Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Ogólnym celem tego systemu infekcyjnego opartego na wkładce membranowej jest zbadanie wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza podczas infekcji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie interakcji gospodarz-patogen, takie jak to, w jaki sposób określone wydzielane składniki bakteryjne przyczyniają się do odpowiedzi komórek gospodarza podczas infekcji bakteryjnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie wydzielanych składników bakteryjnych i dokładniej modeluje fizjologicznie istotne środowisko gospodarz-patogen w kontekście infekcji u ludzi.

Procedurę zademonstruje Rebecca Flaherty, starsza doktorantka z mojego laboratorium. Aby przygotować izogeniczne dzikie szczepy paciorkowców grupy A lub GAS i GAS M1T1 5448, rozpocznij nocne hodowle płynów, zaszczepiając od pięciu do 10 mililitrów bulionu Todda Hewitta i inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Odwirować nocne kultury bakterii i użyć pierwotnej objętości świeżej pożywki bakteryjnej do ponownego zawieszenia osadu.

Następnie znormalizuj kultury bakteryjne do równych stężeń początkowych, rozcieńczając ponownie zawieszone kultury w dodatkowym pożywce, aby uzyskać ten sam OD600. Aby zebrać lizaty do przeprowadzenia analizy sygnalizacji i testów oznaczania ATP, umieść komórki HaCaT w sześciodołkowych szalkach o gęstości siedzenia około trzy razy 10 do piątej komórki na studzienkę i hoduj do 90% konfluencji. Aby przeprowadzić testy przepuszczalności błony homodimeru etydyny i uwalniania dehydrogenazy mleczanowej, umieść komórki HaCaT w 24-dołkowych szalkach o gęstości osadzenia około pięć razy 10 do czwartej komórki na studzienkę i osiągnij 90% konfluencji.

Bezpośrednio przed zabiegiem należy użyć 1x PBS do przemycia komórek. Następnie nałóż dwa mililitry świeżej pożywki wzrostowej z lub bez leczenia farmakologicznego na płytki sześciodołkowe lub 0,5 mililitra pożywki na dołki płytek 24-dołkowych. Następnie, pod okapem z przepływem laminarnym, użyj sterylnych kleszczy, aby ostrożnie umieścić sterylną przepuszczalną wkładkę membranową o średnicy 0,4 mikrona w każdej studzience.

Delikatne i sterylne obchodzenie się z przepuszczalnymi wkładkami podczas przygotowywania infekcji ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia uszkodzeniu lub zanieczyszczeniu membrany podczas tego procesu. Zastosuj pożywkę ze świeżych kultur komórkowych do górnej komory każdej studzienki zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie nanieść odpowiednią objętość znormalizowanych kultur bakteryjnych do górnej komory systemu wkładów membranowych przepuszczalnych i nanieść pożywkę bakteryjną do studzienek kontrolnych.

Ostrożne dodawanie bakterii do górnej komory, a także delikatny transport zakażonych komórek do inkubatora mają kluczowe znaczenie, ponieważ ważne jest, aby bakterie nie zanieczyściły dolnej komory podczas konfiguracji eksperymentalnej. Aby ocenić wydzielane białka gospodarza, użyj sterylnych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć przepuszczalną wkładkę błony. Następnie, nie naruszając monowarstwy komórek, zbierz pożywkę z dolnej komory do 1,5-mililitrowych probówek.

Odwiruj próbki w temperaturze 14 000 RCF i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby osadzać resztki komórkowe. Następnie usuń wszystkie oprócz 50 mikrolitrów supernatantu, przenieś do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast zużyj. W celu oceny lizatów komórek gospodarza delikatnie zasysaj pożywkę powyżej monowarstwy, nie naruszając komórek gospodarza.

Następnie użyj PBS, aby raz przepłukać komórki. Delikatnie zassać PBS i natychmiast nałożyć objętość lodowatego buforu do lizy, aby osiągnąć na przykład stężenie białka od 0,5 do 1,5 miligrama na mililitr. Następnie inkubować próbki na lodzie przez 15 minut.

Następnie użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki od powierzchni płytki każdej studzienki i przenieś całą zawartość każdej studzienki do 1,5-mililitrowej probówki. Następnie odwirować próbki w temperaturze 14 000 RCF i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut. Aby ocenić rozpuszczalne składniki listanu, przenieś supernatant do świeżej probówki i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast zużyć.

Aby ocenić jądrowe lub inne nierozpuszczalne składniki lizatu, należy zarezerwować osad i przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast zużyć. Do oceny za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego odessać pożywkę i użyć 1x zimnego PBS do przemycia komórek. Następnie, za pomocą 4% PFA i PBS, napraw komórki przez noc.

Przeprowadzić dalsze analizy zgodnie z protokołem tekstowym. Przedstawione tutaj dane western blot wskazują na znacznie zwiększoną aktywację kinazy p38 MAP i keratynocytów w obecności streptolizyny S lub szczepów gazowych wytwarzających SLS, co wskazuje, że system ten może być wykorzystany do oceny zmian w aktywacji niezależnych od kontaktu białek sygnalizacyjnych gospodarza. Na tym rysunku pokazano zależną od SLS aktywację kluczowego mediatora zapalnego czynnika jądrowego - kappa B, który przemieszcza się z cytoplazmy do jądra po aktywacji, co wskazuje, że system ten można wykorzystać do wizualizacji wpływu wydzielanych czynników bakteryjnych na odpowiedzi białek gospodarza przy użyciu podejść mikroskopii immunofluorescencyjnej.

W tym przypadku wykazano znaczny wzrost zarówno przepuszczalności błony, jak i uwalniania LDH z komórek gospodarza po ekspozycji na szczepy gazów wytwarzające SLS, w porównaniu z komórkami niezakażonymi lub komórkami narażonymi na szczep z niedoborem SLS. Wyniki te wskazują, że system ten może oceniać zależne od toksyn zmiany cytotoksyczności gospodarza. W tym eksperymencie określono poziomy ATP w keratynocytach i odpowiedź na zakażenie gazem.

16 godzin po zakażeniu zaobserwowano znaczne zmniejszenie ATP, a utrata ATP była bardziej wyraźna w obecności SLS, co jest zgodne z zależnym od toksyny wzrostem sygnalizacji odpowiedzi na stres gospodarza i toksyczności. Po ustaleniu technika ta może być wykorzystana do badania specyficznych reakcji dowolnego wydzielanego czynnika mikrobiologicznego na różne typy komórek gospodarza. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ćwiczyć sterylną technikę na wszystkich etapach konfiguracji eksperymentu i zachować ostrożne obchodzenie się z przepuszczalnymi wkładkami membranowymi, zarówno podczas początkowej konfiguracji, jak i podczas pobierania próbki.

Po tej procedurze można przeprowadzić takie metody, jak western blotting, obrazowanie immunofluorescencyjne i testy przepuszczalności błony, w celu określenia, w jaki sposób czynnik bakteryjny będący przedmiotem zainteresowania przyczynia się do zmian w kaskadach sygnałowych i wpływa na ogólną cytotoksyczność podczas infekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbki komórek gospodarza do oceny różnych odpowiedzi komórek gospodarza po ekspozycji na określony wydzielany czynnik bakteryjny. Nie zapominaj, że obchodzenie się z materiałami niebezpiecznymi biologicznie, takimi jak patogeny bakteryjne, wymaga pewnych względów bezpieczeństwa.

Odpowiednie użycie okularów ochronnych, rękawic i fartuchów laboratoryjnych, wraz z prawidłowym użyciem kaptura bezpieczeństwa biologicznego, jest niezbędne do bezpiecznego przeprowadzenia tych eksperymentów.