Name: Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu nabłonka splotu naczyniówkowego z komórek HIBCPP do badania infekcji bakteryjnych u ludzi. Ta technika umożliwia analizę interakcji patogenów z barierą krew-płyn mózgowo-rdzeniowy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować prof. Hartwigowi Wolburgowi za wykonanie mikroskopii elektronowej.

1. Przygotowanie wkładów filtrujących do hodowli komórkowych do wysiewu komórek HIBCPP w systemie modelu odwróconego
<ol>
	<li>Wstępnie rozgrzany DMEM/F12 (szynka) uzupełniony 5 μg/ml insuliny, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS).</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy umieść do góry nogami wkładki filtrujące do hodowli komórkowych o powierzchni 0.33 cm² o wielkości porów 3 μm w dół na 12-dołkowej płytce (ryc. 1E).</li>
	<li>Wlej pożywkę do dolnej komory wkładu filtrującego do hodowli komórkowych (około 3 ml) i 100 μl na górze wkładu filtrującego. Zalej płytę oraz dolną komorę medium. Zassać nadmiar medium w taki sposób, aby dolna komora wkładu filtracyjnego pozostała wypełniona (Rysunek 1E). 
	Uwaga: Na tym etapie zaleca się użycie pipety serologicznej.</li>
	<li>Przykryć 12-dołkową płytkę pokrywką i przenieść przygotowane wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 aż do dodania komórek.</li>
</ol>
2. Hodowla i pasaż komórek HIBCPP
<ol>
	<li>Przygotować DMEM/F12 (szynka) uzupełnioną 5 μg/ml, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% FCS.</li>
	<li>Wstępnie ogrzane podłoże i PBS w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Odessać pożywkę z kolby. Dodać 10 ml PBS do kolby i zamieszać. Powtórz ten krok raz.</li>
	<li>Dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA do kolby i zamieszać. Umieścić w inkubatorze, 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Po około 20 minutach wyjąć kolbę z inkubatora. Upewnij się, że komórki są odłączone od dna kolby i mają okrągły kształt podczas badania mikroskopem. 
	Uwaga: Komórki nie odłączają się całkowicie od siebie i często znajdują się w aglomeratach. Zaleca się stosowanie ogniw do pasażu 38.</li>
	<li>Aby zatrzymać trypsynizację, dodaj 17 ml pożywki. Zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml. Wirować przy 50 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. 
	Uwaga: Stężenie zawieszonych komórek HIBCPP powinno wynosić 1 x 106 komórek/ml. W celu utrzymania komórek HIBCPP sugeruje się przeniesienie ilości 1-6 x 106 komórek w 10 ml pożywki do kolby T75. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
</ol>
3. Zakładanie wkładów filtracyjnych do hodowli odwróconych komórek za pomocą komórek HIBCPP
<ol>
	<li>Na wierzch każdego odwróconego wkładu filtracyjnego (tj. dolną stronę filtra) dodać 80 μl zawiesiny komórek (tj. 8 x 104 komórek) (Rysunek 1E). 
	Uwaga: Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w zawiesinie, odwracając rurkę przed siewem.</li>
	<li>Przykryć wkłady filtracyjne do hodowli komórek nasiennych pokrywką płytki 12-dołkowej i przenieść do inkubatora w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Pierwszego dnia wlać 1 ml pożywki do dołków 24-dołkowej płytki. Za pomocą kleszczy wyjmij wkłady filtracyjne do hodowli komórkowych z płytki 12-dołkowej, wyrzuć pożywkę do środka, obróć wkłady filtracyjne i umieść je w standardowej orientacji na przygotowanej płytce 24-dołkowej (rysunek 1E).</li>
	<li>Umieszczaj komórki w świeżej pożywce co drugi dzień. Przygotuj 24-dołkowe ze świeżą pożywką i przenieś do niej wkłady filtracyjne. Napełnij wkładki 0,5 ml świeżej pożywki. Sprawdzaj TEER codziennie, jak opisano w punkcie 4.</li>
	<li>Gdy wartości TEER komórek nasiennych HIBCPP na wkładkach do hodowli komórkowych przekraczają 70 Ω x cm² (około 4 dni po wysiewie), należy kontynuować hodowlę komórkową w pożywce zawierającej 1% FCS i 5 μg/ml insuliny. Przygotować płytki 24-dołkowe z 1 ml pożywki na każdą studzienkę. Przenieść wkłady filtracyjne do przygotowanych studzienek i wymienić pożywkę w górnej komorze. 
	Uwaga: To wycofanie surowicy po konfluencji prowadzi do powstania wyższego potencjału błonowego.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komory filtra, przenieść do przygotowanej studzienki i napełnić 500 μl pożywki. Powtórz ten krok raz. Umieścić komórki na noc w inkubatorze, 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER)
<ol>
	<li>Zanurz końcówki elektrod woltoomomierza tkanki nabłonkowej na 15 minut w 80% etanolu. Przenieś woltoomomierz pod maskę i pozwól elektrodzie wyschnąć na chwilę. Umieść elektrodę w odpowiedniej pożywce hodowlanej używanej do komórek na kolejne 15 minut, aby zrównoważyć.</li>
	<li>Pomiary należy wykonywać, ustawiając dłuższe ramię elektrody tak, aby za każdym razem dotykało dna dolnej komory, krótsze ramię należy umieścić w komorze wkładu filtra. 
	Uwaga: Wartości rezystancji wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych bez komórek w pożywce należy stosować jako wartości ślepe ((wartość zmierzona (Ω) – wartość ślepej próby (Ω)) x powierzchnia filtra (tj. 0,33 cm²)).</li>
	<li>Po zmierzeniu umieść elektrodę z powrotem w 80% etanolu na 15 minut. Przechowywać w suchej probówce.</li>
</ol>
5. Oznaczanie przepuszczalności parakomórkowej
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 g FITC-Inuliny w 200 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 5 μg/ml insuliny 1% FCS. Nałożyć 50 μg/ml roztworu do górnej komory filtra przed zakażeniem komórek.</li>
	<li>Po infekcji należy pobrać próbki pożywki z dolnej studzienki, aby określić, ile inuliny przeszło z komory filtra przez warstwę komórkową.</li>
	<li>Przygotować roztwór wzorcowy FITC-Inulina i wykonać rozcieńczenia 1:2 10 razy (100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,13%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, 0,2% i 0%). Określić fluorescencję, mierząc wszystkie próbki w czytniku mikropłytek.</li>
