Name: Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Poznaj model kolity sterowanej antygenem do badania interakcji między fagocytami jednojądrzastymi a limfocytami T CD4 w blaszce właściwej jelita grubego. Ta metoda pozwala śledzić odpowiedź immunologiczną in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JHN jest wspierany przez Szwajcarską Fundację Narodową (SNSF 310030_146290).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podobnie jak w przypadku każdego innego modelu, opisany powyżej model zapalenia jelita grubego oparty na antygenach może stwarzać kilka problemów, o których musi wiedzieć badacz wykonujący tę technikę. Podczas wstrzykiwania komórek OT-II/Red+ CD4+ T CD62L+ do gospodarzy, badacz musi być bardzo delikatny i ostrożny, aby wprowadzić igłę do jamy otrzewnej. Niezastosowanie się do tego może spowodować rozerwanie jelita myszy, co może prowadzić do śmierci, lub podskórne podanie komórek, które n...

Jelito to największa powierzchnia ciała, która jest wystawiona na działanie środowiska zewnętrznego. Ogromne ilości rezydujących mikroorganizmów kolonizują ludzkie jelito, tworząc mikrobiotę jelitową (lub mikroflorę). Szacuje się, że składa się on z nawet 100 bilionów komórek drobnoustrojów i stanowi jedno z najgęściej zaludnionych siedlisk bakteryjnych znanych w biologii1-3. W przewodzie pokarmowym bakterie kolonizują niszę jelitową, w której przeżywają i namnażają się4. W zamian mikrobiota wyposaża gospodarza w dodatkowe cechy funkcjonalne, które nie są zakodowane w jego genomie1. Na przykład mikrobiota stymuluje proliferację komórek nabłonka, wytwarza witaminy, których gospodarze nie są w stanie sami wyprodukować, reguluje metabolizm i chroni przed patogenami4-6. Biorąc pod uwagę ten korzystny związek, niektórzy autorzy sugerowali, że ludzie są "superorganizmami" lub "holobiontami", które są mieszanką genów bakteryjnych i ludzkich. Biorąc pod uwagę korzystny wpływ mikrobioty na gospodarza (ludzkiego), jelitowy układ odpornościowy musi tolerować drobnoustroje komensalne, aby umożliwić ich istnienie w świetle, ale także zabijać patogeny, które atakują od strony światła9-11. Jelitowy układ odpornościowy rozwinął mechanizmy rozróżniania nieszkodliwych i potencjalnie szkodliwych mikroorganizmów luminalnych; Mechanizmy te nie są jednak jeszcze dobrze poznane12. Utrzymanie integralności jelit wymaga ściśle regulowanej homeostazy immunologicznej, aby utrzymać równowagę między tolerancją a odpornością13. Brak równowagi w homeostazie immunologicznej przyczynia się do indukcji chorób jelit, takich jak nieswoiste zapalenie jelit (IBD)3,14.
Istnieją dwa główne typy IBD: choroba Leśniowskiego-Crohna (CD) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego (UC). Pacjenci z tymi chorobami zwykle cierpią z powodu krwawienia z odbytu, silnej biegunki i bólu brzucha15,16. Pojedyncza przyczyna IBD jest nadal nieznana, ale połączenie czynników genetycznych, wpływów środowiskowych i rozregulowanych odpowiedzi immunologicznych może być kluczowym wydarzeniem dla rozwoju choroby.
Modele zwierzęce dla IBD są używane od ponad 50 lat. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano nowe systemy modelowe IBD w celu przetestowania różnych hipotez dotyczących patogenezy IBD17,18. Najlepiej scharakteryzowanym modelem przewlekłego zapalenia jelita grubego jest model transferu komórek T, który indukuje zakłócenie homeostazy komórek T19,20. Model ten polega na przeniesieniu naiwnych limfocytów T z myszy immunokompetentnych do gospodarzy, którzy nie mają limfocytów T i B (takich jak myszy RAG-/- i SCID)16,21. Rozwój choroby w tym modelu jest monitorowany przez 3-10 tygodni