Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie opartego na komórkach nabłonka splotu naczyniówkowego modelu bariery między ludzką krwią a płynem mózgowo-rdzeniowym. Umożliwienie badania zakażeń bakteryjnych od strony podstawno-bocznej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące chorób zakaźnych ośrodkowego układu nerwowego, takie jak to, jakie procesy są zaangażowane podczas interakcji bakteryjnych z nabłonkiem splotu naczyniówkowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia analizę interakcji patogenów z podstawową boczną czarną stroną komórek nabłonka. Metoda ta może być również zastosowana w innych badaniach, takich jak badanie transmigracji komórek odpornościowych i komórek nowotworowych przez nabłonek splotu naczyniówkowego. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł wykorzystania ludzkiego brodawczaka splotu naczyniówkowego lub komórek HIBCCP do tej metody, kiedy przeczytałem manuskrypt z 2005 roku autorstwa Shibaty et.al.

opisując linię komórkową. Zacznij od użycia sterylnych kleszczyków, aby umieścić wkładki filtracyjne do hodowli komórkowych o powierzchni 0,33 centymetra kwadratowego, z trzema porami o wielkości mikronów do góry nogami w indywidualnych dołkach płytki dwunastomodienowej. Następnie za pomocą pipety serologicznej zalej studzienkę około trzema mililitrami wstępnie podgrzanego podłoża, zasysając dodatkowy roztwór, aż dolna komora zostanie wypełniona.

Następnie dodaj 100 mikrometrów pożywki subkulturowej o temperaturze 37 stopni, uzupełnionej dziesięcioprocentowym FCS na wierzchu filtra. Podczas dodawania pożywki bardzo ważne jest, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, ponieważ pęcherzyki uniemożliwią wystarczające nakarmienie komórek. Po dodaniu pożywki do wszystkich wkładek, przykryj płytkę i przenieś wkładki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza o pięcioprocentowej stężeniu CO2.

Teraz umyj kolbę komórek HIBCPP dziesięcioma mililitrami PVS, dwa razy z wirowaniem. Po drugim płukaniu dodaj trzy mililitry 0,25% tripsyn EDTA do komórek i zakręć kolbą. Następnie inkubuj komórki przez około dwadzieścia minut.

Pod koniec inkubacji potwierdzić, że komórki podniosły się z dna kolby i mają okrągły kształt. Komórki nie odłączają się całkowicie od siebie i często znajdują się w aglomeratach. Ponownie zawiesić kulturę za pomocą 17 mililitrów pożywki, aby zatrzymać reakcję i przenieść zawiesinę do 50-mililitrowej probówki.

Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w odpowiedniej objętości podłoża do liczenia. Następnie rozcieńczyć komórki do stężenia jeden razy dziesięć do szóstych komórek na mililitr i odwrócić probówkę, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie dodaj 80 mikrolitrów komórek do górnej części każdego wkładu filtrującego.

Gdy wszystkie wkładki zostaną wysiane, przykryj płytkę i włóż ją z powrotem do inkubatora w celu przeprowadzenia hodowli przez noc. Następnego dnia dodaj jeden mililitr pożywki do każdego dołka na 24-dołkowej płytce. Następnie, za pomocą kleszczy, podnieś każdą wkładkę i wyrzuć pożywkę do środka, umieszczając wkładki prawą stroną do góry w poszczególnych dołkach płytki 24-dołkowej.

Gdy wkłady filtracyjne zostaną przewrócone z płytki 12-dołkowej do płytki 24-dołkowej, należy uważać, aby nie dotknąć membrany filtra, gdy komórki rosną na górze. Napełnij wkładki 0,5 mililitra świeżej pożywki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora. Co dwa dni przenosić wkładki do nowej płytki 24-dołkowej ze świeżą pożywką, wymieniając w ten sposób pożywkę w górnej komorze.

Aby zmierzyć przeznabłonkowy opór elektryczny lub TEER komórek, najpierw zanurz końcówki elektrod woltomierza tkanki nabłonkowej w 80 procentach etanolu. Po 15 minutach wyjmij elektrodę z etanolu, aby elektroda wyschła. Następnie umieść końcówki w porcji subkultury na kolejne 15 minut.

