Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja mikrostruktury i adhezji komórek na nieprzezroczystym inimplantacie jądra tytanowego z dzianiny, przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta naprzód analizę inżynierii tkankowej z nieprzezroczystymi rusztowaniami. Jedną z zalet tej techniki jest to, że można śledzić żywotność komórek, a także proliferację na rusztowaniu za pomocą zdefiniowanej hodowli na powietrzu.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ barwienie fluorescencyjne, a później wizualizacja są trudne. Indywidualne właściwości rusztowania, takie jak wielkość porów, mogą wpływać na czas i/lub fluorescencja rusztowania może wpływać na wybór używanych fluoroforów. Umieść do pięciu rusztowań o grubości sześciu lub siedmiu milimetrów w rurze o pojemności 50 mililitrów i umyj je wodą trzy razy przez 20 minut na mycie.

Zrób to w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie umyj rusztowania w 30 mililitrach 1% roztworu Triton X-100 w tych samych warunkach. Następnie wykonaj jeszcze dwa mycia wodą.

Teraz sekwencyjnie sonikuj rusztowania w odczynniku klasy 99% acetonu, 99% izopropanolu i 99% etanolu. Wykonaj każdy etap sonikacji dwa razy przez pięć minut na jedną sonikację. Następnie poddaj rusztowanie działaniu sonikacji jeszcze trzy razy w wodzie, w sumie przez 15 minut.

Na koniec umieść rusztowania na niestrzępiącej się chusteczce i wysusz je na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia autoklaw rusztowań przez 15 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza i 15 PSI. Aby potwierdzić, że czyszczenie zadziałało, użyj fluorescencji pośredniej.

Załaduj jedną studzienkę z 12-dołkowej płytki 2000 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwiącego siarkę-rodaminę B i za pomocą kleszczy przenieś rusztowanie do tej studzienki. Następnie uchwyć negatywowe obrazy rusztowania za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów sześciennych RFP LED i poszukaj zanieczyszczeń przy dużym powiększeniu. Korzystając z pierwszej szafki bezpieczeństwa biologicznego, przenieś czyste rusztowania do studzienek płyty 24-dołkowej.

Dodaj 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej o temperaturze 37 stopni Celsjusza do każdej studzienki i pozwól rusztowaniu moczyć się przez 15 minut. W międzyczasie przygotuj 500 000 komórek SEP1 zakażonych Ad-GFP na 1 mililitr pożywki. Po 15 minutach całkowicie odessać pożywkę z rusztowań i osadzić je w 100 mikrolitrach zawiesiny komórek.

Następnie inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po krótkiej inkubacji dodaj jeszcze 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej i inkubuj rusztowania przez 24 godziny. Następnego dnia zmień pożywkę hodowlaną, aby usunąć nieprzylegające komórki.

Następnie oceń przyleganie komórek i ich rozprzestrzenianie się na rusztowaniach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów sześciennych GFP LED. W przypadku barwienia żywymi żywymi żywymi organizmami, najpierw umieść komórki SEP1 na rusztowaniu, tak jak poprzednio. Po 24 do 48 godzinach całkowicie odessać pożywkę hodowlaną i myć rusztowania DPBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Teraz wybarwić komórki za pomocą pożywki hodowlanej zawierającej Calcein AM, Hoechst 33342 i homodimer Ethidium. Wszystkie te trzy fluorofory są wrażliwe na światło, dlatego ważne jest, aby utrzymywać komórki w ciemności do przodu. Inkubuj komórki przez 30 minut z fluoroforami, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie w całym rusztowaniu.

Specyficzne cechy rusztowania będą miały wpływ na ten czas inkubacji. Po inkubacji przemyć komórki trzykrotnie DPBS, używając jednego mililitra na studzienkę. Wykonuj każde pranie przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Bezpośrednio po umyciu należy udokumentować rusztowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby zmierzyć żywotność komórek w czasie, należy użyć pomiarów konwersji rezazuryny. Najpierw całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z komórek SEP1 umieszczonych na 24-dołkowej płytce i umyć komórki 500 mikrolitrami DPBS na studzienkę.

Następnie przykryj komórki wymaganą objętością sterylnego roztworu roboczego rezazuryny i włącz jedną studzienkę tylko resazuryną. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 30 minut. Po inkubacji przenieść 100 mikrolitrów kondycjonowanego supernatantu z każdej studzienki do płytki 96 mikrodołków w celu zmierzenia jej fluorescencji, jak opisano w protokole tekstowym.

W celu dalszej uprawy usuń rezazurynę ze studni i umyj trzykrotnie jednym mililitrem DPBS. Wykonuj każde pranie przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po trzecim przemyciu dodać 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdej studzienki komórek i kontynuować ich inkubację w celu dalszych pomiarów przebiegu czasu.

Stosując pośrednie barwienie fluorescencyjne, udokumentowano zanieczyszczenia przed czyszczeniem w celu optymalizacji protokołu czyszczenia. Znaczne zmniejszenie obciążenia substancji na rusztowaniu świadczy o skuteczności opisanego protokołu czyszczenia. O tym, jakie kolejne implanty stosuje się do zabiegu endoprotezoplastyki, decydują zdarzenia, które zachodzą na granicy faz materiału komórkowego.

Po 24 godzinach przylegania do rusztowań, komórki SEP1 przyczepiły się. Następnie zastosowano fluorofory w celu zbadania śmierci i proliferacji komórek w pewnym okresie czasu na rusztowaniach. Barwienie żywych-martwych wykazało niebieskie barwienie jądrowe z czerwoną fluorescencją w martwych komórkach i zieloną fluorescencją w żywych komórkach.

Ponadto żywotność komórek na rusztowaniu określono ilościowo za pomocą testu konwersji reazuryny. W ciągu dwóch tygodni zebrano dane na temat komórek hodowanych z rusztowaniami lub bez nich. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o dostosowaniu używanych fluoroforów do rusztowania i mikroskopu, które są do dyspozycji.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne, w celu wizualizacji obecności białek lub aktywacji kaskad sygnałowych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii endoprotezoplastyki, ponieważ interakcja twarzy komórki z otaczającą tkanką in vivo określi jej funkcję i trwałość.