Name: Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelach 3D przy użyciu systemu wkładów membranowych. Technika ta umożliwia optymalizację parametrów dla inżynierii tkankowej w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została stworzona dzięki wsparciu finansowemu Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) w ramach grantu nr. PO413/12-1 oraz LA 1028/7-1.

<ol><li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip+developments%3A+a+translational+cutting-edge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ATLA%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?</a> ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Maschmeyer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+human+liver-intestine+and+liver-skin+co-cultures+-+A+first+step+toward+systemic+repeated+dose+substance+testing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro.</a> Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).</li>
<li>Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Cultivation+of+Keratinocytes+with+an+Air-Liquid+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface.</a> J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).</li>
<li>Cannon, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+epidermal+model+for+dermal+irritancy+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">New epidermal model for dermal irritancy testing.</a> Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).</li>
<li>Ackermann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phenion+Full-Thickness+Skin+Model+for+Percutaneous+Absorption+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing.</a> Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).</li>
<li>Netzlaff, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+reconstructed+human+epidermis+model+Episkin+in+comparison+to+various+human+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).</li>
<li>Bran, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Discriminative+Criterion+for+the+Development+of+Franz+Diffusion+Tests+for+Transdermal+Pharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals.</a> J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).</li>
<li>Pineau, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22459170">In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell.</a> J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).</li>
<li>Filon, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+percutaneous+absorption+of+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Occup+Environ+Health%22%5BJournal%5D)">In vitro percutaneous absorption of cobalt.</a> Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).</li>
<li>Ng, S. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Static+Franz+Diffusion+Cell+System+for+In+Vitro+Permeation+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22AAPS+PharmSciTech%22%5BJournal%5D)">Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies.</a> AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).</li>
<li>Bonferoni, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Franz+Diffusion+Cell+for+Simultaneous+Assessment+of+Drug+Release+and+Washability+of+Mucoadhesive+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Dev+Tecnol%22%5BJournal%5D)">A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels.</a> Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).</li>
<li>Seiffer, S., Oppermann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+FRAP+experiments+performed+in+a+confocal+laser+scanning+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope.</a> J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).</li>
<li>Pluen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Macromolecules+in+Agarose+Gels%3A+Comparison+of+Linear+and+Globular+Configurations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations.</a> Biophys J. 77, 542-552 (1999).</li>
<li>Cornelissen, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+measurements+in+epidermal+tissues+with+fluorescent+recovery+after+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Res+Technol%22%5BJournal%5D)">Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching.</a> Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).</li>
<li>Pirot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+permeability+barrier+of+human+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo.</a> PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).</li>
<li>Tetteh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+examination+of+skin+diffusion+using+FTIR+spectroscopic+imaging+and+multivariate+target+factor+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis.</a> Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).</li>
<li>Guldbrand, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+fluorescence+correlation+spectroscopy+as+a+tool+for+measuring+molecular+diffusion+within+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin.</a> Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Rech%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Veronike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Organization+and+Differentiation+of+HaCaT+Keratinocytes+in+Organotypic+Coculture+with+Human+Dermal+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts.</a> J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).</li>
<li>Moraes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+a+focus+on+compartmentalized+microdevices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices.</a> Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4386065/">From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips.</a> Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+biological+vasculature+into+a+multi-organ-chip+microsystem%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem.</a> Lab Chip. 13 (18), 3588(2013).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-organ+chip+co-culture+of+neurospheres+and+liver+equivalents+for+long-term+substance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing.</a> J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).</li>
<li>Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chip-based+liver+equivalents+for+toxicity+testing+-+organotypicalness+versus+cost-efficient+high+throughput%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput.</a> Lab Chip. 13 (18), 3481(2013).</li>
<li>Jayakrishna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+High+Molecular+Weight+Compounds+through+Sclera%5BTitle%5D)+AND+%22IOVS%22%5BJournal%5D)">Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera.</a> IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).</li>
<li>Peck, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7816761">Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol.</a> Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).</li>
<li>Ogiso, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+Enhancement+Effect+of+n-Octyl-%CE%B2-D-thioglucoside+on+the+Transdermal+Penetration+of+Fluorescein+Isothiocyanate-Labeled+Dextrans+and+the+Molecular+Weight+Dependence+of+Water-Soluble+Penetrants+through+Stripped+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin.</a> J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).</li>
<li>Hadgraft, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11512545">Skin, the final frontier.</a> Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).</li>
<li>Asselineau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022202X86908560">Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?</a> J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).</li>
<li>Casasco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+differentiation+in+a+model+of+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent.</a> Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).</li>
<li>Kehe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+with+HaCaT+cells+and+a+fibroblast+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line.</a> Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).</li>
<li>Laurent, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Dextran+in+Concentrated+Solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions.</a> Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).</li>
<li>Metzler, R., Klafter, J. <a target="_blank" href="http://www.tau.ac.il/~klafter1/258.pdf">The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach.</a> Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).</li>
</ol>

Uwe Marx jest dyrektorem generalnym i udziałowcem, a Gerd Lindner jest udziałowcem TissUse GmbH, firmy produkującej i komercjalizującej technologię MOC. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Badanie to dokumentuje metodę opracowaną w celu ilościowego określenia przenikania przez konstrukt tkankowy skonstruowany na membranie. Najpierw zbadano przenikanie substancji o różnych rozmiarach molekularnych przez żel agarozowy w celu przetestowania i walidacji metody oraz odpowiedniej symulacji. Powszechnie wiadomo, że mniejsze cząsteczki przenikają szybciej przez siatkę matrycy (z wyjątkiem efektu filtracji żelowej za pomocą chromatografii przepuszczalności). Podobne obserwacje poczyniono w eksperymentach z wykluczeniem wielkości substancji przez twardówkę26, ludzką błonę naskórkową27, ludzką skórę17 i skórę szczura28. Wykazano odwrotną korelację między współczynnikami przepuszczalności a odpowiadającym im promieniem Stokesa (promień twardej kuli, która porusza się z taką samą szybkością dyfuzji jak opisywane cząsteczki, zwykle mniejszą niż efektywny promień cząsteczki) wykazano26,28, a podobną zależność zaobserwowano w eksperymentach z substancjami o różnych rozmiarach cząsteczek. Wykreślając współczynniki przepuszczalności w promieniu 1/Stokesa, stwierdzono korelację liniową między czterema grupami o najmniejszym rozmiarze cząsteczki (R2 = 0,93) (ryc. 6). Oznacza to, że symulowane współczynniki przepuszczalności przy sugerowanej metodzie mieszczą się w realistycznym zakresie.
Błąd wynoszący 46,15% w eksperymentach jest nieco większy niż podany w eksperymentach z przepuszczalnością z systemem komórek dyfuzyjnychFranza 10. Jednym z możliwych wyjaśnień może być rozkład wielkości fluoresceiny-izotiocyjanianu-dekstranu, który zostanie omówiony później.
Opisana metoda ma istotne zalety w porównaniu z metodami wykorzystującymi system komórek dyfuzyjnych Franza. Po pierwsze, konfiguracja jest bardziej kompaktowa; Eksperymenty są wykonywane bezpośrednio w systemie wkładek membranowych, który ma skalę komercyjnej płytki studziennej (∼ 13 cm x 8,5 cm). Umożliwia to jednoczesne badanie wielu próbek, podczas gdy do każdej próbki potrzebna jest oddzielna komórka dyfuzyjna Franza. Po drugie, przepuszczalność modelu skóry można zmierzyć bezpośrednio we wkładzie membranowym, w którym odbywa się uprawa. W przypadku komór dyfuzyjnych Franza próbki muszą być wyjmowane i montowane w systemie, co jest bardziej kłopotliwe w przypadku małych próbek, a także bardziej czasochłonne.
Eksperymenty z przenikaniem matryc komórek kolagenowych wykazały, że metoda ta może być z powodzeniem stosowana w systemach komórkowych. Prezentowany tutaj model został zweryfikowany pod kątem modeli skóry; Metodę tę można jednak zastosować do innych rodzajów organicznych hodowli komórkowych, np. nerek lub wątroby.
W tym badaniu wykorzystano model komórki kolagenowej, w którym komórki HaCaT całkowicie pokryły powierzchnię modelu (patrz ryc. 5). Doprowadziło to do obniżenia współczynnika przepuszczalności, co pokazuje, że metoda jest wystarczająco czuła, aby rozróżnić współczynnik przepuszczalności między modelem kolagenowo-komórkowym z warstwą HaCaT i bez niej. Idealnie byłoby, gdyby model skóry budował barierę, która zbliża się do naskórka prawdziwej skóry29, dlatego ważne jest, aby zweryfikować jakość (np. budowę skóry właściwej, naskórek) modelu skóry przed faktycznym użyciem. Rozwój modelu skóry można zwizualizować za pomocą technik barwienia i określić ilościowo na podstawie wykrycia białka skóry i kolagenu 30,31,32. Współczynnik przepuszczalności może być również ważnym czynnikiem oceny rozwoju modelu skóry, ale potrzebne są dalsze eksperymenty, aby to potwierdzić. Jak wcześniej wspomniano, metoda ta umożliwia równoległe uruchamianie wielu próbek. Możliwe jest również pobranie próbek podczas uprawy w celu zmierzenia przepuszczalności, a tym samym obserwowanie rozwoju tego parametru modelu skóry.
Należy zauważyć, że przepuszczalność jest mierzona jednocześnie za pomocą modelu żelowo-kolagenowo-komórkowego i membrany. Wykryty współczynnik przepuszczalności jest specyficzny dla systemu, przy czym wyniki różnych modeli skóry można porównać tylko w przypadku stosowania tej samej wkładki membranowej. Ponadto model skóry musi pokrywać cały obszar uprawy, aby zapewnić, że substancja badana będzie przenikać tylko przez model, a nie w jego sąsiedztwie, co spowodowałoby błędy w mierzonej przepuszczalności. Kolejnym aspektem, który powinien być brany pod uwagę w przyszłych eksperymentach, jest naturalne środowisko otaczające skórę. Zwykle temperatura powierzchni skóry jest niższa w porównaniu z obszarem wewnętrznym, co może wpływać na warunki przenikania.
W celu dopasowania eksperymentów laboratoryjnych do symulacji komputerowych zaprezentowano metodę umożliwiającą optymalizację parametrów dla symulacji stosowanej. Stwierdzono, że symulacje są dobrze zbieżne z danymi eksperymentalnymi dotyczącymi substancji o małych rozmiarach cząsteczkowych. Zaobserwowano jednak rozbieżności między danymi symulacyjnymi a eksperymentalnymi w przypadku substancji o większych rozmiarach cząsteczkowych. Duże cząsteczki polisacharydów mogą zwiększać tarcie i spowalniać proces dyfuzji w żelu. Efekt ten powoduje nieprawidłową dyfuzję, która jest możliwą przyczyną odchylenia między wartościami eksperymentalnymi i symulacyjnymi33,34. Innym wyjaśnieniem może być obecność mniejszych lub większych cząstek w dekstranie fluoresceiny-izotiocyjanianu. Producent określa masę cząsteczkową substancji jako średnią wielkość o danym zakresie, co pozwala na obecność mniejszych i większych cząstek. Nie jest również jasne, jak rozproszone są te substancje, ponieważ mniejsze cząsteczki szybciej przenikają przez żel i kanał płynu. Możliwe jest rozszerzenie symulacji w celu uwzględnienia tych efektów dyfuzji i tarcia.
Eksperyment i symulacja przepuszczalności zostały opracowane do użytku w 2-OC. Za pomocą symulacji tę eksperymentalną metodę można bezpośrednio przenieść do bardziej wyrafinowanych konfiguracji eksperymentalnych. Na przykład, symulację systemu wkładek membranowych można łatwo przenieść na geometrię 2-OC lub do innych systemów o podobnych konfiguracjach. Ta opcja modulacji symulacji może być wykorzystana do wsparcia projektowania przyszłych eksperymentów. Ponadto efekty uboczne, takie jak parowanie, nieprawidłowa dyfuzja i efekty membranowe, można zintegrować w celu ulepszenia symulacji, poprawiając w ten sposób dokładność. Program symulacyjny daje możliwość zmiany lub ulepszenia równania symulacyjnego, a także zintegrowania innych modułów fizycznych w celu zbadania innych aspektów rozwoju modelu skóry. Jednym z przykładów jest symulacja zużycia glukozy i produkcji mleczanu w modelu komórki kolagenowej.
Szczególnie interesującym aspektem w testowaniu substancji medycznych jest sposób, w jaki substancje te są rozprowadzane w systemie narządów na chipie. Parametr symulacji i przepuszczalności pomaga odpowiedzieć na pytania, takie jak szybkość przenikania substancji do układu, a także jakie stężenie będzie dostępne dla innych tkanek w wielonarządowym chipie. Metoda ta może wspierać i usprawniać rozwój i testowanie takich systemów typu organ-on-chip.

Organiczne kultury 3D stały się potężnymi narzędziami do opracowywania leków i testowania substancji1. Pod tym względem modele ludzkiej skóry cieszą się szczególnym zainteresowaniem ze względu na wymogi regulacyjne, takie jak te w przemyśle kosmetycznym. Doprowadziły one następnie do opracowania licznych modeli skóry 3D, które można stosować samodzielnie jako hodowle jednonarządowe na płytkach wielodołkowych lub w chipach wielonarządowych w połączeniu z dodatkowymi modelami narządów, np. liver2.
Jeśli chodzi o uprawę odpowiednika skóry, interfejs powietrze-ciecz (ALI) jest niezbędnym elementem dla prawidłowego różnicowania naskórka3. Wkładki do hodowli komórkowych składające się z naczynia z membraną przepuszczalną dla cieczy na dnie są zwykle używane do wytworzenia ALI. ALI są szeroko stosowane w dostępnych na rynku modelach skóry, takich jak EpiDerm4, Phenion5 i Episkin6, do hodowli modeli skóry o rozmiarach od 96-dołkowych (4,26 mm średnicy) do 12-dołkowych (12,2 mm średnicy). Opisana tutaj metoda określa przenikanie substancji w systemie wkładu membranowego.
Współczynnik przepuszczalności jest istotnym parametrem do oceny jakości każdego modelu skóry z hodowlą w porównaniu do rodzimej skóry5, i jest używany do oceny, jak szybko substancje aktywne migrują przez skórę. Zwłaszcza jeśli na skórę trzeba nakładać leki lub produkty kosmetyczne, parametr ten jest niezbędny, aby zrozumieć, kiedy dokładnie przechodzą przez nią substancje czynne. Symulacja może dodatkowo pomóc w przewidywaniu zachowania systemu, a następnie w zmniejszeniu niezbędnego czasochłonnego wysiłku eksperymentalnego, zwłaszcza gdy w grę wchodzi duży zestaw substancji.
Komórka dyfuzyjna Franza jest najnowocześniejsza do eksperymentów z przenikaniem skóry i modeli skóry5,6,7,8,9. Urządzenie to składa się z dwóch komór, pomiędzy którymi znajduje się nieruchoma próbka (bariera dyfuzyjna). Substancję, która ma być poddana badaniu, nakłada się bezpośrednio na górną część próbki (przedział dawcy), a stężenie przenikającego związku można wykryć w przeciwległym (akceptorowym) komorze. Po stronie akceptora stała temperatura i jednorodne stężenie substancji są zapewnione przez komorę temperaturową i mieszadło magnetyczne. Próbki można pobierać z ramienia do pobierania próbek po stronie akceptora komórki Franza. Z zakresem wysokości od 19 cm do 179 cm, system ten jest stosunkowo duży10,11. Inną metodą oznaczania współczynników dyfuzji w substancjach żelopodobnych i tkankach jest FRAP. Technika ta wykorzystuje zasadę wybielania fluorescencyjnie znakowanych cząstek w żelu, a następnie określania czasu regeneracji bielonego obszaru w celu obliczenia współczynnika dyfuzji12,13,14.
Ponadto, spektroskopia FTIR z transformacją Fouriera może być używana do wykrywania ruchu cząstek za pomocą absorpcji światła podczerwonego w celu określenia procesu przenikania substancji w skórze15,16. Jednak te lub inne metody obrazowania (np. spektroskopia korelacji fluorescencji dwufotonowej17) wymagają kosztownych instrumentów.
W tym artykule przedstawiono metodę bezpośredniego pomiaru przepuszczalności bariery w systemie wkładów membranowych, gdzie można hodować model skóry. Metoda ta umożliwia przeprowadzanie eksperymentów z przepuszczalnością na dużej liczbie małych próbek (o wielkości studni do 4,26 mm) w kompaktowym systemie. Jest to przeciwieństwo celi dyfuzyjnej Franza, gdzie do każdej sondy potrzebne jest osobne urządzenie, które musi być zamontowane na urządzeniu i jest trudne do zrealizowania dla małych próbek (rozmiar 4,26 mm). Ponadto, ponieważ metoda ta nie wymaga dużego oprzyrządowania (np. mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego), uzyskuje się redukcję zarówno czasu, jak i kosztów.
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone w mikroporowatych systemach wkładek membranowych z próbką (barierą) składającą się z żelu agarozowego lub modelu komórki kolagenowej umieszczonej na membranie. Substancje fluorescencyjne (donor) o różnych rozmiarach molekularnych zostały naniesione na wierzch próbki, a stężenie przenikanej substancji wykryto na dole (akceptorze) za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). W celu walidacji metody i przetestowania dokładności tej symulacji wyprodukowano żele agarozowe, które zastosowano jako barierę. Hydrożele są powszechnie używane do badania procesów dyfuzji i przenikania w porowatym ośrodku w naukach biologicznych13. Metoda została następnie przetestowana w systemie komórkowym składającym się z macierzy kolagenowej pierwotnych fibroblastów i komórek ludzkich dorosłych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury (HaCaT) (model macierzy komórkowej), który jest uproszczonym modelem skóry18,19.
Dodatkowo, proces przenikania był symulowany za pomocą symulacji przepływu z obliczeniową dynamiką płynów. Stwierdzono, że za pomocą optymalizacji parametrów można obliczyć współczynnik dyfuzji na podstawie danych doświadczalnych. Ogólnie rzecz biorąc, ta symulacja oferuje różne zastosowania; Na przykład możliwe jest przewidzenie procesu przenikania na podstawie krótkich eksperymentów, a symulacja może znacznie zmniejszyć liczbę eksperymentów.
Eksperymentalna metoda i symulacja zostały zaprojektowane do zastosowania w systemie organ-on-a-chip1,20,21, w szczególności 2-organ-chip (2-OC) opracowany komercyjnie1,22,23,24,25. W zasadzie w ten sposób można opisać proces przenikania dowolnego modelu narządu opartego na systemach wkładów błonowych.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Carl Roth</td><td>K297.2</td><td>Kolagen w proszku o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td></td><td>Serva</td><td>47256.01</td><td>Roztwór kolagenu R 0,4</td></tr>% <tr><td>DMEM</td><td>Lonza (Biozym Scientific GmbH)</td> <td>880010-12</td><td>Wysoka glukoza z L-glutaminą</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom GmbH</td><td>S0615 0114F</td><td>Surowica cielęca płodu</td></tr><tr><td>Sól sodowa fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46960-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46944-500MG</td><td>4000 g/mol</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S-250MG</td><td>10 000 g/mol</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD20S-250MG</td><td>20 000 g/mol</td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD40S-250MG</td><td>40 000 g/mol</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14170120</td><td>bez wapnia, bez magnezu, z czerwienią fenolową</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.06467.9010</td><td>granulowany</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>tabletki</td></tr><tr><td>Transwell Cell Culture Inserts</td><td>Corning</td><td>3391</td><td>96 studzienka, 0,4 i mikro; m wielkość</td></tr><tr><td>porów Wkładki do hodowli komórkowych Transwell</td><td>Corning (VWR)</td><td>734-1563</td><td>12 dołków, 0,4 i mikro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Biochrom GmbH</td><td>L2143</td><td>z EDTA</td></tr></tbody></table>

metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3d w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates

Modele skóry hodowane in vitro stają się coraz bardziej przydatne w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych, a także są wykorzystywane do opracowywania leków, jak również do testowania substancji. Modele te są najczęściej uprawiane w systemach membranowo-wkładowych, a ich przepuszczalność dla różnych substancji jest istotnym czynnikiem. Zazwyczaj stosowane metody oznaczania tych parametrów wymagają zwykle dużych rozmiarów próbek (np. komórka dyfuzyjna Franza) lub pracochłonnego sprzętu (np. odzysk fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)). W pracy przedstawiono metodę wyznaczania współczynników przepuszczalności bezpośrednio w systemach membranowo-wsadowych o średnicach 4,26 mm i 12,2 mm (powierzchnia uprawy). Metodę zwalidowano za pomocą agarozy i żeli kolagenowych, a także modelu komórki kolagenowej reprezentującego modele skóry. Dokładnie opisano procesy przenikania substancji o różnych rozmiarach molekularnych i przenikania przez różne modele komórkowe (składające się z żelu kolagenowego, fibroblastów i HaCaT).
Ponadto, aby wesprzeć powyższą metodę eksperymentalną, stworzono symulację. Symulacja dobrze pasuje do danych eksperymentalnych dla substancji o małych rozmiarach molekularnych, do 14 x 10-10 m promienia Stokesa (4000 MW), a zatem jest obiecującym narzędziem do opisania systemu. Co więcej, symulacja może znacznie zmniejszyć wysiłek związany z eksperymentami i jest wystarczająco solidna, aby można ją było rozszerzyć lub dostosować do bardziej złożonych konfiguracji.

Eksperymenty nad przepuszczalnością w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami z zastosowaniem 2% żelu agarozy jako bariery przeprowadzono w celu oceny dokładności symulacji. Do weryfikacji wpływu wielkości cząsteczkowej substancji dyfundującej w zakresie promienia Stokesa od 5 x 10-10 m do 45 x 10-10 m (masa molowa 376,27-40 000) wykorzystano sól sodową fluoresceiny (NaFl) oraz dekstrany znakowane izotiocyjanianem fluoresceiny (FD). W celu dopasowania symulacji do danych eksperymentalnych zastosowano natywną optymalizację parametrów symulacji.
W tym celu nachylenia wyłącznie liniowych części symulowanej przepuszczalności porównano z wynikami eksperymentalnymi. Dla niewielkich rozmiarów cząsteczek dane z symulacji i eksperymentu były ze sobą zgodne w stopniu 99,2% dla NaFl oraz 80,2% dla FD 4,000 (patrz Rysunek 4a oraz Rysunek 4b). Większe rozmiary cząsteczek spowodowały większe odchylenia, wykazując korelacje na poziomie 50,5% dla FD 10,000, 79,7% dla FD 20,000 oraz 53,6% dla FD 40,000. Przebieg krzywych w symulacjach wykazał opóźnienie na początku oraz gwałtowniejszy wzrost w dalszej części wykresów (patrz Rysunek 4c-4e).
Współczynniki przenikalności oraz symulowane współczynniki dyfuzji przedstawiono w Tabeli 4. Współczynnik przenikania maleje wraz ze wzrostem rozmiaru cząsteczki. Odchylenie standardowe wynosiło od 0,08 x 10-8 m/s do 0,47 x 10-8 m/s (N = 7), co odpowiadało błędowi bezwzględnemu w zakresie od 4,18% do 46,15%. Eksperymenty z większymi cząsteczkami wykazały większy błąd bezwzględny. Symulowane współczynniki dyfuzji zachowywały się bardzo podobnie do eksperymentalnych współczynników przenikalności. Substancje o większych promieniach Stokesa wykazały malejące współczynniki dyfuzji, a błąd bezwzględny mieścił się w granicach od 9,09% do 18,46% (N = 3).
W dodatkowych eksperymentach z przenikania, jako bariery w 12-dołkowym systemie wkładów membranowych, wykorzystano cztery różne typy kolagenowych modeli komórkowych. Modele te obejmują model bezkomórkowy oraz modele komórkowe z różnymi kombinacjami pierwotnych fibroblastów w żelu kolagenowym i komórek HaCaT na powierzchni. Zastosowano następujące kombinacje: kolagen (Col.) jako model bezkomórkowy, kolagen + fibroblasty (Col.+F.), kolagen + HaCaT (Col.+H.) oraz kolagen + fibroblasty + HaCaT (Col.+F.+H.). Jako substancję donora wykorzystano sól sodową fluoresceiny w DMEM + 10% FCS. Do analizy obrazu kolagenowego modelu komórkowego zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną (HE). Barwienie przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta. Na Rysunku 5 przedstawiono takie barwienie na reprezentatywnym modelu Col.+F.+H. Barwienie HE lekko barwi strukturę tkankową macierzy kolagenowej. Fibroblasty znajdują się w macierzy, a jądra komórkowe fibroblastów i komórek HaCaT są zabarwione na ciemnofioletowo. Na szczycie macierzy kolagenowej znajduje się warstwa zawierająca wiele jąder, które powinny być jądrami komórek HaCaT, tworzącymi warstwę zamykającą na górze modelu.
W Tabeli 5 przedstawiono eksperymentalne współczynniki przenikania oraz symulowane współczynniki dyfuzji. W większości modeli z HaCaT widoczny jest trend w postaci niższych współczynników przenikania/dyfuzji w porównaniu do modeli bez HaCaT. Błąd bezwzględny współczynników przenikania wynosi 10,9-24,4%, a dla współczynników dyfuzji 5,2%-12,9%.
<img alt="Schemat przenikania: układ wkładu membranowego z etykietami donora, akceptora, bariery i płytki odbiorczej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Widok z boku eksperymentu przenikalności w systemie wkładu membranowego. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Równowaga statyczna, wykres stężenia w funkcji czasu, stan stacjonarny, czas opóźnienia, zmiana szybkości dcA/dt, analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykładowy wykres z eksperymentu nad przepuszczalnością. Przedstawiono zmianę stężenia akceptora w czasie. Dwie linie przerywane wyznaczają prawie liniową część wykresu. Nachylenie tej części liniowej służy do wyznaczenia współczynnika przepuszczalności. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagramy równowagi statycznej ze strukturami 3D, układ bariery donor-akceptor, modelowanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Geometria i siatka systemu wkładów membranowych w symulacji. (a) Geometria systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. (b) Geometria systemu wkładów membranowych z 12 dołkami. (c) Siatka systemu wkładów membranowych z 96 dołkami. (d) Siatka systemu wkładów membranowych z 12 dołkami. (e) Przekrój poprzeczny i parametry systemu wkładów membranowych. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres porównujący dane eksperymentalne i symulacyjne stężenia w funkcji czasu, prezentujący wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Porównanie danych eksperymentalnych z badania permeacji z zoptymalizowaną symulacją. (a) sól sodowa fluoresceiny, (b) izotiocyjanian fluoresceiny-dekstran o masie cząsteczkowej 4 000 mol, (c) 10 000 mol, (d) 20 000 mol oraz (e) 40 000 mol. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Macierz kolagenowa z fibroblastami i warstwą HaCaT, obraz mikroskopowy do badań nad inżynierią tkankową." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywne barwienie HE modelu komórkowego w kolagenie (kolagen + fibroblasty + HaCaT). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres współczynnika przepuszczalności w funkcji 1/promienia Stokesa, regresja liniowa, wykres analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56412/56412fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Współczynnik przepuszczalności w funkcji 1/promienia Stokesa przy użyciu soli sodowej fluoresceiny i dekstranu z izotiocyjanianem fluoresceiny w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56412/56412fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Wymiary dla systemu 96-dołkowego w mm</td>
