Name: Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj technikę fluorescencyjnego obrazowania przyczepności i żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach tytanowych. Ta metoda usprawnia analizę inżynierii tkankowej i ocenę interakcji komórkowo-materiałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt jest częściowo finansowany przez Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand (ZIM) des Bundesministeriums für Wirtschaft und Energie -KF3010902AJ4. Opłata za publikację została pokryta przez szpital urazowy BG w Tybindze w Niemczech.

<ol><li>Bridwell, K. H., Anderson, P. A., Boden, S. D., Vaccaro, A. R., Wang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+new+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Joint+Surg+Am%22%5BJournal%5D)">What's new in spine surgery.</a> J Bone Joint Surg Am. 95, 1144-1150 (2013).</li>
<li>Adams, M. A., Dolan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+degeneration%3A+evidence+for+two+distinct+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc degeneration: evidence for two distinct phenotypes.</a> J Anat. 221, 497-506 (2012).</li>
<li>Schizas, C., Kulik, G., Kosmopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disc+degeneration%3A+current+surgical+options%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Disc degeneration: current surgical options.</a> Eur Cell Mater. 20, 306-315 (2010).</li>
<li>Lewis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+pulposus+replacement+and+regeneration%2Frepair+technologies%3A+present+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nucleus pulposus replacement and regeneration/repair technologies: present status and future prospects.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 1702-1720 (2012).</li>
<li>Cunningham, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+scientific+considerations+in+total+disc+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Basic scientific considerations in total disc arthroplasty.</a> Spine J. 4, 219-230 (2004).</li>
<li>Implant for surgical use in humans or vertebrates. US8728164 B2. Google Patents. , (2014).</li>
<li>Kettler, A., Kaps, H. P., Haegele, B., Wilke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+behavior+of+a+new+nucleus+prosthesis+made+of+knitted+titanium+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22SAS+J%22%5BJournal%5D)">Biomechanical behavior of a new nucleus prosthesis made of knitted titanium filaments.</a> SAS J. 1, 125-130 (2007).</li>
<li>Nerurkar, N. L., Elliott, D. M., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+design+criteria+for+intervertebral+disc+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Mechanical design criteria for intervertebral disc tissue engineering.</a> J Biomech. 43, 1017-1030 (2010).</li>
<li>Elias, C. N., Lima, J. H. C., Valiev, R., Meyers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+titanium+and+its+alloys%5BTitle%5D)+AND+%22JOM%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of titanium and its alloys.</a> JOM. 60, 46-49 (2008).</li>
<li>Hallab, N., Link, H. D., McAfee, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial+optimization+in+total+disc+arthroplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biomaterial optimization in total disc arthroplasty.</a> Spine (Phila Pa 1976). 28, 139-152 (2003).</li>
<li>Gustafsdottir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+cytological+profiling+assay+to+measure+diverse+cellular+states%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiplex cytological profiling assay to measure diverse cellular states.</a> PLoS One. 8, e80999(2013).</li>
<li>Bocker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+single-cell-derived+human+mesenchymal+stem+cell+line+expressing+hTERT+after+lentiviral+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Introducing a single-cell-derived human mesenchymal stem cell line expressing hTERT after lentiviral gene transfer.</a> J Cell Mol Med. 12, 1347-1359 (2008).</li>
<li>Ehnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta1+inhibits+bone+morphogenic+protein+%28BMP%29-2+and+BMP-7+signaling+via+upregulation+of+Ski-related+novel+protein+N+%28SnoN%29%3A+possible+mechanism+for+the+failure+of+BMP+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta1 inhibits bone morphogenic protein (BMP)-2 and BMP-7 signaling via upregulation of Ski-related novel protein N (SnoN): possible mechanism for the failure of BMP therapy.</a> BMC Med. 10, 101(2012).</li>
<li>Morgan, S. P., Rose, F. R., Matcher, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMorgan%2C+SP+%22Optical+Techniques+in+Regenerative+Medicine%22">Optical Techniques in Regenerative Medicine</a>. , CRC Press. (2013).</li>
<li>Vielreicher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+a+deep+look%3A+modern+microscopy+technologies+to+optimize+the+design+and+functionality+of+biocompatible+scaffolds+for+tissue+engineering+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Taking a deep look: modern microscopy technologies to optimize the design and functionality of biocompatible scaffolds for tissue engineering in regenerative medicine.</a> J R Soc Interface. 10, 20130263(2013).</li>
<li>Curtis, A., Wilkinson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographical+control+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Topographical control of cells.</a> Biomaterials. 18, 1573-1583 (1997).</li>
<li>Niu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+imaging+of+endothelial+cells+in+bioengineered+blood+vessels%3A+the+impact+of+crosslinking+of+the+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Fluorescent imaging of endothelial cells in bioengineered blood vessels: the impact of crosslinking of the scaffold.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Chan, B. P., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolding+in+tissue+engineering%3A+general+approaches+and+tissue-specific+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations.</a> Eur Spine J. 17, Suppl 4 467-479 (2008).</li>
<li>Navarro, M., Michiardi, A., Castano, O., Planell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+orthopaedics%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in orthopaedics.</a> J R Soc Interface. 5, 1137-1158 (2008).</li>
<li>Priyadarshani, P., Li, Y., Yao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biological+therapy+for+nucleus+pulposus+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Advances in biological therapy for nucleus pulposus regeneration.</a> Osteoarthritis Cartilage. , (2015).</li>
<li>Thermofisher Fluorescence Spectraviewer. , Source:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</a> (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów. Żadna część pracy nie była ani nie jest obecnie rozważana do publikacji ani nie została opublikowana gdzie indziej.

Powierzchnia rusztowania odgrywa ważną rolę w jego interakcji z otaczającymi tkankami in vivo , decydując tym samym o trwałości funkcjonalnej implantów. W związku z tym, biokompatybilność rusztowania jest badana za pomocą testów in vitro z użyciem komórek (linia komórkowa SCP1), po posieciu na rusztowaniach.
Techniki mikroskopowe, które dobrze sprawdzają się w przypadku cienkich i optycznie przezroczystych rusztowań, nie nadają się do stosowania w przypadku rusztowań nieprzez...

Przewlekły ból pleców jest chorobą wieloczynnikową. Zainteresowanie minimalnie inwazyjną opcją leczenia choroby zwyrodnieniowej dysku wzrosło od lat 50. XX wieku. Do dziś najczęściej stosowaną metodą leczenia jest wielosegmentowe zespolenie kręgosłupa. Ponieważ metoda ta często prowadzi do ograniczeń w ruchomości dotkniętego segmentu1,2, badanie ery endoprotezoplastyki stało się szerokim zainteresowaniem. Znaczące postępy w całkowitej wymianie dysku i wymianie jądra stały się dobrą alternatywą w leczeniu przewlekłego bólu pleców1. Pomimo ogromnego postępu, żadna z metod nie została oceniona klinicznie. Mniej sztywne implanty jądra stanowią obiecującą alternatywę dla całkowitej wymiany dysku, pod warunkiem, że pierścień włóknisty jest nienaruszony3,4. Jednak obecnie obecne na rynku implanty jądra często wiążą się z powikłaniami, takimi jak zmiany w trzonie kręgów, zwichnięcia, pionowa utrata wysokości dysku i brak związanej z tym niezbędnej sztywności mechanicznej5. Aby przezwyciężyć obecne wady, z powodzeniem opracowano nowatorski implant jądrowy wykonany z dzianych drutów tytanowych6. Ze względu na unikalną strukturę dzianiny, to nowo opracowane rusztowanie wykazało wyróżniające się cechy biomechaniczne, np. zdolność tłumienia, wielkość porów, nośność i niezawodność7. Mając na celu przetestowanie biokompatybilności tego nowatorskiego implantu jądrowego, przedstawiono poważne ograniczenia w technikach analizy (optycznej) przypisywane nieprzezroczystemu charakterowi implantu.
Aby przetestować biokompatybilność, interakcja komórka-metal odgrywa znaczącą rolę8-10. Interakcja między komórkami a rusztowaniem jest niezbędna do stabilizacji, a tym samym do lepszej integracji implantu z systemem gospodarza. Jednak rosnąca głębokość wrastania może zmienić właściwości mechaniczne rusztowania. Mając na celu zbadanie, czy powierzchnia rusztowania stanowi podstawę do przyłączania, proliferacji i różnicowania komórek, czy też metal wpływa na żywotność komórek, ważne jest rozwiązanie powszechnego, dobrze znanego problemu obrazowania komórek na/w nieprzezroczystych i nieprzezroczystych rusztowaniach. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, zbadano kilka technik opartych na fluorescencji. Firmy dostarczają szeroką gamę fluoroforów do wizualizacji żywych komórek, przedziałów komórkowych, a nawet określonych stanów komórkowych11. Fluorofory do tego eksperymentu zostały wybrane za pomocą internetowego narzędzia Spectral Viewer, aby jak najlepiej pasowały do naszego mikroskopu fluorescencyjnego.
Opracowana strategia analizy zachowania przylegających komórek na/w nieprzezroczystym rusztowaniu z dzianiny tytanowej obejmuje następujące elementy: 1) fluorescencyjne (zielone białko fluorescencyjne/GFP) znakowanie komórek osteochondro-progenitorowych, aby umożliwić śledzenie komórek na rusztowaniu, 2) pomiar żywotności (aktywność mitochondrialną) komórek, oraz 3) wizualizacja interakcji komórka-komórka i komórka-materiał w rusztowaniu. Zabieg ma tę zaletę, że można go łatwo przenieść na inne przylegające komórki i inne nieprzezroczyste lub nieprzezroczyste rusztowania. Co więcej, żywotność i wzorzec wrastania mogą być monitorowane przez kilka dni, dzięki czemu można go stosować z ograniczoną ilością materiału lub komórek rusztowania.
Obecne badanie pokazuje udane wykorzystanie naszego obecnego protokołu do pomiaru żywotności komórek i wizualizacji wzorca wzrostu komórek osteochondro-progenitorowych na/w nieprzezroczystym rusztowaniu z dzianiny. Ponadto opracowane protokoły mogą być wykorzystywane do określania zanieczyszczeń rusztowania i sprawdzania protokołów czyszczenia.

