Name: Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka Drosophila przy użyciu integrazy phiC31. Ta metoda z ukośnymi igłami i kontrolą ciśnienia powietrza zwiększa skuteczność tworzenia linii transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Fundusz Badań Naukowych dla Talentów Wysokiego Poziomu, Uniwersytet Południowych Chin.

1. Przygotowanie plazmidów
<ol>
	<li>Wyizoluj plazmidy z 4 ml nocnych kultur bakteryjnych za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu. Eluować za pomocą 40 μl buforu elucyjnego. 
	UWAGA: Izolacja plazmidów za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu midi-prep nie jest konieczna. Zestaw do minipreparacji plazmidu może w pełni spełnić wymagania eksperymentalne dotyczące mikroiniekcji zarodka. W tym protokole przygotowane plazmidy UAS-cDNA / ORF zawierają dziesięć kopii UAS, minimalny promotor Hsp70, miejsce attB, mini-biały gen i gen będący przedmiotem zainteresowania.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie plazmidowego DNA za pomocą spektrofotometru i przechowywać w temperaturze -80 °C zamrażarki. 
	UWAGA: Stężenie plazmidu nie ma krytycznego znaczenia dla udanej mikroiniekcji zarodka, ponieważ stężenia plazmidu w zakresie od 20 ng/μL do 1683 ng/μL dobrze sprawdzają się w transgenezie u Drosophila (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Tuż przed mikroiniekcją rozmrozić plazmidy i odwirować przy 13000 x g przez 5 min.</li>
	<li>Przenieś 10 μl każdego plazmidu z górnej warstwy cieczy do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
</ol>
2. Ciągnięcie igieł
<ol>
	<li>Włącz ściągacz igłowy z wybranymi ustawieniami (Ciepło: 500, Ciągnięcie: 50, Vel: 60, Opóźnienie: 90, Ciśnienie: 200, Test rampy: 510).</li>
	<li>Włóż kapilę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1,0 mm, średnica wewnętrzna 0,75 mm, długość 10 cm) do ściągacza igieł i zamknij pokrywę.</li>
	<li>Naciśnij przycisk ciągnięcia. Każda szklana kapilara tworzy dwie igły.</li>
</ol>
3. Igły do mielenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)
<ol>
	<li>Użyj szlifierki igłowej zamontowanej z odpowiednią płytką ścierną (dla rozmiarów końcówek 0,7-2,0 μm) szlifierki igłowej.</li>
	<li>Zwilż szmatkę (drut odniesienia) roztworem do mielenia (100 ml wody destylowanej z 0,9 g NaCl, 1 ml środka zwilżającego) i zamocuj szmatkę.</li>
	<li>Włącz szlifierkę igłową i utrzymuj tarczę szlifierską w ruchu.</li>
	<li>Podłącz igłę do nożnej pompki powietrznej z manometrem za pomocą silikonowej rurki kapilarnej, a następnie zamontuj igłę na uchwycie igły młynka igłowego. Dostosuj kąt igły względem płyty szlifierskiej do 35° (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, B).</li>
	<li>Wyreguluj położenie końcówki igły tuż nad powierzchnią płyty szlifierskiej za pomocą pokrętła zgrubnego pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). 
	UWAGA: Ciągnięte igły uzyskane w sekcji 2 mają stożek 6-8 mm i końcówkę mniejszą niż 1 μm (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D), zgodnie z opisem w instrukcji obsługi ściągacza.</li>
	<li>Utrzymuj ciśnienie wewnętrzne igły na poziomie 40 psi za pomocą nożnej pompki powietrznej. Wyreguluj położenie końcówki igły za pomocą precyzyjnego pokrętła sterującego pod mikroskopem i spraw, aby końcówka igły dotykała płytki szlifierskiej.</li>
	<li>Miel przez 3-5 s. Gdy z końcówki igły wydostaną się drobne pęcherzyki powietrza, rozładuj igłę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: W procesie mielenia użycie pompy powietrza zapobiega zasysaniu roztworu mielącego.</li>
	<li>Włóż zmielone igły do pojemnika do przechowywania. 
	UWAGA: Używaj świeżo zmielonych igieł tak często, jak to możliwe, chociaż zmielone igły można przechowywać w etui do przechowywania przez co najmniej kilka tygodni przed mikrowstrzyknięciem.</li>
</ol>
4. Przygotowanie pipet do ładowania plazmidów
<ol>
	<li>Podgrzej pipetę o pojemności 200 μl z zewnętrznym płomieniem palnika alkoholowego.</li>
	<li>Gdy zacznie się topić, rozciągnij pipetę.</li>
	<li>Odetnij zapieczętowany koniec rozciągniętej pipety nożyczkami, a rozciągnięta pipeta jest gotowa do załadowania DNA do zmielonej igły. 
	UWAGA: Alternatywnie, w handlu dostępne są bardzo długie i cienkie końcówki do napełniania igieł mielonych.</li>
	<li>Umieść te pipety w autoklawizowanym plastikowym pudełku.</li>
</ol>
5. Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Zebrać muchy (vas-phiC31; + ; attP2) wykazujące ekspresję integrazy phiC31 i niosące miejsce dokowania attP2 3 dni po ich wykluciu z 50 fiolek i przenieść je do klatki (φ 90 mm x 150 mm). Dodaj trochę świeżej pasty drożdżowej na środek każdego talerza z agarem winogronowym18.</li>
	<li>Przygotuj 2-4 klatki much. Klatki i talerze należy przechowywać w temperaturze 25 °C i wymieniać je codziennie przez 2-4 dni. 
	UWAGA: W tym badaniu połączono transgen vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) na pierwszym chromosomie i transgen attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) na trzecim chromosomie. Wynikowy zapas (vas-phiC31; + ; attP2) jest używany w tym protokole. Pastę drożdżową należy przygotowywać codziennie, a muchy należy podawać świeżą pastę drożdżową. Wymienione klatki muszą zostać oczyszczone i wysuszone, aby pozbyć się pozostałych zarodków w klatkach.</li>
	<li>W dniu mikroiniekcji należy rano wymienić klatki i płytki. Następnie należy wymieniać płytki co 30 minut i pobierać z nich zarodki. Wymień wszystkie klatki i talerze w temperaturze pokojowej (RT), a następnie utrzymuj klatki i płytki w temperaturze 25 °C. 
	UWAGA: Niektóre protokoły preferują inkubację klatek i płytek w temperaturze 18 °C w celu złożenia jaj. Zależy to od liczby zarodków potrzebnych do mikroiniekcji.</li>
</ol>
6. Zarodki dechorionujące
<ol>
	<li>Przygotuj 30% wybielacz, mieszając 60 ml wybielacza (o zawartości aktywnego chloru 34-46 g/l) i 140 ml podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Usuń pozostałe muchy z talerzy agarowych z sokiem winogronowym za pomocą pędzla lub kleszczy i spłucz zarodki do sitka komórkowego wodą podwójnie destylowaną.</li>
	<li>Osuszyć sitko zawierające zarodki bibułą.</li>
	<li>Umieść go na szalce Petriego zawierającej 30% wybielacza i obracaj sitko do komórek ręcznie lub w wytrząsarce poziomej przez 1,5 minuty przy 60 obr./min. 
	UWAGA: Płukanie jest krytycznym krokiem. Jeśli czas płukania nie jest wystarczająco długi, skorupa zarodka nie odpadnie całkowicie. Jeśli czas płukania jest zbyt długi, spowoduje to, że zarodek stanie się miękki i łatwo pęknie. Sitko do komórek powinno być całkowicie zanurzone w 30% wybielaczu. Noś parę gumowych rękawiczek i fartuch laboratoryjny, aby uniknąć obrażeń spowodowanych wybielaczem.</li>
	<li>Płucz zarodki przez 2 minuty podwójnie destylowaną wodą przechowywaną w laboratoryjnej plastikowej butelce do mycia, aby usunąć resztki wybielacza. Wybierz pływające zarodki do składu.</li>
</ol>
7. Ustawianie zarodków w kolejce
<ol>
	<li>Pokrój stały agar z sokiem winogronowym w długie paski za pomocą ostrza. 
	UWAGA: Użyj fioletowego soku winogronowego, aby ułatwić ułożenie białych zarodków.</li>
	<li>Przenieś zarodki na długi pasek za pomocą pędzla.</li>
	<li>Ustaw około 60 zarodków za pomocą igły preparacyjnej wzdłuż krawędzi długiego paska, tak aby ich tyły były skierowane na zewnątrz paska. Ułóż około 60 zarodków w ciągu 5 minut 
	UWAGA: Mikropyl to występ w kształcie stożka na przednim biegunie zarodka, przez który plemniki wchodzą w celu zapłodnienia oocytu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2A). Dlatego, na podstawie występu w kształcie stożka na przednim biegunie zarodka, łatwo jest określić tylną część zarodka pozbawionego naskórków.</li>
	<li>Umieść taśmę dwustronną o grubości 18 mm wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego (18 mm x 18 mm) i usuń papierowy podkład. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do wyrównanych zarodków. Upewnij się, że zarodki są przyklejone do środka taśmy.</li>
</ol>
8. Wysuszanie zarodków
<ol>
	<li>Umieścić szkiełko nakrywkowe z ułożonymi w szeregu zarodkami w pudełku zawierającym środek osuszający. Czas schnięcia różni się w zależności od temperatury i wilgotności. 