poprzez ocenę obecności biegunki, zmniejszonej aktywności fizycznej i utraty masy ciała. Jest to tak zwany syndrom wyniszczenia16. W porównaniu ze zdrowymi myszami tkanka okrężnicy przeszczepionych gospodarzy jest grubsza, krótsza i cięższa16. Korzystając z modelu transferu limfocytów T, można zrozumieć, w jaki sposób różne populacje limfocytów T mogą przyczyniać się do patogenezy IBD22. Model transferu limfocytów T nie analizuje interakcji między APC a limfocytami T w procesie chorobowym w sposób specyficzny dla antygenu. Wykazano, że interakcja między komórkami szpikowymi a komórkami limfoidalnymi może być odpowiedzialna za rozwój zapalenia jelit23. Chociaż wiele aspektów IBD zostało wyjaśnionych, początkowe zdarzenia, które prowadzą do rozwoju choroby, nadal muszą być jasno zrozumiane.
Wykazano, że w przypadku braku przenoszenia mikrobioty nie można stwierdzić zapalenia jelita grubego24. Ostatnio kilka teorii sugeruje, że IBD może być wynikiem odpowiedzi immunologicznej przeciwko bakteriom komensalnym25. Autorzy zasugerowali również, że bakterie komensalne są niezbędne do wywołania stanu zapalnego w dalszej części jelita26. U zwierząt wolnych od zarazków (GF) jelitowy układ odpornościowy jest na ogół upośledzony27,28, ale kolonizacja tych myszy mieszaniną bakterii wolnych od specyficznych patogenów powoduje rozwój w pełni kompetentnego jelitowego układu odpornościowego29. W związku z tym mikrobiota wydaje się być kluczowym elementem w patogenezie IBD, zarówno jako mechanizm predysponujący do rozwoju zapalenia jelit, jak i chroniący przed jego rozwojem30,31. Obecne teorie sugerują, że IBD jest wynikiem braku równowagi mikrobiologicznej, zwanej dysbiozą, u pacjentów predysponowanych genetycznie32, ale nie jest jeszcze jasne, czy dysbioza jest przyczyną, czy konsekwencją choroby12. Biorąc pod uwagę rolę mikroorganizmów w rozwoju IBD, eksperymenty in vitro wykazały, że limfocyty T CD4 + mogą być aktywowane przez APC pulsowane bakteriami jelitowymi33,34.
Ponadto, wykazano, że antygeny różnych gatunków bakterii komensalnych, takich jak E. coli, Bacteroides, Eubacterium i Proteus, są w stanie aktywować limfocyty T CD4+ 35. Wskazuje to, że prezentacja antygenów bakteryjnych limfocytom T ma znaczenie dla rozwoju IBD. Aby zmniejszyć złożoność wielu antygenów pochodzących z mikroflory w procesie chorobowym, stworzono szczep E. coli, który wytwarza antygen OVA. Transferowe zapalenie jelita grubego wywołano przez wstrzyknięcie limfocytów T specyficznych dla OVA zwierzętom skolonizowanym przez E. coli wykazujące ekspresję OVA.
Ten model opiera się na najnowszych dowodach sugerujących, że CX3CR1+ MP, główny podzbiór komórek w blaszce właściwej okrężnicy (cLP)36, oddziałują z limfocytami T CD4+ podczas transferowego zapalenia jelita grubego37. Posłowie pobierają próbki światła jelita na obecność antygenu cząsteczkowego, takiego jak bakterie, za pomocą dendrytów36, 38,39. Wcześniejsze badania wykazały, że MP mogą również pobierać rozpuszczalne antygeny, takie jak OVA, wprowadzone do światła jelita40,41. Biorąc pod uwagę obfitość CX3CR1 + MP w cLP, możliwe jest, że komórki te mogą pobierać próbki bakterii luminalnych i wchodzić w interakcje z limfocytami T CD4. Obrazowanie konfokalne myszy przeszczepionych z limfocytami T CD4 + specyficznymi dla OVA skolonizowanymi E. coli CFP-OVA pokazuje, że CX3CR1 + MP mają kontakt z limfocytami T CD4 + OT-II podczas rozwoju zapalenia jelita grubego wywołanego antygenem. Model ten umożliwia badanie procesu prezentacji antygenu między jelitowymi APC a limfocytami T specyficznymi tylko dla określonych bakterii wykazujących ekspresję antygenu w świetle jelita.