</ol>
6. Przygotowanie bakterii do infekcji komórek HIBCPP na wkładach filtracyjnych do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Na dzień przed eksperymentem zeskrob zamrożone szczepy N. meningitidis z wywaru glicerolowego i rozprowadź na agarze czekoladowym z Vitoxem. Uprawiać przez noc w inkubatorze, w temperaturze 37 °C, z 5% CO2 .</li>
	<li>Wyekstrahuj 20-30 kolonii z nocnej hodowli i przenieś do probówki zawierającej 8 ml pożywki z peptonem proteozy uzupełnionej 0,042% NaHCO3, 0,01 M MgCl2 i 1% Polyvitex.</li>
	<li>Potrząsać bakteriami przez 1,25 godziny przy 220 obr./min, 37 °C. Bakterie osadzać przez odwirowanie z prędkością 2,684 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny za pomocą 8 ml pożywki niezawierającej surowicy. Vortex, aby zapewnić równomierne zawieszenie.</li>
	<li>Aby określić gęstość hodowli, należy zmierzyć rozcieńczenie 1:10 przy gęstości optycznej (OD) 600 nm. Dostosuj zawiesinę bakteryjną do OD600 0.1. 
	Uwaga: Ta zawiesina zawiera ok. 1 x 108 jtk/ml.</li>
	<li>Aby potwierdzić stężenie komórek bakteryjnych, rozcieńczać zawiesinę stopniowo (1:10) do rozcieńczenia 10-5 i ułożyć na płytkach z agarem czekoladowym. 
	Uwaga: Podobne seryjne rozcieńczenia należy wykonać, aby obliczyć krzywe wzrostu bakterii.</li>
</ol>
7. Zakażenie komórek HIBCPP na wkładach filtrujących do hodowli komórkowych i oznaczanie inwazji bakteryjnej przez podwójną immunofluorescencję
<ol>
	<li>Po kontynuowaniu hodowli komórkowej w pożywce zawierającej 1% FCS i 5 μg/ml insuliny, należy codziennie mierzyć komórki za pomocą woltoomomierza tkanki nabłonkowej. Jeśli komórki osiągnęły TEER około 500 Ω x cm², przeprowadź infekcję.</li>
	<li>Zainfekuj komórki przygotowaną zawiesiną bakteryjną przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10. Przechowywać zakażone komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i stężeniu 5% CO2 przez wskazany okres czasu. 
	Uwaga: MOI można obliczyć, biorąc pod uwagę liczbę komórek na wkład filtra do hodowli komórkowej w momencie zbiegu (1,21 x 106 komórek/cm2).</li>
	<li>Zatrzymać infekcję, przemywając ją trzykrotnie 500 μl pożywki bez surowicy (SFM) zawierającej 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) nałożonej do komory filtra, 1 ml do dolnej komory.</li>
	<li>Blok z 500 μl SFM zawierającym 1% buforu BSA w komorze filtra i 1 ml w dolnej komorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby zapobiec przyleganiu przeciwciał do niespecyficznych miejsc wiązania.</li>
	<li>Inkubować ze 100 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty N. meningtidis α-OMP (1:200) w komorze filtra i 500 μl w dolnej komorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.</li>
	<li>Przepłukać komórki, zasysając pożywkę z komory filtra, przenieść wkład filtra do przygotowanego dołka z 1 ml SFM zawierającego 1% BSA i napełnić opróżnioną komorę filtra 500 μl SFM zawierającej 1% BSA. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Utrwal komórki z 500 μl 4% formaldehydu w komorze filtra, 1 ml w dolnej komorze na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć komórki, odsysając pożywkę z komory filtra, przenieść wkład filtracyjny do przygotowanego dołka z 1 ml PBS i napełnić opróżnioną komorę filtra 500 μl PBS. Powtórz ten krok raz. 
	Uwaga: Próbki można przechowywać przez noc w PBS w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Z wkładek wyciąć filtry do hodowli komórkowych i przemyć 250 μl PBS zawierającego 1% BSA. Inkubować komórki przez 15 minut w temperaturze pokojowej z 250 μl znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 594 nm) wtórnym przeciwciałem przeciwko królikowi z kurczaka (1:500) w celu barwienia bakterii zewnątrzkomórkowych. 
	Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 250 μl PBS zawierającego 1% BSA i 0,5% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA.</li>
	<li>Inkubować z 250 μl pierwszorzędowego przeciwciała anty N. meningitidis α-OMP (1:200) przez 30 minut w celu wybarwienia bakterii zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA.</li>
	<li>Zastosuj 250 μl znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 488 nm) przeciwciała wtórnego (1:500), znakowanego fluorescencyjnie (długość fali wzbudzenia 660 nm) falloidyny (1:250) i dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (1:50 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w celu barwienia bakterii zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych, cytoszkieletu aktynowego i jąder. 
	Uwaga: W razie potrzeby należy miareczkować stężenie przeciwciał.</li>
	<li>Umyć komórki trzykrotnie 250 μl PBS zawierającego 1% BSA. Umieścić komórki w pożywce montażowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu badania pod mikroskopem.</li>
	<li>Określ liczbę zaatakowanych bakterii na wstępnie zdefiniowane pole. W tym celu należy policzyć 20 pól na membranę filtracyjną. Oblicz procent zaatakowanych bakterii. 
	Uwaga: Pomnóż średnią liczbę bakterii w 20 mikroskopijnych polach przez współczynnik powierzchni. Wynik wyraża całkowitą ilość bakterii obecnych we wkładzie filtrującym do hodowli komórkowych o powierzchni 0,33 cm². Podziel tę wartość przez ilość bakterii wyhodowanych w pożywce w czasie trwania infekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Abott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37, 13-25 (2009).</li>
<li>Wolburg, H., Paulus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 75-88 (2010).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Imunopathol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Semin Imunopathol. 31, 497-511 (2009).</li>