			<td>Wymiary systemu 12-dołkowego w mm</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.</td>
			<td>5,65 [mm]</td>
			<td>14,7 [mm]</td>
			<td>Średnica dołka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d_a</td>
			<td>4,26 [mm]</td>
			<td>12,1 [mm]</td>
			<td>Średnica membrany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d_w</td>
			<td>8,79 [mm]</td>
			<td>21,97 [mm]</td>
			<td>Średnica akceptora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h_b</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>2 [mm]</td>
			<td>Wysokość bariery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h_sp</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>1 [mm]</td>
			<td>Odległość między dołkiem a dnem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>h_a</td>
			<td>4,73 [mm]</td>
			<td>5,24 [mm]</td>
			<td>Wysokość akceptora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b</td>
			<td>h_b/2</td>
			<td>-</td>
			<td>Głębokość zanurzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.</td>
			<td>((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)</td>
			<td>-</td>
			<td>Promień kuli zanurzeniowej+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r_z</td>
			<td>r+h_b</td>
			<td>-</td>
			<td>Pozycja z kuli imersyjnej+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Parametry geometryczne dla symulacji „Chemical Species Transport”.+Wyłącznie do symulacji żelu agarozy w systemie insertów membranowych z 96 dołkami.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Ekspresja</td>
			<td>Wartość</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C_fl</td>
			<td>0,1 [mg/ml]/376,28 [g/mol]</td>
			<td>0,26576 mol/m2</td>
			<td>Stężenie Fl.So.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C_4</td>
			<td>2 [mg/ml]/4000 [g/mol]</td>
			<td>0,5 mol/m2</td>
			<td>Stężenie FD 4,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C_10</td>
			<td>2 [mg/ml]/10000 [g/mol]</td>
			<td>0,2 mol/m2</td>
			<td>Stężenie FD 10.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C_20</td>
			<td>2 [mg/ml]/20000 [g/mol]</td>
			<td>0,1 mol/m2</td>
			<td>Stężenie FD 20.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C_40</td>
			<td>2 [mg/ml]/40000 [g/mol]</td>
			<td>0,05 mol/m2</td>
			<td>Stężenie FD 40.000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dif_w</td>
			<td>1e-9 [m^2/s]</td>
			<td>1E-9m2/s</td>
			<td>Współczynnik dyfuzji podczas mieszania wody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Parametry fizyczne dla symulacji „Transportu gatunków chemicznych”.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Wyrażenie</td>
			<td>Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>Acceptor(c)</td>
			<td>Definicja stężenia akceptora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>D_search*1e-10</td>
			<td>Współczynnik zmiany dla D</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Parametry symulacji „Optymalizacja”.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Permeat</td>
			<td>Współczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8</td>
			<td>Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10</td>
			<td>Promień Stokesa permeatu (m)x10-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fl.So.</td>
			<td>4.79 ± 0.20</td>
			<td>1.94 ± 0.34</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD 4,000</td>
			<td>2.37 ± 0.31</td>
			<td>0.65 ± 0.12</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD10,000</td>
			<td>1.67 ± 0.47</td>
			<td>0.22 ± 0.02</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD 20 000</td>
			<td>0.65 ± 0.30</td>
			<td>0.29 ± 0.04</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FD 40 000</td>
			<td>0.27 ± 0.08</td>
			<td>0.14 ± 0.02</td>
			<td>45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji substancji o różnym promieniu Stokesa przez żel agarozowy 2% + membranę w systemie wkładów membranowych z 96 dołkami. (fluorescein sodium salt = Fl. So., fitc dextran = FD).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Model</td>
			<td>Współczynnik przepuszczalności (m/s)x10-8</td>
			<td>Współczynnik dyfuzji (m/s2)x10-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kol.</td>
			<td>2.18 ± 0.29</td>
			<td>1.22 ± 0.06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Col.+F.</td>
			<td>1.77 ± 0.38</td>
			<td>0.93 ± 0.12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Col.+H.</td>
			<td>1.64 ± 0.40</td>
			<td>0.96 ± 0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kol.+F.+H.</td>
			<td>1.65 ± 0.18</td>
			<td>0.88 ± 0.11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 5: Przepuszczalność i współczynnik dyfuzji soli sodowej fluoresceiny przez kolagenowy model komórkowy w 12-dołkowym systemie wkładów membranowych (Col. = kolagen, F. = fibroblast, H. = HaCaT).