	UWAGA: Czas schnięcia ma kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji i musi być określony eksperymentalnie. Czas schnięcia wynosi zwykle 9-10 min latem i 17-18 min zimą.</li>
	<li>Przykryj zarodki olejem halowęglowym. 
	UWAGA: Nie upuszczaj zbyt dużej ilości oleju na zarodki, ponieważ dodatkowy olej może przelać się przez klej. Stosunek objętości oleju halowęglowego 700 i oleju halowęglowego 27 wynosi 1:3.</li>
</ol>
9. Mikroiniekcja zarodków
<ol>
	<li>Załaduj 2 μl DNA do igły za pomocą rozciągniętej pipety. Upewnij się, że w igle nie ma pęcherzyków powietrza. Umieścić igłę w uchwycie igły mikromanipulatora.</li>
	<li>Umieść wyrównane zarodki pokryte olejem halowęglowym pod odwróconym mikroskopem. Upewnij się, że tylne końce zarodków są skierowane w stronę igły.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby zbliżyć igłę do zarodków. Oczyścić igłę. Upewnij się, że widoczna jest kropla płynu wypływająca z igły. Zaczynając od ciśnienia wtrysku 300 hPa i ciśnienia równowagi 20 hPa, dostosuj ciśnienie wtrysku i ciśnienie równowagi, aby zapewnić optymalną wielkość kropli cieczy.</li>
	<li>Użyj mikromanipulatora, aby wprowadzić igłę do tylnych końców zarodków i użyj sterownika nożnego podłączonego do mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć DNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Jeśli widoczna jest mała aureola, DNA jest z powodzeniem wstrzykiwane do zarodka. 
	UWAGA: Wybierz zarodki wielojądrowe do wstrzyknięcia i zabij starsze zarodki za pomocą przycisku "wyczyść". Jeśli po wstrzyknięciu wycieknie duża ilość cytoplazmy, zarodki są niedostatecznie wysuszone. Jeśli po wstrzyknięciu wycieka tylko niewielka ilość cytoplazmy lub jej brak, zastrzyki uważa się za udane. Jeśli po wstrzyknięciu z więcej niż jednej trzeciej zarodków wycieka cytoplazma, należy wydłużyć czas schnięcia o 1-2 minuty. Jeśli więcej niż jedna trzecia zarodków jest przesuszona, skróć czas schnięcia o 1-2 minuty.</li>
	<li>Wyjąć igłę z zarodka. Przesunąć igłę do tylnego końca następnego zarodka. Powtórz powyższe kroki.</li>
	<li>Umieść wstrzyknięte zarodki na płytce agarowej. Umieść talerz w pomieszczeniu o temperaturze 18-20 °C. Następnego dnia przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60% i inkubować przez 1 dzień. 
	UWAGA: Po wstrzyknięciu należy przechowywać zarodki w temperaturze 18-20 °C, aby spowolnić ich rozwój, ułatwić integrację plazmidowego DNA z genomem Drosophila i zwiększyć przeżywalność wstrzykniętych zarodków.</li>
</ol>
10. Zbieranie larw
<ol>
	<li>Użyj igły do preparowania, aby zeskrobać i poluzować pokarm w fiolce. Zaopatrz żywność w kilka kropel wody destylowanej. 
	UWAGA: Pozwól, aby woda destylowana została wchłonięta przez żywność, aby zapobiec utonięciu larw.</li>
	<li>Wyjmij płytki z inkubatora.</li>
	<li>Zebrać wyklute larwy za pomocą pędzla pod mikroskopem stereoskopowym i przenieść je do fiolki.</li>
	<li>Umieścić fiolkę w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60%.</li>
</ol>
11. Pozyskiwanie transgenicznych much
<ol>
	<li>Wyklute muchy należy zebrać po inkubacji fiolki w temperaturze 25 °C przez 10 dni.</li>
	<li>Skrzyżuj pojedynczego samca muchy z trzema dziewiczymi samicami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1 i skrzyżuj pojedynczą samicę muchy z trzema samcami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1.</li>
	<li>Umieść krzyże w inkubatorze w temperaturze 25 °C i wilgotności 50%-60%.</li>
	<li>Przesiewaj potomstwo pod kątem much o pomarańczowych oczach. Są to muchy transgeniczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A-C). 
	UWAGA: Muchy noszące kopię transgenu w miejscu dokowania attP2 mają pomarańczowe oczy.</li>
	<li>Skrzyżuj pojedynczego pomarańczowookiego samca muchy z trzema dziewiczymi samicami much z balanserów TM2/TM6C Sb1 Tb1, aby założyć stado. 
