Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii
16 sierpnia 2016
Tutaj opisujemy czułą immunochemiczną metodę mapowania przestrzennego rozkładu pochodnych utleniania 5mC opartą na użyciu przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidowego.
Ogólnym celem tego protokołu immunochemicznego jest ocena przestrzennego rozkładu zmodyfikowanych form cytozyny w różnych kontekstach tkankowych i komórkowych w oparciu o zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidu. Metoda ta pokonuje ograniczenia innych technik, które nie dostarczają informacji przestrzennych niezbędnych do zrozumienia biologicznej funkcji zmodyfikowanych form cytozyny. Ponadto metoda ta pozwala na jednoczesne wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny z markerami linii białkowej i może być wykorzystana do badania ich lokalizacji jądrowej.
Aby rozpocząć tę procedurę, napraw uwodnione skrawki tkanek zarodków myszy CD1 typu dzikiego i dorosłych tkanek mózgowych, umieszczając je w lodowatym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar utrwalacza, myjąc skrawki w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeniknąć skrawki tkanki, umieszczając je w słoiku Coplin wypełnionym PBX na 30 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń nadmiar centrali, myjąc sekcje na krótko w PBT. Teraz umieść przepuszczalne skrawki w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu odpienienia DNA. Następnie przenieś skrawki do 10-milimolowego Tris-Hcl na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl.
Alternatywnie, umyj sekcje trzy razy przez pięć minut każdy w PBS. Inkubować skrawki w PBT przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń płyn z obszaru otaczającego sekcje tkanki.
W międzyczasie utrzymuj sekcje tkanki wilgotne. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcje bez ich dotykania. Następnie inkubować skrawki w 100 mikrolitrach roztworu blokującego przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
Następnie inkubować skrawki tkanki w 100 mikrolitrach rozcieńczenia 1:5000 mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego anty-5hmC i rozcieńczenia 1:1000 króliczego poliklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego anty-5caC w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie przeprowadź inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń nadmiar przeciwciał, myjąc skrawki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej.
Następnie usuń nadmiar PBT i, jeśli to konieczne, ponownie otocz sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową. Następnie rozcieńczyć 1:400 koziego przeciwciała anty-króliczego sprzężonego z HRP i 1:400 rozcieńczenia przeciwciała sprzężonego z 555 przeciwko osłom w roztworze blokującym. Następnie inkubować skrawki tkanek w 100 mikrolitrach mieszaniny przeciwciał wtórnych przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.
Następnie umyj skrawki tkanki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś skrawki tkanki do 100 mikrolitrów tyramidu w rozcieńczeniu 1:200 w buforze wzmacniającym sygnał tyramidu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji, w którym roztwór tyramidu powinien być zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmacniania sygnału tyramidowego, w którym obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału na bazie tyramidu.
Natychmiast po tym należy usunąć nadmiar roztworu tyramide, myjąc szkiełka trzy razy przez pięć minut w PBT. Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast przykryj sekcje kroplą medium montażowego. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach chusteczki i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.
Następnie utrzymuj skrawki tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Aby określić rozkład 5hmC w skrawkach tkanki mózgowej, przeprowadzono jednoczesne wykrywanie tej modyfikacji epigenetycznej za pomocą markera neuronów postmitotycznych, NeuN. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie 5hmC kolokalizowało się z komórkami NeuN-dodatnimi, komórki glejowe NeuN-ujemne miały niższe poziomy genomowego 5hmC.
Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się nerwowych komórkach macierzystych, przeprowadzono barwienie tego markera za pomocą markera glejowego, GFAP, na utrwalonych kulturach nerwowych komórek macierzystych trzy dni po indukcji różnicowania gleju. W przeciwieństwie do nerwowych komórek macierzystych lub dojrzałych astrocytów, w dużej części komórek wykazujących ekspresję GFAP zaobserwowano silny sygnał 5caC. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby mieć przygotowane wszystkie odczynniki i materiały wraz z próbkami. Po tej procedurze można wykonać obrazowanie konfokalne w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące dystrybucji jądrowej zmodyfikowanych form cytozyny. Może to przyczynić się do rozszyfrowania ich potencjalnej funkcji biologicznej.
Nie zapominaj, że praca z 2 N Hcl może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak szafka bezpieczeństwa i odzież ochronna.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia wrażliwą metodę immunochemiczną do mapowania przestrzennego rozmieszczenia pochodnych utlenienia 5mC za pomocą przeciwciał wtórnych sprzężonych z peroksydazą i wzmocnienia sygnału tyramidowego. Metoda ta pozwala na ocenę zmodyfikowanych form cytozyny w różnych kontekstach tkankowych i komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- Rozumienie przestrzennego rozmieszczenia zmodyfikowanej cytozyny jest kluczowe dla wyjaśnienia jej funkcji biologicznych.
- Obecne techniki często nie mają rozdzielczości przestrzennej, co ogranicza ich skuteczność.
- Ta metoda umożliwia współwykrywanie z liniami markerów białkowych.
- Może być zastosowana do badania lokalizacji jądrowej modyfikacji cytozyny.
Cel badania
- Opracowanie metody mapowania rozmieszczenia pochodnych utlenienia 5mC.
- Dostarczenie informacji przestrzennych niezbędnych do zrozumienia biologicznych ról tych modyfikacji.
- Ułatwienie badania zmodyfikowanej cytozyny w różnych tkankach.
Stosowane metody
- Fiksacja sekcji tkankowych z zarodków myszy i dorosłych mózgów.
- Permeabilizacja i depurynacja DNA sekcji tkankowych.
- Inkubacja z przeciwciałami pierwotnymi specyficznymi dla zmodyfikowanej cytozyny.
- Zastosowanie wzmocnienia sygnału tyramidowego dla ulepszonego wykrywania.
Główne wyniki
- Barwienie 5hmC skolokalizało się z neuronami NeuN-dodatnimi.
- Niższe poziomy genomowego 5hmC stwierdzono w komórkach glialnych NeuN-ujemnych.
- Silne sygnały 5caC obserwowano w różnicujących się komórkach macierzystych neuronów ekspresujących GFAP.
- Metodę można wykonać w około ośmiu godzinach.
Wnioski
- Ta immunochemiczna metoda zapewnia solidne podejście do badania modyfikacji cytozyny.
- Zwiększa zrozumienie funkcji biologicznych tych modyfikacji w kontekście neuronowym.
- Środki ostrożności są niezbędne podczas obsługi reagentów takich jak 2 N HCl.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Understanding the spatial distribution of cytosine modifications is critical for deciphering epigenetic regulation in disease-relevant systems. This method enables co-detection with lineage markers, supporting target validation and mechanistic de-risking in neuroscience and oncology research. It provides predictive confidence by linking DNA modifications to cellular phenotypes in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping 5hmC and 5caC localization in specific cell types.
- Operational Value: Enables functional target validation through co-detection with NeuN and GFAP markers.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating epigenetic marks with neuronal or glial differentiation states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Quantitative Outputs: Tyramide signal amplification provides sensitive, reproducible detection of low-abundance modifications.
- Platform Reuse: Standardized protocol allows scalability across tissue types and antibody panels.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Studied in embryonic and adult brain tissues, relevant to neurodevelopmental and neurodegenerative disorders.
- Translational Continuity: Nuclear localization data supports biomarker alignment from discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Spatial resolution reduces mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical biomarker assessment, enabling iterative refinement of epigenetic targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific distribution of 5mC oxidation derivatives.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized fixation, permeabilization, and amplification steps.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts enabling comparison of modification levels across conditions.
- Translational Research: Connects epigenetic marks to cell identity markers, supporting biomarker-driven preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to multiple tissue types and antibody combinations, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking cytosine modifications to specific cellular lineages.
- Operational Value: Tyramide signal amplification ensures standardization and reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatial context for epigenetic target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on epigenetic activity in disease-relevant cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunohistochemistry and epitope retrieval techniques.
- Dependent on hydrolysis steps (2 N HCl) necessitating specialized safety equipment and training.
- Needs standardized blocking and washing protocols to minimize background signal.
- Adaptation across model systems requires validation of antibody specificity and permeabilization efficiency.
- Practical limitation: HCl treatment may affect epitope integrity for some protein targets, requiring optimization.
