Name: Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę immunohistochemiczną do wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny w tkankach mózgu myszy z użyciem amplifikacji sygnału tyramidowego. Technika umożliwia mapowanie przestrzenne 5hmC i 5caC w neuronach oraz komórkach glejowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jednostce Zaawansowanej Mikroskopii (Szkoła Nauk Przyrodniczych, Uniwersytet w Nottingham) oraz zespołowi Histologii MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edynburg), Instytutowi Neuronauki w ULB i FNRS za pomoc i wsparcie. Prace te były wspierane przez MRC (MR/L001047/1 do A.D.J.).

Wszystkie procedury związane ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z komisją etyczną Uniwersytetu w Nottingham.
1. Wybór odpowiedniego preparatu tkankowego do barwienia immunologicznego
<ol>
	<li>Wygeneruj zatopiony w parafinie wycinek zarodków myszy CD1 typu dzikiego i dorosłych tkanek mózgowych, jak opisano wcześniej25. Do metody barwienia immunologicznego należy użyć skrawków tkanki mózgowej utrwalonych 4% formaldehydem (FA) lub 4% paraformaldehydem (PFA)25. 
	nuta: Stosowanie skrawków tkanek osadzonych w parafinie wymaga dewaxingu przed znakowaniem przeciwciał. Ponieważ leczenie 2 - 4 M kwasem solnym (HCl) zastosowane w protokole denaturacji DNA nie jest zgodne z większością strategii odzyskiwania antygenu, zalecamy stosowanie skrawków krio- lub mikrotomowych do jednoczesnego wykrywania pochodnych utleniania 5 mC z markerami białkowymi.</li>
</ol>
2. Odparafinowywanie skrawków tkanek zatopionych w parafinie
<ol>
	<li>W działającej komorze bezpieczeństwa klasy II umyj skrawki tkanek zatopionych w parafinie w słoiku z kopliny wypełnionym ksylenem, 2 razy po 10 minut w temperaturze RT. 
	nuta: Ważne jest, aby używać świeżego ksylenu, ponieważ niepełne usuwanie parafiny może prowadzić do niespójnych wzorów barwienia.</li>
	<li>Po odwoskowaniu należy szybko nawodnić skrawki tkanki, myjąc kolejno w 95, 75 i 50% etanolu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
3. Utrwalanie i przepuszczalność skrawków krio- i mikrotomów
<ol>
	<li>Napraw uwodnione skrawki tkanki, umieszczając je w lodowato zimnym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć nadmiar utrwalacza, przemłukując skrawki solą fizjologiczną w PBS (bufor fosforanowy) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Skrawki tkanek należy przeniknąć, umieszczając je w słoiku z kopliny wypełnionym PBX (0,5% Triton X-100 w PBS) na 30 minut w temperaturze pokojowej. Usuń nadmiar PBX, myjąc skrawki na krótko w PBT (0,01% Tween 20 w PBS).</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne dla pochodnych Oxi-5mC
<ol>
	<li>Umieścić przepuszczalne skrawki w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu usunięcia DNA. 
	nuta: Chociaż wyższe stężenia HCl (np. 4 N) prowadzą do bardziej efektywnej denaturacji DNA, nie są one kompatybilne z jednoczesnym wykrywaniem oksy-mC z DAPI.</li>
	<li>Umieść skrawki w 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl. Alternatywnie, umyj sekcje trzy razy po 5 minut każda w PBS. Inkubować skrawki w PBT przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń płyn z obszaru otaczającego część tkanki, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia części tkanki na dowolnym etapie, delikatnie potrząsając szkiełkiem. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcję bez dotykania sekcji. 
	nuta: Hydrofobowy długopis barierowy zmniejsza objętość przeciwciała wymaganego do barwienia tkanki i może pozwolić na barwienie wielu sekcji różnymi przeciwciałami na tym samym szkiełku.</li>
	<li>Inkubować skrawki w 100 μl roztworu blokującego (10% albuminy surowicy bydlęcej w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. 
	nuta: Pominięcie tego kroku nie wpłynęłoby na skuteczność barwienia zmodyfikowanych zasad cytozynowych.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek w 100 μl mysiego monoklonalnego anty-5hmC w rozcieńczeniu 1:5 000 i rozcieńczeniu 1:1 000 króliczych poliklonalnych przeciwciał pierwszorzędowych anty-5caC w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. Alternatywnie, w razie potrzeby przeprowadzić inkubację przez noc w temperaturze 4 °C. 
	nuta: Skrawki przetworzone bez przeciwciał pierwszorzędowych mogą służyć jako odpowiednie kontrole ujemne dla procedury barwienia. Mysie embrionalne skrawki mózgu z 12,5 dnia po stosunku wzbogacone w 5caC, 5fC i 5hmC 20 mogą być wykorzystane jako kontrola pozytywna.</li>
	<li>Usuń nadmiar przeciwciał, myjąc skrawki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez 5 minut każda w słoiku Coplin w temperaturze RT. 
	nuta: Zwiększenie objętości roztworów myjących może zmniejszyć plamienie tła.</li>
	<li>Usuń nadmiar PBT i, jeśli to konieczne, ponownie owiń sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową.</li>
	<li>Wykonaj rozcieńczenie 1:400 koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z HRP i rozcieńczenie 1:400 przeciwciała anty-mysiego 555 w roztworze blokującym.</li>
	<li>Inkubować skrawki tkanek w 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych z kroku 4.9 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
	<li>Umyj skrawki tkanek w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy po 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić skrawki tkanki w 100 μl tyramidu rozcieńczonego w stosunku 1:200 w buforze wzmacniającym sygnał tyramidu na 2 minuty w temperaturze suchej.</li>
	<li>Natychmiast usunąć nadmiar roztworu tyramidu, myjąc szkiełka trzykrotnie po 5 minut każde w PBT.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast przykryj sekcje kroplą medium montażowego (patrz Lista materiałów).</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach chusteczki i natychmiast uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.</li>
	<li>Skrawki tkanek przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Zbadaj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 405, 488 i/lub 555 nm (powiększenie 10 - 40x).</li>
</ol>

