Name: Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj protokół mikrofabrykacji wszczepialnego okna obrazowania z mikro soczewkami przy użyciu druku 3D laserem. Ta metoda umożliwia badaczom zaawansowane obrazowanie procesów biologicznych in vivo z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania otrzymały dofinansowanie z Unii Europejskiej w ramach programu badań i innowacji Horyzont 2020 (G.A. No. 964481-IN2SIGHT).

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Pierwsze rzutowanie kroplowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
	<ol>
		<li>Oczyścić acetonem obie powierzchnie okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm (grubość 170 μm).</li>
		<li>Osuszyć obie powierzchnie azotem o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umieść kontrolowaną ilość 46 μl płynnego fotorezystu po jednej stronie szklanego szkiełka nakrywkowego za pomocą pipety objętościowej. 
		UWAGA: Materiał światłoczuły użyty w tym protokole to biokompatybilny, hybrydowy organiczno-nieorganiczny fotorezystor znany jako SZ2080, który jest dobrze znany i zatwierdzony do zastosowań biomedycznych26. Zwróć uwagę, aby pozostawić wolny pierścień zewnętrzny na szklanym podłożu. Będąc wolnym od fotorezystu, ta szklista przestrzeń zapewnia prawidłowe trzymanie próbki wewnątrz podpory, aby lepiej wspomóc przygotowanie.</li>
		<li>Pozostawić próbkę pod osłoną chemiczną na 48 godzin, aby umożliwić wysuszenie pierwszej kropli fotorezystu przez odparowanie rozpuszczalnika, osiągając stan zol-żel.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Drugie rzucanie kropli (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
	<ol>
		<li>Gdy pierwsza kropla fotorezystu osiągnie stan zol-żel (krok 1.1.4.), odwróć próbkę do góry nogami, odsłaniając czystą powierzchnię.</li>
		<li>Umieść próbkę na uchwycie wsporczym, podnosząc z ziemi pierwszą odlewaną powierzchnię.</li>
		<li>Umieść drugą kroplę 46 μl ciekłego fotorezystu na czystej powierzchni szkła, pozostawiając zewnętrzny pierścień, jak również w kroku 1.1.3.</li>
		<li>Pozostawić próbkę pod maską chemiczną na co najmniej 48 godzin, pozwalając rozpuszczalnikowi odparować. 
		UWAGA: Po 4-6 dniach podwójnie odlana próbka jest gotowa do użycia dla 2PP (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B). Od teraz zwracaj uwagę, aby nie wystawiać próbki na działanie światła otoczenia ze względu na materiał światłoczuły. Ekspozycja na światło degraduje fotorezyst.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Polimeryzacja dwufotonowa (2PP) mikrostruktur
<ol>
	<li>Ustawienie wyrównania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Włącz femtosekundowe źródło lasera bliskiej podczerwieni (długość fali 1030 nm, 1 MHz, przy minimalnym czasie trwania impulsu = 230 fs). 
		UWAGA: Ustaw parametry lasera, takie jak szerokość impulsu i częstotliwość powtarzania.</li>
		<li>Ustaw ścieżkę optyczną wiązki laserowej, aż dotrze do obiektywu mikroskopu, przez szereg układów optycznych i luster zamontowanych na kinematycznych mocowaniach zwierciadła. Iteracyjnie obracaj lustra, aby wyśrodkować wiązkę w otworach wyrównania bliskiej podczerwieni (NIR). 
		UWAGA: Odległość robocza obiektywu mikroskopu powinna być większa niż całkowita wysokość końcowego urządzenia, które ma być wyprodukowane (wysokość soczewki + grubość szkiełka nakrywkowego + wysokość mikrorusztowania). Otwory otworkowe NIR są odpowiednio zaprojektowane, aby uprościć wyrównanie wiązek podczerwieni. Zapewnia to precyzyjne wyrównanie wiązki wzdłuż ścieżki optycznej, przechodząc przez takie elementy, jak płytka półfalowa, ekspander wiązki i zwierciadło dichroiczne. Aby automatycznie sterować mocą lasera, wiązka przechodzi przez polaryzator poziomy i płytkę półfalową, a druga jest zamontowana na zmotoryzowanym rotatorze. W razie potrzeby wiązka może przejść przez ekspander wiązki, aby zwiększyć średnicę wiązki i wypełnić tylne wejście do obiektywu.</li>
		<li>Skieruj wiązkę laserową prostopadle do uchwytu próbki, wyrównując ją za pomocą centrowania odbicia wstecznego.</li>
		<li>Zamontuj obiektyw mikroskopu o dużej odległości roboczej na dedykowanym wsporniku na końcu ścieżki optycznej w pobliżu próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). 