<table><tbody><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Rotary Shake</td><td>Reiss Laborbedarf e. K.</td><td>Model 3020 GFL</td><td></td></tr> 2 <tr><td>mm szlufki szczelinowe&nbsp;</td><td>Peqlab Biotechnologie GmbH</td><td>71-2020</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell system&nbsp;</td><td>BioRad Laboratories GmbH</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Difco</td><td>244510</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5G</td><td></td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1797-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji plazmidu o wysokiej czystości</td><td>Roche</td><td>11754777001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH & Co</td><td>3810.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora żelowa&nbsp;</td><td>PEQLAB Biotechnology GmbH</td><td>40-0708</td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie barwnika</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Drabinka DNA&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0312</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny</td><td>Carl Roth GmbH & Co. KG</td><td>2218.3</td><td></td></tr><tr><td>System dokumentacji fotograficznej&nbsp;</td><td>Decon Science Tech GmbH</td><td>DeVision G&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie DNA&nbsp;</td><td>MWG-Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L182-50</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>HBO 100</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Drabinka do wstępnie barwionych białek&nbsp;</td><td>Fermentas, St. Leon-Rot, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IstanBlue Solution</td><td>Expedeon, Cambridgeshire, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa&nbsp;</td><td>Macherey-Nagel GmbH & Co. KG</td><td>741280</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła elektryczna&nbsp;</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-015-600</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-albuminy jaja kurzego&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab181688</td><td></td></tr><tr><td>Przeciw królikom IgG&nbsp; HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0545&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott</td><td>2594.00.00</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Sitka</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>CD4+ CD62 L+ Zestaw izolacyjny T&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-227&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MACS LS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny MACS MS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Separator MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Separator MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia 20G</td><td>SouthPointe Surgical Supply, Inc</td><td>FN-7903</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, neutralny buforowany, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1496904</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu VIII</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2139</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) podłoże</td><td>AppliChem</td><td>A2044, 9050</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>438456</td><td></td></tr><tr><td>Mysz BD Fc Block</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>FITC-sprzężone wiązanie mAb V&szlig; 5.1, 5.2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553189</td><td></td></tr><tr><td>sprzężony z APC mAb wiążący CD4 GK1.5&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-0041-83</td><td></td></tr><tr><td>Kaliber FACS&nbsp;</td><td>Oprogramowanie BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCS Express V3</td> Skaningowy mikroskop konfokalny <td>DeNovo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Zeiss ZEN&nbsp;</td>Płytki immunologiczne <td>Zeiss</td><td>v4.2.0.121</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp&nbsp;</td><td>NUNC, Roskilde</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona fosfataza alkaliczna</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>016-050-084</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże fosfatazy alkalicznej Sól disodowa fosforanu 4-nitrofenylu sześciowodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71768-5G</td><td></td></tr><tr><td>mAb R4-6A2</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td></td></tr><tr><td>mAb XMG1.2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td></td></tr><tr><td>TECAN mikropłytka-czytnik ELISA</td> Oprogramowanie <td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasyWin</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I rekombinowane</td><td></td><td>4536282001</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom t