<ol><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes Dev. 16, 6-21 (2002).</li>
<li>Reik, W., Dean, W., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in mammalian development.</a> Science. 293, 1089-1093 (2001).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat Genet. 33, 245-254 (2003).</li>
<li>Li, E., Bestor, T. H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutation+of+the+DNA+methyltransferase+gene+results+in+embryonic+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality.</a> Cell. 69 (6), 915-926 (1992).</li>
<li>Okano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferases+Dnmt3a+and+Dnmt3b+are+essential+for+de+novo+methylation+and+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development.</a> Cell. 99 (3), 247-257 (1999).</li>
<li>Cedar, H., Bergman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+of+DNA+methylation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Programming of DNA methylation patterns.</a> Annu Rev Biochem. 81, 97-117 (2012).</li>
<li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Chouliaras, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consistent+decrease+in+global+DNA+methylation+and+hydroxymethylation+in+the+hippocampus+of+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Consistent decrease in global DNA methylation and hydroxymethylation in the hippocampus of Alzheimer's disease patients.</a> Neurobiol Aging. 34, 2091-2099 (2013).</li>
<li>Jowaed, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+regulates+alpha-synuclein+expression+and+is+decreased+in+Parkinson%27s+disease+patients%27+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains.</a> J Neurosci. 30, 6355-6359 (2010).</li>
<li>Reik, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+at+onset+in+Huntington%27s+disease+and+methylation+at+D4S95%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Age at onset in Huntington's disease and methylation at D4S95.</a> J Med Genet. 30, 185-188 (1993).</li>
<li>Landgrave-Gòmez, J., Mercado-Gòmez, O., Guevara-Guzmán, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurological+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases.</a> Front Cell Neurosci. 27, 9-58 (2015).</li>
<li>Seisenberger, S., Peat, J. R., Hore, T. A., Santos, F., Dean, W., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+DNA+methylation+in+the+mammalian+life+cycle%3A+building+and+breaking+epigenetic+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 368 (1609), (2013).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+Tet+protein-mediated+5-+methylcytosine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of Tet protein-mediated 5- methylcytosine oxidation.</a> Genes Dev. 25, 2436-2452 (2011).</li>
<li>Oswald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+demethylation+of+the+paternal+genome+in+the+mouse+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote.</a> Curr Biol. 10 (8), 475-478 (2000).</li>
<li>Ooi, S. K., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorful+history+of+active+DNA+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The colorful history of active DNA demethylation.</a> Cell. 133 (7), 1145-1148 (2008).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+proteins+can+convert+5-methylcytosine+to+5-formylcytosine+and+5-carboxylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine.</a> Science. 333, 1300-1303 (2011).</li>
<li>He, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-mediated+formation+of+5-carboxylcytosine+and+its+excision+by+TDG+in+mammalian+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA.</a> Science. 333, 1303-1307 (2011).</li>
<li>Wheldon, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+accumulation+of+5-carboxylcytosine+indicates+involvement+of+active+demethylation+in+lineage+specification+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transient accumulation of 5-carboxylcytosine indicates involvement of active demethylation in lineage specification of neural stem cells.</a> Cell Rep. 7, 1353-1361 (2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-resolution+analysis+of+5-hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome.</a> Cell. 149, 1368-1380 (2012).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+assisted+bisulfite+sequencing+%28CAB-Seq%29+for+5-carboxylcytosine+detection+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Chemical modification assisted bisulfite sequencing (CAB-Seq) for 5-carboxylcytosine detection in DNA.</a> J Am Chem Soc. 26, 9315-9317 (2013).</li>