		UWAGA: Kamera CCD jest zamontowana nad zwierciadłem dichroicznym ustawionym w linii ustawionej względem osi optycznej obiektywu w celu monitorowania procesu produkcyjnego. Pozwoli to zobaczyć punkt skupienia lasera i spolimeryzowane struktury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykładowy montaż
	<ol>
		<li>Przymocować (za pomocą taśmy) podwójnie upuszczone szklane szkiełko nakrywkowe do uchwytu próbki zamontowanego na stolikach do tłumaczenia. Zamontuj próbkę tak, aby druga osadzona kropla była skierowana w dół. 
		UWAGA: Uchwyt na próbkę ma centralny otwór, w którym próbka może być zawieszona na stoliku naziemnym5. Uchwyt jest podłączony do mechanicznego systemu gimbala, który jest przykręcony do stolika translacyjnego X, Y w celu ruchu próbki.</li>
		<li>Wyśrodkuj próbkę ręcznie za pomocą zamontowanego obiektywu mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Centrowanie próbki
	<ol>
		<li>Ustaw moc lasera na minimalną wartość wystarczającą do zobaczenia odbicia wiązki w oprogramowaniu kamery CCD (około 5 mW). 
		UWAGA: Zmierz moc lasera w tylnej źrenicy obiektywu (transmisja obiektywu używana w tym protokole wynosi 70% przy długości fali 1030 nm).</li>
		<li>Włącz oprogramowanie interfejsu operatora dla sterownika ruchu i kamery CCD.</li>
		<li>Skoncentruj wiązkę lasera na górnej powierzchni pierwszej kropli fotorezystu.</li>
		<li>Podążając za zakrzywionym profilem kropli, znajdź krawędzie próbki wzdłuż kierunków X i Y. Ustaw środek kropli jako odniesienie do zera bezwzględnego za pomocą software. 
		UWAGA: Taśma używana do mocowania próbki odgrywa rolę w wykrywaniu krawędzi poprzez modyfikację współczynnika załamania, a tym samym odbicia wiązki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kompensacja wychylenia próbki
	<ol>
		<li>W środku próbki skoncentruj wiązkę lasera na powierzchni styku między górną powierzchnią szkiełka nakrywkowego a podstawą pierwszej kropli fotorezystu. Ustaw go jako odniesienie zerowe na osi Z.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę średnicę próbki, przesunąć do pozycji krawędziowej (dla szkiełka nakrywkowego 12 mm jest to ~ - 4 mm) w kierunku ujemnym osi X. W tej pozycji skoncentruj powierzchnię styku (między szkłem a górnym spadkiem fotorezystu) i ustaw ją jako odniesienie do zera bezwzględnego wzdłuż kierunku pionowego Z.</li>
		<li>Przesunąć do pozycji krawędzi w dodatnim kierunku osi X (dla szkiełka nakrywkowego 12 mm jest to ~ + 4 mm). Znajdź tutaj powierzchnię interfejsu, przesuwając cel wzdłuż kierunku pionowego Z.</li>
		<li>Przechylić próbkę, aby skorygować odchylenie w kierunku Z między pozycjami ujemną i dodatnią wzdłuż osi X. Użyj regulowanego mocowania kinematycznego do przechylania uchwytu próbki (jak gimbal).</li>
		<li>Powtarzać kroki 2.4.2-2.4.4 iteracyjnie, aż próbka zostanie całkowicie zrównoważona na osi X.</li>
		<li>Wykonaj tę samą procedurę, która została opisana w krokach 2.4.2-2.4.5 wzdłuż kierunku Y.</li>
		<li>Gdy próbka jest idealnie zrównoważona zarówno na osi płaskiej X, jak i Y, wróć do pozycji środkowej i skoncentruj się w tym miejscu na granicy faz między szkłem a fotorezystem.</li>
		<li>Ustaw nową wartość Z fokusu jako odniesienie na osi Z (Z = 0). 
		UWAGA: Procedura opisana w kroku 2.4 ma na celu zapewnienie idealnej prostopadłości między wiązką lasera a powierzchnią szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić idealne zakotwiczenie struktur 2PP, które zostaną później wyprodukowane. Począwszy od punktu 2.4, wszystkie zabiegi muszą być wykonywane zgodnie ze współczynnikiem załamania światła. Dlatego w razie potrzeby dodaj medium dopasowania indeksu celu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrorusztowania 2PP na dolnym spadku fotorezystu
	<ol>
		<li>Włącz czerwony system oświetlenia LED, aby monitorować proces polimeryzacji w czasie rzeczywistym. 