	UWAGA: Konieczne jest ustawienie więcej niż jednego pokolenia krzyżówek, aby wyciąć transgen phiC31 na pierwszym chromosomie.</li>
</ol>

phiC31 Integrase-Mediated Embryo Transgenesis in Drosophila

<ol><li>Rubin, G. M., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Drosophila+with+transposable+element+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors.</a> Science. 218 (4570), 348-353 (1982).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phic31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31.</a> Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phic31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).</li>
<li>Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+position+effects+and+the+gypsy+retrovirus+insulator+to+engineer+precisely+expressed+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes.</a> Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).</li>
<li>Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+transformation+of+Drosophila+via+phic31+integrase-mediated+cassette+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange.</a> Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+A+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).</li>
<li>Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+to+detect+in+vivo+Y+chromosome+loss+in+Drosophila+wing+disc+cells%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells.</a> G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).</li>
<li>Ringrose, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in Drosophila melanogaster.</a> Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).</li>
<li>Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+attp40+docking+site+and+derivatives+are+insertion+mutations+of+msp-300%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300.</a> PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).</li>
<li>Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Drosophila+attp40+background+on+the+glomerular+organization+of+or47b+olfactory+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons.</a> G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li>
<li>Pfeiffer, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+neuroanatomy+and+neurogenetics+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).</li>
<li>Bellen, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+gene+disruption+project%3A+Progress+using+transposons+with+distinctive+site+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities.</a> Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).</li>
<li>Zirin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transgenic+drosophila+resource+collections+for+loss-+and+gain-of-function+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies.</a> Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+transgenic+Drosophila+by+microinjecting+the+site-specific+phic31+integrase+mRNA+and+a+transgene-containing+donor+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid.</a> Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).</li>
<li>Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic Drosophila.</a> Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).</li>
<li>Loncar, D., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li>
<li>Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+techniques+in+fly+embryos+to+study+the+function+and+dynamics+of+SMC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes.</a> Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila. W przypadku transgenezy specyficznej dla miejsca za pośrednictwem phiC31 wstrzyknęliśmy 120-140 zarodków dla każdego plazmidu i uzyskaliśmy co najmniej jedną linię transgeniczną dla około 85% plazmidów (Tabela uzupełniająca 2). Z naszego doświadczenia wynika, że plazmidowe DNA wyizolowane za pomocą zestawu do minipreparacji plazmidu wystarcza do transgenezy u Drosophila. Stężenia plazmidowego DNA w zakresie od 20 ng/μL do 1683 ng/μL mogą nie mieć widocznego wpływu na wskaźnik powodzenia transgenezy, ponieważ większość z nich może wytwarzać muchy transgeniczne (Tabela uzupełniająca 1).
Przygotowanie igieł iniekcyjnych ma kluczowe znaczenie dla skutecznego mikroiniekcji zarodków. Igła do wstrzykiwań jest zamykana po pociągnięciu jej przez ściągacz igły. W przypadku rutynowej transgenezy za pośrednictwem phiC31 u Drosophila, końcówka igły jest zwykle łamana przez szkiełko nakrywkowe17. Jednak losowo złamane igły często nie nadają się do mikroiniekcji zarodków, ponieważ mogą zostać zablokowane lub spowodować wyciek dużej ilości cytoplazmy, a tym samym muszą zostać zastąpione nową podczas wstrzyknięcia. Igły iniekcyjne, których końcówki są ścięte przez młynek, zwykle nie blokują się ani nie powodują dużego wycieku cytoplazmatycznego, co zmniejsza częstotliwość wymiany igły. Zauważyliśmy, że roztwór do mielenia może dostać się do skośnej końcówki igły, gdy końcówka jest otwarta podczas szlifowania. Po wejściu do igły roztwór do mielenia nie wyschnie szybko w naturalny sposób. Aby zapobiec zasysaniu roztworu mielącego, podłączamy igłę do wstrzykiwania do nożnej pompy powietrza z manometrem. Podczas szlifowania końcówki igły używamy pompy powietrza do wywierania ciśnienia powietrza na igłę, dzięki czemu roztwór mielący nie dostaje się do skośnej końcówki, co umożliwia natychmiastowe użycie skośnej igły. Razem nożna pompa powietrzna z manometrem powinna pomóc w przyspieszeniu transgenezy u Drosophila, szczególnie w przypadku dużej liczby plazmidów.
