Opracowanie modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem w celu zbadania prezentacji antygenów przez komórki prezentujące antygen limfocytom T

Ogólnym celem tego modelu zapalenia jelita grubego sterowanego antygenem jest ustalenie, czy jednojądrzaste fagocyty CX3, CR1 dodatnie oddziałują i aktywują limfocyty T CD4-dodatnie podczas specyficznego dla antygenu zapalenia jelita grubego oraz czy ta zależna od fagocytów jednojądrzastych efektorowych ekspansja limfocytów T zachodzi w blaszce właściwej jelita. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nieswoistych zapaleń jelit, takie jak rodzaje interakcji zachodzących w komórkach prezentujących antygen i efektorowych limfocytach T w blaszce właściwej okrężnicy. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na badanie interakcji komórek odpornościowych i elementów, które prowadzą do patogenności nieswoistego zapalenia jelit.

Metoda ta wykorzystuje model zapalenia jelita grubego z transferem limfocytów T, w którym naiwne limfocyty T CD4 specyficzne dla antygenu czerwonej fluorescencji są przenoszone do gospodarza z niedoborem odporności, powodując ekspresję białka zielonej fluorescencji w komórkach jednojądrzastych. Po transferze komórek następuje doustne podanie bakterii wykazujących ekspresję antygenu fluorescencyjnego na niebiesko. Zdarzenia immunologiczne zachodzące w blaszce jelitowej właściwej gospodarzy mogą być monitorowane na różnych etapach rozwoju choroby.

Użyj nożyczek preparacyjnych, aby otworzyć okrężnicę wzdłużnie i umyj tkankę na szalce Petriego zawierającej 25 mililitrów PBS, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia i śluz. Pokrój okrężnicę na pięć do ośmiu milimetrowych kawałków i umieść powstałe fragmenty w 20 mililitrach świeżego DPBS bez wapnia i magnezu, uzupełnionych dziesięcioma milimolowymi HEPES-ami i pięciomilimolowymi EDTA. Wirować probówkę z próbką przez 30 sekund z maksymalną prędkością.

Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dziesięć minut, delikatnie potrząsając, aby usunąć nabłonek. Pod koniec inkubacji ponownie wiruj przez 30 sekund. Następnie należy wyrzucić supernatant zawierający komórki nabłonka.

Przenieś kawałki tkanki do nowej probówki zawierającej 20 mililitrów świeżego buforu PBS, HEPES i EDTA, a następnie powtórz inkubację z etapami wirowania przed i po. Po trzecim powtórzeniu wszystkie komórki nabłonkowe są usuwane, a supernatant jest czysty. Delikatnie umyj fragmenty tkanek w PBS, aby usunąć wszelkie resztki komórek nabłonka.

Pokrój fragmenty tkanki na dwie na dwa milimetrowe części i przenieś kawałki do trawienia w dziesięciu milimetrach pożywki RPI, uzupełnionej 0,5 miligrama na mililitr kolagenazy typu ósmego i dziesięciu jednostek na mililitr DNAse jeden. Wirować próbki przez 30 sekund. Następnie inkubuj kawałki tkanki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przez 30 do 35 minut i wiruj probówkę co pięć minut podczas inkubacji.

Po strawieniu tkanki przecedź powstałą zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Umyj sitko komórkowe raz i odwiruj zawiesinę jednokomórkową przez odwirowanie. Na koniec umyj komórki raz w PBS i odwiruj.

Następnie określ liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego. Cyjanowe białko fluorescencyjne wytwarzające białko albuminy jaja kurzego E. coli aktywuje produkcję interferonu gamma w komórkach OT-II in vitro, w przeciwieństwie do e.

coli, które wyrażają tylko CFP. Konfokalne obrazowanie ex vivo 3D tkanki okrężnicy myszy z ekspresją transgenicznego zielonego białka fluorescencyjnego, karmionych komórkami jajowymi PCFP E. coli, wykazuje obecność bakterii wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego w kryptach okrężnicy w pobliżu komórek nabłonka jelita grubego i kolokalizowanych z fagocytami jelitowymi gospodarza.

U czerwonych zwierząt OT-II limfocyty T CD4-dodatnie charakteryzują się koekspresją białka czerwonej fluorescencji i V beta pięciopunktowego pierwszego. Po prowokacji komórkami jajowymi PCFP E. coli, transgeniczne myszy transgeniczne z niedoborem limfocytów BNT z ekspresją białka zielonej fluorescencji, którym adoptywnie przeszczepiono czerwone limfocyty T CD62 z czerwonymi limfocytami T CD4 i dodatnimi limfocytami T OT-II, szybko tracą masę ciała i rozwijają kliniczne objawy zapalenia jelita grubego.

Siedem dni po przeniesieniu komórek tylko kilka fagocytów gospodarza pobrało próbki komórek jajowych E. coli PCFP i czerwonych komórek dodatnich OT-II. 14 dni po transferze komórek fagocyty gospodarza, które pobrały próbkę e.

Komórki jajowe PCFP coli znajdują się w bliskiej odległości od adoptywnie przenoszonych czerwonych komórek dodatnich OT-II. Do 21 dni po przeniesieniu komórek duża liczba komórek gospodarza pobrała próbki komórek jajowych E. coli PCFP, a czerwone komórki donora OT-II, które są rozproszone w blaszce okrężnicy właściwej, są w bliskim kontakcie z fagocytami jelitowymi gospodarza.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie limfocytów jelitowych i analiza cytokin w surowicy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące stanu aktywacji limfocytów T CD4 i potwierdzić nasilenie zapalenia jelita grubego. Po każdym opracowaniu technika ta toruje drogę do badań w dziedzinie immunologii w celu zbadania małych zdarzeń, które prowadzą do nieswoistego zapalenia jelit w modelu mysim.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować komórki odpornościowe blaszki właściwej okrężnicy do dalszej analizy ex vivo.