<li>Globisch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Szwagierczak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantifi+cation+of+5-+hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantifi cation of 5- hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, e181(2010).</li>
<li>Ruzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+distribution+of+high+levels+of+genomic+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific distribution of high levels of genomic 5-hydroxymethylcytosine in mammalian development.</a> Cell Res. 21, 1332-1334 (2011).</li>
<li>Almeida, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-quantitative+immunohistochemical+detection+of+5-hydroxymethyl-cytosine+reveals+conservation+of+its+tissue+distribution+between+amphibians+and+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Semi-quantitative immunohistochemical detection of 5-hydroxymethyl-cytosine reveals conservation of its tissue distribution between amphibians and mammals.</a> Epigenetics. 7, 137-140 (2012).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341, 1237905(2013).</li>
<li>Santos, F., Dean, W. Chapter 11, Using immunofluorescence to observe methylation changes in mammalian preimplantation embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantos%2C+F+%22Nuclear+reprogramming+methods+and+Protocols%22">Nuclear reprogramming methods and Protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. 129-138 (2006).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+5-carboxycytosine+recognition+by+RNA+polymerase+II+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for 5-carboxycytosine recognition by RNA polymerase II elongation complex.</a> Nature. 523, 621-625 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Chociaż zgłaszana niska obfitość pochodnych utleniania 5mC, 5fC i 5caC w niektórych tkankach stanowiłaby znaczące ograniczenia dla standardowego protokołu immunochemicznego, włączenie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą pozwoliło na wykrycie tych modyfikacji cytozyny w utrwalonych tkankach i komórkach (Figura 2). Jednak optymalny czas inkubacji z roztworem tyramidu powinien być zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmacniania sygnału tyramidowego, w którym obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału na podstawie tyramidu, szczegóły patrz Almeida i in. 2012 26. Ponadto stosunek sygnału do tła można znacznie poprawić, przenosząc płyny do płukania w słoiku z Coplinu, aby umożliwić skuteczne usunięcie nadmiaru przeciwciał. Po inkubacji z roztworem tyramidu ważne jest, aby natychmiast zatrzymać reakcję poprzez przemycie roztworem PBT w celu zmniejszenia zabarwienia tła. Bardzo ważne jest, aby skrawki nie wyschły w żadnym momencie zabiegu.
Skuteczność depulacji DNA można poprawić, przeprowadzając reakcję odpieniania w temperaturze 37 °C. Podczas gdy użycie 4 N HCl zamiast 2 N zwiększa barwienie zmodyfikowanych form 5mC przy użyciu 4 N HCl do depulacji DNA nie pozwoliłoby na jednoczesne barwienie z DAPI, ponieważ oddziałuje on wyłącznie z dwuniciowym DNA.
Chociaż technika ta może zapewnić solidną półilościową ocenę zmodyfikowanych form zasad cytozyny, jeśli są wykrywalne, nie można jej stosować do oceny bezwzględnych poziomów 5mC lub jego pochodnych utleniania. W związku z tym zalecamy stosowanie innych podejść uzupełniających, ale ilościowych16, 19 -24. Od czasu odkrycia pochodnych utleniania 5mC w genomach ssaków opracowano kilka podejść do badania ich ról biologicznych16, 19-24. Chociaż podejścia te mogą być cenne w określaniu bezwzględnych poziomów pochodnych utleniania 5mC, nie dostarczają informacji na temat ich rozkładu przestrzennego20, 26. Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną tutaj metodę do mapowania przestrzennego rozkładu i lokalizacji pochodnych utleniania 5mC w różnych typach komórek rozwijającego się i dorosłego mózgu20
Ujawniając ich rozmieszczenie przestrzenne20, technika ta może mieć kluczowe znaczenie dla zrozumienia biologicznych implikacji i losu utlenionych pochodnych 5mC w różnych kontekstach biologicznych, w których można wykryć te zmodyfikowane pochodne 5mC, w tym różnicowanie komórkowe, rozwój i chorobę. Ponadto opisana tutaj metoda może dać półilościową ocenę utlenionych pochodnych 5mC w różnych tkankach, oceniając kinetykę reakcji peroksydazy (która jest proporcjonalna do intensywności barwienia) w różnych czasach inkubacji tyramidem26.

