Name: Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj techniki mikroiniekcji i elektroporacji zarodków Ciona intestinalis w celu badania regulacji genów i funkcji w rozwoju strunowców. Ta metoda umożliwia badanie ewolucyjnych mechanizmów rozwojowych istotnych dla biologii komórek macierzystych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet w Innsbrucku w Austrii i Austriacką Akademię Nauk (ÖAW).

1. Preparaty do mikroiniekcji i elektroporacji u jaj i zygot Ciona
<ol>
	<li>Przygotować 10 l sztucznej wody morskiej z HEPES (ASWH) do hodowli zarodków. Rozpuścić 420 mM NaCl, 9 mM KCl, 10 mM CaCl2·2H2O, 24,5 mM MgCl2·6H2O, 25,5 mM MgSO4·7H2O i 2,15 mMNaHCO3 w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) mieszając przez noc. Dodaj 5 mM HEPES pH 8,0 i sprawdź/dostosuj pH do 8,0. Przechowuj ASWH w temperaturze 4 °C. Podgrzej go do 18 °C i przefiltruj bibułą filtracyjną przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj 20x inaktywowany roztwór dechorionacyjny: 20% tioglikolan sodu, 1% pronaza w ASWH. Przechowywać 500 μl podwielokrotności w temperaturze -20 °C i przed użyciem rozcieńczyć do końcowej objętości 10 ml ASWH.</li>
	<li>Przygotuj od 15 do 20 naczyń hodowlanych dla jaj/zarodków. Wlej rozpuszczoną 1% agarozę w ASWH do szalek Petriego o średnicy 3,5, 5, 9 lub 15 cm, pokrywając je cienką warstwą o grubości 1-2 mm. Pozwól agarozie zastygnąć i przykryj talerze ASWH. Przechowuj je w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 1-2 tygodnie. Wymień ASWH przed użyciem.</li>
	<li>Przygotuj specjalne naczynia do iniekcji.
	<ol>
		<li>Wlej warstwę stopionej 1% agarozy o grubości 5-7 mm na 5-centymetrową szalkę Petriego i umieść formę na agarozie (taką jak zamek błyskawiczny przyklejony do plastikowego szkiełka nakrywkowego), aby po zestaleniu agarozy powstało wgłębienie, które może pomieścić jaja. Przygotuj od 4 do 5 naczyń do wstrzykiwań i przykryj ASWH. Przechowywać w temperaturze 4 °C i przed użyciem zastąpić świeżym ASWH. Do wstrzykiwań należy używać wyłącznie świeżych płytek (maksymalnie jednodniowych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować bufor do barwienia β-galaktozydazy (LacZ): 1 mM MgCl2·6H2O, 3 mM K4[Fe(CN)6]·3H2O, 3 mM K3[Fe(CN)6] w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) z Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 0,05% Tween). Przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C. Przygotować substrat LacZ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-Galaktopiranozyd (X-gal, 10 U/ml) w porcjach 40 mg/ml w dimetyloformamidzie (DMF) i przechowywać zapasy w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Namocz pipety Pasteura w wodzie z kranu na noc, aby zapobiec przywieraniu zarodków.</li>
	<li>Przygotować igły do wstrzykiwań.
	<ol>
		<li>Ustaw ściągacz do mikropipet w warunkach takich jak ciepło 425, ciąg 75, prędkość 75 i czas 200 (na podstawie testu rampy filamentu 415).</li>
		<li>Pociągnij od 4 do 5 szklanych kapilar zawierających filament, aby uzyskać od 8 do 10 długich, cienkich igieł zwykle zamkniętych na końcówce. Przechowuj igły w bezpyłowym pudełku na igły, przymocowanym do podwójnej taśmy klejącej na podwyższonym wsporniku, aby uniknąć złamania końcówek i co jest wygodne do napełniania igłą. 
		UWAGA: Przetestuj otrzymane igły, wstrzykując kilka jaj z zielonym barwnikiem witalnym (jak opisano w sekcji 6) i dostosuj warunki ciągnięcia igły, aby uzyskać kształt końcówki, który pozwala na precyzyjne i powtarzalne wstrzykiwanie, jak opisano w punkcie 6.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań. Przygotować 4 μl roztworu do wstrzykiwań, np. składającego się z 1 μl 2 mM MO, 2 μl 10 μg/μl zielonego barwnika witalnego i 1 μl ddH2O. Dodać końcowe stężenie 0,05-0,5 μg/μl zamkniętego mRNA lub 20 ng/μl plazmidowego DNA zgodnie z pytaniem eksperymentalnym. Dobrze wymieszaj. Przechowywać na lodzie, jeśli roztwór zawiera mRNA.</li>
</ol>
2. Zbiór gamet
<ol>
	<li>Dorosłe osobniki Ciona należy przeprowadzić preparację w pomieszczeniu z embrionami chłodzonymi w temperaturze 18 °C. Użyj małych nożyczek i zacznij od końca, który jest przeciwległy syfonom po stronie wydechu (krótszego) syfonu, pod którym przebiega jajowód i przewód nasienny.</li>
	<li>Odsłoń jajowód i delikatnie wykonaj nacięcie w jajowodzie za pomocą końcówki nożyczek. Wrzuć wypływające jaja bezpośrednio do 6-dołkowej płytki zawierającej ASWH, delikatnie naciskając jajowód zamkniętymi nożyczkami, usuwając jaja. Przenieść pozostałe jaja za pomocą pipety Pasteura wstępnie przepłukanej ASWH.</li>
	<li>Złóż jaja od różnych zwierząt w różnych studniach. Obserwuj jakość jaj pod lunetą preparacyjną. 
	UWAGA: Dobrze rozwinięte jaja są okrągłe i mają kolor różowy do lekko żółtego. Są otoczone niekomórkową powłoką witelinową, kosmówką, która tworzy dobrze zdefiniowaną przestrzeń periwitelinową wokół jaja. Kosmówka jest związana z komórkami testowymi w jej wnętrzu i komórkami pęcherzykowymi w kształcie gwiazdy na zewnątrz. Jaja niskiej jakości często nie mają przestrzeni okołojajowej lub komórek pęcherzykowych. Wydają się mniej okrągłe, bardziej ziarniste lub mają inny kolor. Niedojrzałe oocyty są mniejsze i mają srebrnobiały kolor.</li>
	<li>Przeciąć nasienie nożyczkami i zebrać skoncentrowane plemniki do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą oddzielnej pipety Pasteura. Zbierz plemniki od różnych zwierząt (co najmniej dwóch) w tej samej probówce. Przechowywać plemniki w temperaturze 4 °C przez kilka dni.</li>
</ol>

3. Zapłodnienie

<ol>
	<li>Pobrać plemniki i komórki jajowe w temperaturze 18 °C, jak opisano w kroku 2.</li>
	<li>Aktywuj plemniki.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml ASWH w probówce o pojemności 1,5 ml i wymieszać z 50 μl 1 M Tris pH 9,5. Następnie dodaj 20 μl zagęszczonej spermy i delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.</li>
		<li>Sprawdź aktywację plemników w kropli nasienia umieszczonej na pokrywie małej szalki Petriego lub szkiełku podstawowym i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Plemniki powinny pływać gorączkowo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 100-200 μl aktywowanego roztworu nasienia do każdej studzienki jajowej (zawierającej od 100 do 1000 jaj), dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół, aby jaja unosiły się w pożywce. Odczekaj 10 minut bez przesuwania zarodków.</li>
</ol>
4. Dechorionacja jaj i zarodków
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 500 μl podwielokrotności 20-krotnego roztworu dechorionacyjnego do 10 ml w ASWH. Aktywować roztwór dechorionacyjny, dodając kroplami 200 μl 2,5 M NaOH do 10 ml 1x roztworu dechorionacyjnego. Utworzy się mleczny osad. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę.</li>
	<li>Zebrać jaja lub zygoty (po 10 minutach oczekiwania w kroku 3.3) do szklanych probówek za pomocą pipety Pasteura. Zbierz jaja od 2 do 3 zwierząt w jednej probówce (około 1,000-5,000 jaj / probówkę). Osad za pomocą wirówki ręcznej poprzez wirowanie z dużą prędkością (1 200 x g) przez około 20 sekund, aby utworzyć osad zarodka na dnie probówki. Powoli zatrzymaj wirówkę i wyjmij ASWH za pomocą pipety Pasteura.</li>
	<li>Dodać 4 ml aktywowanego roztworu dechorionacyjnego do granulowanych jaj/zygot w każdej probówce. Zawieś jaja/zygoty, delikatnie pipetując je w górę iw dół za pomocą pipety Pasteura uzdatnionej wodą z kranu, zwieńczonej małą gumową gruszką. Roztwór powinien zmienić kolor na żółtawy po 1-3 minutach.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z dechorionacją, usuwając małą porcję dechorionującej zawiesiny jaja/zygoty za pomocą pipety Pasteura. Umieść kroplę na szkiełku i obserwuj pod lunetą sekcyjną. Pipetuj jaja/zygoty w górę i w dół i sprawdzaj co 20-30 sekund. 