<table><tbody><tr><td>Płytki 6/24/48-dołkowe, kolba hodowlana T25/ T75</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>*</td><td></td></tr><tr><td>* Płytki 24-dołkowe</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>CELLSTAR 662 160</td><td></td></tr><tr><td>* Płytki 48-dołkowe</td><td>Corning Incorporated USA</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>* Płytki 6-dołkowe</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>* T25</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>690 175</td><td></td></tr><tr><td>* T75</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>658 175</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, purum &ge; 99.0%</td><td>Carl Roth</td><td>3738.4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>5025.1</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan-2&nbsp;</td><td>Carl Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafy bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Thermo Scientific</td><td>safe 2020</td><td></td></tr><tr><td>Ester acetoksymetylowy kalceiny (kalceina AM)</td><td>Sigma</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>Spoiwo do inkubatora kultur komórkowych</td><td>, Tuttlingen, Niemcy</td><td>9040-0078</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca (0,22 i mikro; m)</td> <td>Millipore, IRL</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Wirówki 5810 R i 5417 R</td><td>Thermo Fisher Scientific, NY</td><td>Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td> <td>Carl Roth</td><td>4720.2</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS bez Ca & Mg</td><td>Sigma</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 99%</td><td>&nbsp; SAV płyn prod. GmBH</td><td>475956</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer</td><td>Sigma</td><td>46043</td><td></td></tr><tr><td>EVOS System obrazowania fluorescencyjnego</td><td>Technologie życiowe</td><td>AMF4300</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dzianinowy implant jądra tytanowego</td><td>Buck co & KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modyfikacja MEM Alpha z glutaminą bez nukleozydu</td><td>Sigma</td><td>E15-832</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Omega</td><td>BMG Labtech, Niemcy</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa rezazuryny</td><td>Sigma</td><td>199303-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa sulforodaminy B</td><td>Sigma</td><td>S1402-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rotator probówek</td><td>Labinco BV, Holandia</td><td>Model LD-76</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (hydroksymetylo) aminometan</td><td>Carl Roth</td><td>AE15.1</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,5%</td> <td>Carl Roth</td><td>CN76.1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna / EDTA</td><td>Sigma</td><td>L11-004</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Imaging Cell Viability on Non-transparent Scaffolds &#8212; Using the Example of a Novel Knitted Titanium Implant