Metylacja zasad cytozyny w DNA (5mC) stanowi główny znacznik epigenetyczny występujący w genomach kręgowców związany z wyciszaniem transkrypcji1. 5mC jest wprowadzane i utrzymywane przez metylotransferazy DNA2-5 i wykazano, że odgrywa ważną rolę w wielu procesach biologicznych, w tym imprintingu genomu, inaktywacji chromosomu X, różnicowaniu i rozwoju komórek3, 6. W związku z tym zaburzenie wzorców genomowych 5mC wiąże się z wieloma chorobami7, 8-11. Pomimo postępów w zrozumieniu roli 5mC w rozwoju i chorobie, nadal pozostaje w dużej mierze nieznane, w jaki sposób ślad ten jest usuwany w tkankach rozwijających się i dorosłych. Ostatnio zaproponowano kilka potencjalnych mechanizmów demetylacji DNA, w tym aktywne i pasywne mechanizmy demetylacji12, 13, 14, 15. Odkrycie produktów sekwencyjnego utleniania 5mC, w którym pośredniczy 10-11 enzymów translokacyjnych (tet1/2/3), takich jak 5-hydroksylometylocytozyna (5hmC), 5-formylocytozyna (5fC) i 5-karboksylcytozyna (5caC) w eukariotycznym DNA 16, 17, 18, 19 wywołało spekulacje, czy mogą one służyć jako produkty pośrednie procesów demetylacji DNA lub działać jako stabilne znaczniki epigenetyczne same w sobie13. Podczas gdy wykazanie, że składnik naprawy przez wycinanie zasady, glikozylaza tymina-DNA (TDG) może wiązać i usuwać zarówno 5fC, jak i 5caC z DNA19, 20, sugeruje rolę zmodyfikowanych pochodnych 5mC w aktywnej demetylacji DNA. Ostatnie dowody wskazujące, że 5fC/5caC może modulować szybkość procesywności RNA II wskazują na potencjalny udział tych znaczników w regulacji transkrypcji29. Ze względu na to potencjalne znaczenie biologiczne utlenionych form 5mC, do badania ich dystrybucji genomowej i globalnej zawartości zastosowano szereg technik biochemicznych i opartych na przeciwciałach16, 19-24.
Biorąc pod uwagę, że większość organów kręgowców składa się z różnych typów komórek i że rozkład zmodyfikowanych zasad cytozyny jest specyficzny dla tkanek i typów komórek 16-18, 20, 23, 25-27, określenie przestrzennego rozkładu utlenionych pochodnych 5mC w różnych tkankach staje się ważnym zadaniem eksperymentalnym niezbędnym do odkrycia ich funkcji biologicznych. Większość podejść biochemicznych i opartych na przeciwciałach nie dostarcza żadnych informacji przestrzennych dotyczących rozmieszczenia zmodyfikowanych form 5mC w różnych typach tkanek i komórek. W przeciwieństwie do tego, techniki oparte na immunochemii mogą zapewnić szybkie narzędzie do oceny rozkładu przestrzennego i lokalizacji jądrowej 5mC28 i jego utlenionych pochodnych20. To powiedziawszy, zgłaszana bardzo niska obfitość 5fC (20 na każde 106 cytozyny) i 5caC (3 na każde 106 cytozyny) w genomie myszy18 stanowi poważne wyzwanie dla standardowej immunochemii.
Tutaj opisujemy wysoce czułą metodę immunochemiczną, która zapewnia solidne i szybkie wykrywanie utlenionej formy cytozyny w tkance mózgowej ssaków. Poprzez włączenie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą w połączeniu z etapem amplifikacji sygnału, metoda ta pozwala uniknąć wyzwań związanych z wykrywaniem bardzo niskich ilości 5fC i 5caC. Ponadto technika ta może być wykorzystana do jednoczesnego wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny z markerami specyficznymi dla linii, skutecznie uzupełniając inne podejścia w wyjaśnianiu biologicznych funkcji tych znaczników epigenetycznych.