	UWAGA: Najpierw odrywają się komórki pęcherzykowe, następnie kosmówka zmienia kolor na żółty i nieprzezroczysty, a na końcu odłącza się od zygot. Różowe dechorionowane jaja/zygoty opadną na dno szklanej rurki. Dechorionacja nie powinna trwać dłużej niż maksymalnie 5 minut.</li>
	<li>Napełnij probówkę ASWH, gdy 50% jaj/zygot zostanie zdechorionowanych. 
	UWAGA: Bardzo delikatnie wirować (8 x g) przez około 10-15 sekund, co odpowiada bardzo niskiej prędkości, wystarczającej do osadzenia zdekorionowanych jaj/zarodków. Powoli zatrzymaj wirówkę, aby nie zaburzyć osadu jaj/zygot na dnie probówki.</li>
	<li>Usuń prawie cały płyn ze szklanej rurki, w tym pływający materiał z niecałkowicie zdekorionowanymi jajami/zygotami i zastąp ASWH. Powoli pipetować w górę i w dół, aby umyć i delikatnie odwirować ponownie, jak w kroku 4.2. Alternatywnie poczekaj, aż zygoty uspokoją się grawitacyjnie. Umyj jeszcze raz, aż nie pozostaną żadne resztki kosmówki.</li>
	<li>Przenieś jaja/zygoty do świeżo wypłukanych naczyń hodowlanych za pomocą pipety Pasteura. Trzymaj zygoty (nie jaja) w małej gęstości (około 200 zarodków na 10 cm naczynie), aby uniknąć ich sklejania. Hodować zarodki do pożądanego stadium w temperaturach od 13 do 20 °C. Alternatywnie, należy naelektryzować zygoty (etap 5) lub wstrzyknąć niezapłodnione komórki jajowe (etap 6).</li>
</ol>
5. Elektroporacja
<ol>
	<li>Zapłodnić jaja i zdechorionować zygoty w temperaturze 18 °C, jak w sekcjach 3 i 4. Dostarczyć od 50 do 400 jaj na próbkę do elektroporacji.</li>
	<li>Przygotować 50 μl plazmidowego DNA w probówce o pojemności 1,5 ml (maks. 100 μg plazmidowego DNA w 50 μl ddH2O) i dodać 200 μl 0,95 M mannitolu. Dobrze wymieszaj, wirując.</li>
	<li>Wysyłka i osad grawitacyjny zdechorionowanych zygot w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml. Usuń ASWH do oznaczenia 100 μl na probówce.</li>
	<li>Postępuj kolejno dla każdej probówki zygoty w następujący sposób: dodaj roztwór DNA/mannitolu za pomocą pipety Pasteura. Delikatnie wymieszaj z zygotami i natychmiast pobierz zawiesinę DNA/mannitol/zygota i przenieś do 4-milimetrowej kuwety do elektroporacji.</li>
	<li>Umieść kuwetę natychmiast w uchwycie do elektroporacji i daj pojedynczy impuls o długości 16 ms przy napięciu 50 V.</li>
	<li>Wyjmij zygoty z kuwety za pomocą tej samej pipety Pasteura i rozłóż je na szalce hodowlanej zawierającej świeży i przefiltrowany ASWH. Odpipetować zygoty, zanim zaczną się rozszczepiać, około 1 godziny po zapłodnieniu (hpf) w temperaturze 18 °C.</li>
	<li>Przepłukać pipetę między próbkami w zlewce z ASWH.</li>
	<li>Hodować zygoty w temperaturze 15-20 °C, przy wystarczająco niskiej gęstości około 200 zarodków na 10 cm naczynie, aby uniknąć ich sklejania.</li>
</ol>
6. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Przygotować pozbawione kosmówki jaja do wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Dechorionację jaj należy usunąć oddzielnie od 2 do 4 zwierząt, jak opisano w punkcie 4. Przechowuj niezapłodnione i zdechorionowane jaja w oddzielnych małych naczyniach hodowlanych pokrytych agarozą. Umyj jajka kilka razy w naczyniach, aby usunąć zanieczyszczenia.</li>
		<li>Test zapłodnić małymi partiami odkorionowanych jaj (około 50) od każdego osobnika. Do każdej porcji należy użyć osobnego naczynia o średnicy 5 cm i nanieść 2 μl aktywowanego nasienia (krok 3.2). Dobrze wymieszaj, obracając naczynia i rozłóż jajka w naczyniu, przesuwając naczynia na boki. Trzymaj plemniki i jajeczka razem przez około 10 minut bez ruchu.</li>
		<li>Wyeliminuj maksymalną ilość plemników w następujący sposób: przenieś zapłodnione jaja do świeżej naczynia hodowlanej lub spłucz dwukrotnie świeżym ASWH. Rozszczepione zarodki należy pozostawić w nienaruszonym stanie do stadium 32 komórek (w temperaturze 18 °C przez około 3 godziny po zapłodnieniu). Do mikroiniekcji należy wybrać jaja z najlepiej rozwijającej się partii (najlepszy procent zapłodnienia i najbardziej regularny wzór rozszczepienia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić igły iniekcyjne.
	<ol>
		<li>Wypełnij 4 igły iniekcyjne w pozycji pionowej, aby umożliwić przepływ grawitacyjny wzdłuż filamentu. Umieść 0,5 μl roztworu do wstrzykiwań (krok 1.8) zawierającego zielony barwnik witalny na tylnym końcu igieł, które są umieszczone czubkiem igły w dół. Poczekaj, aż płyn wypełni końcówkę igły na dole.</li>
		<li>Ustaw igły poziomo i napełnij je olejem mineralnym za pomocą cienkiej i długiej metalowej lub plastikowej końcówki do pipety. Powoli nałożyć roztwór do wstrzykiwań na olej mineralny, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza podczas napełniania igły.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw mikromanipulator w pomieszczeniu chłodzonym o temperaturze 18 °C.