<li>Ishiwata, I., Ishiwata, C., Ishiwata, E., Sato, Y., Kiguchi, K., Tachibana, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+malignant+choroid+plexus+papilloma+cell+line+%28HIBCPP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human malignant choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP).</a> Hum Cell. 18, 67-72 (2005).</li>
<li>Schwerk, C., Papandreou, T., Schuhmann, D., Nickol, L., Borkowski, J., Steinmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+invasion+and+translocation+of+Neisseria+meningitidis+and+Streptococcus+suis+in+anovel+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in anovel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> PloS One. 7, e30069(2012).</li>
<li>Bernd, A., Ott, M., Ishikawa, H., Schroten, H., Schwerk, C., Fricker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+efflux+transport+proteins+of+the+human+choroid+plecus+papilloma+cell+line+HIBCPP%2C+a+functional+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plecus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Pharm Res. , (2014).</li>
<li>Gründler, T., Quednau, N., Stump, C., Orian-Rousseau, V., Ishikawa, H., Wolburg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li>
<li>Schwerk, C., Tenenbaum, T., Kwang, S. K., Schroten, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+-+a+multi-role+player+during+infectious+diseases+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus - a multi-role player during infectious diseases of the CNS.</a> Front Cell Neurosci. 9, 80(2015).</li>
<li>Pron, B., Taha, M. K., Rambaud, C., Fournet, J. C., Pattey, N., Monnet, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Neisseria+meningtidis+with+the+components+of+the+blood-brain+barrier+correlates+with+increased+expression+of+PilC%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interaction of Neisseria meningtidis with the components of the blood-brain barrier correlates with increased expression of PilC.</a> J Infect Dis. 176, 1285-1292 (1997).</li>
<li>Guarner, J., Greer, P. W., Whitney, A., Shieh, W. J., Fischer, M., White, E. H., Carlone, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+diagnosis+of+human+meningococcal+disease+using+immunohistochemical+and+PCR+assays+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and diagnosis of human meningococcal disease using immunohistochemical and PCR assays assays.</a> Am J Clin Pathol. 122, 754-764 (2004).</li>
<li>Pizarro-Cerda, J., Kuhbacher, A., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+of+Listeria+monocytogenes+in+mammalian+epithelial+cells%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Entry of Listeria monocytogenes in mammalian epithelial cells: an updated view.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, (2012).</li>
<li>Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe+sensing%2C+positive+feedback+loops+and+the+pathogenesis+of+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Microbe sensing, positive feedback loops and the pathogenesis of inflammatory diseases.</a> Immunol. Rev. 227, 248-263 (2009).</li>
<li>Wilson, E. H., Weninger, W., Hunter, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+immune+cells+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Trafficking of immune cells in the central nervous system.</a> J Clin Invest. 120, 1368-1379 (2010).</li>
<li>Meeker, R. B., Williams, K., Killebrew, D. A., Hudson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+trafficking+through+the+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Cell trafficking through the choroid plexus.</a> Cell Adh Migr. 6, 390-396 (2012).</li>
<li>Borkowski, J., Li, L., Steinmann, U., Quednau, N., Stump-Guthier, C., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+elicits+a+pro-inflammatory+response+involving+I+kappa+B+zeta+in+a+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving I kappa B zeta in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model.</a> J Neuroinflammation. 11, 163(2014).</li>
<li>Steinmann, U., Borkowski, J., Wolburg, H., Schroppel, B., Findeisen, P., Weiss, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmigration+of+polymorphnuclear+neutrophils+and+monocytes+through+the+human+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+after+bacterial+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Transmigration of polymorphnuclear neutrophils and monocytes through the human blood-cerebrospinal fluid barrier after bacterial infection in vitro.</a> J Neuroinflammation. 10, 30(2013).</li>
<li>McGuiness, B. T., Clarke, I. N., Lambden, P. R., Barlow, A. K., Poolman, J. T., Heckels, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point+mutation+in+meningococcal+por+A+gene+associated+with+increased+endemic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Point mutation in meningococcal por A gene associated with increased endemic disease.</a> Lancet. 337, 514-517 (1991).</li>
<li>Ram, S., Cox, A. D., Wright, J. C., Vogel, U., Getzlaff, S., Boden, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisserial+lipopolysaccharide+is+a+target+for+complement+component+C4b.+inner+core+phosphoethanolamine+residues+define+C4b+linkage+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neisserial lipopolysaccharide is a target for complement component C4b. inner core phosphoethanolamine residues define C4b linkage specificity.</a> J Biol Chem. 278, 50853-50862 (2003).</li>
<li>Claus, H., Maiden, M. C., Maag, R., Frosch, M., Vogel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+carried+meningococci+lack+the+genes+required+for+capsule+synthesis+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Many carried meningococci lack the genes required for capsule synthesis and transport.</a> Microbiology. 148, 1813-1819 (2002).</li>
<li>Claus, H., Maiden, M. C., Wilson, D. J., Mccarthy, N. D., Jolley, K. A., Urwin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+meningococci+carried+by+children+and+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of meningococci carried by children and young adults.</a> J Infect Dis. 191, 1263-1271 (2005).</li>
<li>Tenenbaum, T., Papandreou, T., Gellrich, D., Friedrichs, U., Seibt, A., Adam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+bacterial+invasion+and+translocation+of+Streptococcus+suis+across+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro.</a> Cell Microbiol. 11, 323-336 (2009).</li>
<li>Laflamme, N., Echchannaoui, H., Landmann, R., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+toll-like+receptor+2+and+4+in+the+brain+of+mice+challenged+with+cell+wall+components+derived+from+gram-negative+and+gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cooperation between toll-like receptor 2 and 4 in the brain of mice challenged with cell wall components derived from gram-negative and gram-positive bacteria.</a> Eur J Immunol. 33, 1127-1138 (2003).</li>
<li>Laflamme, S., Rivest, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4%3A+the+missing+link+of+the+cerebral+innate+immune+response+triggered+by+circulating+gram-negative+bacterial+cell+wall+components%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4: the missing link of the cerebral innate immune response triggered by circulating gram-negative bacterial cell wall components.</a> FASEB J. 15, 155-163 (2001).</li>
<li>Zughaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+meningitidis+capsular+polysaccharides+indice+inflammatory+responses+via+TLR2+and+TLR4-MD-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Neisseria meningitidis capsular polysaccharides indice inflammatory responses via TLR2 and TLR4-MD-2.</a> J Leukoc Biol. 89, 469-480 (2011).</li>
<li>Yamamoto, M., Yamazaki, S., Uematsu, S., Sato, S., Hemmi, M., Hoshino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Toll%2FIL-1-receptor+-mediated+gene+expression+by+the+inducible+nuclear+protein+IkappaBzeta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of Toll/IL-1-receptor -mediated gene expression by the inducible nuclear protein IkappaBzeta.</a> Nature. 430, 218-222 (2004).</li>
<li>Lorenz, J., Zahlten, J., Pollok, I., Lippmann, J., Scharf, S., N'Guessan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pheumophila-induced+IkappaBzeta-dependent+expression+of+interleukin-6+in+lung+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Legionella pheumophila-induced IkappaBzeta-dependent expression of interleukin-6 in lung epithelium.</a> Eur Respir J. 37, 648-657 (2011).</li>
<li>Jaerve, A., Muller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+in+CNS+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Chemokines in CNS injury and repair.</a> Cell Tissue Res. 349, 229-248 (2012).</li>
<li>Schneider, H., Weber, C. E., Schoeller, J., Steinmann, U., Borkowski, J., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+T-cells+after+infection+of+human+choroid+plexus+papilloma+cells+with+Echovirus+30+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of T-cells after infection of human choroid plexus papilloma cells with Echovirus 30 in an in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Virus Res. 170, 66-74 (2012).</li>
<li>Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choroid+plexus%3A+Target+for+polypeptides+and+site+of+their+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Choroid plexus: Target for polypeptides and site of their synthesis.</a> Microsc. Res. Tech. 52, 65-82 (2001).</li>
<li>Dickson, P. W., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+messenger+RNA+for+transthyretin+%28prealbumin%29+in+human+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">High levels of messenger RNA for transthyretin (prealbumin) in human choroid plexus.</a> Neurosci. Lett. 66, 311-315 (1986).</li>
<li>Stylianopoulou, F., Herbert, J., Soares, M. B., Efstratiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+insulin-like+growth+factor+II+gene+in+the+choroid+plexus+and+the+leptomeninges+of+the+adult+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of the insulin-like growth factor II gene in the choroid plexus and the leptomeninges of the adult rat central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 85, 141-145 (1988).</li>
<li>Lim, L., Zhou, H., Costa, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+winged+helix+transcription+factor+HFH-4+is+expressed+during+choroid+plexus+epithelial+development+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The winged helix transcription factor HFH-4 is expressed during choroid plexus epithelial development in the mouse embryo.</a> Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94, 3094-3099 (1997).</li>
<li>Vandenhaute, E., Stump-Guthier, C., Lasierra Losada, M., Tenenbaum, T., Rudolph, H., Ishikawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+choroid+plexus+may+be+an+underestimated+site+of+tumor+invasion+to+the+brain%3A+an+in+vitro+study+using+neuroblastoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">The choroid plexus may be an underestimated site of tumor invasion to the brain: an in vitro study using neuroblastoma cell lines.</a> Cancer Cell Int. , 15-102 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki nabłonkowe CP tworzą BCSFB, który oddziela płyn mózgowo-rdzeniowy od krwi2,3. Niedawno ustaliliśmy, że linia komórkowa HIBCPP jest funkcjonalnym ludzkim modelem BCSFB. Komórki wykazują ważne funkcje barierowe BCSFB in vitro, w tym rozwój wysokiego potencjału błonowego, niską przepuszczalność dla makrocząsteczek, a także obecność ciągłych nici TJs5. Białka TJ przyczyniają się do wierzchołkowej/podstawno-bocznej polaryzacji komórek. Polaryzacja ma duże znaczenie dla ukierunkowanej lok...

Bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB) jest jednym z trzech miejsc barierowych między krwią a mózgiem1. Jego morfologicznym korelatem są komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP)2,3, spirali śródbłonkowo-nabłonkowej, która jest silnie unaczyniona i zlokalizowana w komorach mózgu. CP służy do produkcji płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), a także do oddzielenia tego ostatniego od krwi. Aby osiągnąć funkcję barierową, komórki nabłonkowe CP wykazują niską aktywność pinocytotyczną, wyrażają specyficzne transportery i są gęsto połączone ciągłą siecią połączeń ścisłych (TJ)2,3.
Ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP), pochodzące ze złośliwego brodawczaka splotu naczyniówkowegoJaponki 4, zostały użyte do skonstruowania funkcjonalnego modelu BCSFB in vitro. Komórki HIBCPP wykazują kilka cech funkcjonalnego BCSFB, takich jak tworzenie nici TJ, rozwój wysokiego potencjału błony przeznabłonkowej, który można określić jako transnabłonkowy opór elektryczny (TEER) oraz niewielka przepuszczalność makrocząsteczek. Ponadto komórki HIBCPP wykazują ekspresję charakterystycznych transporterów, które mogą służyć do regulacji mikrośrodowiska jonowego i wykazują polaryzację wierzchołkową/podstawno-boczną5,6,7.
Wykazano, że BCSFB funkcjonuje jako miejsce wejścia patogenów (bakterii, wirusów i grzybów) do ośrodkowego układu nerwowego (OUN)8. Inwazja patogenów, w tym Neisseria meningitidis (N. meningitidis), bakterii Gram-ujemnej, może powodować poważne choroby, takie jak zapalenie opon mózgowych. Dowody na to, że pokonuje ochronną barierę nabłonkową CP, są poparte obserwacjami histopatologicznymi u pacjentów z chorobą meningokokową wykazujących zwiększoną ilość meningokoków w naczyniach i komórkach nabłonka CP9,10. Aby dostać się do komórek gospodarza, bakterie często przejmują mechanizmy endocytotyczne, w których pośredniczą lub wyzwalają określone receptory powierzchniowe znajdujące się na komórkach gospodarza. Ponieważ interakcje patogenów z tymi receptorami mogą być specyficzne dla danego gatunku11, z modeli zwierzęcych można korzystać tylko w ograniczonym zakresie. Linia komórkowa HIBCPP daje możliwość zbadania procesu inwazji, a także mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ludzkiego systemu modelowego. Zastosowanie wkładek do hodowli komórkowych umożliwia nam analizę interakcji patogenów z komórkami gospodarza z dwóch różnych stron komórek. Wiele bakterii, w tym N. meningitidis, jest silnie narażonych na wpływ grawitacji podczas testów infekcji. W celu optymalnej interakcji patogenów z komórkami HIBCPP podczas testów, bakterie są początkowo dodawane do górnej komory systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych. Aby umożliwić infekcję odpowiednio od strony komórki wierzchołkowej lub podstawno-bocznej, ustalono dwie wersje systemu in vitro: W standardowym systemie komórki HIBCPP są wysiewane do górnej komory wkładu filtrującego, naśladując sytuację, w której mikroorganizmy znajdują się po stronie płynu mózgowo-rdzeniowego i wchodzą w kontakt ze stroną wierzchołkową komórek (Figura 1A, W przeciwieństwie do tego, użycie komórek HIBCPP w systemie wkładek filtrujących do odwróconych kultur komórkowych odzwierciedla warunki, w których bakterie dostały się do krwiobiegu. Mikroorganizmy rozprzestrzeniają się we krwi i napotykają komórki nabłonka CP od strony podstawno-bocznej (ryc. 1B, D). Warto zauważyć, że w tym układzie modelowym wykazano, że bakterie atakują komórki HIBCPP w sposób polarny, szczególnie od strony komórki podstawno-bocznej5,7.
Po zakażeniu CP, zaatakowane patogeny mogą być rozpoznane przez wrodzony układ odpornościowy poprzez ligację do receptorów rozpoznawania wzorców (PRR). Dobrze opisani członkowie receptorów Toll-like (TLR) należą do rodziny receptorów Toll-like (TLR). TLR mogą wiązać się z charakterystycznymi strukturami zakaźnych mikroorganizmów, które są nazywane wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP). Ligacja receptorów prowadzi do aktywacji kaskad sygnalizacyjnych komórek gospodarza, które wyzwalają ekspresję cytokin i chemokin12, które z kolei stymulują transmigrację komórek odpornościowych przez BCSFB13,14. Wykazano, że komórki HIBCPP wyrażają kilka TLR na poziomie mRNA i że zakażenie N. meningitidis powoduje wydzielanie kilku cytokin i chemokin, w tym CXCL1-3, IL6, IL8 i TNFα15,16.
Tutaj opisujemy hodowlę i infekcję ludzkiej linii komórkowej HIBCPP w systemie wstawiania odwróconej hodowli komórkowej, który naśladuje BCSFB. Ten modelowy system umożliwia badanie interakcji patogenów z istotną in vivo stroną komórkową podstawno-boczną, a także późniejszą odpowiedź komórkową.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>4&acute;,6 diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7512</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe Starlab</td><td></td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>Anti Neisseria meningitidis &alpha;-OMP</td><td></td><td></td><td>Przeciwciało to było darem od dr H. Clausa i dr U. Vogela (University of W&uuml; rzburg, Niemcy)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (kurczak anty królik)</td><td>Invitrogen</td><td>A21441</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 (kurczak anty królik)</td><td>Invitrogen</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 660 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22285</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Calbiochem</td><td>12659</td><td></td></tr><tr><td>Czekoladowe talerze agarowe</td><td>Biomerieux</td><td>43109</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-095</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + L-Glut + 15 mM HEPES bez fenolu</td><td>Gibco</td><td>11039-047</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Inulina</td><td>Sigma</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>19278</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>2393</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>55761</td><td></td></tr><tr><td>PBS + Mg + Ca</td><td>Gibco</td><td>14040-174</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670049</td><td></td></tr><tr><td>Polyvitex</td><td>Biomerieux</td><td>55651</td><td></td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez surowicy</td><td>Gibco</td><td>10902-096</td><td></td></tr><tr><td>Thincert wkładki do hodowli komórkowych do płytek 24-dołkowych, wielkość porów 3 i mikro; m</td><td>Greiner</td><td>662630</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych 75 cm&sup2; czerwona nasadka sterylna</td><td>Greiner</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Woltomierz Millicell-ERS2 z elektrodą MERSSTX01</td><td>Milipore</td><td>MERSSTX00</td><td></td></tr></tbody></table>