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Nieswoiste zapalenie jelit (IBD) to przewlekłe zapalenie przewodu pokarmowego (GIT). Jednym z najlepszych sposobów badania mechanizmów immunologicznych zaangażowanych w chorobę jest model transferu limfocytów T zapalenia jelita grubego. W tym modelu myszy z niedoborem odporności (biorcy RAG-/-) są odtwarzane za pomocą naiwnych limfocytów T CD4 + od zdrowych gospodarzy typu dzikiego.
Ten model pozwala na badanie najwcześniejszych zdarzeń immunologicznych prowadzących do chorób i przewlekłych stanów zapalnych, kiedy stan zapalny jelit trwa nadal, ale nie zależy od zdefiniowanego antygenu. Aby zbadać potencjalną rolę komórek prezentujących antygen (APC) w procesie chorobowym, pomocne jest posiadanie modelu choroby opartego na antygenie, w którym zdefiniowany antygen pochodzenia komensalnego prowadzi do zapalenia jelita grubego. W związku z tym opracowano model zapalenia jelita grubego sterowanego przez antygen. W tym modelu OT-II limfocyty T CD4 +, które mogą rozpoznawać tylko określone epitopy w białku OVA, są przenoszone do gospodarzy RAG /- prowokowanych E. coli wykazujących ekspresję CFP-OVA. Model ten pozwala na badanie oddziaływań między APC a limfocytami T w blaszce właściwej.

Aby stworzyć model zapalenia jelita grubego indukowanego antygenem, n E. coli szczep został skonstruowany, zawierający plazmid, w którym gen CFP jest połączony z sekwencją kodującą białko owalbuminy kurczaka, a konstrukt fuzyjny jest ekspresowany pod kontrolą silnego promotora konstytutywnego Pnadmierny (Rycina 1A). Mikroskopia fluorescencyjna wykazuje, że rekombinowany *E. coli* pCFP-OVA, ale nie szczep parentalny E. col...

W tym modelu zapalenia jelita grubego napędzanego antygenem, limfocyty T OT-II CD4+ wyrażające białko czerwonej fluorescencji zostały adoptywnie przeniesione do myszy RAG-/-, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w fagocytach jednojądrzastych (MP). Gospodarzom poddano prowokację Escherichia coli (E. coli) wykazującej ekspresję białka albuminy jaja kurzego (OVA) połączonego z cyjanowym białkiem fluorescencyjnym (CFP).