		UWAGA: Oświetlenie diodą elektroluminescencyjną z czerwonym światłem jest umieszczone pod złożonym uchwytem na próbkę - gimbalem (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). To oświetlenie pozwoli zobaczyć spolimeryzowaną objętość podczas procesu 2PP. Fotorezyst jest wrażliwy na krótsze fale (światło widzialne); w związku z tym czerwone światło LED nie będzie zakłócać próbki.</li>
		<li>Przy wyłączonym laserze przesuń obiektyw wzdłuż kierunku Z poniżej szkiełka nakrywkowego, aby znaleźć drugą powierzchnię interfejsu między dolną powierzchnią szkła a podstawą dolnego spadku oporu. 
		UWAGA: Drugi interfejs zostanie znaleziony przy wartości Z w przybliżeniu równej grubości szkiełka nakrywkowego (170 μm).</li>
		<li>Zwiększ moc lasera do 100 mW, aby umożliwić polimeryzację dwufotonową w dolnym spadku.</li>
		<li>Dostosuj pozycję ogniskowej (zwiększając Z), aby znaleźć drugi interfejs, polimeryzując prostą strukturę odniesienia. 
		UWAGA: Przykładem struktury referencyjnej jest linia polimeryzowana o długości 50 μm.</li>
		<li>Ustaw pierwszą pozycję ogniskowej, w której zachodzi polimeryzacja struktury odniesienia, jako odniesienie zerowe wzdłuż kierunku pionowego (oś Z). 
		UWAGA: Odniesienie w kroku 2.5.5 podkreśla płaszczyznę podstawy dla 2PP mikrorusztowań.</li>
		<li>Ustaw moce polimeryzacji (~ 100-200 mW) i uruchom kod maszynowy jako program sterowany numerycznie (CNC) w celu prawidłowego ruchu etapów translacyjnych w celu wytworzenia pożądanej struktury 3D (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A). 
		UWAGA: Program CNC składa się z zestawu współrzędnych przestrzennych (x, y, z), które określają, w którą stronę poruszają się platformy translacyjne, aby wytworzyć ostateczny obiekt 3D. Na te zdolności polimeryzacji będzie miała wpływ wysokość górnego spadku i specyficzne warunki eksperymentalne (fotorezyst, laser i system ruchu).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikrosoczewki 2PP na górnym spadku fotorezystu
	<ol>
		<li>Poruszając się wzdłuż osi Z, wróć do pierwszego interfejsu między górną powierzchnią szkła a górnym spadkiem fotorezystu (krok 2.4.8). Utrzymuj ten sam płaski układ odniesienia (współrzędne X, Y), aby zapewnić idealne wyrównanie mikrosoczewek 2PP z już wyprodukowanymi mikrostrukturami.</li>
		<li>Znajdź interfejs, polimeryzując prostą strukturę referencyjną. 
		UWAGA: Użyj tego samego procesu, który opisano w kroku 2.5.4, ale różni się tylko kierunkiem ruchu pionowego.</li>
		<li>Ustaw pierwszą linię polimeryzacji jako odniesienie zerowe wzdłuż kierunku pionowego (oś Z). 
		UWAGA: Odniesienie w kroku 2.6.3 podkreśla płaszczyznę uziemienia dla 2PP mikrosoczewek.</li>
		<li>Ustaw parametry produkcyjne dla 2PP konturu żądanej mikrosoczewki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Wiązka laserowa opisuje kołową trajektorię zmniejszającą się w celu ciągłej polimeryzacji zewnętrznej powierzchni pojedynczej mikrosoczewki. Ustaw parametry kreskowania i cięcia odpowiednio wzdłuż kierunków X i Z. 
		UWAGA: Konstrukcja soczewek powinna uwzględniać efektywną ogniskową pożądaną przez użytkownika. Z reguły powinna to być wartość większa niż grubość szkiełka nakrywkowego, co powinno pozwolić na zobrazowanie całego atlasu. Zalecana jest wstępna symulacja obliczeniowa końcowego układu optycznego.</li>
		<li>Ustaw moc polimeryzacji (~ 15-20 mW) i uruchom program, który kieruje ruchem etapów translacyjnych. 
		UWAGA: Na te moce polimeryzacji będzie miała wpływ wysokość górnego spadku, specyficzne warunki eksperymentalne i konstrukcja pożądanej mikrosoczewki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B). Rysunek 4 przedstawia reprezentatywny przykład mikrosoczewki parabolicznej z funkcją parametryczną, która opisuje profil mikrosoczewki i jej główne cechy geometryczne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Opracowanie próbki
<ol>
	<li>Usuń próbkę z eksperymentalnego zestawu produkcyjnego.
