniania tlenu, generatory sił molekularnych, takie jak środki sieciujące mikrotubule, ATP i system regeneracji ATP.

Po wymieszaniu odwirowywać próbkę w schłodzonym wirniku Airfuge pod ciśnieniem 30 psi przez trzy minuty. Następnie dodaj podgrzane centrosomy do mieszanki. Zoptymalizuj ilość dodawanych centrosomów, aby uzyskać jeden lub dwa centrosomy na kroplę.

Następnie użyj tej mieszaniny do wytworzenia kropelek emulsji, jak opisano wcześniej. W celu rekrutacji dyneiny do biotynylowanych lipidów w korze kropelkowej, należy włączyć GFP-dyneinę TMR i streptawidynę do fazy wodnej. Na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem wizualizuj wzrost mikrotubul po 30 minutach w temperaturze 26 stopni Celsjusza.

Podczas obrazowania wzrost mikrotubul może być wspomagany poprzez zwiększenie temperatury do 28, a nawet 30 stopni Celsjusza. W przypadku projekcji Z należy wziąć stosy w odstępach co jeden mikron, co powinno wymagać około 20 obrazów na kroplę. Przejdź do głównego panelu kamery, kliknij Edytuj Z i ustaw Z Step na 1.0.

Kliknij Dalej, aby zapisać ustawienia. Następnie ustaw maksymalne liniowe wzmocnienie EM, klikając kartę Kamera w panelu Akwizycja i przesuwając pasek wzmocnienia EM do 300. Następnie ustaw Czas ekspozycji na 200 milisekund na tej samej karcie.

Kliknij Nagraj, aby zapisać ustawienia. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem na żywo wykonuj projekcje Z co dwie minuty przez dwie godziny, skracając czas ekspozycji do około 100 milisekund i zwiększając odstępy Z do dwóch mikronów. Do eksperymentów z obrazowaniem na żywo należy używać kubka PDMS zamiast zwykłej komory przepływowej, aby uzyskać maksymalne unieruchomienie próbki.

Korzystając z opisanych protokołów, badano tworzenie asterów w kropelkach emulsji wodnej i olejowej zawierających centrosomy. Początkowo centrosomy swobodnie dyfundują w ograniczonych objętościach. Po około 20 do 30 minutach pierwsze mikrotubule stają się widoczne, a dyfuzja centrosomów zostaje ograniczona, ponieważ mikrotubule rosną w stosunku do kory we wszystkich kierunkach.

Kiedy mikrotubule rosną dłużej niż połowa średnicy kropelki, centrosomy są spychane do przeciwnych granic, a mikrotubule rosną wzdłuż kory kropelkowej. Bez streptawidyny dymeina ulega dyfuzji w kropelce. Jednak w przypadku streptawidyny, w ciągu około 10 minut od utworzenia kropelki, dyneina łączy się z biotynylowanymi lipidami.

Oglądając tubulinę fluorescencyjną w obecności dyneiny korowej, jasne jest, że centrosomy są umieszczone centralnie. Natomiast przy braku dyneiny centrosomy są wypychane na przeciwne strony kropli. Jest to prawdopodobnie spowodowane dyneiną sprzyjającą katastrofom mikrotubul i korowym siłom ciągnącym, co powoduje wyśrodkowanie astry.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać technologii mikroprzepływowych do tworzenia wrzecionowatych struktur w sferycznych kropelkach emulsji. Po opanowaniu, tworzenie kropelek i obrazowanie można wykonać w ciągu dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Za pomocą tej procedury można otoczkować inne czynniki montażu wrzeciona w celu zbadania ich wpływu na morfologię i ustawienie wrzeciona.

Podczas stosowania chloroformu lub PDMS należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek.