Wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny za pomocą czułej immunohistochemii

Ogólnym celem tego protokołu immunochemicznego jest ocena przestrzennego rozkładu zmodyfikowanych form cytozyny w różnych kontekstach tkankowych i komórkowych w oparciu o zastosowanie przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z peroksydazą i amplifikacji sygnału tyramidu. Metoda ta pokonuje ograniczenia innych technik, które nie dostarczają informacji przestrzennych niezbędnych do zrozumienia biologicznej funkcji zmodyfikowanych form cytozyny. Ponadto metoda ta pozwala na jednoczesne wykrywanie zmodyfikowanych form cytozyny z markerami linii białkowej i może być wykorzystana do badania ich lokalizacji jądrowej.

Aby rozpocząć tę procedurę, napraw uwodnione skrawki tkanek zarodków myszy CD1 typu dzikiego i dorosłych tkanek mózgowych, umieszczając je w lodowatym 4% PFA lub 4% FA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar utrwalacza, myjąc skrawki w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przeniknąć skrawki tkanki, umieszczając je w słoiku Coplin wypełnionym PBX na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń nadmiar centrali, myjąc sekcje na krótko w PBT. Teraz umieść przepuszczalne skrawki w 2 N HCl na 60 minut w temperaturze pokojowej w celu odpienienia DNA. Następnie przenieś skrawki do 10-milimolowego Tris-Hcl na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zneutralizować HCl.

Alternatywnie, umyj sekcje trzy razy przez pięć minut każdy w PBS. Inkubować skrawki w PBT przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie usuń płyn z obszaru otaczającego sekcje tkanki.

W międzyczasie utrzymuj sekcje tkanki wilgotne. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcje bez ich dotykania. Następnie inkubować skrawki w 100 mikrolitrach roztworu blokującego przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.

Następnie inkubować skrawki tkanki w 100 mikrolitrach rozcieńczenia 1:5000 mysiego monoklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego anty-5hmC i rozcieńczenia 1:1000 króliczego poliklonalnego przeciwciała pierwszorzędowego anty-5caC w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Alternatywnie przeprowadź inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń nadmiar przeciwciał, myjąc skrawki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej.

Następnie usuń nadmiar PBT i, jeśli to konieczne, ponownie otocz sekcje hydrofobowym pisakiem barierowym, ponieważ PBT zawiera detergent, który może osłabić barierę hydrofobową. Następnie rozcieńczyć 1:400 koziego przeciwciała anty-króliczego sprzężonego z HRP i 1:400 rozcieńczenia przeciwciała sprzężonego z 555 przeciwko osłom w roztworze blokującym. Następnie inkubować skrawki tkanek w 100 mikrolitrach mieszaniny przeciwciał wtórnych przez godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.

Następnie umyj skrawki tkanki w słoiku Coplin wypełnionym PBT trzy razy przez pięć minut każdy w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś skrawki tkanki do 100 mikrolitrów tyramidu w rozcieńczeniu 1:200 w buforze wzmacniającym sygnał tyramidu przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Czas inkubacji, w którym roztwór tyramidu powinien być zoptymalizowany eksperymentalnie dla każdej pojedynczej partii zestawu do wzmacniania sygnału tyramidowego, w którym obserwuje się liniową zależność między intensywnością sygnału a czasem trwania wzmocnienia sygnału na bazie tyramidu.

Natychmiast po tym należy usunąć nadmiar roztworu tyramide, myjąc szkiełka trzy razy przez pięć minut w PBT. Ostrożnie usuń nadmiar PBT i natychmiast przykryj sekcje kroplą medium montażowego. Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na skrawkach chusteczki i uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci.

Następnie utrzymuj skrawki tkanki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kilka godzin przed badaniem mikroskopowym. Aby określić rozkład 5hmC w skrawkach tkanki mózgowej, przeprowadzono jednoczesne wykrywanie tej modyfikacji epigenetycznej za pomocą markera neuronów postmitotycznych, NeuN. Analiza immunohistochemiczna wykazała, że podczas gdy wyraźne barwienie 5hmC kolokalizowało się z komórkami NeuN-dodatnimi, komórki glejowe NeuN-ujemne miały niższe poziomy genomowego 5hmC.

Aby określić rozkład 5caC w różnicujących się nerwowych komórkach macierzystych, przeprowadzono barwienie tego markera za pomocą markera glejowego, GFAP, na utrwalonych kulturach nerwowych komórek macierzystych trzy dni po indukcji różnicowania gleju. W przeciwieństwie do nerwowych komórek macierzystych lub dojrzałych astrocytów, w dużej części komórek wykazujących ekspresję GFAP zaobserwowano silny sygnał 5caC. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około osiem godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby mieć przygotowane wszystkie odczynniki i materiały wraz z próbkami. Po tej procedurze można wykonać obrazowanie konfokalne w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące dystrybucji jądrowej zmodyfikowanych form cytozyny. Może to przyczynić się do rozszyfrowania ich potencjalnej funkcji biologicznej.

Nie zapominaj, że praca z 2 N Hcl może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak szafka bezpieczeństwa i odzież ochronna.