Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie modelu bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy człowieka w oparciu o komórki nabłonka splotu naczyniówkowego. Umożliwia to badanie infekcji bakteryjnych z strony podstawno-bocznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób zakaźnych ośrodkowego układu nerwowego, takie jak procesy uczestniczące w oddziaływaniach bakterii z nabłonkiem splotu naczyniówkowego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na analizę oddziaływań patogenów z bazolateralną stroną komórek nabłonkowych. Metodę tę można zastosować również w innych badaniach, takich jak analiza transmigracji komórek odpornościowych oraz komórek nowotworowych przez nabłonek splotu naczyniowego.

opisującego linię komórkową. Rozpocznij od użycia sterylnej pincety do umieszczenia wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych o powierzchni wzrostu 0,33 cm² i porach o rozmiarze 3 µm dnem do góry w poszczególnych dołkach płytki 12-dołkowej. Następnie, za pomocą pipety serologicznej, zalej dołek około 3 ml podgrzanego medium, odsysając nadmiar roztworu, aż dolna komora zostanie dokładnie wypełniona.

Następnie dodaj 100 µm podłoża do pasażowania o temperaturze 37°C uzupełnionego o 10% FCS na powierzchnię filtra. Podczas dodawania podłoża bardzo ważne jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uniemożliwić odpowiednie odżywienie komórek. Po dodaniu podłoża do wszystkich wkładek, przykryj płytkę i przenieś wkładki do inkubatora z 5% CO2 w temperaturze 37°C.

Następnie przemyj kolbę z komórkami HIBCPP dziesięcioma mililitrami PVS, dwukrotnie, delikatnie obracając kolbą. Po drugim płukaniu dodaj do komórek trzy mililitry 0,25 procent tripsyny EDTA i zamieszaj zawartość kolby. Następnie inkubuj komórki przez około dwadzieścia minut.

Po zakończeniu inkubacji należy potwierdzić, że komórki oddzieliły się od dna kolby i mają okrągły kształt. Komórki nie odrywają się całkowicie od siebie i często występują w postaci aglomeratów. Kulturę należy resuspender w 17 mililitrach pożywki, aby zatrzymać reakcję, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 mililitrów.

Następnie odwiruj komórki i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki w celu policzenia. Następnie rozcieńcz komórki do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml i odwróć probówkę, aby równomiernie rozdzielić komórki. Po tym dodaj 80 µL komórek na górną część każdego wkładu filtra.

Po zasianiu wszystkich wkładów należy przykryć płytkę i przenieść ją do inkubatora w celu hodowli przez noc. Następnego dnia do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy dodać jeden mililiter pożywki. Następnie, używając pęsety, należy podnieść każdy wkład i usunąć z niego pożywkę, a następnie umieścić wkłady stroną górną do góry w poszczególnych dołkach płytki 24-dołkowej.

Podczas przekładania wkładów z płytki 12-dołkowej do płytki 24-dołkowej należy uważać, aby nie dotykać membrany filtra, na której rosną komórki. Napełnić wkłady 0,5 milliliters świeżej pożywki i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Co dwa dni przenosić wkłady do nowej płytki 24-dołkowej ze świeżą pożywką, wymieniając w ten sposób pożywkę w komorze górnej.

Aby zmierzyć transepitelialną oporność elektryczną (TEER) komórek, należy najpierw zanurzyć końcówki elektrod woltomierza do tkanek nabłonkowych w 80% etanolu. Po 15 minutach wyjmij elektrodę z etanolu i pozostaw ją do wyschnięcia. Następnie umieść końcówki w porcji pożywki do subkultury na kolejne 15 minut.

Po ustabilizowaniu się elektrody należy ustawić dłuższe ramię tak, aby dotykało dna dolnej komory jednej studni płytki do hodowli komórkowej, a krótsze ramię tak, aby sięgało do komory z wkładką filtracyjną. Następnie należy zmierzyć wartości oporności wkładki filtracyjnej w medium bez komórek w celu uzyskania wartości tła. Następnie należy zmierzyć TEER dla każdej z zasianych wkładek.