	<ol>
		<li>Podłączyć plastikową rurkę uchwytu igły do szklanej strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej olejem mineralnym. Napełnij rurkę i uchwyt igły olejem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Włóż igłę do uchwytu igły i umieść uchwyt na mikromanipulatorze.</li>
		<li>Wyregulować ruch uchwytu igły wzdłuż linii prostej pod kątem 45° w stosunku do powierzchni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić jaja pozbawione kosmówki wzdłuż wgłębienia agarozy w naczyniu do wstrzykiwań, tak aby jaja mogły być wstrzykiwane pojedynczo pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>W razie potrzeby złamać końcówkę igły, delikatnie dociskając igłę do agarozy lub do kawałka szklanego szkiełka nakrywkowego umieszczonego na agarozie. Lekko docisnąć pokrętło strzykawki, aby sprawdzić, czy końcówka igły jest otwarta (zielona zawartość igły zostanie usunięta).</li>
	<li>Niezapłodnione jaja należy wstrzykiwać jeden po drugim, najpierw wprowadzając igłę do komórki jajowej i lekko zasysając, aby przerwać błonę jajową, a następnie wstrzykując. Wstrzyknąć zielony roztwór do wstrzykiwań w środek komórki jajowej maksymalnie do 1/3 średnicy komórki. (Odpowiada to około 30 pl dla średnicy jaja 140 μm).</li>
	<li>Przenieść wstrzyknięte niezapłodnione jaja do świeżego naczynia hodowlanego i inkubować je w temperaturze 15-18 °C aż do zapłodnienia.</li>
	<li>Zapłodnić wstrzyknięte komórki jajowe świeżo aktywowanymi plemnikami, tak jak w przypadku zapłodnień testowych (krok 6.1.2). Wyeliminuj maksymalną ilość plemników, przenosząc zygoty do świeżego naczynia hodowlanego. Rozłóż zarodki i nie zaburzaj ich w fazach rozszczepienia (do stadium 32 komórek).</li>
	<li>Hodowla zarodków do pożądanego stadium w temperaturze między 13 a 20 °C.</li>
	<li>Zbierz zarodki, obracając je na środku płytki i przenosząc do silikonowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Napraw i zamontuj lub zamontuj (kroki 7 i 8).</li>
	<li>Porównaj uzyskane fenotypy z kontrolnymi zarodkami, którym wstrzyknięto. 
	UWAGA: Wstrzyknij drugi, nienakładający się MO, który jest ukierunkowany na ten sam transkrypt, aby uzyskać identyczne fenotypy. Uratuj określony fenotyp (fenotypy) MO za pomocą zmodyfikowanego mRNA kodującego interesujące Cię białko, ale które nie jest rozpoznawane przez MO. Wstrzyknij kontrolny MO, który nie daje fenotypu.</li>
</ol>
7. Barwienie LacZ
<ol>
	<li>Zbierz zarodki na pożądanym etapie w silikonowanych probówkach o pojemności 1,5 ml i utrwal je w 0,2% aldehydzie glutarowym w 1 ml ASWH przez maksymalnie 15 do 30 minut.</li>
	<li>Myć 2x 10 min 1 ml 1x PBT.</li>
	<li>Spłukać raz w 500 μl buforu barwiącego LacZ. Zastąp 1 ml buforu barwiącego uzupełnionym substratem X-Gal (użyj 10 μl/ml 40 mg/ml X-Gal Stock). Przenieś zarodki na 12-dołkową płytkę, aby lepiej obserwować barwienie.</li>
	<li>Wysiaduj w ciemności. Inkubację zmieniać od 0,5 godziny do nocy w temperaturze 4 °C, w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37 °C, w zależności od siły czynnika wyrażającego LacZ.</li>
	<li>Umyj zarodki do 4 razy w 1 ml 1X PBT, aby usunąć bufor barwiący.</li>
	<li>Post-fix przez 10 minut w temperaturze pokojowej z 2% paraformaldehydem (PFA) w 1 ml 1x PBT lub 0,2% aldehydu glutarowego w 1 ml 1x PBT w celu interpretacji i wizualizacji barwionych zarodków.</li>
</ol>
8. Montaż fluorescencyjnie oznakowanych Wmbryos
<ol>
	<li>Utrwal zarodki w pożądanym stadium rozwojowym przez 20 minut w 2% PFA w 1 ml ASWH.</li>
	<li>Umyj zarodki 2x w 1 ml 1x PBT. Unikaj ekspozycji na światło, trzymając zarodki w ciemności.</li>
	<li>Przenieś do 50 zarodków na jedno szkiełko. Najpierw usuń maksymalną ilość PBT za pomocą pipety i ostrożnie za pomocą ręcznika papierowego.</li>
	<li>Dodać 20-25 μl podłoża montażowego.</li>
	<li>Dodaj szkiełko nakrywkowe, ustawiając je pod kątem (najpierw z jednej strony) i powoli opuszczaj je spiczastym przedmiotem (igłą, kleszkami, końcówką pipety), unikając pęcherzyków, aż próbka zostanie przykryta. Przymocuj szkiełko nakrywkowe na jego krawędziach za pomocą kropek przezroczystego lakieru do paznokci.</li>
	<li>Po wyschnięciu uszczelnij całe szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+duplications+and+the+origins+of+vertebrate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">Gene duplications and the origins of vertebrate development.</a> Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).</li>
<li>Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+number+in+an+invertebrate+chordate%2C+Ciona+intestinalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).</li>
<li>Dehal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+draft+genome+of+Ciona+intestinalis%3A+insights+into+chordate+and+vertebrate+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins.</a> Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).</li>
<li>Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciona+intestinalis%3A+an+emerging+model+for+whole-genome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses.</a> Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).</li>
<li>Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunicates+and+not+cephalochordates+are+the+closest+living+relatives+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates.</a> Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).</li>
<li>Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+a+chordate+developmental+program%2C+one+cell+at+a+time%3A+invariant+cell+lineages%2C+short-range+inductions+and+evolutionary+plasticity+in+ascidians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians.</a> Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).</li>
<li>Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+spatial+expression+of+fusion+gene+constructs+with+the+5%E2%80%B2+upstream+region+of+Halocynthia+roretzi+muscle+actin+gene+in+Ciona+savignyi+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Roux%27s+Arch+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos.</a> Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).</li>
<li>Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+notochord-specific+enhancer+from+the+Brachyury+promoter+region+of+the+ascidian%2C+Ciona+intestinalis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis.</a> Development. 124 (3), 589-602 (1997).</li>
<li>Zeller, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+use+of+transgenic+ascidian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and use of transgenic ascidian embryos.</a> Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).</li>
<li>Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+morpholinos+in+Ciona+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Action of morpholinos in Ciona embryos.</a> Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).</li>
<li>Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+blueprint+for+a+chordate+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulatory blueprint for a chordate embryo.</a> Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).</li>
<li>Tassy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ANISEED+database%3A+digital+representation%2C+formalization%2C+and+elucidation+of+a+chordate+developmental+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program.</a> Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).</li>
<li>Brozovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANISEED+2015%3A+a+digital+framework+for+the+comparative+developmental+biology+of+ascidians%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+cis-regulatory+networks+in+the+early+Ciona+intestinalis+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo.</a> Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).</li>
<li>Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+code+of+maternal+GATA%2C+Ets+and+%CE%B2-catenin-TCF+transcription+factors+specifies+and+patterns+the+early+ascidian+ectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm.</a> Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li>
<li>Khoueiry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cis-regulatory+signature+in+ascidians+and+flies%2C+independent+of+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites.</a> Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).</li>
<li>Gilchrist, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+the+systematic+identification+of+non-redundant+full-ORF+cDNAs+for+polymorphic+and+evolutionary+divergent+genomes%3A+Application+to+the+ascidian+Ciona+intestinalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).</li>
<li>Roure, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicassette+Gateway+vector+set+for+high+throughput+and+comparative+analyses+in+ciona+and+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos.</a> PLoS One. 2 (9), e916(2007).</li>
<li>Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+maternal+factor+unique+to+ascidians+silences+the+germline+via+binding+to+P-TEFb+and+RNAP+II+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation.</a> Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).</li>
<li>Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+knockout+in+the+ascidian+Ciona+intestinalis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis.</a> Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).</li>
<li>Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+genome+editing+in+Ciona+embryos+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9.</a> Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).</li>
<li>ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.aniseed.cnrs.fr/v3">http://www.aniseed.cnrs.fr/v3</a> (2007).</li>
<li>VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. , 
 <a target="_blank" href="http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml">http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml</a> (2013).</li>
<li>Genomatix Inc. , 
 <a target="_blank" href="http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl">http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Istnieją dwie główne techniki generowania transgenicznych zarodków Ciona : mikroiniekcja RNA lub DNA i elektroporacja DNA. Te techniki perturbacji genów w zarodkach Ciona zostały po raz pierwszy zastosowane w latach 90. XX wieku7,8 i od tego czasu były sukcesywnie udoskonalane, a obecnie stosowane w Ciona (i innych rodzajach puchatych)20 na całym świecie.