<table><tbody><tr><td>Słoik z kopiny</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-48585-30</td><td>Ksylen</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> wykonany ze szkła <td>Używaj tylko w komorze bezpieczeństwa klasy II</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12821680</td><td>pH 7,5, filtrowany przed użyciem</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Po przygotowaniu może być przechowywany w temperaturze -20 &deg; C w porcjach przez kilka miesięcy</td></tr><tr><td>4% formaldehydu&nbsp; Panie przewodniczący, panie i panowie!</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Po wyprodukowaniu może być przechowywany w temperaturze -20 & deg; C w podakach przez kilka miesięcy</td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny denaturowany, stopień histologiczny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64-17-5</td><td>95, 75, 50% w PBS</td></tr><tr><td>0,01% Tween 20 w PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>PBT</td></tr><tr><td>0,5% Triton X-100 w PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>PBX</td></tr><tr><td>2 N HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71826</td><td>ostrzeżenie skrajnie toksyczny</td></tr><tr><td>100 mM Tris-HCl&nbsp;</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td>pH dostosowane do 8,5</td></tr><tr><td>hydrofobowy długopis barierowy</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td>do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Szkiełkowa komora wilgotnościowa</td><td>Laboratorium Urządzeń Naukowych</td><td>197-BL</td><td></td></tr><tr><td>mysie przeciwciało anty-5mC</td><td>Diagenode</td><td>C15200081</td><td>monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-5hmC</td><td>Motyw aktywny</td><td>39791</td><td>królik poliklonalny przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-5caC</td><td>Motyw aktywny</td><td>61225</td><td>królicze poliklonalne przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>sprzężone z peroksydazą przeciwciało anty-królicze seconday</td><td>Dako</td><td>K1497</td><td></td></tr><tr><td>555-kongjuowane kozie przeciwciało anty-mysie</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-11005</td><td>&nbsp; przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>10% BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td>Roztwór blokujący</td></tr><tr><td>22 x 32 mm Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>BDH</td><td>406/0188/24</td><td></td></tr><tr><td>System wzmacniania sygnału tyramidowego</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>Inne sprzężone z fluorochomami przeciwciała seconday mogą być stosowane do kodetekcji oksy-5mC&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Podłoże montażowe z DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Bezbarwny lakier</td><td></td><td></td><td></td>do paznokci</tr><tr><td>poliklonalne przeciwciało poliklonalne anty-GFAP z kurczaka</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA5-18598</td><td>1:400 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-NeuN mysie przeciwciało monoklonalne</td><td>Merck milipore</td><td>MAB377B</td><td>rozcieńczenie 1:400</td></tr></tbody></table>

wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry

Metylacja zasad cytozynowych (5-metylocytozyna, 5mC) występująca w genomach kręgowców jest zwykle związana z wyciszaniem transkrypcji. 5-hydroksylometylocytozyna (5hmC), 5-formylocytozyna (5fC) i 5-karboksylcytozyna (5caC) to niedawno odkryte zmodyfikowane zasady cytozyny wytwarzane przez enzymatyczne utlenianie 5mC, których funkcje biologiczne pozostają stosunkowo niejasne. Zastosowano szereg podejść, od technik biochemicznych po techniki oparte na przeciwciałach, aby zbadać dystrybucję genomu i globalną zawartość tych modyfikacji w różnych systemach biologicznych. Chociaż niektóre z tych podejść mogą być przydatne do ilościowej oceny tych zmodyfikowanych form 5mC, większość z tych metod nie dostarcza żadnych informacji przestrzennych dotyczących rozkładu tych modyfikacji DNA w różnych typach komórek, wymaganych do prawidłowego zrozumienia ich ról funkcjonalnych. W tym artykule przedstawiamy bardzo czułą metodę immunochemicznego wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny. Metoda ta pozwala na jednoczesne wykrywanie tych znaczników epigenetycznych z markerami linii białek i może być wykorzystana do badania ich lokalizacji jądrowej, przyczyniając się w ten sposób do rozszyfrowania ich potencjalnych ról biologicznych w różnych kontekstach eksperymentalnych.

