Indukcja zapalenia jelit myszy przez adoptywny transfer efektorowych limfocytów T CD4 ⁺ CD45RB do myszy z niedoborem odporności

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie stanu zapalnego jelit poprzez adoptywny transfer naiwnych limfocytów T do myszy z niedoborem odporności. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie komórek ze śledziony myszy, lizę komórek krwi, a następnie wzbogacenie populacji o limfocyty T CD cztery dodatnie. Drugim krokiem jest znakowanie tych komórek fluorescencyjnymi przeciwciałami CD four sprzężonymi z DI i CD 45 RB.

Następnie znakowane komórki są sortowane przy użyciu faktów na populacje CD 45, RB niskie i CD 45 RB wysokie. Ostatnim krokiem jest przeniesienie wysokich komórek RB CD 45 do myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe. Ostatecznie przeniesione komórki są aktywowane i powodują miejscowe uszkodzenie tkanek przy braku komórek regulatorowych T, co skutkuje eksperymentalnym zapaleniem jelita grubego.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami zapalnymi jelit, takie jak rola określonych populacji komórek i mikrobioty przewodu pokarmowego w patogenezie choroby. Po eutanazji myszy dawcy spryskaj brzuch 70% etanolem, aby wysterylizować obszar. Następnie wykonaj poziome nacięcie w poprzek brzucha i oderwij skórę, aby odsłonić otrzewną za pomocą kleszczy.

Trzymaj otrzewną z dala od narządów wewnętrznych i wykonaj nacięcie w lewej otrzewnej brzusznej. Następnie wytnij śledzionę od myszy i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 10 mililitrów lodowatego, kompletnego podłoża. Zmiażdż śledzionę dwoma sterylnymi szkiełkami szkiełkowymi, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.

Przefiltruj komórki przez sitko o średnicy 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, a następnie przepłucz sitko pięcioma mililitrami kompletnego podłoża do pięciu śledzion w jednej stożkowej probówce. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 450 razy G przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Odessać supernatant do pojemnika na odpady, a następnie delikatnie ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach lodowatego buforu do etykietowania.

Połączyć 20 mikrolitrów zawiesiny komórek ze 180 mikrolitrami 0,4% roztworu błękitu trianowego i inkubować komórki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do hemocytometru i policz liczbę nieniebieskich komórek pod mikroskopem, aby rozpocząć osad wzbogacający i delikatnie zawiesić komórki w lodowatym buforze do znakowania w stężeniu 20 razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Dodaj pięć mikrolitrów biotynylowanego przeciwciała wzbogacającego limfocyty T CD cztery razy 10 razy 10 do sześciu komórek, a następnie inkubuj komórki na lodzie z przeciwciałem przez 15 minut.

Dodać 10-krotność objętości buforu znakującego do zawiesiny komórek, a następnie odwirować komórki w temperaturze 450 razy G przez siedem minut. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Następnie ponownie zawiesić sprzężone ze streptawidyną cząstki magnetyczne przez wirowanie i dodać pięć mikrolitrów cząstek na jeden razy 10 do sześciu komórek do komórek.

Wymieszaj cząstki z komórkami, delikatnie przesuwając probówkę, a następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze od sześciu do 12 stopni Celsjusza przez 30 minut. Ponownie zawiesić komórki do stężenia od 20 do 80 razy 10 do sześciu komórek na mililitr z buforem do znakowania. Następnie przenieś jeden mililitr oznakowanych komórek do probówki o okrągłym dnie o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów i umieść tę dodatnią probówkę frakcji na magnesie na sześć do ośmiu minut.

Trzymając probówkę na magnesie, ostrożnie usuń supernatant za pomocą szklanej pipety do pasty, nie naruszając oznakowanych komórek i przenieś go do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Ta frakcja zawiera CD cztery dodatnie limfocyty T. Wyjmij rurkę z frakcją dodatnią z magnesu i ponownie zawieś komórki w buforze do etykietowania, energicznie pipetując.