Krytyczne kroki w protokole
Udana transgeneza do gamet Ciona , które można łatwo pobrać od dorosłych zwierząt, zależy od wielu krytycznych czynników. Jakość gamet zależy od sezonu tarła (zazwyczaj od maja do grudnia na północnym Atlantyku, zmieniającego się wraz z temperaturą wody i natlenieniem), od jakości wody morskiej w akwariach (przy prawidłowym zasoleniu dorosłe osobniki pozostają zdrowe przez 2-4 tygodnie) i wreszcie od prawidłowego obchodzenia się z gametami po ekstrakcji od dorosłych, jak opisano poniżej dla różnych etapów protokołu.
Na etapach przygotowania, inkubacja pipet Pasteura z wodą z kranu zapobiegnie przywieraniu zarodków, a wstępna inkubacja w wodzie morskiej na szalkach Petriego pokrytych agarozą usunie toksyczne substancje uwalniane z agarozy. Ogólnie rzecz biorąc, potrawy można przygotować do 2 tygodni przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć rozwoju bakterii i spłukać na świeżo przed użyciem. Jednodniowe, małe naczynia wydają się najlepsze do wstrzykiwań.
Skuteczność i długość dechorionacji jest kluczowym krokiem w protokole, ponieważ długotrwałe leczenie komórek jajowych/zarodków zaszkodzi rozwojowi. Staranne przygotowanie (bez wstrząsania) i prawidłowe przechowywanie (w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia) pozwala zachować jakość roztworu dechorionacyjnego. Proteazy w roztworze tracą skuteczność, jeśli są zbyt gwałtownie mieszane podczas przygotowywania lub z czasem, zwłaszcza jeśli są przechowywane w temperaturze pokojowej przez dłuższe godziny/dni. Zoptymalizowaliśmy ten krytyczny krok, używając świeżego roztworu do dechorionacji, wygodnie przygotowanego z zamrożonych porcji 20-krotnego roztworu podstawowego.
Prawidłowe obchodzenie się z delikatnymi komórkami jajowymi/zarodkami z odwążówką jest niezbędne, a strzyżenie lub dźganie zarodków podczas pipetowania będzie szkodliwe. Podczas pipetowania zarodki są utrzymywane w jak największym stopniu w zawiesinie (poprzez delikatne "przedmuchiwanie" płynu w celu ich zawirowania, a następnie płynne, ale szybkie pipetowanie), trzymając szklaną pipetę w pozycji pionowej, a nie poziomej. Ostrożność ta ma zastosowanie do wszystkich etapów pipetowania w celu mycia, ponownego zawieszania i przenoszenia komórek jajowych/zarodków do i z probówek, kuwet lub płytek, przed i po utrwaleniu. Po utrwaleniu należy również zwrócić szczególną uwagę na oddzielenie urządzeń pipetujących dla żywych i utrwalonych zarodków, aby uniknąć toksyczności spowodowanej pozostałościami utrwalaczy.
Mikroiniekcja jest dość trudna w przypadku jaj/zarodków Ciona ze względu na ich mały rozmiar i sprężystość błony witelinowej i zależy w decydującym stopniu od zoptymalizowanego rozmiaru końcówki igły do wstrzykiwań, idealnego kąta iniekcji (ruch igły w jednej linii, wzdłuż promienia jaja) i precyzyjnie dostrojonego, ręcznego łamania błony witeliny (przez odsysanie przed aspiracją do wstrzyknięcia). To ostatnie jest możliwe tylko wtedy, gdy pęcherzyki powietrza zostaną całkowicie wyeliminowane z rurki iniekcyjnej, która zawiera olej mineralny w celu wygładzenia ciśnienia ssania/wtrysku. Ponadto najmniejsze kawałki kurzu lub resztek jaj zatykają igłę i można ich łatwo uniknąć dzięki czystym warunkom pracy i etapom płukania jaj przed przeniesieniem na naczynie iniekcyjne. Po wstrzyknięciu, przeniesienie jaj na świeże szalki pozwoli uniknąć toksycznych skutków spowodowanych martwymi zarodkami, które nie przeżyły procedury iniekcji.
Rozwiązywanie problemów
Potencjalne problemy w procedurze można rozwiązać, stosując następujące rozwiązania. Niskie wskaźniki zapłodnienia mogą wynikać z niewystarczającej aktywacji plemników, niskiej czystości komórek jajowych lub dużych objętości zapłodnienia. Używaj świeżo zebranych i mniej rozcieńczonych nasienia. Sprawdź ruch plemników po aktywacji. Przed zapłodnieniem umyć jaja ASWH, jak opisano w kroku 4.2. Zmniejsz objętość wody i zmniejsz ilość jaj w naczyniu/studzience do zapłodnienia. Utraty zarodków na etapach przygotowania można uniknąć, dodając kroplę roztworu dechorionacyjnego w celu skuteczniejszego odwirowania niezdekorionowanych komórek jajowych/zarodków. Czas dechorionacji powinien być zoptymalizowany, ponieważ częściowo zdekorionowane jaja nie osadzają się, a przedłużająca się dechorionacja jest toksyczna, powodując eksplozję zarodków.
