Mikroiniekcja zarodka i elektroporacja w jelicie strunowca Ciona

Ogólnym celem technik transfekcji przejściowej w zarodkach Ciona jest zbadanie regulacji genów i funkcji wymaganych do tworzenia larw podobnych do kijanek, wykorzystując ich niezmienną linię komórkową i zwarty genom bezkręgowców, w celu uzyskania wglądu w pochodzenie bezkręgowców strunowcowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki molekularnej, takie jak konserwatywne mechanizmy programu rozwojowego strunowca, które są istotne dla badań nad komórkami macierzystymi i odkrywania leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że dzięki elektroporacji zarodków można obsłużyć setki lub tysiące zsynchronizowanych zarodków w ciągu jednego dnia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z dechorionacją delikatnego zarodka oraz dlatego, że trudno jest opracować skuteczną technikę mikroiniekcji. Zacznij od sekcji dorosłych zarodków Ciona w pomieszczeniu z embrionami chłodzonymi o temperaturze 18 stopni Celsjusza. Za pomocą małych nożyczek wykonaj nacięcie na przeciwległym końcu syfonów i po stronie krótszego syfonu, pod którym przebiega jajowód i przewód nasienny.

Wydłuż nacięcie, aby odsłonić jajowód. Następnie użyj czubka nożyczek, aby wykonać precyzyjne nacięcie w jajowodzie. Delikatnie dociśnij jajowód zamkniętymi nożyczkami i usuń jaja.

Pozwól, aby jaja wpadły bezpośrednio do sześciodołkowej płytki zawierającej sztuczną wodę morską z HEPES. Użyj pipety Pasteura, wstępnie przepłukanej ASWH, aby zebrać i przenieść pozostałe jaja. Aby pobrać nasienie, przetnij przewód nasienny nożyczkami, a następnie użyj oddzielnej pipety Pasteura, aby zebrać skoncentrowane plemniki i przenieś do 1,5 mililitrowej probówki.

Aktywuj plemniki, łącząc jeden mililitr ASWH i 50 mikrolitrów Tris w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Następnie dodaj 20 mikrolitrów skoncentrowanej spermy, zamknij nakrętkę i delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę lub używając pipety Pasteura. Następnie dodaj od 100 do 200 mikrolitrów aktywowanego roztworu plemników do każdej studzienki jaj i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół, tak aby jaja unosiły się w pożywce.

Rozpocznij dechorionację od zebrania zygot i dozowania ich do szklanych probówek. Za pomocą wirówki ręcznej obracaj zygoty tysiąc dwieście razy G przez około 20 sekund, a następnie powoli zatrzymaj wirówkę. Usuń ASWH z granulek za pomocą pipety Pasteura.

Dodaj cztery mililitry aktywowanego roztworu dechorionacyjnego do osadu w każdej probówce. Zawieś zygoty, delikatnie pipetując w górę iw dół za pomocą pipety Pasteura uzdatnionej wodą z kranu, zwieńczonej małą gumową gruszką. Roztwór powinien zmienić kolor na żółtawy po 1 do 3 minutach.

Podczas dechorionacji należy usunąć małą porcję zawiesiny dechorionującej za pomocą pipety Pasteura. Umieść kroplę na szkiełku i obserwuj ją pod mikroskopem preparacyjnym. Pipetować zawiesinę zygoty w górę i w dół i sprawdzać szkiełko co 20 do 30 sekund.

Najpierw odrywają się komórki pęcherzykowe, następnie kosmówka zmienia kolor na żółty i nieprzezroczysty, a na końcu odłącza się od zygot. Różowe zdechorionowane zygoty opadną na dno szklanej rurki. Gdy ponad 50% zygot zostanie zdechorionowanych, napełnij rurkę ASWH.

Bardzo delikatnie wirować przez około 10 do 15 sekund, tylko tyle, aby osadzać zdekorionowane zygoty. Powoli zatrzymaj wirówkę. Usuń prawie cały płyn ze szklanej rurki, w tym wszelki pływający materiał, i zastąp go ASWH.

Powoli pipetuj w górę i w dół, aby umyć, a następnie delikatnie odwiruj jak poprzednio. Umyj ponownie, aż nie pozostaną żadne resztki kosmówki. Osad grawitacyjny myje się do zdechorionowanych zygot w silikonowanych rurkach o średnicy 1,5 mililitra.

Po sedymentacji usuń ASWH do oznaczenia 100 mikrolitrów na probówce. Teraz za pomocą pipety Pasteura dodaj 250 mikrolitrów wcześniej przygotowanego DNA w roztworze mannitolu do jednej probówki zygot. Delikatnie wymieszaj i natychmiast przenieś mieszaninę do czteromilimetrowej kuwety do elektroporacji.

Umieść kuwetę w uchwycie do elektroporacji i daj pojedynczy impuls 16 milisekund pod napięciem 50 woltów. Następnie wyjmij zygoty z kuwety za pomocą tej samej pipety Pasteura i wyrzuć je do naczynia hodowlanego zawierającego świeży, przefiltrowany ASWH. Mieszaj naczynie, aby rozprowadzić zygoty.

Przepłukać pipetę w zlewce z ASWH, a następnie przejść do następnej próbki. Po elecroporacji wszystkich zygot hoduj zygoty w temperaturze od 15 do 20 stopni Celsjusza. Ustaw mikromanipulator w pomieszczeniu chłodzonym o temperaturze 18 stopni Celsjusza.

Podłącz plastikową rurkę i uchwyt igły do szklanej strzykawki o pojemności 10 mililitrów wypełnionej olejem mineralnym. Napełnij rurkę i uchwyt igły olejem i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Wprowadzić igłę do wstrzykiwań zawierającą 0,5 mikrolitra roztworu iniekcyjnego z zielonym barwnikiem witalnym do uchwycić igłę.

I umieść uchwyt na mikromanipulatorze. Wyreguluj uchwyt igły tak, aby poruszał się wzdłuż linii prostej pod kątem 45 stopni w stosunku do powierzchni. Ułóż jaja z dechorionacją w małym naczyniu hodowlanym pokrytym agarozą wzdłuż wgłębienia, tak aby jaja mogły być wstrzykiwane jedno po drugim pod mikroskopem preparacyjnym.

W razie potrzeby złamać końcówkę igły, delikatnie dociskając igłę do kawałka szklanego szkiełka nakrywkowego, umieszczonego na agarozie. Lekko docisnąć, aby sprawdzić, czy końcówka igły jest otwarta. Niezapłodnione jaja należy wstrzykiwać jeden po drugim, najpierw wprowadzając igłę do komórki jajowej i lekko zasysając, aby przerwać błonę jajową.

Następnie wstrzyknąć zielony roztwór do wstrzykiwań w środek komórki jajowej, maksymalnie do jednej trzeciej średnicy komórki. Po wstrzyknięciu wszystkich jaj usuń igłę, przenieś wstrzyknięte, niezapłodnione jaja do świeżej naczyń hodowlanych i inkubuj w temperaturze od 15 do 18 stopni Celsjusza aż do zapłodnienia. Mikroiniekcję wykorzystano do zbadania regulacji czynnika transkrypcyjnego mieliny Ciona intestinalis lub MyT w stadium gastruli zarodków Ciona.

Monitorowana przez hybrydyzację insitu, endogenna ekspresja jest obserwowana w prekursorach płytki nerwowej szóstego rzędu w typie dzikim. Mikroiniekcja morpholinos w celu powalenia wczesnych czynników embrionalnych, takich jak Forkhead box A, czynnik transkrypcyjny, eliminuje ogólną ekspresję MyT. I odwrotnie, ekspresja MyT jest ektopowo aktywowana po regulacji węzła chłonnego, co sugeruje, że węzeł normalnie tłumi ekspresję MyT w tych bocznych prekursorach rdzenia nerwowego.

Czynnik transkrypcyjny GATAa został oznaczony znacznikiem Venus i elektroporowany do blastomerów ektodermalnych za pomocą sterownika pfog. Jak widać tutaj, GATAa jest w większości zlokalizowany w jądrach, zgodnie z oczekiwaniami dla czynnika transkrypcyjnego. Podczas gdy ekspresja Wenus jest wszechobecna.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić transfekcję przejściową za pomocą elektroporacji do zsynchronizowanych zygot Ciona, jak postępować z delikatnymi zarodkami z dekorionacją i jak znaleźć właściwy kąt mikroiniekcji. Po ich opracowaniu techniki te utorowały drogę do genomiki funkcjonalnej. Badanie funkcji genów, sieci regulacyjnych genów i ochrony modułów rozwojowych, ważnych dla tworzenia tkanek również u ludzi.