Aby określić rozkład 5hmC w przekrojach tkanki mózgowej, przeprowadziliśmy jednoczesną detekcję tej modyfikacji epigenetycznej wraz z markerem neuronów pomitotycznych, NeuN, wykorzystując komercyjne przeciwciało anty-5hmC, które specyficznie oddziałuje z tym znakiem, a nie z innymi formami zmodyfikowanej cytozyny20, 25. Analiza immunohistochemiczna rozkładu 5hmC i 5caC w dorosłym mózgu wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie 5hmC kolokalizuje z komórkami NeuN-dodatnimi, NeuN-ujemne komórki glejowe wykazują niższe poziomy genomowego 5hmC (Rysunek 1)20.
Wcześniej wykazaliśmy, że zależne od białek Tet utlenianie 5mC zachodzi podczas specyfikacji linii komórek macierzystych neuronów (NSCs) 20. Mimo że w NSCs są one niewykrywalne immunochemicznie, 5fC i 5caC wykazują wyraźne barwienie immunohistochemiczne we wczesnych etapach różnicowania NSCs w kierunku linii neuronalnych i glejowych. Oba te znaczniki gromadzą się przejściowo równocześnie z pojawieniem się markerów wczesnego różnicowania neuronalnego i glejowego20. Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się NSCs, przeprowadziliśmy podwójne barwienie tego znacznika wraz z markerem glejowym GFAP w utrwalonych kulturach NSCs po 3 dniach indukcji różnicowania glejowego. W przeciwieństwie do NSCs lub dojrzałych astrocytów (dane nie pokazane), zaobserwowaliśmy silny sygnał 5caC w stosunkowo dużej proporcji komórek wykazujących ekspresję GFAP w tych kulturach (Ryc. 2)20.
<img alt="Barwienie immunofluorescencyjne, badanie neurobiologiczne, 5hmC, NeuN, DAPI, nałożenie markerów komórkowych." src="/files/ftp_upload/54416/54416fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Podwójne barwienie immunocytochemiczne 5hmC (zielony) i NeuN (czerwony) w tkance mózgu dorosłego osobnika z przeciwbarwieniem DAPI (niebieski). Przedstawiono poszczególne kanały oraz widok scalony. Paski skali wynoszą 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunobarwienie GFAP i 5caC, obraz mikroskopowy, analiza ekspresji białek astrocytów." src="/files/ftp_upload/54416/54416fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Podwójne immunobarwienie 5caC i GFAP w hodowli NSC w 3. dniu różnicowania glialnego. Przedstawiono poszczególne kanały oraz obraz scalony. Paski skali wynoszą 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54416/54416fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu immunochemicznego jest ocena przestrzennego rozmieszczenia zmodyfikowanych form cytozyny w różnych kontekstach tkankowych i komórkowych, z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą oraz tyramidowego wzmocnienia sygnału. Metoda ta pozwala przełamać ograniczenia innych technik, które nie dostarczają informacji przestrzennych niezbędnych do zrozumienia funkcji biologicznej zmodyfikowanych form cytozyny. Ponadto metoda ta umożliwia jednoczesną detekcję zmodyfikowanych form cytozyny wraz z markerami linii białkowych i może być wykorzystywana do badania ich lokalizacji jądrowej.Aby rozpocząć tę procedurę, należy utrwalić rehydratyzowane przekroje tkanek embrionów myszy CD1 typu dzikiego oraz tkanek mózgu osobników dorosłych, umieszczając je w lodowatym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy usunąć nadmiar utrwalacza, przemywając przekroje w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W kolejnym kroku należy przepermabilizować przekroje tkanek, umieszczając je w naczyniu Coplina wypełnionym PBX na 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń nadmiar PBX, krótko płucząc przekroje w PBT. Teraz umieść permeabilizowane przekroje w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu depurynacji DNA. Następnie przenieś przekroje do 10 millimolar Tris-Hcl na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl.Alternatywnie, wypłucz skrawki trzy razy przez pięć minut każdy w PBS. Inkubuj skrawki w PBT przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń ciecz z obszaru otaczającego skrawki tkanek.W międzyczasie należy utrzymywać przekroje tkanek w stanie wilgotnym. Użyj hydrofobowego pisaka do tworzenia bariery, aby otoczyć przekroje, nie dotykając ich bezpośrednio. Następnie inkubuj przekroje w 100 µL roztworu blokującego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.Następnie inkubuj skrawki tkanki w 100 µL roztworu zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko 5hmC (mysie monoklonalne) w rozcieńczeniu 1:5000 oraz przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko 5caC (królicze poliklonalne) w rozcieńczeniu 1:1000 w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie inkubację można przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie usuń nadmiar przeciwciał, przemywając skrawki w naczyniu Coplina wypełnionym PBT trzykrotnie po pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie usuń nadmiar PBT i w razie potrzeby ponownie obrysuj sekcje markerem hydrofobowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową. Po tym wykonaj rozcieńczenie 1:400 przeciwciała koziego anty-króliczego sprzężonego z HRP oraz rozcieńczenie 1:400 przeciwciała osiołkowego anty-mysiego sprzężonego z 555 w roztworze blokującym. Następnie inkubuj sekcje tkanek w 100 µl mieszaniny przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.Następnie przemyj skrawki tkanek w naczyniu Coplina wypełnionym PBT trzykrotnie przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Potem przenieś skrawki tkanek do 100 µL tyramidu w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do wzmocnienia sygnału tyramidowego na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji w roztworze tyramidu powinien zostać zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmocnienia sygnału tyramidowego, w której obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału opartego na tyramidzie.Następnie usuń nadmiar roztworu tyramidu, myjąc preparaty trzy razy po pięć minut w PBT. Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast pokryj przekroje kroplą medium montażowego. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkę na przekroje tkankowe i zabezpiecz krawędzie szkiełka lakierem do paznokci.Następnie należy przechowywać skrawki tkanek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Aby określić rozkład 5hmC w skrawkach tkanki mózgowej, przeprowadzono detekcję tej modyfikacji epigenetycznej wraz z NeuN, markerem neuronów postmitotycznych. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie na 5hmC kolokalizowało z komórkami NeuN-dodatnimi, komórki glejowe NeuN-ujemne charakteryzowały się niższym poziomem genomowego 5hmC.Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się neuralnych komórkach macierzystych, przeprowadzono barwienie tego markera wraz z markerem glejowym GFAP w utrwalonych kulturach neuralnych komórek macierzystych trzy dni po indukcji różnicowania glejowego. W przeciwieństwie do neuralnych komórek macierzystych lub dojrzałych astrocytów, zaobserwowano silny sygnał 5caC w dużej proporcji komórek wykazujących ekspresję GFAP. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około ośmiu godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć przygotowane wszystkie odczynniki i materiały wraz z próbkami. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać obrazowanie konfokalne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące dystrybucji jądrowej zmodyfikowanych form cytozyny. Może to pomóc w rozszyfrowaniu ich potencjalnej funkcji biologicznej.Należy pamiętać, że praca z 2 N HCl może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak korzystanie z dygestorium i stosowanie odzieży ochronnej.