model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP), znajdujące się w układzie komorowym mózgu, tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). BCSFB działa w oddzielaniu płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od krwi i ograniczaniu wymiany molekularnej w minimalnym stopniu. Model in vitro BCSFB opiera się na komórkach pochodzących z ludzkiego brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). Komórki HIBCPP wykazują typowe funkcje barierowe, w tym tworzenie ścisłych połączeń (TJ), rozwój transnabłonkowego oporu elektrycznego (TEER), a także niewielką przepuszczalność dla makrocząsteczek. Istnieje kilka patogenów, które mogą dostać się do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) przez BCSFB, a następnie spowodować ciężką chorobę, taką jak zapalenie opon mózgowych. Jednym z tych patogenów jest Neisseria meningitidis (N. meningitidis), bakteria specyficzna dla człowieka. Zastosowanie komórek HIBCPP w systemie wkładek filtracyjnych z odwróconą hodowlą komórkową umożliwia badanie interakcji patogenów z komórkami BCSFB od strony komórki podstawno-bocznej, co jest istotne in vivo. W tym artykule opisujemy wysiew i hodowlę komórek HIBCPP na wkładkach do hodowli komórkowych. Ponadto wykazano zakażenie komórek N. meningitidis wraz z analizą zaatakowanych i przylegających bakterii za pomocą podwójnej immunofluorescencji. Ponieważ komórki CP są również zaangażowane w inne choroby, w tym zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i stwardnienie rozsiane, a także podczas przerzutów komórek nowotworowych do mózgu, system modelowy może być również stosowany w innych dziedzinach badań. Daje to potencjał do rozszyfrowania mechanizmów molekularnych i zidentyfikowania nowych celów terapeutycznych.