	<ol>
		<li>Gdy laser jest wyłączony, wyłącz oś translacyjną X, Y i Z i wyjmij uchwyt.</li>
		<li>Odkleić taśmę klejącą i odłączyć próbkę od uchwytu. 
		UWAGA: Przed opracowaniem próbki należy zwrócić uwagę, aby nie wystawiać próbki na działanie światła otoczenia ze względu na materiał światłoczuły. Ekspozycja na światło usieciowałaby całą ilość fotorezystu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przykładowy rozwój (<silna klasa="xfig">Rysunek 5A)
	<ol>
		<li>Umieść próbkę w odpowiednim podporze, aby podnieść ją z ziemi i przytrzymaj w pozycji poziomej. 
		UWAGA: Ten uchwyt na próbki jest niestandardowym stojakiem na próbki wydrukowanym w SLA, odpowiednio zaprojektowanym tak, aby wystawić obie prototypowe powierzchnie 2PP na działanie rozwiązania rozwijającego5.</li>
		<li>Przygotować zlewkę o pojemności 50 ml i umieścić w niej podpórkę do przenoszenia próbki. 
		UWAGA: Zwróć uwagę na utrzymanie mikrosoczewek 2PP na górnej powierzchni, aby uniknąć deformacji strukturalnych podczas rozwoju ze względu na ich niespolimeryzowany rdzeń wewnętrzny.</li>
		<li>Napełnić zlewkę ~20 ml roztworu rozwijającego, całkowicie pokrywając próbkę. Roztwór składa się z 50% (v/v) roztworu 2-pentanonu i 50% (v/v) alkoholu izopropylowego.</li>
		<li>Pozostawić próbkę w roztworze rozwijającym się na 45 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mycie próbek
	<ol>
		<li>Podnieś wsparcie z rozwijającego się rozwiązania.</li>
		<li>Dotykając go ręcznie lub używając pęsety, pobierz próbkę i dokładnie umyj ją kilkoma kroplami alkoholu izopropylowego.</li>
		<li>Osuszyć obie wykonane powierzchnie szkiełka nakrywkowego delikatnym strumieniem azotu (w temperaturze pokojowej). 
		UWAGA: Wszystkie procedury opisane w krokach 3.2-3.3 są wykonywane pod wyciągiem chemicznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Próbka promieniowania UV
<ol>
	<li>Ekspozycja mikrosoczewek na promieniowanie UV (długość fali 385 nm) (<klasa silna="xfig">Rysunek 5B)
	<ol>
		<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie na próbkę zawieszonym na płaszczyźnie uziemienia. Połóż próbkę mikrosoczewkami skierowanymi w dół. 
		UWAGA: Uchwyt próbki ma centralny otwór do umieszczenia próbki zawieszonej na stopniu gruntowym, zachowując integralność mikrostruktury na dolnej powierzchni.</li>
		<li>Przygotuj lampę UV o długości fali 385 nm.</li>
		<li>Umieścić próbkę pod źródłem promieniowania UV prostopadle do powierzchni szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Wystaw próbkę na działanie promieniowania UV ustawionego na 300 mW przez 120 s. 
		UWAGA: Ekspozycja na promieniowanie UV następuje przechodząc przez mikrorusztowanie i szklane podłoże. W ten sposób jeszcze nie spolimeryzowany rdzeń soczewek zostanie usieciowany promieniami UV, unikając bezpośredniej i dodatkowej ekspozycji na wcześniej spolimeryzowaną powierzchnię.</li>
		<li>Ustawiając źródło UV pod kątem -45° i +45° w stosunku do normalnego położenia płaszczyzny próbki, powtórzyć krok 4.1.4. 
