Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

Ogólnym celem tego modelu zapalenia jelita grubego indukowanego antygenem jest ustalenie, czy monocyty i makrofagi (fagocyty jednojądrowe) wykazujące ekspresję CX3 i CR1 oddziałują z limfocytami T CD4+ i aktywują je podczas swoistego dla antygenu zapalenia jelita grubego oraz czy ta zależna od fagocytów jednojądrowych ekspansja efektorowych limfocytów T zachodzi w obrębie błony właściwej jelita. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nieswoistych zapaleń jelit, takie jak rodzaje interakcji zachodzących między komórkami prezentującymi antygen a efektorowymi limfocytami T w błonie właściwej jelita grubego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania interakcji komórek odpornościowych oraz czynników prowadzących do patogenności nieswoistych zapaleń jelit.

Metoda ta wykorzystuje model zapalenia jelita grubego indukowanego transferem limfocytów T, w którym czerwone fluorescencyjne, antygenowo swoiste naiwne limfocyty T CD4 są transferowane do immunodeficyjnego gospodarza, którego komórki mononuklearne wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego. Po transferze komórek przeprowadza się gavage doustne niebieskich fluorescencyjnych bakterii wykazujących ekspresję antygenu. Zdarzenia immunologiczne zachodzące w blaszce właściwej błony śluzowej jelita gospodarzy mogą być monitorowane na różnych etapach rozwoju choroby.

Za pomocą nożyczek do sekcji rozciąć okrężnicę wzdłużnie i wypłukać tkankę w szalce Petriego zawierającej 25 milliliters PBS, aby usunąć zanieczyszczenia i śluz. Pokroić okrężnicę na kawałki o długości od pięciu do ośmiu milimetrów i umieścić powstałe fragmenty w 20 milliliters świeżego DPBS bez wapnia i magnezu, uzupełnionego o dziesięć millimolar HEPES i pięć millimolar EDTA. Mieszać probówkę z próbką na wortexie przez 30 seconds z maksymalną prędkością.

Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez dziesięć minut przy delikatnym wstrząsaniu w celu usunięcia nabłonka. Po zakończeniu inkubacji ponownie wymieszać w vorteksie przez 30 s. Następnie odrzucić nadsącz zawierający komórki nabłonkowe.

Przenieś fragmenty tkanki do nowej probówki zawierającej 20 milliliters świeżego buforu PBS, HEPES i EDTA, a następnie powtórz inkubację wraz z etapami mieszania w wortexie przed i po niej. Po trzecim powtórzeniu wszystkie komórki nabłonka zostaną usunięte, a nadsącz stanie się przejrzysty. Delikatnie przemyj fragmenty tkanki w PBS, aby usunąć pozostałe komórki nabłonka.

Pokroić fragmenty tkanki na kawałki o wymiarach 2x2 mm i przenieść je do 10 ml pożywki RPI uzupełnionej o 0,5 mg/ml kolagenazy typu VIII oraz 10 U/ml DNazy I. Próbki mieszać w wstrząsaczu typu vortex przez 30 s. Następnie inkubować kawałki tkanki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 30–35 min, mieszając zawartość probówki w wstrząsaczu typu vortex co 5 min podczas inkubacji.

Po strawieniu tkanki, przecedź powstałą zawiesinę przez sito komórkowe o rozmiarze oczek 70 micron przez koniczną probówkę o pojemności 50 mililitrów. Przepłucz sito komórkowe raz, a następnie odwiruj zawiesinę pojedynczych komórek w wirówce. Na koniec raz przemyj komórki w PBS i odwiruj.

Następnie należy określić liczbę żywych komórek za pomocą metody wykluczania błękitu trypanu. E. coli produkujące białko owalbuminy z białkiem fluorescencyjnym cyjanowym aktywują produkcję interferonu gamma w komórkach OT-II in vitro, w przeciwieństwie do e.

coli, które wykazują ekspresję wyłącznie CFP. Obrazowanie konfokalne 3D ex vivo tkanki okrężnicy myszy transgenicznych wykazujących ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, którym podano e. coli PCFP ova, wykazuje obecność bakterii wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w kryptach okrężnicy w pobliżu komórek nabłonka jelitowego oraz ich ko-lokalizację z fagocytami jelitowymi gospodarza.

U zwierząt OT-II red limfocyty T CD4 pozytywne charakteryzują się koekspresją czerwonego białka fluorescencyjnego oraz V beta 5.1. Po podaniu e. coli PCFP ova, u myszy transgenicznych wykazujących deficyt limfocytów BNT i ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, którym przeszczepiono adoptywnie limfocyty T OT-II red CD4 pozytywne CD62 ligand pozytywne, dochodzi do szybkiej utraty masy ciała i rozwoju klinicznych objawów zapalenia jelita grubego.

Siedem dni po transferze komórek tylko kilka fagocytów gospodarza pobrało próbki e. coli PCFP ova, a komórki OT-II dodatnie pod względem czerwonego barwnika nie są wykrywane. 14 dni po transferze komórek fagocyty gospodarza, które pobrały próbki e.

cząsteczki PCFP e. coli znajdują się w bliskim sąsiedztwie adoptywnie przeniesionych komórek OT-II red pozytywnych. W 21. dniu po transferze komórek duża liczba komórek gospodarza pobrała cząsteczki PCFP e. coli, a donorskie komórki OT-II red pozytywne, rozproszone w całej błonie właściwej okrężnicy, pozostają w bliskim kontakcie z fagocytami jelitowymi gospodarza.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zostać ukończona w ciągu czterech godzin. Po przeprowadzeniu tego procesu można zastosować inne metody, takie jak barwienie limfocytów jelitowych i analiza cytokin w surowicy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stanu aktywacji komórek T CD4 oraz potwierdzić stopień nasilenia zapalenia jelita grubego. Z każdym nowym udoskonaleniem technika ta toruje drogę do badań w dziedzinie immunologii, umożliwiając zgłębienie drobnych zdarzeń prowadzących do choroby zapalnej jelit w modelu mysim.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować komórki odpornościowe blaszki właściwej okrężnicy do późniejszej analizy ex vivo.