Zwyrodnienie krążka międzykręgowego i przepuklina dysku jest jedną z głównych przyczyn bólu dolnej części pleców. Zubożenie macierzy zewnątrzkomórkowej, którego kulminacją jest wytłoczenie jądra miażdżystego (NP), prowadzi do zniszczenia krążka międzykręgowego. Obecnie dostępne zabiegi chirurgiczne zmniejszają ból, ale nie przywracają mechanicznej funkcjonalności kręgosłupa. Aby zachować cechy mechaniczne kręgosłupa, całkowita wymiana dysku lub jądra stała się w ten sposób szerokim zainteresowaniem. Jednak ta era endoprotezoplastyki jest nadal w stanie niedojrzałym, ponieważ żaden z istniejących produktów nie został oceniony klinicznie.
To badanie ma na celu przetestowanie biokompatybilności nowego implantu jądrowego wykonanego z dzianych drutów tytanowych. Pomimo wszystkich zalet mechanicznych, materiał ten ma swoje ograniczenia w konwencjonalnej analizie optycznej, ponieważ powstały implant jest nieprzezroczysty. W tym miejscu przedstawiamy strategię, która opisuje wizualizację in vitro, śledzenie i badanie żywotności komórek osteochondro-progenitorowych na rusztowaniu. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji skuteczności protokołu czyszczenia, a także do zbadania biokompatybilności tych i innych nieprzezroczystych rusztowań. Co więcej, protokół ten może być wykorzystany do pokazania wzorca przylegania komórek, a także żywotności komórek i szybkości proliferacji na/w rusztowaniu. Ten test biokompatybilności in vitro zapewnia korzystne narzędzie do analizy interakcji komórka-materiał w nieprzezroczystych i nieprzezroczystych rusztowaniach.

Wstępne wyniki wykazały, że opisany nowy implant jądra nie tylko posiada dobre właściwości tłumiące, ale jest również biokompatybilny z komórkami SCP-1. Podczas procesu produkcji implantu wchodzi on w kontakt z silnie żrącymi i toksycznymi substancjami (smar, trawionka, roztwór do polerowania elektrolitycznego). Dzięki zastosowaniu technik pośredniego barwienia fluorescencyjnego udało nam się zwizualizować pozostałe zanieczyszczenia, a w konsekwencji zoptymalizować protokół czyszczenia, w...

Tutaj prezentujemy technikę obrazowania opartą na fluoroforach, która pozwala na wykrywanie żywotności komórek na nieprzezroczystym tytanowym rusztowaniu, jak również wykrywanie przebłysków zanieczyszczeń rusztowania. Ten protokół rozwiązuje problem z obrazowaniem interakcji komórka-komórka lub komórka-metal na nieprzezroczystych rusztowaniach.