detection-modified-forms-cytosine-using-sensitive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zestaw do analizy EpiMark 5-hmC i 5-mC może być stosowany do analizy i oznaczania ilościowego 5-metylocytozyny oraz 5-hydroksymetylocytozyny w obrębie konkretnego locus. Zestaw odróżnia 5-mC od 5-hmC poprzez dodanie glukozy do grupy hydroksylowej 5-hmC w reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (T4-BGT). Gdy 5-hmC występuje w kontekście CCGG, modyfikacja ta przekształca podatną na cięcie sekwencję rozpoznawaną przez MspI w sekwencję niepodatną na cięcie.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny o wysokiej czułości w tkance mózgowej myszy Balb/C

Opisano dwuetapowy proces znakowania z wykorzystaniem β-glukozylotransferazy (β-GT) w celu przeniesienia azydoglućkozy na 5-hmC, a następnie zastosowanie chemii klik w celu przeniesienia łącznika biotynowego dla łatwego i niezależnego od gęstości wzbogacenia. Ta wydajna i specyficzna metoda znakowania umożliwia wzbogacenie 5-hmC przy niezwykle niskim poziomie tła oraz wysokoprzepustowe mapowanie epigenomiczne za pomocą sekwencjonowania następnej generacji.

Selektywne wychwytywanie 5-hydroksymetylocytozyny z DNA genomowego

Ten film przedstawia protokół wykrywania sygnału podczas chromogenicznej hybrydyzacji RNA in situ. Technika ta może być stosowana do wizualnego diagnozowania aktywnej infekcji onkogennej w nienaruszonej próbce tkanki.

Wykrywanie sygnału RNA CISH: technika wykrywania sygnałów chromogennych podczas hybrydyzacji RNA in situ w nienaruszonych próbkach tkanek

Ten film opisuje technikę dot-blot do określania poziomu metylacji DNA w ludzkich chondrocytach in vitro poprzez plamienie próbek DNA na nylonowej membranie i późniejszą wizualizację za pomocą przeciwciał monoklonalnych. Pomaga to określić fenotyp chondrocytów na różnych etapach hodowli.

5-metylocytozyna Dot Blot w celu określenia stopnia metylacji DNA

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Tutaj prezentujemy protokół oparty na immunohistologicznej detekcji białka c-FOS, klasycznej technice używanej do identyfikacji populacji neuronów zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo.

Wykrywanie immunohistologiczne białka c-FOS: użyteczne narzędzie jako marker centralnych szlaków zaangażowanych w określone reakcje fizjologiczne in vivo i ex vivo

Nowo odkryte utlenione formy 5-metylocytozyny (oksy-mC), 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC), 5-formylocytozyny (5fC) i 5-karboksylcytozyny (5caC) mogą reprezentować odrębne modyfikacje DNA o unikalnych rolach funkcjonalnych. W tym miejscu opisano półilościowy przepływ pracy do wizualizacji rozkładu przestrzennego oksy-mC, profilowania intensywności sygnału i kolokalizacji.

Barwienie immunologiczne w modyfikacjach DNA: analiza obliczeniowa obrazów konfokalnych

Celem tego raportu jest opisanie protokołu do solidnego immunohistochemicznego wykrywania markerów epigenetycznych, 5-metylocytozyny (5mC) i 5-hydroksymetylocytozyny (5hmC) w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy.

Immunohistochemiczne wykrywanie 5-metylocytozyny i 5-hydroksymetylocytozyny w rozwijającej się i postmitotycznej siatkówce myszy

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania 5-hydroksymetylocytozyny w komórkach i tkankach mózgu, wykorzystujący barwienie immunofluorescencyjne i metody dot-blot DNA.

Wykrywanie 5-hydroksymetylocytozyny w nerwowych komórkach macierzystych i mózgach myszy

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę immunohistochemiczną do wykrywania zmodyfikowanych form cytozyny w tkankach mózgu myszy z użyciem amplifikacji sygnału tyramidowego. Technika umożliwia mapowanie przestrzenne 5hmC i 5caC w neuronach oraz komórkach glejowych.

Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Przeglądaj więcej filmów