Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila
June 7th, 2024
Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.
Transgeneza u drosophila jest niezbędna do badania funkcji genów na poziomie organizmu. Mikroiniekcja zarodka jest kluczowym krokiem w budowie muszek transgenicznych. Tutaj jako przykład weźmiemy transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u drosophila i przedstawimy szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodka w celu transgenezy u drosophila.
Igły iniekcyjne, których końcówki są ścięte przez młynek w celu zamaskowania bloku embrionalnego lub mniej dużego wycieku cytoplazmatycznego. Jednak roztwór mielący może dostać się do skośnej końcówki igły podczas procesu mielenia, ponieważ roztwór mielący wewnątrz końcówki nie wysycha naturalnie szybko. Nasz protokół wykorzystuje nożną pompkę powietrza z manometrem do wywierania ciśnienia powietrza na igłę podczas szlifowania jej końcówki.
Zapobiega to syfonowaniu roztworu mielącego, a tym samym zapobiega przedostawaniu się roztworu mielącego do fazowanej końcówki, co umożliwia użycie zbudowanej igły w metodzie. Na początek zwilż szmatkę roztworem do mielenia. Przymocuj szmatkę do szlifierki igłowej, a następnie podłącz igłę do nożnej pompki powietrznej za pomocą silikonowej rurki kapilarnej.
Zamontuj igłę na uchwycie igły młynka. Wyreguluj kąt igły tak, aby była wygięta pod kątem 35 stopni do płyty szlifierskiej. Użyj pokrętła regulacji zgrubnej pod mikroskopem, aby wyregulować położenie końcówki igły, aż znajdzie się tuż nad powierzchnią szlifowania.
Następnie użyj nożnej pompy powietrza, aby utrzymać wewnętrzne ciśnienie igły na poziomie 40 funtów na cal kwadratowy, a następnie użyj precyzyjnego pokrętła sterującego, aby końcówka igły dotknęła płyty szlifierskiej. Po zmieleniu przez trzy do pięciu sekund rozładuj igłę, gdy pęcherzyki powietrza zaczną wydostawać się z końcówki. Następnie podgrzej pipetę o pojemności 200 mikrolitrów z zewnętrznym płomieniem palnika alkoholowego.
Gdy końcówka pipety zacznie się topić, rozciągnij ją. Odetnij zapieczętowany koniec końcówki pipety nożyczkami. Aby odchlorować zarodki drosophila, usuń muchy z talerzy agarowych z sokiem winogronowym za pomocą pędzla.
Opłucz zebrane zarodki w sitku do komórek wodą podwójnie destylowaną. Osusz sitko do komórek bibułą, a następnie umieść wysuszone sitko na szalce Petriego zawierającej 30% wybielacza. Ręcznie wymieszaj sitko do komórek, aby zapewnić równomierne mieszanie.
Opłucz zarodki w podwójnie destylowanej wodzie przez dwie minuty, a następnie wybierz pływające zarodki pędzlem, aby ustawić się do dalszej transgenezy. Na początek za pomocą pędzla przenieś odchlorowane zarodki Drosophila na długi pasek agatora winogronowego. Użyj igły do preparowania, aby ułożyć około 60 zarodków wzdłuż krawędzi paska, z ich tyłami skierowanymi na zewnątrz.
Teraz umieść dwustronną taśmę o długości 18 milimetrów wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego. Po usunięciu podłoża delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do wyrównanych zarodków. Przenieść szkiełko nakrywkowe z zarodkami do pudełka zawierającego środek osuszający.
Dodaj na nie olej halowęglowy. Aby mikrowstrzyknąć zarodki, najpierw załaduj dwa mikrolitry DNA do igły za pomocą rozciągniętej pipety. Umieść wyrównane zarodki z olejem halowęglowym pod odwróconym mikroskopem.
Następnie za pomocą mikromanipulatora wprowadź igłę w tylne końce zarodka. Za pomocą rozrusznika nożnego ostrożnie wstrzyknij DNA do zarodka. Po zakończeniu mikroiniekcji pierwszego zarodka należy usunąć igłę, a następnie przesunąć ją do tylnego końca następnego zarodka.
Przenieść wstrzyknięte zarodki na płytkę agarową w celu inkubacji. Po wykluciu się z jaj przygotuj fiolkę z jedzeniem. Dodać kilka kropli wody destylowanej do fiolki.
