Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Ogólnym celem niniejszego protokołu immunochemicznego jest ocena przestrzennego rozmieszczenia zmodyfikowanych form cytozyny w różnych kontekstach tkankowych i komórkowych, z wykorzystaniem przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą oraz tyramidowego wzmocnienia sygnału. Metoda ta pozwala przełamać ograniczenia innych technik, które nie dostarczają informacji przestrzennych niezbędnych do zrozumienia funkcji biologicznej zmodyfikowanych form cytozyny. Ponadto metoda ta umożliwia jednoczesną detekcję zmodyfikowanych form cytozyny wraz z markerami linii białkowych i może być wykorzystywana do badania ich lokalizacji jądrowej.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy utrwalić rehydratyzowane przekroje tkanek embrionów myszy CD1 typu dzikiego oraz tkanek mózgu osobników dorosłych, umieszczając je w lodowatym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy usunąć nadmiar utrwalacza, przemywając przekroje w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. W kolejnym kroku należy przepermabilizować przekroje tkanek, umieszczając je w naczyniu Coplina wypełnionym PBX na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń nadmiar PBX, krótko płucząc przekroje w PBT. Teraz umieść permeabilizowane przekroje w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu depurynacji DNA. Następnie przenieś przekroje do 10 millimolar Tris-Hcl na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl.

Alternatywnie, wypłucz skrawki trzy razy przez pięć minut każdy w PBS. Inkubuj skrawki w PBT przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń ciecz z obszaru otaczającego skrawki tkanek.

W międzyczasie należy utrzymywać przekroje tkanek w stanie wilgotnym. Użyj hydrofobowego pisaka do tworzenia bariery, aby otoczyć przekroje, nie dotykając ich bezpośrednio. Następnie inkubuj przekroje w 100 µL roztworu blokującego przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.

Następnie inkubuj skrawki tkanki w 100 µL roztworu zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko 5hmC (mysie monoklonalne) w rozcieńczeniu 1:5000 oraz przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko 5caC (królicze poliklonalne) w rozcieńczeniu 1:1000 w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie inkubację można przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie usuń nadmiar przeciwciał, przemywając skrawki w naczyniu Coplina wypełnionym PBT trzykrotnie po pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń nadmiar PBT i w razie potrzeby ponownie obrysuj sekcje markerem hydrofobowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową. Po tym wykonaj rozcieńczenie 1:400 przeciwciała koziego anty-króliczego sprzężonego z HRP oraz rozcieńczenie 1:400 przeciwciała osiołkowego anty-mysiego sprzężonego z 555 w roztworze blokującym. Następnie inkubuj sekcje tkanek w 100 µl mieszaniny przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej.

Następnie przemyj skrawki tkanek w naczyniu Coplina wypełnionym PBT trzykrotnie przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Potem przenieś skrawki tkanek do 100 µL tyramidu w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do wzmocnienia sygnału tyramidowego na dwie minuty w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji w roztworze tyramidu powinien zostać zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmocnienia sygnału tyramidowego, w której obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału opartego na tyramidzie.

Następnie usuń nadmiar roztworu tyramidu, myjąc preparaty trzy razy po pięć minut w PBT. Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast pokryj przekroje kroplą medium montażowego. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkę na przekroje tkankowe i zabezpiecz krawędzie szkiełka lakierem do paznokci.

Następnie należy przechowywać skrawki tkanek w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Aby określić rozkład 5hmC w skrawkach tkanki mózgowej, przeprowadzono detekcję tej modyfikacji epigenetycznej wraz z NeuN, markerem neuronów postmitotycznych. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie na 5hmC kolokalizowało z komórkami NeuN-dodatnimi, komórki glejowe NeuN-ujemne charakteryzowały się niższym poziomem genomowego 5hmC.

Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się neuralnych komórkach macierzystych, przeprowadzono barwienie tego markera wraz z markerem glejowym GFAP w utrwalonych kulturach neuralnych komórek macierzystych trzy dni po indukcji różnicowania glejowego. W przeciwieństwie do neuralnych komórek macierzystych lub dojrzałych astrocytów, zaobserwowano silny sygnał 5caC w dużej proporcji komórek wykazujących ekspresję GFAP. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około ośmiu godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć przygotowane wszystkie odczynniki i materiały wraz z próbkami. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać obrazowanie konfokalne w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące dystrybucji jądrowej zmodyfikowanych form cytozyny. Może to pomóc w rozszyfrowaniu ich potencjalnej funkcji biologicznej.

Należy pamiętać, że praca z 2 N HCl może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak korzystanie z dygestorium i stosowanie odzieży ochronnej.