W niniejszej pracy opisujemy hodowlę i zakażanie komórek HIBCPP w odwróconym systemie wkładów do hodowli komórkowych. Model ten pozwala nam badać mechanizmy inwazji oraz podstawowe molekularne szlaki sygnalizacyjne od strony bazolateralnej komórek, odtwarzając fizjologiczną sytuację, w której bakterie rozprzestrzeniają się i wnikają do komórek nabłonkowych drogą krwi (Rysunek 1).
Komórki HIBCPP wykazują określon...

Komórki nabłonkowe splotu naczyniówkowego (CP) tworzą barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy (BCSFB). Model in vitro BCSFB wykorzystuje ludzkie komórki brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP). W artykule opisano hodowlę i infekcję podstawno-boczną komórek HIBCPP przy użyciu systemu wkładek filtrujących do hodowli komórkowych.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

The epithelial cells of the choroid plexus (CP), located in the ventricular system of the brain, form the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). The ...

Ogólnym celem tej metody jest stworzenie modelu bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy człowieka w oparciu o komórki nabłonka splotu naczyniówkowego. Umożliwia to badanie infekcji bakteryjnych z strony podstawno-bocznej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące chorób zakaźnych ośrodkowego układu nerwowego, takie jak procesy uczestniczące w oddziaływaniach bakterii z nabłonkiem splotu naczyniówkowego.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na analizę oddziaływań patogenów z bazolateralną stroną komórek nabłonkowych. Metodę tę można zastosować również w innych badaniach, takich jak analiza transmigracji komórek odpornościowych oraz komórek nowotworowych przez nabłonek splotu naczyniowego.opisującego linię komórkową. Rozpocznij od użycia sterylnej pincety do umieszczenia wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych o powierzchni wzrostu 0,33 cm² i porach o rozmiarze 3 µm dnem do góry w poszczególnych dołkach płytki 12-dołkowej. Następnie, za pomocą pipety serologicznej, zalej dołek około 3 ml podgrzanego medium, odsysając nadmiar roztworu, aż dolna komora zostanie dokładnie wypełniona.Następnie dodaj 100 µm podłoża do pasażowania o temperaturze 37°C uzupełnionego o 10% FCS na powierzchnię filtra. Podczas dodawania podłoża bardzo ważne jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uniemożliwić odpowiednie odżywienie komórek. Po dodaniu podłoża do wszystkich wkładek, przykryj płytkę i przenieś wkładki do inkubatora z 5% CO2 w temperaturze 37°C.Następnie przemyj kolbę z komórkami HIBCPP dziesięcioma mililitrami PVS, dwukrotnie, delikatnie obracając kolbą. Po drugim płukaniu dodaj do komórek trzy mililitry 0,25 procent tripsyny EDTA i zamieszaj zawartość kolby. Następnie inkubuj komórki przez około dwadzieścia minut.Po zakończeniu inkubacji należy potwierdzić, że komórki oddzieliły się od dna kolby i mają okrągły kształt. Komórki nie odrywają się całkowicie od siebie i często występują w postaci aglomeratów. Kulturę należy resuspender w 17 mililitrach pożywki, aby zatrzymać reakcję, a następnie przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 mililitrów.Następnie odwiruj komórki i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości pożywki w celu policzenia. Następnie rozcieńcz komórki do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml i odwróć probówkę, aby równomiernie rozdzielić komórki. Po tym dodaj 80 µL komórek na górną część każdego wkładu filtra.Po zasianiu wszystkich wkładów należy przykryć płytkę i przenieść ją do inkubatora w celu hodowli przez noc. Następnego dnia do każdego dołka płytki 24-dołkowej należy dodać jeden mililiter pożywki. Następnie, używając pęsety, należy podnieść każdy wkład i usunąć z niego pożywkę, a następnie umieścić wkłady stroną górną do góry w poszczególnych dołkach płytki 24-dołkowej.Podczas przekładania wkładów z płytki 12-dołkowej do płytki 24-dołkowej należy uważać, aby nie dotykać membrany filtra, na której rosną komórki. Napełnić wkłady 0,5 milliliters świeżej pożywki i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Co dwa dni przenosić wkłady do nowej płytki 24-dołkowej ze świeżą pożywką, wymieniając w ten sposób pożywkę w komorze górnej.Aby zmierzyć transepitelialną oporność elektryczną (TEER) komórek, należy najpierw zanurzyć końcówki elektrod woltomierza do tkanek nabłonkowych w 80% etanolu. Po 15 minutach wyjmij elektrodę z etanolu i pozostaw ją do wyschnięcia. Następnie umieść końcówki w porcji pożywki do subkultury na kolejne 15 minut.Po ustabilizowaniu się elektrody należy ustawić dłuższe ramię tak, aby dotykało dna dolnej komory jednej studni płytki do hodowli komórkowej, a krótsze ramię tak, aby sięgało do komory z wkładką filtracyjną. Następnie należy zmierzyć wartości oporności wkładki filtracyjnej w medium bez komórek w celu uzyskania wartości tła. Następnie należy zmierzyć TEER dla każdej z zasianych wkładek.Po dokonaniu pomiaru należy umieścić elektrodę z powrotem w 80% etanolu na 15 minut, a następnie przechowywać w suchej probówce. Gdy wartości TEER dla insertów z wysianymi komórkami HIBCPP przekroczą 70 ohms/cm², należy wymienić medium na świeże medium hodowlane uzupełnione o 5 µg/mL insuliny i 1% FCS, a następnie pozostawić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc. Aby określić przepuszczalność parakomórkową kultur na insertach, należy dodać 50 µg/mL świeżo przygotowanej FITC-inuliny w świeżym medium hodowlanym z niską zawartością surowicy do górnej komory filtra każdego insertu, a następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora.Gdy hodowle osiągną wartość TEER wynoszącą około 500 ohms per centimeter squared, zainfekuj komórki odpowiednią zawiesiną bakteryjną przy wielokrotności infekcji wynoszącej dziesięć i przenieś komórki do inkubatora na odpowiedni czas hodowli. Następnie przemyj komórki trzykrotnie, przenosząc filtr do nowej studni zawierającej 1 mL medium bezsurowiczego. Za każdym razem dozuj do komory filtra 500 µL tego samego medium. Na koniec określ stężenie inuliny, która przeniknęła z komory filtra przez warstwę komórek po infekcji bakteryjnej, pobierając próbki medium z dolnej studni każdego wkładu filtra z hodowlą komórkową i mierząc wszystkie próbki w czytniku mikropłytek w odniesieniu do dziesięciu rozcieńczeń wzorca FITC-inuliny w stosunkach jeden i dwa.Komórki HIBCCP wykazują specyficzne funkcje barierowe, które pozwalają im w umiarkowanym stopniu ograniczać wymianę molekularną. Na przykład analizy immunofluorescencyjne białek związanych z połączeniami ścisłymi, takich jak ZO-1, okludyna i claudyna-1, wykazują nieprzerwany sygnał w miejscach kontaktu międzykomórkowego. Ilustruje to powiązanie komórek za pomocą ciągłych pasm połączeń ścisłych.W odpowiednich warunkach hodowli komórki HIBCPP wykazują wysoki potencjał błonowy, który bez dodatkowej obróbki osiąga około 500 Ω/cm², utrzymując typowe funkcje barierowe bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy, takie jak tworzenie potencjału błonowego oraz niska przepuszczalność dla makromolekuł. Jednak wraz ze stosowaniem zwiększających się stężeń DMSO wartości TEER spadają w sposób zależny od dawki, przy czym podobny znaczący spadek wartości TEER obserwuje się po zastosowaniu cytochalasyny D. Co więcej, dodatek 2% obj. DMSO lub cytochalasyny D powoduje odpowiadający temu istotny wzrost przepuszczalności dla strumienia inuliny FITC.Ponadto zakażenie bakteryjne komórek HIBCCP skutkuje znaczną inwazją warstwy komórkowej przez dwa patogenne szczepy bakterii: MC58 oraz jego mutanta pozbawionego kapsuły. W przypadku apatogennego szczepu alpha 14 obserwuje się jedynie niewielką inwazję.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dotykać membrany filtra po wysianiu komórek, ponieważ kontakt ten naruszy nienaruszoną warstwę HIBCCP. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy transmigracji in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów migracji komórek odpornościowych i nowotworowych przez komórki nabłonka splotów naczyniówkowych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny farmakologii do badania transportu substratów przez nabłonek splotów naczyniówkowych in vitro.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wystarczającą wiedzę na temat przygotowania modelu bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy w oparciu o komórki HIBCCP do infekcji patogenami drogą podstawno-boczną. Proszę pamiętać, że praca z ludzkimi patogenami może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca pod odpowiednim dygestorium ochronnym.