Włóż rurkę z powrotem do magnesu na kolejne sześć do ośmiu minut. Ponownie ostrożnie przenieś nainę SUP do rurki ze wzbogaconą frakcją. Zwiększyć wydajność CD czterech dodatnich limfocytów T, powtarzając wzbogacanie w razie potrzeby w celu przygotowania komórek do znakowania: Najpierw odwirować wzbogaconą frakcję w temperaturze 450 razy G przez siedem minut i odrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawieś komórki w buforze znakującym do stężenia 10 razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Podwielokrotność pięć razy 10 piątych komórek w pojedynczych mikroprobówkach fuge dla niebarwionych izotopów i pojedynczych barwionych komórek kontrolnych. Następnie dodaj pięć mikrogramów na mililitr CD cztery, FE i jeden mikrogram na mililitr przeciwciał CD 45 RB PE do probówki zawierającej oryginalną zawiesinę komórkową.

Dodać kontrolne barwienia izotopowe i pojedyncze barwienia o tym samym stężeniu do odpowiednich podwielokrotności komórek. Delikatnie wymieszaj komórki z przeciwciałami, a następnie inkubuj probówki na lodzie przez 30 minut. Zakryj rurki, aby chronić je przed światłem.

Następnie umyj komórki dwukrotnie w buforze do etykietowania, jak wskazano w protokole tekstowym, i ponownie zawieś komórki w ilości 10 razy 10 z sześciu komórek na mililitr w buforze do etykietowania. Następnie przepuść zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikronów do rurki faksowej. Umieść tubkę na lodzie i przykryj ją, aby zapobiec fotowybielaniu plam.

Użyj niebarwionych i jednostopniowych komórek kontrolnych, aby skalibrować kompensację w sortowniku komórek. Wyklucz nieżywotne komórki za pomocą bramkowania rozproszonego do przodu i na boki. A następnie ustaw bramkowanie dla CD czterech dodatnich i CD czterech komórek RB dodatnich z kontrolami barwionymi izotopami.

Następna bramka, populacja CD 4 dodatnia, a następnie sortuj komórki na populacje CD 45, RB wysokie i CD 45 RB niskie. Zebrać komórki do probówek zawierających dwa mililitry kompletnej pożywki, a następnie uruchomić podwielokrotność około 10 razy 10 do trzecich komórek z każdej frakcji na sortowniku komórek, aby ocenić czystość próbki w celu przygotowania komórek CD 45 RB o wysokiej zawartości i CD 45 RB o niskiej zawartości do przemywania iniekcyjnego i ponownie zawiesić je w PBS do odpowiedniej gęstości komórek, jak wskazano w protokole tekstowym. Następnie mocno unieruchomij mysz biorcę i wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej dootrzewnowej w prawą i lewą stronę brzucha.

Co tydzień monitoruj myszy biorców pod kątem parametrów klinicznych, jak wskazano w protokole tekstowym. Progresja choroby po wstrzyknięciu jest zwykle widoczna w piątym tygodniu. Poświęć mysz w określonym momencie lub gdy straci 20% swojej początkowej masy ciała i usuń okrężnicę.

Następnie zmierz i zapisz długość i wagę okrężnicy. CD cztery dodatnie limfocyty T o wysokim poziomie CD 45 RB przeniesiono do myszy z jednym nokautem i NFIL z trzema RAG z podwójnym nokautem w ciągu pięciu tygodni po wstrzyknięciu. Myszy z podwójnym nokautem straciły 10% swojej początkowej masy ciała, okrężnicy zarówno z jednym nokautem, jak i podwójnym nokautem.

Myszy biorcy zostały zagęszczone i skrócone w porównaniu z okrężnicami myszy kontrolnych CD cztery dodatnie limfocyty T CD 45 RB do przeniesienia do jeden nokaut i jeden nokaut P jeden 10 zmutowanych myszy biorcy delta analiza histologiczna po trzech tygodniach od przeniesienia wykazała przerost nabłonka, nacieki komórek zapalnych i ropnie krypty u biorców mutacji delta z nokautem jeden, ale nie myszy z nokautem po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w ciągu czterech do sześciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.