Identyfikacja zarodków w stadium preblastodermy lub blastodermy syncytialnej ma kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji19,20, ponieważ wstrzykiwanie zarodków w późniejszych stadiach prawie nie powoduje powstania muszek transgenicznych. Muchy w wieku poniżej 10 dni są używane do składania jaj, ponieważ mają tendencję do składania większej liczby jaj niż starsze. W procesie dekorionacji zarodków stosuje się sitko do komórek, aby uprościć wybielanie i płukanie zarodków wodą podwójnie destylowaną. Po wypłukaniu zarodków unoszące się w powietrzu zarodki wskazują, że skorupki jaj zostały dobrze potraktowane i mogą być wykorzystane do późniejszego mikroiniekcji. Zarówno czas dechorionacji, jak i schnięcia zarodków mają kluczowe znaczenie dla mikroiniekcji i powinny być optymalizowane eksperymentalnie, ponieważ przedłużony czas dechorionacji lub suszenia może zabić zarodki. Na czas dechorionacji i suszenia ma wpływ temperatura i wilgotność, które zmieniają się w zależności od miejsca i od czasu do czasu i powinny być odpowiednio dostosowane w oparciu o szybkość wylęgu zarodka.

Muszka owocowa Drosophila melanogaster jest niezwykle podatna na manipulacje genetyczne i analizę genetyczną. Transgeniczne muszki owocowe są szeroko stosowane w badaniach biologicznych. Od czasu opracowania na początku lat 80., transgeneza za pośrednictwem transpozonu elementu P była niezbędna do badań nad Drosophila1. W niektórych scenariuszach inne transpozony, takie jak piggyBac i Minos, były również używane do transgenezy u Drosophila2. Transgeny za pośrednictwem transpozonu są losowo wstawiane do genomu Drosophila, a poziomy ekspresji transgenów w różnych loci genomu mogą się różnić ze względu na efekty pozycji, a zatem nie można ich porównać2. Wady te zostały przezwyciężone przez transgenezę specyficzną dla miejsca, w której pośredniczy phiC313. Gen phiC31 bakteriofaga koduje integrazę, która pośredniczy w specyficznej dla sekwencji rekombinacji między miejscami attB i attP w Drosophila3. Wiele miejsc dokowania attP zostało scharakteryzowanych i jest dostępnych w Bloomington Drosophila Stock Center3,4,5,6,7,8,9.
System transgenezy phiC31 dla Drosophila jest szeroko stosowany przez społeczność much. Wśród miejsc dokowania attP, attP18 na chromosomie X, attP40 na drugim chromosomie i attP2 na trzecim chromosomie są zwykle preferowanymi miejscami integracji transgenu na każdym chromosomie, ponieważ transgeny w tych trzech miejscach wykazują wysoki poziom indukowanej ekspresji, mając jednocześnie niski poziom ekspresji podstawowej5. Ostatnio jednak van der Graaf i współpracownicy odkryli, że miejsce attP40, blisko locus genu Msp300, i transgeny zintegrowane z attP40 powodują grupowanie się jąder mięśni larwalnych u Drosophila10. W innym niedawnym badaniu Duan i współpracownicy odkryli, że homozygotyczny chromosom attP40 zakłóca normalną organizację kłębuszków nerkowych klasy neuronów receptora węchowego Or47b u Drosophila11. Wyniki te sugerują, że podczas projektowania eksperymentów i interpretacji danych należy uwzględnić rygorystyczne kontrole.
Drosophila jest idealnym organizmem modelowym do badania in vivo funkcji genów ze względu na krótki cykl życia, niski koszt i łatwość utrzymania. Genetyczne badania przesiewowe całego genomu opierają się na budowie bibliotek transgenicznych całego genomu w Drosophila12,13,14,15. Wcześniej wygenerowaliśmy 5551 konstruktów UAS-cDNA/ORF opartych na binarnym systemie GAL4/sekwencja aktywująca (GAL4/UAS), obejmujących 83% genów Drosophila konserwatywnych u ludzi w Drosophila Genomics Resource Center (DGRC) Gold Collection16. Plazmidy UAS-cDNA/ORF mogą być wykorzystane do stworzenia transgenicznej biblioteki UAS-cDNA/ORF u Drosophila. Wydajna technologia mikroiniekcji zarodków może przyspieszyć tworzenie bibliotek muszek transgenicznych.
W przypadku mikroiniekcji zarodkowej, końcówka igły jest zwykle złamana na szkiełku nakrywkowym17. W związku z tym igły często się zapychają lub powodują wyciek dużych ilości cytoplazmy, a gdy pojawiają się te problemy, należy zastosować nowe igły. Chociaż igły do ukosowania mogą zwiększyć wydajność mikroiniekcji, roztwór do mielenia dostaje się do ukosowanej końcówki podczas procesu mielenia. Roztwór mielący w skośnej końcówce nie odparowuje szybko w sposób naturalny; Dlatego igły nie mogą być używane do mikroiniekcji bezpośrednio po ukosowaniu. Czynniki te obniżają skuteczność zabiegów mikroiniekcji zarodków. Tutaj, używając jako przykładu transgenezy specyficznej dla miejsca za pośrednictwem phiC31, przedstawiamy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila. Aby zapobiec przedostawaniu się roztworu do mielenia do igły, wykorzystujemy pompę powietrza do wywierania ciśnienia powietrza w igle, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się roztworu mielącego do skośnej końcówki. Igły skośne są gotowe do załadowania próbki i mikroiniekcji bezpośrednio po ukosowaniu.