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Intervertebral disc degeneration and disc herniation is one of the major causes of lower back pain. Depletion of extracellular matrix, culminating in ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wizualizacja mikrostruktury oraz adhezji komórkowej na nieprzezroczystym dzianym implancie z rdzenia tytanowego przy użyciu technik obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta usprawnia analizę inżynierii tkankowej z wykorzystaniem nieprzezroczystych rusztowań. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość śledzenia żywotności oraz proliferacji komórek na rusztowaniu przy zdefiniowanych warunkach hodowli w powietrzu.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ barwienie fluorescencyjne i późniejsza wizualizacja są wymagające. Indywidualne właściwości rusztowania, takie jak wielkość porów, mogą wpływać na czas trwania procesu, a fluorescencja rusztowania może wpływać na wybór stosowanych fluoroforów. Umieść do pięciu rusztowań o grubości sześciu lub siedmiu milimetrów w probówce o pojemności 50 mililitrów i przemyj je wodą trzykrotnie, przez 20 minut podczas każdego płukania.Czynność tę należy przeprowadzić w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Następnie rusztowania należy przemyć w 30 mililitrach 1% roztworu Triton X-100 w tych samych warunkach. Potem należy przeprowadzić dwa kolejne płukania wodą.Następnie poddaj rusztowania sekwencyjnej sonikacji w acetonie 99% stopnia czystości analitycznej, izopropanolu 99% i etanolu 99%. Każdy etap sonikacji przeprowadź dwukrotnie, przez pięć minut podczas każdego cyklu. Następnie sonikuj rusztowania jeszcze trzy razy w wodzie, przez łącznie 15 minut.Zakończ procedurę, kładąc rusztowania na tkance beztłuszczowej i pozostawiając je do wyschnięcia na powietrzu przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia wysterylizuj rusztowania w autoklawie przez 15 minut w temperaturze 121 °C i pod ciśnieniem 15 PSI. Aby potwierdzić skuteczność czyszczenia, zastosuj fluorescencję pośrednią.Do jednego dołka płytki 12-dołkowej wlej 2000 µL świeżo przygotowanego roztworu barwiącego z siarczanu rodaminy B i za pomocą pęsety przenieś rusztowanie do tego dołka. Następnie wykonaj obrazy negatywowe rusztowania przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów RFP LED i sprawdź pod dużym powiększeniem, czy nie ma zanieczyszczeń. Korzystając z komory bezpiecznej dla użytkownika, przenieś czyste rusztowania do dołków płytki 24-dołkowej.Do każdej studzienki dodaj 500 µL pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C i pozostaw rusztowanie do namoczenia na 15 minut. W tym czasie przygotuj zawiesinę 500 000 komórek SEP1 zainfekowanych Ad-GFP na 1 mL pożywki. Po 15 minutach całkowicie odessij pożywkę z rusztowań i nanieś na nie 100 µL zawiesiny komórkowej.Następnie inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37°C. Po krótkiej inkubacji dodaj kolejne 500 µL medium hodowlanego i inkubuj rusztowania przez 24 godziny. Następnego dnia wymień medium hodowlane, aby usunąć nieprzylegające komórki.Następnie, oceniając adhezję i rozprzestrzenianie się komórek na rusztowaniach, należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestaw filtrów kostkowych do GFP LED. W celu wykonania barwienia żywe-martwe, najpierw wysiej komórki SEP1 na rusztowaniu w sposób opisany wcześniej. Po 24 do 48 godzinach całkowicie odessaj pożywkę hodowlaną i przemyj rusztowania za pomocą DPBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy zabarwić komórki, używając pożywki hodowlanej zawierającej Calcein AM, Hoechst 33342 oraz Ethidium homodimer. Te trzy fluorofory są światłoczułe, dlatego niezwykle ważne jest utrzymywanie komórek w ciemności w dalszej części procedury. Inkubuj komórki z fluoroforami przez 30 minut, aby uzyskać równomierne rozmieszczenie barwników w całym rusztowaniu.Czas inkubacji będzie zależeć od specyficznych właściwości rusztowania. Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie DPBS, używając jednego mililitra na dołek. Każde przemywanie powinno trwać pięć minut w temperaturze pokojowej.Bezpośrednio po płukaniu należy udokumentować rusztowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby zmierzyć żywotność komórek w czasie, należy zastosować pomiary konwersji rezauryny. Najpierw całkowicie odessać pożywkę hodowlaną z komórek SEP1 osadzonych w płytce 24-dołkowej i przemyć komórki 500 µL DPBS na dołek.Następnie należy pokryć komórki wymaganą objętością sterylnego roztworu roboczego rezazureny i uwzględnić jedną studzienkę zawierającą wyłącznie rezazurenę. Następnie inkubuje się komórki w temperaturze 37 °C przez około 30 minut. Po inkubacji należy przenieść 100 µL przygotowanego supernatantu z każdej studzienki do płytki 96-dołkowej w celu pomiaru fluorescencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W celu dalszej hodowli usunąć rezazurynę z dołka i trzykrotnie przemyć go jednym mililitrem DPBS. Każde przemywanie należy przeprowadzać przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po trzecim przemyciu do każdego dołka z komórkami dodać 500 mikrolitrów pożywki hodowlanej i kontynuować inkubację w celu przeprowadzenia dalszych pomiarów w serii czasowej.Za pomocą pośredniego barwienia fluorescencyjnego udokumentowano obecność zanieczyszczeń przed oczyszczaniem, aby zoptymalizować protokół czyszczenia. Znaczna redukcja ilości substancji na rusztowaniu potwierdza efektywność opisanego protokołu czyszczenia. Sukces kolejnych implantów stosowanych w leczeniu artroplastycznym zależy od zdarzeń zachodzących na styku komórki i materiału.Po 24 godzinach adhezji do rusztowań komórki SEP1 przyczepiły się do podłoża. Następnie zastosowano fluorofory, aby zbadać śmierć i proliferację komórek na rusztowaniach w określonym przedziale czasowym. Barwienie żywe-martwe wykazało niebieskie barwienie jąder komórkowych z czerwoną fluorescencją w komórkach martwych i zieloną fluorescencją w komórkach żywych.Dodatkowo, żywotność komórek na rusztowaniu została określona ilościowo za pomocą testu konwersji rezazuryny. Przez dwa tygodnie gromadzono dane dotyczące komórek hodowanych z rusztowaniami lub bez nich. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dostosowaniu używanych fluoroforów do dostępnego rusztowania oraz mikroskopu.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak barwienie immunofluorescencyjne, w celu wizualizacji obecności białek lub aktywacji kaskad sygnałowych. Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię artroplastyki, ponieważ oddziaływanie komórek z otaczającą tkanką in vivo będzie definiować ich funkcję i trwałość.

imaging-cell-viability-on-non-transparent-scaffolds-using-example

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Rusztowania otrzymane metodą elektroprzędzenia mogą być poddawane obróbce po produkcji w celu zastosowania ich w inżynierii tkankowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody przędzenia złożonych rusztowań (poprzez przędzenie sekwencyjne), tworzenia rusztowań o większej grubości (poprzez nakładanie wielu warstw z wykorzystaniem wyżarzania termicznego lub parowego), zapewniania sterylności (produkcja aseptyczna lub sterylizacja po produkcji) oraz uzyskiwania odpowiednich właściwości...

Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

W tym filmie zademonstrujemy techniki modyfikacji porowatych metalowych implantów w celu poprawy ich funkcjonalności i kontroli migracji komórek. Techniki obejmują opracowywanie gradientów porów w celu kontrolowania ruchu komórek w 3D oraz wytwarzanie naśladowców błony podstawnej w celu kontrolowania ruchu komórek w 2D. Opisano również opartą na HPLC metodę monitorowania integracji implantów in vivo poprzez analizę białek krwi.

Wieloskalowa modyfikacja implantów metalowych z gradientami porów, polielektrolitami i ich pośrednie monitorowanie in vivo

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Protokół krok po kroku do międzypozycyjnego umieszczania naczyń TEV (Tissue Engineered Departments) w tętnicy szyjnej owcy za pomocą zespolenia end-to-end i cyfrowej oceny w czasie rzeczywistym in vivo, aż do uśmiercenia zwierzęcia.

Technika chirurgiczna implantacji przeszczepów naczyniowych wykorzystujących inżynierię tkankową, a następnie monitorowanie in vivo

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Bioaktywne i mechanicznie niezawodne rusztowania metalowe zostały wyprodukowane metodą składającą się z dwóch procesów, dynamicznego odlewania zamrażalnego w celu wytworzenia porowatego Ti oraz powlekania i zagęszczenia rusztowań Ti. Proces zagęszczania jest prosty, skuteczny i ma zastosowanie do wytwarzania rusztowań o stopniu funkcjonalnym.

Produkcja mechanicznie przestrajalnych i bioaktywnych rusztowań metalowych do zastosowań biomedycznych

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

W tym badaniu szczegółowo opisujemy metody decelularyzacji, charakterystyki fizycznej, obrazowania i implantacji in vivo biomateriałów pochodzenia roślinnego, a także metody sadzenia i różnicowania komórek w rusztowaniach. Opisane metody pozwalają na ocenę biomateriałów pochodzenia roślinnego do zastosowań w inżynierii tkanki kostnej.

Bezkomórkowe rusztowania pochodzące z jabłek do inżynierii tkanki kostnej in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Poznaj technikę fluorescencyjnego obrazowania przyczepności i żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach tytanowych. Ta metoda usprawnia analizę inżynierii tkankowej i ocenę interakcji komórkowo-materiałowych.

Obrazowanie żywotności komórek na nieprzezroczystych rusztowaniach — na przykładzie nowatorskiego implantu z dzianiny tytanowej

Przeglądaj więcej filmów