Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

Ogólnym celem tego protokołu jest określenie przepuszczalności i współczynników dyfuzji modeli 3D skóry w systemie wkładek z małą membraną. Zagadnienia te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące inżynierii tkankowej skóry 3D do zastosowań farmaceutycznych i kosmetycznych, w których przepuszczalność i współczynnik dyfuzji są istotnymi czynnikami jakości. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośredni pomiar tych współczynników w małej wkładce wielodołkowej.

System małych wkładek membranowych w symulacji może być dalej modyfikowany do użytku w urządzeniach narządowych na statku i innych zastosowaniach, które wykorzystują systemy wkładek membranowych. Aby przygotować żel agarozowy, zacznij od nałożenia 28,6 mikrolitrów świeżo przygotowanego płynnego żelu agarozowego o temperaturze 80 stopni Celsjusza na każdą membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych. Po 10 minutach żel zestala się i można go użyć do testu przepuszczalności.

Aby przygotować model komórki kolagenowej, najpierw wymieszaj 125 mikrolitrów HBSS i jeden mililitr roztworu R kolagenu na lodzie, a następnie zneutralizuj wodorotlenkiem sodu. Następnie do mieszaniny dodać 125 mikrolitrów pierwotnych fibroblastów zawieszonych w kompletnym pożywce. I dodaj 28,6 mikrolitrów powstałego roztworu komórkowego do każdej studzienki nowego 96-dołkowego systemu wpuszczanego w membranę.

Po 30 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych dodać 75 mikrolitrów kompletnej pożywki na powierzchnię żelu i 300 mikrolitrów kompletnej pożywki na dno każdej studzienki w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zastąp pożywkę 75 mikrolitrami wysokotemperaturowych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury dla każdego modelu komórki kolagenu i zwróć płytkę do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne trzy dni. Czwartego dnia należy odessać pożywkę z powierzchni modelu komórkowego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne siedem dni.

Aby wykonać test przepuszczalności, należy dozować 75 mikrolitrów substancji dawcy do dowolnego systemu wkładek modelu małej studzienki i dodać 300 mikrolitrów substancji akceptorowej na dno każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wilgotności 95 procent i około 480 obr./min przez pięć godzin, przenosząc system wkładek membranowych raz na godzinę do pustej płytki 96-dołkowej i mierząc rozproszoną fluorescencję w dolnych dołkach płytki eksperymentalnej na czytniku płytek. Po zakończeniu eksperymentu z przepuszczalnością otwórz odpowiednie oprogramowanie do modelowania i rozpocznij nowy model.

Wybierz Kreator modelu i model 3D. Dodaj Transport rozcieńczonych gatunków i kliknij badanie. Następnie wybierz opcję Zależne od czasu i kliknij gotowe.

W obszarze Definicje globalne kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać parametry i wprowadzić parametry geometryczne i fizyczne do siatki. Skonfiguruj geometrię systemu wkładania membrany na podstawie eksperymentów i kliknij prawym przyciskiem myszy Definicje, aby dodać dwie sondy domenowe, wybierając jedną sondę jako domenę akceptującą, a drugą jako domenę dawcy. Ustaw obie domeny na średnią z wyrażeniem C i jednostką moli na metr sześcienny.

I ustaw współczynnik dyfuzji pod właściwości transportowe jeden i transport rozcieńczonych gatunków. Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać drugą właściwość transportu dwa i wybierz drugą barierę w wyborze domeny. Przy transporcie rozcieńczonych gatunków, dla wartości początkowych jeden, należy zdefiniować stężenie jako zero.

Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać drugą wartość początkową dwa i wybierz dawcę jako trzecią domenę. Ustawić stężenie jako początkowe stężenie substancji donorowej fluorescencji. Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać symetrię jeden i wybrać wszystkie powierzchnie wyboru obwiedni, które odzwierciedlają całą geometrię.

Kliknij prawym przyciskiem myszy siatkę, aby dodać dwa wolne czworościany i ustaw drugą barierę jako domenę. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny czworościenny, aby dodać rozmiar wstępnie zdefiniowanej siatki do bardzo drobnej. W drugim wolnym czworościanie ustaw akceptor i donor jako domeny, a wstępnie zdefiniowaną siatkę na drobniejszy.

Następnie w obszarze badania pierwszego kliknij przycisk Oblicz, aby rozpocząć symulację. Aby dopasować współczynnik dyfuzji do danych wygenerowanych przez symulację dyfuzji, otwórz menu dodawania psychicznego i wybierz matematykę. Znajdź optymalizację i czułość.

Wybierz optymalizację i kliknij dodaj do komponentu. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy definicje, aby dodać zmienne i ręcznie wprowadź zmienne z tabeli trzeciej. Następnie, w menu sprzężenia komponentów, kliknij prawym przyciskiem myszy definicje, dodaj średnią jeden, a następnie ręcznie dodaj akceptora jako nazwę operatora i wybierz domenę pierwszą.

Wyeksportuj dane eksperymentalne do nowego dokumentu tekstowego. Użyj średnika, aby oddzielić dane na kolumny, i podziału wiersza, aby oddzielić dane na wiersze. Kliknij prawym przyciskiem myszy optymalizację, aby dodać globalny cel najmniejszych kwadratów i dołączyć dokument tekstowy do danych eksperymentalnych.

Kliknij globalny cel najmniejszych kwadratów, aby zdefiniować pierwszą kolumnę jako pierwszą kolumnę czasu, a drugą kolumnę jako pierwszą kolumnę wartości. W kolumnie wyrażenie wartości wprowadź zmienną C.Kliknij prawym przyciskiem myszy optymalizację, aby dodać globalne zmienne sterujące jeden. I zadeklaruj wyszukiwanie podkreślenia D jako zmienną z początkową wartością jeden, dolną granicą zera i górną granicą 1 000.

Kliknij prawym przyciskiem myszy badanie pierwsze, aby dodać optymalizację. I wybierz SNOPT jako metodę solwera optymalizacji. Ustaw tolerancję optymalności na jeden do potęgi minus osiem.

Następnie ustaw współczynnik dyfuzji na barierze na D. Ustaw czas symulacji w badaniu ustawienie od zera sekund do 22 000 sekund w odstępie 100 sekund i kliknij przycisk Oblicz, aby rozpocząć optymalizację parametrów. Analiza histologiczna modelu komórki kolagenu ujawnia niewielkie zabarwienie fibroblastów w macierzy centralnej. W górnej części macierzy kolagenowej można zaobserwować warstwę zawierającą wiele jąder, prawdopodobnie składającą się z dorosłych ludzi o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury.

Użycie soli sodowej fluoresceiny i dekstranu izotyocyjanianu fluoresceiny pozwala zweryfikować wpływ wielkości cząsteczki substancji dyfuzyjnej, która ujawnia, że w przypadku małych rozmiarów cząsteczek symulacja i dane eksperymentalne są zgodne dla obu cząsteczek. Większe rozmiary cząsteczek generują jednak większe odchylenia w progresjach krzywych w symulacjach, wykazując opóźnienie na początku i silniejszy wzrost w późniejszym przebiegu wykresów. Rzeczywiście, współczynnik przenikania zmniejsza się wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki, przy czym symulowane współczynniki zachowują się podobnie do eksperymentalnych współczynników przepuszczalności.

Warto zauważyć, że większość modeli, które wykorzystują wysokotemperaturowe keratynocyty o niskiej zawartości wapnia i niskiej temperaturze u dorosłych, ma niższe współczynniki przenikania i dyfuzji w porównaniu z modelami bez wysokotemperaturowych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i niskiej zawartości wapnia. Model symulacji kolagenu można ustalić w ciągu 11 do 12 dni, a pomiar przenikania można wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania zabiegu ważne jest, aby warunki brzegowe, takie jak temperatura, objętość wypełnienia, stężenie nakładanej substancji, wilgotność i proces membranowy, były stałe, aby zmniejszyć zmienność współczynnika przenikania.

Za pomocą tej symulacji modułu można zmniejszyć wysiłek eksperymentalny i przewidzieć długoterminową wydajność. Może być również dostosowany do innych urządzeń do przenikania lub systemów własności narządów. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się zastosowaniami farmaceutycznymi i kosmetycznymi, a także rozwojowi interakcji w inżynierii tkankowej w celu zbadania procesów przenikania dyfuzji w sztucznych tkankach.