<table><tbody><tr><td>100 &mu; m Sitko do komórek</td><td>NEST</td><td>258367</td><td></td></tr><tr><td>Dwustronny klej 3M</td><td>3M</td><td>415</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe</td><td>SUTTER</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Diamentowa płyta ścierna</td><td>SUTTER</td><td>104E</td><td></td></tr><tr><td>PŁONĄCY/BRĄZOWY Ściągacz do mikropipet</td><td>SUTTER</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nożna pompa powietrza z manometrem</td><td>Shenfeng</td><td>SF8705D</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ts2R</td><td></td></tr><tr><td>Pompa mikroiniekcyjna</td><td>eppendorf</td><td>FemtoJet 4i</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>eppendorf</td><td>TransferMan 4r</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta Beveler</td><td>SUTTER</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu (18 mm x 18 mm)</td><td>CITOLAS</td><td>10211818C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe (25 mm x 75 mm)</td><td>CITOLAS</td><td>188105W</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (90 mm x 15 mm)</td><td>LAIBOER</td><td>4190152</td><td></td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1026269</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Zestaw do miniprepu</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgeneza u Drosophila jest podstawowym podejściem do badania funkcji genów na poziomie organizmu. Mikroiniekcja zarodka jest kluczowym krokiem w budowie muszek transgenicznych. Mikroiniekcja wymaga niektórych rodzajów sprzętu, w tym mikroiniektora, mikromanipulatora, mikroskopu odwróconego i mikroskopu stereoskopowego. Plazmidy wyizolowane za pomocą zestawu minipreparacyjnego plazmidu kwalifikują się do mikroiniekcji. Zarodki w stadium preblastodermy lub blastodermy syncytialnej, w których jądra mają wspólną cytoplazmę, poddaje się mikroiniekcji. Sitko komórkowe ułatwia proces dekorionacji zarodków. Optymalny czas dechorionacji i wysuszenia zarodków musi zostać określony doświadczalnie. Aby zwiększyć skuteczność mikroiniekcji zarodków, igły przygotowane za pomocą ściągacza muszą być ukosowane za pomocą młynka do igieł. W procesie mielenia igieł wykorzystujemy nożną pompę powietrza z manometrem, aby uniknąć efektu kapilarnego końcówki igły. Rutynowo wstrzykujemy 120-140 zarodków do każdego plazmidu i uzyskujemy co najmniej jedną linię transgeniczną dla około 85% plazmidów. W artykule tym wzięto za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u Drosophila.

Końcówka igły do iniekcji jest ściinana za pomocą szlifierki do igieł (Rycina 1). W ciągu jednej godziny można ściinać od 50 do 60 igieł. DNA jest mikroiniekcjonowane do tylnej części zarodka w stadium przedblastodermy lub syncytialnej blastodermy, kiedy jądra dzielą wspólną cytoplazmę (Rycyna 2A). Tylną część zarodka można łatwo zlokalizować na podstawie mikropylu znajdującego się w przedniej części zarodka (Rycina 2A). Zarodki w stadiach komórkowej blastodermy i gastrulacji nie mogą być używane do iniekcji, ponieważ w tych etapach każde jądro jest otoczone błoną komórkową, przez co szansa na uzyskanie much transgeniczncyh jest niemal zerowa (Rycina 2B). Przesuszone zarodki ulegają deformacji podczas nakłuwania i nie mogą być wykorzystane do mikroiniekcji (Rycina 2C). Niedosuszone zarodki mogą wydzielać dużą ilość cytoplazmy po nakłuciu igłą (Rycina 2D), co skutkuje niższą przeżywalnością zarodków. Odpowiednio wysuszone zarodki mogą lub nie mogą tracić niewielką ilość cytoplazmy podczas iniekcji (Rycina 2E).
Linia Drosophila wykazująca ekspresję integrazu phiC31 i posiadająca miejsce dokowania attP2, wykorzystywana do mikroiniekcji embrionów w niniejszym protokole, ma białe oczy (Rysunek 3A), natomiast starsze muchy tego genotypu mają różowe oczy, co wynika z nagromadzenia czerwonego białka fluorescencyjnego ekspresowanego specyficznie w oku (Rysunek 3B). Jako marker selekcyjny dla transgenezy u Drosophila stosujemy gen mini-white, a muchy transgeniczne są identyfikowane na podstawie koloru oczu, który waha się od jasnożółtego do czerwonego. Muchy transgeniczne posiadające transgen w miejscu dokowania attP2 mają pomarańczowe oczy (Rysunek 3C), co pozwala łatwo odróżnić je od much nieposiadających transgenów.