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Ogólnym celem tego modelu zapalenia jelita grubego indukowanego antygenem jest ustalenie, czy monocyty i makrofagi (fagocyty jednojądrowe) wykazujące ekspresję CX3 i CR1 oddziałują z limfocytami T CD4+ i aktywują je podczas swoistego dla antygenu zapalenia jelita grubego oraz czy ta zależna od fagocytów jednojądrowych ekspansja efektorowych limfocytów T zachodzi w obrębie błony właściwej jelita. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nieswoistych zapaleń jelit, takie jak rodzaje interakcji zachodzących między komórkami prezentującymi antygen a efektorowymi limfocytami T w błonie właściwej jelita grubego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania interakcji komórek odpornościowych oraz czynników prowadzących do patogenności nieswoistych zapaleń jelit.Metoda ta wykorzystuje model zapalenia jelita grubego indukowanego transferem limfocytów T, w którym czerwone fluorescencyjne, antygenowo swoiste naiwne limfocyty T CD4 są transferowane do immunodeficyjnego gospodarza, którego komórki mononuklearne wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Po transferze komórek przeprowadza się gavage doustne niebieskich fluorescencyjnych bakterii wykazujących ekspresję antygenu. Zdarzenia immunologiczne zachodzące w blaszce właściwej błony śluzowej jelita gospodarzy mogą być monitorowane na różnych etapach rozwoju choroby.Za pomocą nożyczek do sekcji rozciąć okrężnicę wzdłużnie i wypłukać tkankę w szalce Petriego zawierającej 25 milliliters PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i śluz. Pokroić okrężnicę na kawałki o długości od pięciu do ośmiu milimetrów i umieścić powstałe fragmenty w 20 milliliters świeżego DPBS bez wapnia i magnezu, uzupełnionego o dziesięć millimolar HEPES i pięć millimolar EDTA. Mieszać probówkę z próbką na wortexie przez 30 seconds z maksymalną prędkością.Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dziesięć minut przy delikatnym wstrząsaniu w celu usunięcia nabłonka. Po zakończeniu inkubacji ponownie wymieszać w vorteksie przez 30 s. Następnie odrzucić nadsącz zawierający komórki nabłonkowe.Przenieś fragmenty tkanki do nowej probówki zawierającej 20 milliliters świeżego buforu PBS, HEPES i EDTA, a następnie powtórz inkubację wraz z etapami mieszania w wortexie przed i po niej. Po trzecim powtórzeniu wszystkie komórki nabłonka zostaną usunięte, a nadsącz stanie się przejrzysty. Delikatnie przemyj fragmenty tkanki w PBS, aby usunąć pozostałe komórki nabłonka.Pokroić fragmenty tkanki na kawałki o wymiarach 2x2 mm i przenieść je do 10 ml pożywki RPI uzupełnionej o 0,5 mg/ml kolagenazy typu VIII oraz 10 U/ml DNazy I. Próbki mieszać w wstrząsaczu typu vortex przez 30 s. Następnie inkubować kawałki tkanki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 30–35 min, mieszając zawartość probówki w wstrząsaczu typu vortex co 5 min podczas inkubacji.Po strawieniu tkanki, przecedź powstałą zawiesinę przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 70 micron przez koniczną probówkę o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz sito komórkowe raz, a następnie odwiruj zawiesinę pojedynczych komórek w wirówce. Na koniec raz przemyj komórki w PBS i odwiruj.Następnie należy określić liczbę żywych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu. E. coli produkujące białko owalbuminy z białkiem fluorescencyjnym cyjanowym aktywują produkcję interferonu gamma w komórkach OT-II in vitro, w przeciwieństwie do e.coli, które wykazują ekspresję wyłącznie CFP. Obrazowanie konfokalne 3D ex vivo tkanki okrężnicy myszy transgenicznych wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, którym podano e. coli PCFP ova, wykazuje obecność bakterii wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w kryptach okrężnicy w pobliżu komórek nabłonka jelitowego oraz ich ko-lokalizację z fagocytami jelitowymi gospodarza.U zwierząt OT-II red limfocyty T CD4 pozytywne charakteryzują się koekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego oraz V beta 5.1. Po podaniu e. coli PCFP ova, u myszy transgenicznych wykazujących deficyt limfocytów BNT i ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, którym przeszczepiono adoptywnie limfocyty T OT-II red CD4 pozytywne CD62 ligand pozytywne, dochodzi do szybkiej utraty masy ciała i rozwoju klinicznych objawów zapalenia jelita grubego.Siedem dni po transferze komórek tylko kilka fagocytów gospodarza pobrało próbki e. coli PCFP ova, a komórki OT-II dodatnie pod względem czerwonego barwnika nie są wykrywane. 14 dni po transferze komórek fagocyty gospodarza, które pobrały próbki e.cząsteczki PCFP e. coli znajdują się w bliskim sąsiedztwie adoptywnie przeniesionych komórek OT-II red pozytywnych. W 21. dniu po transferze komórek duża liczba komórek gospodarza pobrała cząsteczki PCFP e. coli, a donorskie komórki OT-II red pozytywne, rozproszone w całej błonie właściwej okrężnicy, pozostają w bliskim kontakcie z fagocytami jelitowymi gospodarza.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zostać ukończona w ciągu czterech godzin. Po przeprowadzeniu tego procesu można zastosować inne metody, takie jak barwienie limfocytów jelitowych i analiza cytokin w surowicy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stanu aktywacji komórek T CD4 oraz potwierdzić stopień nasilenia zapalenia jelita grubego. Z każdym nowym udoskonaleniem technika ta toruje drogę do badań w dziedzinie immunologii, umożliwiając zgłębienie drobnych zdarzeń prowadzących do choroby zapalnej jelit w modelu mysim.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki odpornościowe blaszki właściwej okrężnicy do późniejszej analizy ex vivo.

development-an-antigen-driven-colitis-model-to-study-presentation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodologię szybkiej izolacji komórek dendrytycznych (DCs) oraz makrofagów z jelit myszy. Charakterystyka fenotypowa jelitowych komórek dendrytycznych i makrofagów jest przeprowadzana za pomocą wielokolorowej analizy cytometrycznej, natomiast wzbogacanie za pomocą kulek magnetycznych z następującym po nim sortowaniem komórek jest stosowane w celu uzyskania populacji o wysokiej czystości do badań funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka komórek dendrytycznych oraz makrofagów z jelit myszy