a-choroid-plexus-epithelial-cell-based-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film przedstawia model in vitro do badania patogenów przekraczających barierę krew-mózg (BBB). Komórki śródbłonka mikronaczyniowego, które wyrażają ścisłe połączenia, tworzą warstwę śródbłonka w górnej komorze, podczas gdy neurony, astrocyty i mikroglej reprezentują miąższ mózgu w dolnej komorze, oddzielony porowatą błoną. Zakażenie wirusem w modelu BBB naśladuje patogen przechodzący z krwi do mózgu. Po wprowadzeniu wirusa neurotropowego przenika on przez barierę krew-mózg poprzez...

Model in vitro do badania przenikania patogenów przez barierę krew-mózg i infekcji komórek mózgowych

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Tutaj prezentujemy protokół opisujący ustawienie systemu hodowli z porowatej membrany poliestrowej BBB (bariera krew-mózg) w celulonowym systemie hodowli w celu oceny transportu biomolekuł lub czynników zakaźnych przez ludzki BBB i ich fizjologicznego wpływu na sąsiednie komórki mózgowe.

Model interfejsu krew-mózg człowieka do badania przekraczania barier przez patogeny lub leki oraz ich interakcji z mózgiem

Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.

Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

To badanie wykorzystuje cytometrię przepływową i dwie różne strategie bramkowania na izolowanych perfundowanych splotach naczyniówkowych mózgu myszy; ten protokół identyfikuje główne podzbiory komórek odpornościowych, które wypełniają tę strukturę mózgu.

Izolacja i charakterystyka komórek odpornościowych z mikropreparowanych splotów naczyniówkowych myszy

Splot naczyniówkowy (CP), niedostatecznie zbadana tkanka w neurobiologii, odgrywa kluczową rolę w zdrowiu i chorobie ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje technikę mikrodysekcji w celu wyizolowania CP i zastosowanie skaningowej mikroskopii elektronowej w celu uzyskania ogólnego obrazu jego struktury komórkowej.

Mikrodysekcja i skaningowa mikroskopia elektronowa z całym mocowaniem Wizualizacja splotu naczyniówkowego myszy

Poznaj metodę tworzenia modelu nabłonka splotu naczyniówkowego z komórek HIBCPP do badania infekcji bakteryjnych u ludzi. Ta technika umożliwia analizę interakcji patogenów z barierą krew-płyn mózgowo-rdzeniowy.

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej (Wideo) | JoVE Journal

Model nabłonka splotu naczyniówkowego oparty na komórkach ludzkiej bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy do badania infekcji bakteryjnej od strony podstawno-bocznej

Przeglądaj więcej filmów