<img alt="Układ do pomiaru lepkości, kapilarność, obrazy mikroskopowe, analiza na poziomie mikro, eksperyment fizyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Szlifowanie igieł. (A) Nożna pompa powietrzna z manometrem jest wykorzystywana do przyłożenia ciśnienia powietrza do igły. (B) Igła jest zamocowana w szlifierce do igieł pod kątem 35° do powierzchni płyty szlifującej. (C) Należy użyć pokrętła grubego ustawienia, aby umieścić czubek igły tuż nad powierzchnią płyty szlifującej, a następnie użyć pokrętła precyzyjnego, aby rozpocząć fazowanie czubka. (D) Czubek wyciągniętej igły pod mikroskopem. Paski skali = 10 µm. (E) Igła sfazowana pod mikroskopem. Sfazowany czubek igły wskazany jest strzałką. Paski skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe różnych stadiów embrionu, szczegółowo przedstawiające procesy rozwojowe (skala 50 μm)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2:Drosophila embriony odpowiednie do mikroiniekcji. (A) Embrion Drosophila w stadium przedblastodermy lub syncytialnego blastodermy może zostać poddany iniekcji w biegun tylny embrionu, zaznaczony czerwoną elipsą. Mikropyla w biegunie przednim embrionu wskazana jest strzałką. (B) Embrion Drosophila w stadium blastodermy komórkowej nie może być użyty do mikroiniekcji. (C) Embrion nadmiernie wysuszony wygląda na zdeformowany. (D) Niewystarczające wysuszenie embrionu prowadzi do dużego wycieku cytoplazmy po iniekcji. (E) W przypadku udanej iniekcji może wyciec niewielka ilość cytoplazmy. Paski skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Zmienność koloru oczu Drosophila, obrazy mikroskopowe A-C, ukazujące różnice genetyczne w pigmencie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66679/66679fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kolor oczu transgenicznych Drosophila z transgenem w miejscu dokowania attP2. (A) Linia wstrzyknięta attP2 wykazująca ekspresję integrazą phiC31 (vas-phiC31; + ; attP2) ma białe oczy. RFP specyficznie ekspresowane w oku służy jako marker selekcyjny dla transgenu phiC31. (B) Starsza linia wstrzyknięta attP2 wykazująca ekspresję integrazą phiC31 ma różowe oczy, co wynika z akumulacji białka RFP w oku. (C) Muchy z transgenem zintegrowanym w miejscu dokowania attP2 mają pomarańczowe oczy. Paski skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/66679fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Transgeneza u Drosophila w wyniku mikroiniekcji 100 różnych plazmidów do zarodków. Do zarodków wstrzyknięto łącznie 100 różnych plazmidów o różnych stężeniach w zakresie od 20 ng/µL do 1683 ng/µL, a muchy transgeniczne uzyskano dla 85 z 100 plazmidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Efektywność mikroiniekcji zarodków w celu transgenezy u Drosophila. W sumie 120 różnych plazmidów zostało wstrzykniętych do zarodków, a muchy transgeniczne uzyskano dla 101 z 120 plazmidów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66679/Supplementary%20Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Transgeneza u drosophila jest niezbędna do badania funkcji genów na poziomie organizmu. Mikroiniekcja zarodka jest kluczowym krokiem w budowie muszek transgenicznych. Tutaj jako przykład weźmiemy transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u drosophila i przedstawimy szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u drosophila.Igły iniekcyjne, których końcówki są ścięte przez młynek w celu zamaskowania bloku embrionalnego lub mniej dużego wycieku cytoplazmatycznego. Jednak roztwór mielący może dostać się do skośnej końcówki igły podczas procesu mielenia, ponieważ roztwór mielący wewnątrz końcówki nie wysycha naturalnie szybko. Nasz protokół wykorzystuje nożną pompkę powietrza z manometrem do wywierania ciśnienia powietrza na igłę podczas szlifowania jej końcówki.Zapobiega to syfonowaniu roztworu mielącego, a tym samym zapobiega przedostawaniu się roztworu mielącego do fazowanej końcówki, co umożliwia użycie zbudowanej igły w metodzie. Na początek zwilż szmatkę roztworem do mielenia. Przymocuj szmatkę do szlifierki igłowej, a następnie podłącz igłę do nożnej pompki powietrznej za pomocą silikonowej rurki kapilarnej.Zamontuj igłę na uchwycie igły młynka. Wyreguluj kąt igły tak, aby była wygięta pod kątem 35 stopni do płyty szlifierskiej. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej pod mikroskopem, aby wyregulować położenie końcówki igły, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią szlifowania.Następnie użyj nożnej pompy powietrza, aby utrzymać wewnętrzne ciśnienie igły na poziomie 40 funtów na cal kwadratowy, a następnie użyj precyzyjnego pokrętła sterującego, aby końcówka igły dotknęła płyty szlifierskiej. Po zmieleniu przez trzy do pięciu sekund rozładuj igłę, gdy pęcherzyki powietrza zaczną wydostawać się z końcówki. Następnie podgrzej pipetę o pojemności 200 mikrolitrów z zewnętrznym płomieniem palnika alkoholowego.Gdy końcówka pipety zacznie się topić, rozciągnij ją. Odetnij zapieczętowany koniec końcówki pipety nożyczkami. Aby odchlorować zarodki drosophila, usuń muchy z talerzy agarowych z sokiem winogronowym za pomocą pędzla.Opłucz zebrane zarodki w sitku do komórek wodą podwójnie destylowaną. Osusz sitko do komórek bibułą, a następnie umieść wysuszone sitko na szalce Petriego zawierającej 30% wybielacza. Ręcznie wymieszaj sitko do komórek, aby zapewnić równomierne mieszanie.Opłucz zarodki w podwójnie destylowanej wodzie przez dwie minuty, a następnie wybierz pływające zarodki pędzlem, aby ustawić się do dalszej transgenezy. Na początek za pomocą pędzla przenieś odchlorowane zarodki Drosophila na długi pasek agatora winogronowego. Użyj igły do preparowania, aby ułożyć około 60 zarodków wzdłuż krawędzi paska, z ich tyłami skierowanymi na zewnątrz.Teraz umieść dwustronną taśmę o długości 18 milimetrów wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego. Po usunięciu podłoża delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do wyrównanych zarodków. Przenieść szkiełko nakrywkowe z zarodkami do pudełka zawierającego środek osuszający.Dodaj na nie olej halowęglowy. Aby mikrowstrzyknąć zarodki, najpierw załaduj dwa mikrolitry DNA do igły za pomocą rozciągniętej pipety. Umieść wyrównane zarodki z olejem halowęglowym pod odwróconym mikroskopem.Następnie za pomocą mikromanipulatora wprowadź igłę w tylne końce zarodka. Za pomocą rozrusznika nożnego ostrożnie wstrzyknij DNA do zarodka. Po zakończeniu mikroiniekcji pierwszego zarodka należy usunąć igłę, a następnie przesunąć ją do tylnego końca następnego zarodka.Przenieść wstrzyknięte zarodki na płytkę agarową w celu inkubacji. Po wykluciu się z jaj przygotuj fiolkę z jedzeniem. Dodać kilka kropli wody destylowanej do fiolki.Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i pędzla zbierz wyklute larwy, a następnie przenieś je do fiolki. Inkubować fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wilgotności od 50 do 60% przez 10 dni. Przesuszone zarodki wydawały się zdeformowane i nie mogły być użyte do mikroiniekcji.Niedosuszone zarodki po nakłuciu wydzielały dużą ilość cytoplazmy, zmniejszając w ten sposób przeżywalność. Odpowiednio wysuszone zarodki po wstrzyknięciu wyciekały tylko w niewielkiej objętości, jeśli w ogóle. Linia Drosophila wyrażająca integrazę phiC31 używaną do mikroiniekcji zarodka miała białe oczy.Starzejące się muszki tego genotypu mają różowe oczy wynikające z nagromadzonego białka czerwonej fluorescencji ulegającego ekspresji specyficznie w oku. Udało się wyprodukować transgeniczne muchy z transgenem w miejscu dokowania ATTP2 z pomarańczowymi oczami.

embryo-microinjection-for-transgenesis-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroiniekcji i obrazowania o wysokiej rozdzielczości w zarodku syncytialnym Drosophila melanogaster w celu badania mitozy.

Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

Ten film opisuje, jak wykonywać mikrozastrzyki, które dostarczają odczynniki do żywych zarodków Drosophila. Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do wprowadzenia związków egzogennych, takich jak kwasy nukleinowe i białka, we wczesnych stadiach rozwoju zarodka. Przedstawiony protokół pokazuje, jak skonfigurować i wykonać procedurę wstrzykiwania dowolnego rozpuszczalnego odczynnika - w tym przypadku białka fluorescencyjnego do eksperymentów z obrazowaniem na żywo.

Mikroiniekcja żywych zarodków Drosophila: wczesne dostarczenie odczynników do rozwijającego się zarodka

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Poznaj zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka Drosophila przy użyciu integrazy phiC31. Ta metoda z ukośnymi igłami i kontrolą ciśnienia powietrza zwiększa skuteczność tworzenia linii transgenicznych.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów