Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Transgeneza u drosophila jest niezbędna do badania funkcji genów na poziomie organizmu. Mikroiniekcja zarodka jest kluczowym krokiem w budowie muszek transgenicznych. Tutaj jako przykład weźmiemy transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u drosophila i przedstawimy szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u drosophila.

Igły iniekcyjne, których końcówki są ścięte przez młynek w celu zamaskowania bloku embrionalnego lub mniej dużego wycieku cytoplazmatycznego. Jednak roztwór mielący może dostać się do skośnej końcówki igły podczas procesu mielenia, ponieważ roztwór mielący wewnątrz końcówki nie wysycha naturalnie szybko. Nasz protokół wykorzystuje nożną pompkę powietrza z manometrem do wywierania ciśnienia powietrza na igłę podczas szlifowania jej końcówki.

Zapobiega to syfonowaniu roztworu mielącego, a tym samym zapobiega przedostawaniu się roztworu mielącego do fazowanej końcówki, co umożliwia użycie zbudowanej igły w metodzie. Na początek zwilż szmatkę roztworem do mielenia. Przymocuj szmatkę do szlifierki igłowej, a następnie podłącz igłę do nożnej pompki powietrznej za pomocą silikonowej rurki kapilarnej.

Zamontuj igłę na uchwycie igły młynka. Wyreguluj kąt igły tak, aby była wygięta pod kątem 35 stopni do płyty szlifierskiej. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej pod mikroskopem, aby wyregulować położenie końcówki igły, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią szlifowania.

Następnie użyj nożnej pompy powietrza, aby utrzymać wewnętrzne ciśnienie igły na poziomie 40 funtów na cal kwadratowy, a następnie użyj precyzyjnego pokrętła sterującego, aby końcówka igły dotknęła płyty szlifierskiej. Po zmieleniu przez trzy do pięciu sekund rozładuj igłę, gdy pęcherzyki powietrza zaczną wydostawać się z końcówki. Następnie podgrzej pipetę o pojemności 200 mikrolitrów z zewnętrznym płomieniem palnika alkoholowego.

Gdy końcówka pipety zacznie się topić, rozciągnij ją. Odetnij zapieczętowany koniec końcówki pipety nożyczkami. Aby odchlorować zarodki drosophila, usuń muchy z talerzy agarowych z sokiem winogronowym za pomocą pędzla.

Opłucz zebrane zarodki w sitku do komórek wodą podwójnie destylowaną. Osusz sitko do komórek bibułą, a następnie umieść wysuszone sitko na szalce Petriego zawierającej 30% wybielacza. Ręcznie wymieszaj sitko do komórek, aby zapewnić równomierne mieszanie.

Opłucz zarodki w podwójnie destylowanej wodzie przez dwie minuty, a następnie wybierz pływające zarodki pędzlem, aby ustawić się do dalszej transgenezy. Na początek za pomocą pędzla przenieś odchlorowane zarodki Drosophila na długi pasek agatora winogronowego. Użyj igły do preparowania, aby ułożyć około 60 zarodków wzdłuż krawędzi paska, z ich tyłami skierowanymi na zewnątrz.

Teraz umieść dwustronną taśmę o długości 18 milimetrów wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego. Po usunięciu podłoża delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do wyrównanych zarodków. Przenieść szkiełko nakrywkowe z zarodkami do pudełka zawierającego środek osuszający.

Dodaj na nie olej halowęglowy. Aby mikrowstrzyknąć zarodki, najpierw załaduj dwa mikrolitry DNA do igły za pomocą rozciągniętej pipety. Umieść wyrównane zarodki z olejem halowęglowym pod odwróconym mikroskopem.

Następnie za pomocą mikromanipulatora wprowadź igłę w tylne końce zarodka. Za pomocą rozrusznika nożnego ostrożnie wstrzyknij DNA do zarodka. Po zakończeniu mikroiniekcji pierwszego zarodka należy usunąć igłę, a następnie przesunąć ją do tylnego końca następnego zarodka.

Przenieść wstrzyknięte zarodki na płytkę agarową w celu inkubacji. Po wykluciu się z jaj przygotuj fiolkę z jedzeniem. Dodać kilka kropli wody destylowanej do fiolki.

Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i pędzla zbierz wyklute larwy, a następnie przenieś je do fiolki. Inkubować fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wilgotności od 50 do 60% przez 10 dni. Przesuszone zarodki wydawały się zdeformowane i nie mogły być użyte do mikroiniekcji.

Niedosuszone zarodki po nakłuciu wydzielały dużą ilość cytoplazmy, zmniejszając w ten sposób przeżywalność. Odpowiednio wysuszone zarodki po wstrzyknięciu wyciekały tylko w niewielkiej objętości, jeśli w ogóle. Linia Drosophila wyrażająca integrazę phiC31 używaną do mikroiniekcji zarodka miała białe oczy.

Starzejące się muszki tego genotypu mają różowe oczy wynikające z nagromadzonego białka czerwonej fluorescencji ulegającego ekspresji specyficznie w oku. Udało się wyprodukować transgeniczne muchy z transgenem w miejscu dokowania ATTP2 z pomarańczowymi oczami.