Ten film demonstruje technikę generowania chemicznie wywołanego mysiego modelu zapalenia jelita grubego - choroby zapalnej jelit. Mysz może spożywać roztwór siarczanu sodu dekstranu (DSS) przez odpowiedni czas. Po spożyciu DSS uszkadza barierę warstwy śluzu i nabłonka w okrężnicy, umożliwiając drobnoustrojom jelitowym przedostanie się do leżącej poniżej tkanki – gdzie są wyczuwane przez rezydujące komórki odpornościowe, aby pośredniczyć w przesadnej odpowiedzi immunologicznej, powodując stan...

Technika generowania mysiego modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem sodu

Zapalenie jelita grubego wywołane DNBS/TNBS oferuje alternatywną i tanią metodę badania patobiologii nieswoistych zapaleń jelit. Protokół omówiony w tym artykule przedstawia skuteczne zastosowanie DNBS do wywoływania zapalenia jelita grubego u myszy i szczurów oraz pozwala na dokładne zbadanie odpowiedzi jelitowych za pośrednictwem gospodarza.

Modele zapalenia jelita grubego DNBS/TNBS: dostarczające informacji na temat nieswoistych zapaleń jelit i wpływu tłuszczu w diecie

Tutaj prezentujemy protokół indukowania zapalenia jelita grubego u myszy poprzez adoptywny transfer syngenicznych limfocytów T CD4+CD45RB do biorców z niedoborem limfocytów T i B. Cechy kliniczne i histopatologiczne naśladują choroby zapalne jelit u ludzi. Metoda ta pozwala na badanie inicjacji zapalenia jelita grubego i postępu choroby.

Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 + CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Mysia kolostomia dystalna, nowy model dywersyjnego zapalenia jelita grubego u myszy C57BL / 6

Protokół przedstawia kompletny, potwierdzony, indukowany przez TNBS mysi model choroby Leśniowskiego-Crohna oraz metody wizualizacji receptorów estrogenowych za pomocą immunohistochemii przy użyciu immunofluorescencji utrwalonych formaliną odcinków jelita grubego zanurzonych w parafinie.

Wizualizacja receptorów estrogenowych w okrężnicy myszy z chorobą Leśniowskiego-Crohna wywołaną TNBS przy użyciu immunofluorescencji

W tym protokole opisany jest model adoptywnego transferowego zapalenia jelita grubego dla antygenu mikrobioty jelitowej z limfocytów T. Limfocyty T CD4 + izoluje się od myszy transgenicznych CBir1 TCR. Są one specyficzne dla immunodominującego antygenu mikrobioty jelitowej CBir1 flageliny, który jest przenoszony do myszy biorcy Rag1-/-, prowadząc do zapalenia jelit.

Indukcja zapalenia jelit przez adoptywny transfer transgenicznych limfocytów T CD4 + CBir1 TCR do myszy z niedoborem odporności

Opisano nową metodę indukcji i ekspansji antygenowo swoistych limfocytów T, niezależną od komórek dendrytycznych (DC). Sztuczne komórki prezentujące antygen (aAPC) oparte na HLA A2-Ig są ładowane peptydami ograniczonymi przez HLA-A2 w celu efektywnej ekspansji CTL o różnej swoistości antygenowej. Technologia ta wykazuje duży potencjał w zastosowaniu w immunoterapii adoptywnej opartej na CTL.

Sztuczne komórki prezentujące antygen oparte na HLA-Ig dla efektywnej ekspansji ludzkich CTL ex vivo

Poznaj model kolity sterowanej antygenem do badania interakcji między fagocytami jednojądrzastymi a limfocytami T CD4 w blaszce właściwej jelita grubego. Ta metoda pozwala śledzić odpowiedź immunologiczną in vivo.

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

Przeglądaj więcej filmów