Gdy elektroda się zrównoważy, ustaw dłuższe ramię tak, aby dotykało dna dolnej komory jednego dołka płytki do hodowli komórek, a krótsze ramię tak, aby sięgało do komory wkładu filtra. Zmierz wartości rezystancji wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych w pożywce bez komórek, aby uzyskać wartości ślepej próby. Następnie zmierz TEER każdej z założonych wkładek.

Po odmierzeniu umieść elektrodę z powrotem w 80-procentowym etanolu na 15 minut, a następnie przechowuj w suchej probówce. Gdy wartości TEER wkładek z nasionami HIBCPP przekroczą 70 omów na centymetr kwadratowy, należy odnowić pożywkę za pomocą świeżej pożywki z dodatkiem pięciu mikrogramów na mililitr insuliny i jednego procenta FCS i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek na noc. Aby określić przepuszczalność parakomórkową kultur inkubowanych, dodaj 50 mikrogramów na mililitr świeżo przygotowanej inuliny FITC w świeżej pożywce o niskiej zawartości surowicy do górnej komory filtracyjnej każdej wkładki i włóż komórki z powrotem do inkubatora.

Gdy hodowle osiągną TEER około 500 omów na centymetr kwadratowy, należy zainfekować komórki zawiesiną bakteryjną będącą przedmiotem zainteresowania przy wielokrotności infekcji wynoszącej dziesięć i zwrócić komórki do inkubatora na odpowiedni okres hodowli. Następnie umyj komórki trzykrotnie, przenosząc filtr do nowej studzienki z jednym mililitrem pożywki bez surowicy. Za każdym razem umieszczaj pożywkę w komorze filtra z 500 mikrolitrami tego samego podłoża, na koniec określ stężenie inuliny, która przeszła z komory filtra przez warstwę komórkową po infekcji bakteryjnej, pobierając próbki pożywki z dolnej studzienki każdej wkładki filtracyjnej do hodowli komórkowej i mierząc wszystkie próbki w czytniku mikropłytek w porównaniu z dziesięcioma i dwoma standardowymi rozcieńczeniami FITC-inulina.

Komórki HIBCCP wykazują specyficzne funkcje barierowe, które umożliwiają im ograniczenie wymiany molekularnej w niewielkim stopniu. Na przykład analizy immunofluorescencyjne złącza typu związanego z białkiem, ZO-1, Okludyną i Klaudyną-1, ujawniają nieprzerwany sygnał w miejscach kontaktu między komórkami. Ilustrowanie wzajemnych powiązań komórek za pomocą ciągłych pasm ścisłych połączeń.

Hodowane w odpowiednich warunkach komórki HIBCPP wykazują wysoki potencjał błonowy, który osiąga do około 500 omów na centymetr kwadratowy bez leczenia, zachowując typowe funkcje barierowe bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, takie jak tworzenie potencjału błonowego, a także niską przepuszczalność dla makrocząsteczek. Jednak wraz ze wzrostem stężenia DMSO, wartości TEER zmniejszają się w sposób zależny od dawki, przy czym podobny znaczący spadek wartości TEER obserwuje się po leczeniu cytochalazyną D. Co więcej, dodanie dwóch procent objętościowych DMSO, czyli cytochalazyny D, powoduje odpowiedni znaczny wzrost przepuszczalności strumienia FITC-inuliny.

Ponadto infekcja bakteryjna komórek HIBCCP powoduje znaczną inwazję warstwy komórkowej przez dwa chorobotwórcze szczepy bakterii. MC58 i jego mutant z niedoborem kapsułek. Podczas gdy w przypadku patogennego szczepu alfa 14 obserwuje się tylko niewielką inwazję.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dotykać membrany filtracyjnej po wysianiu komórek, ponieważ nienaruszona warstwa HIBCCP zostanie przerwana przez kontakt. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak testy transmigracji in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów migracji komórek immunologicznych i nowotworowych przez komórki nabłonka splotu naczyniówkowego. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się farmakologią do zbadania przenoszenia substratów przez nabłonek splotu naczyniówkowego in vitro.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować oparty na komórkach HIBCCP model bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do podstawnego bocznego zakażenia patogenami. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak praca pod odpowiednim kapturem ochronnym.