Za pomocą mikroskopu stereoskopowego i pędzla zbierz wyklute larwy, a następnie przenieś je do fiolki. Inkubować fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w wilgotności od 50 do 60% przez 10 dni. Przesuszone zarodki wydawały się zdeformowane i nie mogły być użyte do mikroiniekcji.
Niedosuszone zarodki po nakłuciu wydzielały dużą ilość cytoplazmy, zmniejszając w ten sposób przeżywalność. Odpowiednio wysuszone zarodki po wstrzyknięciu wyciekały tylko w niewielkiej objętości, jeśli w ogóle. Linia Drosophila wyrażająca integrazę phiC31 używaną do mikroiniekcji zarodka miała białe oczy.
Starzejące się muszki tego genotypu mają różowe oczy wynikające z nagromadzonego białka czerwonej fluorescencji ulegającego ekspresji specyficznie w oku. Udało się wyprodukować transgeniczne muchy z transgenem w miejscu dokowania ATTP2 z pomarańczowymi oczami.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodków, kluczowym etapie tworzenia transgenicznych muchek za pomocą transgenezy pośredniczonej przez integrazę phiC31 u Drosophila.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Biologia rozwojowa
Tło
- Transgeneza u Drosophila jest niezbędna do badania funkcji genów.
- Mikroiniekcja zarodków jest kluczową techniką do konstruowania transgenicznych muchek.
- System integrazy phiC31 to szeroko stosowany metodą transgenezy.
- Optymalizacja technik mikroiniekcji może poprawić skuteczność generowania linii transgenicznych.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy protokół mikroiniekcji zarodków u Drosophila.
- Aby zwiększyć efektywność tworzenia transgenicznych muchek.
- Aby zademonstrować zastosowanie integrazy phiC31 w transgenezie.
Zastosowane metody
- Protokół mikroiniekcji zarodków z użyciem integrazy phiC31.
- Zastosowanie igły z pofalowaną końcówką, aby zminimalizować wycieki cytoplazmy.
- Zastosowanie ciśnienia powietrza podczas szlifowania igły dla optymalnego kształtu końcówki.
- Szczegółowe kroki przygotowania i realizacji procesu mikroiniekcji.
Główne wyniki
- Udane zademonstrowanie techniki mikroiniekcji zarodków.
- Ulepszona konstrukcja igły doprowadziła do zmniejszenia wycieków cytoplazmy.
- Protokół umożliwia wydajne generowanie transgenicznych Drosophila.
- Zastosowanie ciśnienia powietrza podczas szlifowania poprawiło wydajność igły.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół ułatwia tworzenie transgenicznych muchek.
- Wykorzystanie integrazy phiC31 może usprawnić procesy transgenezy.
- Przyszłe badania mogą budować na tym protokole dla różnych eksperymentów genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Embryo microinjection for transgenesis in Drosophila enables precise genetic manipulation at the organism level, supporting functional genomics and target validation in early discovery. The protocol's optimization, including needle preparation and embryo handling, enhances reproducibility and efficiency, directly impacting the reliability of downstream genetic studies. This capability is foundational for building disease-relevant models and advancing mechanistic de-risking in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional interrogation of gene targets in a whole-organism context.
- Supports mechanistic de-risking by allowing controlled genetic modifications.
- Facilitates generation of transgenic lines for pathway and phenotype studies.
- Improves predictive confidence in target selection through organism-level validation.
Screening & Assay Development
- Provides validated transgenic models for downstream compound screening.
- Standardizes genetic backgrounds, enhancing assay reproducibility.
- Delivers quantitative outputs by enabling consistent transgene integration.
- Prepares robust biological systems for scalable screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Establishes disease-relevant Drosophila models for translational studies.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation.
- Aligns organism-level phenotypes with biomarker development strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of genetic targets into preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This embryo microinjection protocol positions transgenesis as a critical inflection point from early discovery through preclinical model development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via targeted gene integration.
- Screening: Delivers reproducible transgenic lines for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts on transgene expression and organismal phenotypes.
- Translational Research: Bridges genetic manipulation with disease modeling and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated generation of transgenic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across genetic engineering workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets and model systems.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microinjection and embryo handling.
- Demands specialized instrumentation, including microinjectors and needle grinders.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible transgenic line generation.
- Adaptation may be needed for different genetic constructs or Drosophila strains.
- Efficiency depends on precise embryo preparation and needle optimization.