Rozwój asynchroniczny może wynikać z resztek plemników uwolnionych podczas sekcji. Przechowuj partie jaj oddzielnie od różnych zwierząt, aby uniknąć niekontrolowanego zapłodnienia krzyżowego. Nieprawidłowy rozwój może mieć różne przyczyny. Na początku i na końcu sezonu, po rozdzieleniu zarodków pochodzących od różnych osobników, można wybrać najlepsze partie. Unikaj zakłócania zarodków przez 10 minut po zapłodnieniu, aby uniknąć zakłócania ich segregacji ooplazmatycznej. Upewnij się, że zarodki nie zaczęły się dzielić podczas przenoszenia, ponieważ pipetowanie oddziela siostrzane blastomery i powoduje częściowe zarodki. Użyj mniej plemników do zdekorionowanych komórek jajowych, aby uniknąć polispermii. Używaj świeżo przygotowanych, ale opłukanych potraw z agarozy. Upewnij się, że urządzenie do pipetowania nie zawiera utrwalaczy. Trzymaj zarodki kontrolne, które nie zostały zdekorionowane i nie zostały poddane elektroporacji, aby wykryć, na którym etapie rozwój został zakłócony. Uzupełnij zarodki antybiotykami, jeśli dojdzie do zanieczyszczenia i rozkładu.
Jeśli urządzenie do wstrzykiwań jest "zatkane", otwór igły do wstrzykiwań można zweryfikować poprzez usunięcie części jego poplamionej zawartości. Zatykający się materiał można zetrzeć, ostrożnie przeciągając końcówkę igły przez agarozę. Należy usunąć pęcherzyki powietrza z rurki iniekcyjnej i (lub) igły. Zmienić igłę, aby lepiej kontrolować objętość wstrzyknięcia, ponieważ końcówka igły może pęknąć lub zatkać się podczas wstrzyknięcia. Opłucz jajka i umieść je w czystym naczyniu do wstrzykiwań, jeśli w naczyniu nagromadziły się zanieczyszczenia. Odwirować roztwór do wstrzykiwań przed napełnieniem świeżych igieł w celu osadzenia wszelkich małych cząstek lub kryształów. Pomocne jest również ćwiczenie iniekcji tylko z niezbędnym barwnikiem. Sprawdź technikę wstrzykiwania, zapładniając jaja z wstrzyknięciami i bez iniekcji. Wreszcie, konsultacja z doświadczonym kolegą może być pomocna w poprawie techniki wstrzykiwania.
Aby kontrolować efekty niezamierzone, drugi nienakładający się MO i ratunek ze zmodyfikowanym mRNA, które nie jest rozpoznawane przez MO, może wiernie wykluczyć niespecyficzne efekty fenotypowe w Ciona.
Mikroiniekcja: znaczenie i ograniczenia
Mikroiniekcja w Ciona została wykorzystana do wygenerowania pierwszego planu dla całej sieci regulacji genów zarodka (GRN) w strunowcu11. Jednak pomimo tak niezwykłego osiągnięcia, mikroiniekcja w zarodkach Ciona ma ograniczenia ze względu na stosunkowo mały rozmiar (0,14 mm średnicy) jaj Ciona . W porównaniu z innymi gatunkami strunowców, w których obce DNA/mRNA jest wprowadzane przez mikroiniekcje, jaja Ciona są stosunkowo trudne w obsłudze, a odsetek wstrzykiwanych zarodków Ciona na eksperyment pozostaje niski (średnio od 30 do 50 zarodków na eksperyment), co utrudnia analizy ilościowe. Niemniej jednak, w przypadku niepokojących czynników matczynych w Ciona, mikroiniekcja MO jest metodą z wyboru również do badania ich udziału w jarzmowym początku rozwoju od 16 do 32 stadiów komórkowych15. Ponadto możliwe jest, choć znacznie trudniejsze, mikroiniekcja pojedynczych blastomerów do stadium 16-32 komórek. Wreszcie, mikroiniekcja pozostaje najbardziej efektywną techniką generowania transgenicznych zarodków (poprzez wstrzyknięcie mRNA lub DNA) u gatunków puchatych innych niż Ciona, dla których nie istnieją w pełni zoptymalizowane protokoły elektroporacji.
Elektroporacja: znaczenie i ograniczenia
Aby przezwyciężyć niską liczbę i inne ograniczenia związane z mikroiniekcją, większość społeczności Ciona stosowała elektroporację plazmidowego DNA od czasu jej opracowania i opublikowania jako zoptymalizowany i znormalizowany protokół przez Zellera i in. w 2004roku. Rzeczywiście, tysiące transgenicznych zarodków Ciona mogą zostać wygenerowane w ciągu jednej godziny, a nawet 500 zarodków jest jednocześnie elektropostowanych w jednej kuwecie za pomocą pojedynczego impulsu 50 V o długości 16 ms. Podejście polegające na generowaniu ogromnej liczby transgenicznych embrionów jest nadal unikalne wśród organizmów modelowych strunowców. Doprowadziło to do tego, że Ciona szybko została uznana za potężny system modelowy do przeprowadzania analiz in vivo potencjalnych regionów cis-regulatorowych i lokalizacji komórkowej/subkomórkowej, czego przykładem jest tutaj.
Chociaż elektroporacja w zygotach Ciona zasadniczo zrewolucjonizowała dziedzinę badań nad grn strunowy, technika ta napotyka jednak pewne ograniczenia. Po pierwsze, plazmidy są przejściowo wprowadzane do zarodków Ciona i najprawdopodobniej są dziedziczone jako układy pozachromosomalne, co sprawia, że stabilność elektroporowanego plazmidowego DNA jest spekulatywna. Co więcej, bardzo trudne, a być może nawet niemożliwe jest kontrolowanie kopii elektroporowanych plazmidów, które zostaną pobrane przez zygotę, co spowoduje fluktuacje fenotypowe. Kolejnym problemem, który utrudnia interpretację wyników elektroporacji, jest zjawisko, które nazywamy mozaicyzmem. Elektroporowane plazmidowe DNA może być pobierane w różnych pozycjach zarodka w stadium jednokomórkowym; który określa, które i ile ćwiartek zygoty otrzyma plazmid, który zostanie odziedziczony przez potomne blastomery. Takie różnice w oczywisty sposób utrudniają interpretację efektów ilościowych. Jednak większość problemów związanych ze zmiennością elektroporacji rozwiązuje odpowiednia ilość próbek biologicznych, z liczeniem i statystykami komórek LacZ (lub GFP), które są łatwo dostępne w jednej partii.
Wszechstronność i potencjał elektroporacji w inżynierii genetycznej
Elektroporacja ostatecznie pozwala na średnioprzepustowe badania przesiewowe potencjalnych regionów cis-regulatorowych i ilościowe analizy funkcji genów po sklonowaniu do plazmidów reporterowych lub ekspresyjnych. Ze względu na zwarty genom Ciona, identyfikacja i klonowanie potencjalnych regionów regulacyjnych jest dość proste3. Strategię wykorzystania bogactwa danych społecznościowych przedstawiono na rysunku 2A. Klonowanie plazmidów reporterowych i kodujących geny jest dodatkowo ułatwione dzięki generowaniu zestawów wektorów19 dostosowanych do metody Cina, kompatybilnych z GATEWAY oraz kompatybilnej biblioteki ORF o pełnej długości18. Oba narzędzia są dostępne dla społeczności i pozwalają na wydajną, wolną od restrykcji rekombinację czynników regulacyjnych i regionów kodujących, jak pokazano na rysunku 2B.
W ostatnich latach elektroporacja została z powodzeniem zaadaptowana do uzyskania ukierunkowanej na tkankę manipulacji genami za pomocą plazmidów, które wyrażają narzędzia do edycji genów, takie jak komponenty CRISPR/Cas9, pod kontrolą specyficznych dla tkanek czynników21,22. Takie podejścia szybko poszerzą naszą wiedzę na temat dynamiki GRN i potencjalnie konserwatywnych mechanizmów sygnałowych, w tym kodów czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w tworzenie tkanek i stopniowe wychodzenie z pluripotencji. Co więcej, specyficzne tkankowo podejścia do utraty lub wzmocnienia funkcji (za pomocą CRISPR/Cas9 lub nadekspresji) za pomocą elektroporacji będą miały zasadnicze znaczenie dla badania ortologów Ciona genów związanych z chorobami ludzkimi. Rzeczywiście, katalogi ortologów Ciona genów chorób ludzkich i ich pełnowymiarowych klonów kodujących ORF są łatwo dostępne do analizy w Ciona18. Ze względu na duplikacje całego genomu u kręgowców, większość ludzkich genów posiada funkcjonalnie nadmiarowe paralogi, które komplikują analizy funkcji genów1. Ciona , jako prostszy system z typowym układem tkanek strunowców u larw, powinna odkryć fundamentalne role tak ważnych, często funkcjonalnie zachowanych genów.

Ostatnio, sekwencja genomu i transkrybowane repertuary genów stały się dostępne w wielu organizmach modelowych. Jednak określenie funkcjonalnych powiązań genów i tego, w jaki sposób te połączenia są wbudowane w DNA w celu wykonywania aktywności transkrypcyjnej w embrionalnym czasie i przestrzeni, pozostaje głównym wyzwaniem, zwłaszcza u kręgowców. Złożoność interakcji regulacyjnych i złożoność genomów1,2, zwłaszcza u kręgowców, spowalniają skuteczne analizy funkcjonalne, w szczególności na poziomie DNA in vivo. Rzeczywiście, obecnie nie analizuje się GRN od zapłodnienia do końcowego, terminalnie zróżnicowanego stanu rozwijającego się organizmu.
Puchaci C. intestinalis reprezentują organizm modelowy, w którym możliwe mogą być takie pełne analizy GRN. Ma niezduplikowany genom typowy dla bezkręgowców z niewielką redundancją. Kręgowce, w przeciwieństwie do nich, przeszły dwie rundy duplikacji genomu, które wygenerowały większe rodziny genów i funkcjonalne zróżnicowanie, ale także redundancję między paralogami. Zwarte sekwencje cis-regulatorowe (jednostki kontrolne GRN) C. intestinalis i niezmienna linia embrionalna z niewielką liczbą komórek przypominają C. elegans. Co więcej, jego unikalna pozycja filogenetyczna jako bezkręgowej grupy siostrzanej kręgowców w obrębie strunowców pozwala na obserwację rozwojową, w rozdzielczości komórkowej, tworzącego się planu ciała strunowca3-6.
Kluczową kwestią, która zapewnia przyszły sukces genomiki funkcjonalnej w organizmach modelowych, jest generowanie dużej liczby embrionów do ilościowych zaburzeń in vivo. Przełomem w genomice funkcjonalnej Ciona był rozwój techniki mikroiniekcji w jajach Ciona 7 oraz możliwość szybkiego uzyskania wielu przejściowo transgenicznych zwierząt za pomocą elektroporacji in vivo w setkach zygot Ciona 8,9. W tym miejscu po raz pierwszy przedstawiamy bardziej pracochłonną technikę mikroiniekcji do celowania w pojedyncze geny, która pozostaje metodą z wyboru w przypadku knockdownu genów za pośrednictwem morfoliny (MO), w szczególności transkryptów matczynych. Oligonukleotydy MO zazwyczaj celują w inicjator ATG lub miejsca splicingu RNA i zakłócają translację białek. Następnie pokazujemy, w jaki sposób elektroporacja w zapłodnionych komórkach jajowych Ciona pozwala na ilościową analizę dużej liczby zarodków, otwierając w ten sposób drogi do efektywnej analizy wzmacniaczy in vivo oraz specyficznych dla tkanek podejść do wzmocnienia lub utraty funkcji, z możliwością jednoczesnych manipulacji i analiz. Dalej pokazujemy, w jaki sposób narzędzia społecznościowe Ciona są wykorzystywane do przewidywania in silico regionów regulacyjnych i wydajnego klonowania w pełni otwartych ramek odczytu (ORF) w wektorach ekspresji. Na koniec wykazujemy zróżnicowane subkomórkowe lokalizacje fluorescencyjnie znakowanych lub znakowanych białek po nadekspresji przez elektroporację.

<table><tbody><tr><td>Lab ze stałą temp. (~18 &deg; C)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Do pracy z zarodkami</td></tr><tr><td>Ciona intestinalis dorosłych</td><td>UPMC - Station Biologique, Roscoff, Francja</td><td></td><td>Do zbierania gamet</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>CaCl2x2H2O</td><td>Roth</td><td>A119.1</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>MgCl2x6H2O</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>MgS04x7H2O</td><td>Roth</td><td>P027.2</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Roth</td><td>6885.1</td><td>Dla ASWH</td></tr><tr><td>Hepes&nbsp;</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td>Do</td></tr><tr><td>tioglikolanu sodu ASWH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>MZ-6</td><td>do dechorionacji</td></tr><tr><td>pronazy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T0632-100G</td><td>do dechorionacji</td></tr><tr><td>D-Mannitol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9546-250G</td><td>Do elektroporacji</td></tr><tr><td>plazmidowego DNA (przygotowanie >1&mikro; g/&mikro; l)</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.100</td><td>Do elektroporacji lub mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>dowolny dostawca</td><td></td><td>Do powlekania naczyń do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego</td><td>VWR</td><td>612-2079</td><td>Pokryte 1% agarozą w ASWH, pokryte ASWH</td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>dowolny dostawca</td><td></td><td>Do wycinania gamet</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Roth</td><td>6771.1</td><td>Do aktywacji roztworu dechorionacyjnego</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Roth</td><td>5429.3</td><td>1 M pH 9,5, do aktywacji plemników</td></tr><tr><td>Pipety Pasteura&nbsp;</td><td>VWR</td><td>612-1701</td><td>Uzdatniony przez zanurzenie w wodzie z kranu na co najmniej 12 godzin</td></tr><tr><td>Wirówka ręczna</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>1011</td><td>Użyj szklanych probówek wirówkowych</td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>T3406-250EA</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Probówki