Po dokonaniu pomiaru należy umieścić elektrodę z powrotem w 80% etanolu na 15 minut, a następnie przechowywać w suchej probówce. Gdy wartości TEER dla insertów z wysianymi komórkami HIBCPP przekroczą 70 ohms/cm², należy wymienić medium na świeże medium hodowlane uzupełnione o 5 µg/mL insuliny i 1% FCS, a następnie pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc. Aby określić przepuszczalność parakomórkową kultur na insertach, należy dodać 50 µg/mL świeżo przygotowanej FITC-inuliny w świeżym medium hodowlanym z niską zawartością surowicy do górnej komory filtra każdego insertu, a następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora.

Gdy hodowle osiągną wartość TEER wynoszącą około 500 ohms per centimeter squared, zainfekuj komórki odpowiednią zawiesiną bakteryjną przy wielokrotności infekcji wynoszącej dziesięć i przenieś komórki do inkubatora na odpowiedni czas hodowli. Następnie przemyj komórki trzykrotnie, przenosząc filtr do nowej studni zawierającej 1 mL medium bezsurowiczego. Za każdym razem dozuj do komory filtra 500 µL tego samego medium. Na koniec określ stężenie inuliny, która przeniknęła z komory filtra przez warstwę komórek po infekcji bakteryjnej, pobierając próbki medium z dolnej studni każdego wkładu filtra z hodowlą komórkową i mierząc wszystkie próbki w czytniku mikropłytek w odniesieniu do dziesięciu rozcieńczeń wzorca FITC-inuliny w stosunkach jeden i dwa.

Komórki HIBCCP wykazują specyficzne funkcje barierowe, które pozwalają im w umiarkowanym stopniu ograniczać wymianę molekularną. Na przykład analizy immunofluorescencyjne białek związanych z połączeniami ścisłymi, takich jak ZO-1, okludyna i claudyna-1, wykazują nieprzerwany sygnał w miejscach kontaktu międzykomórkowego. Ilustruje to powiązanie komórek za pomocą ciągłych pasm połączeń ścisłych.

W odpowiednich warunkach hodowli komórki HIBCPP wykazują wysoki potencjał błonowy, który bez dodatkowej obróbki osiąga około 500 Ω/cm², utrzymując typowe funkcje barierowe bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, takie jak tworzenie potencjału błonowego oraz niska przepuszczalność dla makromolekuł. Jednak wraz ze stosowaniem zwiększających się stężeń DMSO wartości TEER spadają w sposób zależny od dawki, przy czym podobny znaczący spadek wartości TEER obserwuje się po zastosowaniu cytochalasyny D. Co więcej, dodatek 2% obj. DMSO lub cytochalasyny D powoduje odpowiadający temu istotny wzrost przepuszczalności dla strumienia inuliny FITC.

Ponadto zakażenie bakteryjne komórek HIBCCP skutkuje znaczną inwazją warstwy komórkowej przez dwa patogenne szczepy bakterii: MC58 oraz jego mutanta pozbawionego kapsuły. W przypadku apatogennego szczepu alpha 14 obserwuje się jedynie niewielką inwazję.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dotykać membrany filtra po wysianiu komórek, ponieważ kontakt ten naruszy nienaruszoną warstwę HIBCCP. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy transmigracji in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów migracji komórek odpornościowych i nowotworowych przez komórki nabłonka splotów naczyniówkowych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny farmakologii do badania transportu substratów przez nabłonek splotów naczyniówkowych in vitro.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przygotowania modelu bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy w oparciu o komórki HIBCCP do infekcji patogenami drogą podstawno-boczną. Proszę pamiętać, że praca z ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca pod odpowiednim dygestorium ochronnym.