Przedstawiono metodę określania przepuszczalności w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych oraz optymalizacji parametrów in silico do obliczania współczynników dyfuzji za pomocą symulacji.

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

In vitro cultivated skin models have become increasingly relevant for pharmaceutical and cosmetic applications, and are also used in drug development as ...

Ogólnym celem tego protokołu jest określenie przepuszczalności i współczynników dyfuzji modeli 3D skóry w systemie wkładek z małą membraną. Zagadnienia te mogą pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące inżynierii tkankowej skóry 3D do zastosowań farmaceutycznych i kosmetycznych, w których przepuszczalność i współczynnik dyfuzji są istotnymi czynnikami jakości. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona bezpośredni pomiar tych współczynników w małej wkładce wielodołkowej.System małych wkładek membranowych w symulacji może być dalej modyfikowany do użytku w urządzeniach narządowych na statku i innych zastosowaniach, które wykorzystują systemy wkładek membranowych. Aby przygotować żel agarozowy, zacznij od nałożenia 28,6 mikrolitrów świeżo przygotowanego płynnego żelu agarozowego o temperaturze 80 stopni Celsjusza na każdą membranę 96-dołkowego systemu wkładek membranowych. Po 10 minutach żel zestala się i można go użyć do testu przepuszczalności.Aby przygotować model komórki kolagenowej, najpierw wymieszaj 125 mikrolitrów HBSS i jeden mililitr roztworu R kolagenu na lodzie, a następnie zneutralizuj wodorotlenkiem sodu. Następnie do mieszaniny dodać 125 mikrolitrów pierwotnych fibroblastów zawieszonych w kompletnym pożywce. I dodaj 28,6 mikrolitrów powstałego roztworu komórkowego do każdej studzienki nowego 96-dołkowego systemu wpuszczanego w membranę.Po 30 minutach w inkubatorze do hodowli komórkowych dodać 75 mikrolitrów kompletnej pożywki na powierzchnię żelu i 300 mikrolitrów kompletnej pożywki na dno każdej studzienki w celu inkubacji przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego dnia zastąp pożywkę 75 mikrolitrami wysokotemperaturowych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury dla każdego modelu komórki kolagenu i zwróć płytkę do inkubatora hodowli komórkowych na kolejne trzy dni. Czwartego dnia należy odessać pożywkę z powierzchni modelu komórkowego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze na kolejne siedem dni.Aby wykonać test przepuszczalności, należy dozować 75 mikrolitrów substancji dawcy do dowolnego systemu wkładek modelu małej studzienki i dodać 300 mikrolitrów substancji akceptorowej na dno każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wilgotności 95 procent i około 480 obr./min przez pięć godzin, przenosząc system wkładek membranowych raz na godzinę do pustej płytki 96-dołkowej i mierząc rozproszoną fluorescencję w dolnych dołkach płytki eksperymentalnej na czytniku płytek. Po zakończeniu eksperymentu z przepuszczalnością otwórz odpowiednie oprogramowanie do modelowania i rozpocznij nowy model.Wybierz Kreator modelu i model 3D. Dodaj Transport rozcieńczonych gatunków i kliknij badanie. Następnie wybierz opcję Zależne od czasu i kliknij gotowe.W obszarze Definicje globalne kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać parametry i wprowadzić parametry geometryczne i fizyczne do siatki. Skonfiguruj geometrię systemu wkładania membrany na podstawie eksperymentów i kliknij prawym przyciskiem myszy Definicje, aby dodać dwie sondy domenowe, wybierając jedną sondę jako domenę akceptującą, a drugą jako domenę dawcy. Ustaw obie domeny na średnią z wyrażeniem C i jednostką moli na metr sześcienny.I ustaw współczynnik dyfuzji pod właściwości transportowe jeden i transport rozcieńczonych gatunków. Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać drugą właściwość transportu dwa i wybierz drugą barierę w wyborze domeny. Przy transporcie rozcieńczonych gatunków, dla wartości początkowych jeden, należy zdefiniować stężenie jako zero.Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać drugą wartość początkową dwa i wybierz dawcę jako trzecią domenę. Ustawić stężenie jako początkowe stężenie substancji donorowej fluorescencji. Kliknij prawym przyciskiem myszy transport rozcieńczonych gatunków, aby dodać symetrię jeden i wybrać wszystkie powierzchnie wyboru obwiedni, które odzwierciedlają całą geometrię.Kliknij prawym przyciskiem myszy siatkę, aby dodać dwa wolne czworościany i ustaw drugą barierę jako domenę. Kliknij prawym przyciskiem myszy dowolny czworościenny, aby dodać rozmiar wstępnie zdefiniowanej siatki do bardzo drobnej. W drugim wolnym czworościanie ustaw akceptor i donor jako domeny, a wstępnie zdefiniowaną siatkę na drobniejszy.Następnie w obszarze badania pierwszego kliknij przycisk Oblicz, aby rozpocząć symulację. Aby dopasować współczynnik dyfuzji do danych wygenerowanych przez symulację dyfuzji, otwórz menu dodawania psychicznego i wybierz matematykę. Znajdź optymalizację i czułość.Wybierz optymalizację i kliknij dodaj do komponentu. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy definicje, aby dodać zmienne i ręcznie wprowadź zmienne z tabeli trzeciej. Następnie, w menu sprzężenia komponentów, kliknij prawym przyciskiem myszy definicje, dodaj średnią jeden, a następnie ręcznie dodaj akceptora jako nazwę operatora i wybierz domenę pierwszą.Wyeksportuj dane eksperymentalne do nowego dokumentu tekstowego. Użyj średnika, aby oddzielić dane na kolumny, i podziału wiersza, aby oddzielić dane na wiersze. Kliknij prawym przyciskiem myszy optymalizację, aby dodać globalny cel najmniejszych kwadratów i dołączyć dokument tekstowy do danych eksperymentalnych.Kliknij globalny cel najmniejszych kwadratów, aby zdefiniować pierwszą kolumnę jako pierwszą kolumnę czasu, a drugą kolumnę jako pierwszą kolumnę wartości. W kolumnie wyrażenie wartości wprowadź zmienną C.Kliknij prawym przyciskiem myszy optymalizację, aby dodać globalne zmienne sterujące jeden. I zadeklaruj wyszukiwanie podkreślenia D jako zmienną z początkową wartością jeden, dolną granicą zera i górną granicą 1 000.Kliknij prawym przyciskiem myszy badanie pierwsze, aby dodać optymalizację. I wybierz SNOPT jako metodę solwera optymalizacji. Ustaw tolerancję optymalności na jeden do potęgi minus osiem.Następnie ustaw współczynnik dyfuzji na barierze na D. Ustaw czas symulacji w badaniu ustawienie od zera sekund do 22 000 sekund w odstępie 100 sekund i kliknij przycisk Oblicz, aby rozpocząć optymalizację parametrów. Analiza histologiczna modelu komórki kolagenu ujawnia niewielkie zabarwienie fibroblastów w macierzy centralnej. W górnej części macierzy kolagenowej można zaobserwować warstwę zawierającą wiele jąder, prawdopodobnie składającą się z dorosłych ludzi o niskiej zawartości wapnia i wysokiej temperatury.Użycie soli sodowej fluoresceiny i dekstranu izotyocyjanianu fluoresceiny pozwala zweryfikować wpływ wielkości cząsteczki substancji dyfuzyjnej, która ujawnia, że w przypadku małych rozmiarów cząsteczek symulacja i dane eksperymentalne są zgodne dla obu cząsteczek. Większe rozmiary cząsteczek generują jednak większe odchylenia w progresjach krzywych w symulacjach, wykazując opóźnienie na początku i silniejszy wzrost w późniejszym przebiegu wykresów. Rzeczywiście, współczynnik przenikania zmniejsza się wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki, przy czym symulowane współczynniki zachowują się podobnie do eksperymentalnych współczynników przepuszczalności.Warto zauważyć, że większość modeli, które wykorzystują wysokotemperaturowe keratynocyty o niskiej zawartości wapnia i niskiej temperaturze u dorosłych, ma niższe współczynniki przenikania i dyfuzji w porównaniu z modelami bez wysokotemperaturowych keratynocytów o niskiej zawartości wapnia i niskiej zawartości wapnia. Model symulacji kolagenu można ustalić w ciągu 11 do 12 dni, a pomiar przenikania można wykonać w ciągu sześciu godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Podczas wykonywania zabiegu ważne jest, aby warunki brzegowe, takie jak temperatura, objętość wypełnienia, stężenie nakładanej substancji, wilgotność i proces membranowy, były stałe, aby zmniejszyć zmienność współczynnika przenikania.Za pomocą tej symulacji modułu można zmniejszyć wysiłek eksperymentalny i przewidzieć długoterminową wydajność. Może być również dostosowany do innych urządzeń do przenikania lub systemów własności narządów. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się zastosowaniami farmaceutycznymi i kosmetycznymi, a także rozwojowi interakcji w inżynierii tkankowej w celu zbadania procesów przenikania dyfuzji w sztucznych tkankach.

a-method-for-determination-simulation-permeability-diffusion-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Ten film demonstruje metodę badania przenikania przez model bariery krew-mózg (BBB) in vitro przy użyciu astrocytów i komórek śródbłonka na wkładce membranowej, z wolnym FITC i ferrytyną obciążoną FITC. FITC-ferrytyna wiązała się z receptorami na komórkach śródbłonka i przenikała przez barierę błonową do dolnej komory, podczas gdy wolna FITC wykazywała ograniczoną przenikalność i pozostawała w górnej komorze.

Badanie przenikania FITC i FITC-ferrytyny przez model bariery krew-mózg in vitro

Wiele zastosowań terapeutycznych wymaga bezpiecznego i wydajnego transportu nośników leków i ich ładunków przez bariery komórkowe w ciele.  W artykule opisano adaptację uznanych metod do oceny szybkości i mechanizmu transportu nanonośników leków (NC) przez bariery komórkowe, takie jak nabłonek przewodu pokarmowego (GI).

Modele i metody oceny transportu systemów dostarczania leków przez bariery komórkowe

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Tutaj opisana jest metoda wykorzystująca system infekcji oparty na wkładce membranowej do badania wpływu Streptolizyny S, wydzielanej toksyny wytwarzanej przez Streptococcus grupy A, na keratynocyty. System ten może być z łatwością zastosowany do badania innych wydzielanych białek bakteryjnych na różnych typach komórek gospodarza podczas infekcji.

Wdrożenie systemu infekcji opartego na wkładce membrany przepuszczalnej w celu zbadania wpływu wydzielanych toksyn bakteryjnych na komórki gospodarza ssaków

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Prezentujemy protokół do wysokoprzepustowej produkcji kanałów naczyniowych o elastycznych rozmiarach i pożądanych wzorach na standardowej sześciodołkowej płytce przy użyciu technologii biodruku 3D, określanej jako naczynia na płytce (VOP). Platforma ta ma potencjał, aby przyspieszyć rozwój terapii zaburzeń związanych z upośledzonym śródbłonkiem.

Wysokoprzepustowa metoda biodruku do modelowania przepuszczalności naczyń krwionośnych na standardowych płytkach sześciodołkowych z elastycznością rozmiaru i wzoru

Poznaj metodę symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelach 3D przy użyciu systemu wkładów membranowych. Technika ta umożliwia optymalizację parametrów dla inżynierii tkankowej w zastosowaniach farmaceutycznych i kosmetycznych.

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych (Wideo) | JoVE Journal

Metoda wyznaczania i symulacji przepuszczalności i dyfuzji w modelu tkankowym 3D w systemie wkładów membranowych dla płytek wielodołkowych

Przeglądaj więcej filmów