Eppendorf</td><td>Sigma</td><td>T3531-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator kwadratowy</td><td>Bio Rad Gene Pulser Xcell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji 4 mm</td><td>Eurogentec</td><td>CE-0004-50</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Sto Premium</td><td>PR248212600</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td>VWR</td><td>ECN 613-1551</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma</td><td>G6257-10ML</td><td>Do utrwalania w barwieniu LacZ</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6148-500G</td><td>Do utrwalania próbek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td>Do mocowania próbek fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &szlig;-D-Galactopyranoside)</td><td>Roth</td><td>2315.2</td><td>LacZ; zapas w 40 mg/ml DMF (dimetyloformamid)</td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6&#8226; 3H2O</td><td>Merck</td><td>4984</td><td>Do buforu barwiącego LacZ</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Merck</td><td>4973</td><td>Do bufora barwiącego</td></tr><tr><td>LacZ Na22HPO4</td><td>Roth</td><td>4984.2</td><td>Dla PBT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.2</td><td>Dla PBT</td></tr><tr><td>Animacja&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>SLBJ5103V</td><td>Do</td></tr><tr><td>oleju mineralnego</td> PBT <td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Testowana hodowla zarodków</td></tr><tr><td>Green Vital Dye</td><td>Fast Green Sigma&nbsp;</td><td>F7251</td><td>do mikroiniekcji; 10&mikro; g/&mikro; l</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet (płonący/brązowy)</td> <td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td>Do ciągnięcia igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego GC100TF-10</td><td>Harvard Apparatus Ltd. UK</td><td>30-0038</td><td>1,0 mm OD x 0,78 mm ID, zawierające filament, do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MWS-2</td><td>Trzyosiowy olejowy układ hydrauliczny; do precyzyjnego ruchu 3D podczas wtrysku</td></tr><tr><td>Uchwyt do wstrzykiwań</td><td>Narishige</td><td>1M-H1</td><td>Do trzymania igieł iniekcyjnych, cały system wypełniony olejem mineralnym</td></tr><tr><td>Strzykawka All Glass Walter</td><td>Graf & Co GmbH & Co. KG&nbsp;</td><td>Nr 95199.10427A4</td><td>10 ml FortunaOptima; wypełniony olejem mineralnym, do precyzyjnego dostrojenia ciśnienia mikroiniekcji&nbsp;</td></tr><tr><td>Morfolinos&nbsp;</td><td>GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA</td><td></td><td>Wstrzyknięcie w 0,25-0,5 mM</td></tr><tr><td>z czapeczką</td><td>mRNA Ambion mMessage zestaw</td><td></td> mMashine <td>Wstrzyknięcie w 0,05-0,5 i mikro; g/&mikro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Wstrzyknięcie plazmidowego DNA</td><td></td><td></td><td>przy 20 ng / & mikro; l</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania rekombinacyjnego</td><td>Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen</td><td>11789-013</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania rekombinacyjnego</td><td>Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-HA tag</td><td>abcam</td><td>ab9110</td><td>do immunofluorescencji, użyj 1:400 w 3% BSA / PBT</td></tr><tr><td>TRITC kozie przeciwciało anty-królicze</td><td>Jackson</td><td>111-025-144</td><td>do immunofluorescencji użyj 1:300 w 3% BSA/PBT</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca ciona

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Proste organizmy modelowe są instrumentalne dla badań in vivo procesów różnicowania rozwojowego i komórkowego. Obecnie ewolucyjny dystans do człowieka wynikający z konwencjonalnych systemów modelowania bezkręgowców oraz złożoność genomów kręgowców stanowią kluczowe wyzwania dla modelowania normalnych i patologicznych warunków człowieka. Strunowca Ciona intestinalis to strunowca bezkręgowców, który wyłonił się ze wspólnego przodka z kręgowcami i może reprezentować cechy na styku bezkręgowców i kręgowców. Wspólny plan budowy ciała ze znacznie prostszym składem komórkowym i genomowym powinien ujawnić powiązania sieci regulacji genów (GRN) i funkcjonalne odczyty genomiczne wyjaśniające zjawiska w stanie kręgowców. Zwarty genom Ciona, ustalonej linii embrionalnej z kilkoma podziałami i dużymi komórkami, w połączeniu z wszechstronnymi narzędziami społecznościowymi sprzyja efektywnym analizom funkcjonalnym genów w tym organizmie. W tym miejscu przedstawiamy kilka kluczowych metod dla tego obiecującego organizmu modelowego, który należy do najbliższej grupy siostrzanej kręgowców. Przedstawiamy protokoły przejściowej transgenezy przez elektroporację, wraz z knockdownem genów za pośrednictwem mikroiniekcji, które razem zapewniają środki do badania funkcji genów i genomowych elementów regulatorowych. Rozszerzamy nasze protokoły, aby dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób bazy danych społeczności są wykorzystywane do projektowania in silico eksperymentów regulacyjnych lub funkcjonalnych genów. Przykładowe badanie pokazuje, w jaki sposób można uzyskać nowe informacje na temat wzajemnych oddziaływań i ich kwantyfikacji wybranych czynników neuronalnych zachowanych między Cioną a człowiekiem. Ponadto pokazujemy przykłady zróżnicowanej lokalizacji subkomórkowej w komórkach embrionalnych, po elektroporacji DNA u zygot Ciona. Na koniec omawiamy potencjał tych protokołów do adaptacji do interferencji genów specyficznych dla tkanek za pomocą pojawiających się metod edycji genów. Metody in vivo zastosowane w projekcie Ciona pozwalają przezwyciężyć główne niedociągnięcia klasycznych organizmów modelowych w dążeniu do rozwikłania konserwatywnych mechanizmów w programie rozwoju struny, istotnych dla badań nad komórkami macierzystymi, odkrywania leków i późniejszego zastosowania klinicznego.

Prezentujemy przejściową transgenezę i knockdown genu u Ciona intestinalis, siostrzanej grupie strunowców kręgowców, przy użyciu technik mikroiniekcji i elektroporacji. Takie metody ułatwiają genomikę funkcjonalną u tego prostego bezkręgowca, który charakteryzuje się podstawowymi cechami kręgowców, w tym struną grzbietową i nabłonkiem czuciowym głowy, a także wieloma ortologiami genów związanych z chorobami ludzkimi.

Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Ogólnym celem technik transfekcji przejściowej w embrionach Ciona jest badanie regulacji i funkcji genów niezbędnych do formowania larw przypominających kijanki, z wykorzystaniem ich niezmiennego rodowodu komórkowego oraz kompaktowego genomu bezkręgowca, aby uzyskać wgląd w pochodzenie bezkręgowców z grupy chordatów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki molekularnej, takie jak zachowane mechanizmy programu rozwojowego chordatów, które mają znaczenie dla badań nad komórkami macierzystymi oraz dla odkrywania nowych leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki elektroporacji embrionów można w ciągu jednego dnia opracować setki lub tysiące zsynchronizowanych embrionów.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności ze względu na delikatność embrionów podczas dechorionacji oraz trudności w opracowaniu wydajnej techniki mikroiniekcji. Należy rozpocząć od sekcji dorosłych osobników Ciona w pomieszczeniu dla embrionów schłodzonym do 18 °C. Za pomocą małych nożyczek należy wykonać nacięcie na przeciwległym końcu syfonów, po stronie krótszego syfonu, pod którym przebiegają jajowód i przewód nasienny.Wydłuż nacięcie, aby odsłonić jajowód. Następnie, za pomocą czubka nożyczek, wykonaj precyzyjne nacięcie w jajowodzie. Delikatnie uciśnij jajowód zamkniętymi nożyczkami i oddziel jaja.Pozwól jajom spaść bezpośrednio do płytki sześciodołkowej zawierającej sztuczną wodę morską z HEPES. Użyj pipety Pasteura, uprzednio wypłukanej ASWH, aby zebrać i przenieść pozostałe jaja. Aby pobrać plemniki, przetnij przewód nasienny nożyczkami, a następnie użyj oddzielnej pipety Pasteura do zebrania skoncentrowanych plemników i przenieś je do probówki 1,5 ml.Aktywuj plemniki, łącząc 1 ml ASWH oraz 50 µL Tris w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 20 µL stężonego zawiesiny plemników, zamknij nakrętkę i delikatnie wymieszaj poprzez odwracanie probówki lub za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj od 100 do 200 µL roztworu aktywowanych plemników do każdego dołka z jajami i wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół, tak aby jaja unosiły się w medium.Dechorionację rozpoczynamy od zebrania zygot i przeniesienia ich do probówek szklanych. W wirówce ręcznej wirować zygoty przy 1200 ×g przez około 20 sekund, a następnie powoli zatrzymać wirówkę. Usunąć ASWH z osadów za pomocą pipety Pasteura.Do osadu w każdej probówce należy dodać cztery mililitry aktywowanego roztworu do dechorionacji. Zygoty należy zawiesić, delikatnie pipetując je w górę i w dół za pomocą pipety Pasteura traktowanej wodą z kranu, zakończonej małą gumową gruszką. Po 1 do 3 minutach roztwór powinien zmienić barwę na żółtawą.Podczas usuwania otoczek jajowych, za pomocą pipety Pasteura, pobierz niewielką ilość zawiesiny do dechorionacji. Nanieś kroplę na szkiełko i obserwuj ją pod mikroskopem stereoskopowym. Pipetuj zawiesinę zygot w górę i w dół, sprawdzając zawartość szkiełka co 20 do 30 sekund.Najpierw odrywają się komórki mieszkowe, następnie chorion staje się żółty i nieprzezroczysty, a na koniec oddziela się od zygot. Różowe, zdechorionowane zygoty opadną na dno szklanej probówki. Gdy ponad 50% zygot zostanie zdechorionowanych, należy napełnić probówkę roztworem ASWH.Bardzo delikatnie wiruj przez około 10 do 15 sekund, tylko tyle, aby osadzić zdechorionowane zygoty. Powoli zatrzymaj wirówkę. Usuń niemal cały płyn z probówki szklanej, w tym wszelki materiał pływający, i zastąp go ASWH.Powoli pipetuj w górę i w dół w celu przemycia, a następnie delikatnie odwiruj w sposób opisany wcześniej. Przemywaj ponownie, aż do całkowitego usunięcia szczątków chorionu. Osadź przez grawitację przemyte, zdechorionowane zygoty w silikonizowanych probówkach o pojemności 1,5 mililitra.Po sedymentacji odessać ASWH do poziomu 100 µl w probówce. Następnie za pomocą pipety Pasteura dodać 250 µl wcześniej przygotowanego DNA w roztworze mannitolu do jednej probówki z zygotami. Delikatnie wymieszać i bezzwłocznie przenieść mieszaninę do kuwety do elektroporacji o szerokości czterech milimetrów.Umieść kuwetę w uchwycie do elektroporacji i podaj pojedynczy impuls o długości 16 milisekund przy napięciu 50 voltów. Następnie usuń zygoty z kuwety za pomocą tej samej pipety Pasteura i przenieś je do naczynia hodowlanego zawierającego świeże, filtrowane ASWH. Poruszaj naczyniem, aby rozmieścić zygoty.Przepłucz pipetę w zlewce z ASWH, a następnie przejdź do następnej próbki. Po elektroporacji wszystkich zygot, inkubuj zygoty w temperaturze od 15 do 20 °C. Ustaw mikromanipulator w pomieszczeniu chłodzonym do 18 °C.Podłączyć plastikową rurkę i uchwyt igły do szklanej strzykawki o pojemności 10 mililitrów wypełnionej olejem mineralnym. Wypełnić rurkę i uchwyt igły olejem, usuwając wszelkie pęcherzyki powietrza. Wprowadzić do uchwytu igły igłę wstrzykującą zawierającą 0,5 mikrolitrów roztworu wstrzykiwanego z zielonym barwnikiem witalnym.Następnie umieść uchwyt na mikromanipulatorze. Wyreguluj uchwyt igły w taki sposób, aby poruszał się w linii prostej pod kątem 45 stopni względem powierzchni. Ułóż zdechorionowane jaja w małej, pokrytej agarozą szalce hodowlanej wzdłuż wgłębienia, tak aby można było je wstrzykiwać pojedynczo pod mikroskopem stereoskopowym.W razie potrzeby odłam końcówkę igły, delikatnie dociskając ją do szkiełka podstawowego umieszczonego na agarozie. Zastosuj lekki nacisk, aby upewnić się, że otwór w końcówce igły jest drożny. Wstrzykuj substancję do niezapłodnionych jaj pojedynczo, wprowadzając najpierw igłę do jaja, a następnie wykonując lekką aspirację w celu przerwania błony jajowej.Następnie wstrzykните zielony roztwór do środka jaja, na maksymalną głębokość jednej trzeciej średnicy komórki. Po wstrzyknięciu we wszystkie jaja wyjmijcie igłę, przenieście wstrzyknięte, niezapłodnione jaja do nowej szalki hodowlanej i inkubujcie w temperaturze od 15 do 18 °C do momentu zapłodnienia. Mikroiniekcję wykorzystano do badania regulacji czynnika transkrypcyjnego mieliny Ciona intestinalis, czyli MyT, w stadium gastruli embrionów Ciona.Monitorowana za pomocą hybrydyzacji in situ, endogenna ekspresja jest obserwowana w prekursorach płytki nerwowej w szóstym rzędzie u typu dzikiego. Mikroiniekcja morfolinów w celu wyciszenia wczesnych czynników embrionalnych, takich jak czynnik transkrypcyjny Forkhead box A, eliminuje ogólną ekspresję MyT. Odwrotnie, ekspresja MyT jest aktywowana ektopowo po obniżeniu poziomu nodal, co sugeruje, że nodal normalnie represuje ekspresję MyT w tych bocznych prekursorach sznura nerwowego.czynnik transkrypcyjny GATAa został oznakowany tagiem Venus i wprowadzony drogą elektroporacji do blastomerów ektodermalnych przy użyciu drivera pfog. Jak widać tutaj, GATAa lokalizuje się głównie w jądrach komórkowych, co jest spodziewane w przypadku czynnika transkrypcyjnego. Natomiast ekspresja Venus ma charakter powszechny.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przeprowadzania transientnej transfekcji metodą elektroporacji w zsynchronizowanych zygotach Ciona, obchodzenia się z delikatnymi embrionami po usuwaniu otoczki (dechorionacji) oraz znajdowania odpowiedniego kąta mikroiniekcji. Rozwój tych technik utorował drogę do genomiki funkcjonalnej, umożliwiając badanie funkcji genów, sieci regulacji genów oraz zachowanych modułów rozwojowych, które są istotne dla tworzenia tkanek również u ludzi.

embryo-microinjection-electroporation-chordate-ciona

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

W celu oceny funkcji i regulacji genów podczas rozwoju dopaminergicznych neuronów śródmózgowia opisujemy metodę obejmującą elektroporację in ovo konstruktów plazmidowego DNA do embrionalnych progenitorów dopaminergicznych neuronów brzusznej części śródmózgowia kurczaka. Technika ta może być wykorzystana do uzyskania wydajnej ekspresji genów zainteresowania w celu zbadania różnych aspektów rozwoju śródmózgowia i różnicowania neuronów dopaminergicznych.

In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj techniki mikroiniekcji i elektroporacji zarodków Ciona intestinalis w celu badania regulacji genów i funkcji w rozwoju strunowców. Ta metoda umożliwia badanie ewolucyjnych mechanizmów rozwojowych istotnych dla biologii komórek macierzystych.

Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Przeglądaj więcej filmów