		UWAGA: Ta trzyetapowa ekspozycja na promieniowanie UV pod różnymi kątami pozwoli na pełne usieciowanie całego niespolimeryzowanego oporu w objętości mikrosoczewek, osiągając stabilność. Jest to szczególnie ważne w przypadku szerokich mikrosoczewek.</li>
		<li>Wyjmij próbkę z uchwytu i przechowuj ją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Charakterystyka morfologiczna
<ol>
	<li>Akwizycja za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) (<silna klasa="xfig">Rysunek 6)
	<ol>
		<li>Przygotuj stację SEM. Przymocuj kawałek taśmy węglowej do uchwytu SEM, aby uzyskać próbkę przylegania.</li>
		<li>Umieścić szklaną próbkę na uchwycie pod kątem 45° w stosunku do orientacji kamery SEM. Zwróć uwagę na umieszczenie próbki w pustym miejscu na szkiełku nakrywkowym, aby zachować integralność struktury (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
		<li>Powtórz akwizycję, jak w kroku 5.1.2 dla obu powierzchni szklanego szkiełka nakrywkowego, aby zebrać obrazy 3D SEM mikrorusztowań i mikrosoczewek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6A,C).</li>
		<li>Ostrożnie odłącz próbkę od taśmy węglowej i przechowuj ją w zakrytym pudełku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sadakane, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+of+dendritic+spines+in+marmoset+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging of dendritic spines in marmoset neocortex.</a> eNeuro. 2 (4), 1-10 (2015).</li>
<li>Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+and+applications+of+long-term+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Procedures and applications of long-term intravital microscopy.</a> Methods. 128, 52-64 (2017).</li>
<li>Marini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlenses+fabricated+by+two-photon+laser+polymerization+for+cell+imaging+with+non-linear+excitation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Microlenses fabricated by two-photon laser polymerization for cell imaging with non-linear excitation microscopy.</a> Adv Funct Mater. 33 (39), 202213926(2023).</li>
<li>Kariman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+dioptric+power+micro-lens+fabricated+by+two-photon+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">High dioptric power micro-lens fabricated by two-photon polymerization.</a> Opt Express. 32 (27), 48114-48131 (2024).</li>
<li>Conci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Opt+Mater%22%5BJournal%5D)">Advanced optical materials.</a> Adv Opt Mater. 10 (7), e2101103(2022).</li>
<li>Conci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+label-free+tissue+histology+through+a+microstructured+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">In vivo label-free tissue histology through a microstructured imaging window.</a> APL Bioeng. 8 (1), 016107(2024).</li>
<li>Dondossola, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+foreign+body+response+to+biomaterials+by+non-linear+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Examination of the foreign body response to biomaterials by non-linear intravital microscopy.</a> Nat Biomed Eng. 1 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Lee, K. S., Kim, R. H., Yang, D. Y., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+3D+nano%2Fmicrofabrication+using+two-photon+initiated+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in 3D nano/microfabrication using two-photon initiated polymerization.</a> Prog Polym Sci. 33 (6), 631-681 (2008).</li>
<li>LaFratta, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fabrication.</a> Angew Chem Int Ed. 46 (33), 6238-6258 (2007).</li>
<li>Malinauskas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+laser+nanostructuring+of+photopolymers%3A+A+decade+of+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrafast laser nanostructuring of photopolymers: A decade of advances.</a> Phys Rep. 533 (1), 1-31 (2013).</li>
<li>Zyla, G., Farsari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+of+laser-based+3D+printing%3A+A+perspective+on+multi-photon+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Laser+Micro%2FNanoeng%22%5BJournal%5D)">Frontiers of laser-based 3D printing: A perspective on multi-photon lithography.</a> J Laser Micro/Nanoeng. 19 (1), 1-12 (2024).</li>
<li>Eltom, A., Zhong, G., Muhammad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold+techniques+and+designs+in+tissue+engineering+functions+and+purposes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater+Sci.+Eng%22%5BJournal%5D)">Scaffold techniques and designs in tissue engineering functions and purposes: A review.</a> Adv Mater Sci. Eng. 2019, 3429527(2019).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additive+manufacturing+of+polymer-derived+ceramics%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Powder+Metall+Part+Mater%22%5BJournal%5D)">Additive manufacturing of polymer-derived ceramics.</a> Adv Powder Metall Part Mater. 351 (6268), 716-725 (2020).</li>
<li>Cai, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+biodegradable+three-dimensional+macroporous+scaffold+using+aligned+electrospun+nanofibrous+yarns+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Novel biodegradable three-dimensional macroporous scaffold using aligned electrospun nanofibrous yarns for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res. 100 A (5), 1187-1194 (2012).</li>
<li>Nandakumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+process+for+imprinting+micro+and+nanopatterns+on+electrospun+fiber+meshes+at+physiological+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A fast process for imprinting micro and nanopatterns on electrospun fiber meshes at physiological temperatures.</a> Small. 9 (20), 3405-3409 (2013).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microlens+array+and+its+application%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Mech+Eng%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microlens array and its application: A review.</a> Chin J Mech Eng. 31 (1), 20(2018).</li>
<li>Cai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlenses+arrays%3A+Fabrication%2C+materials%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Microlenses arrays: Fabrication, materials, and applications.</a> Microsc Res Tech. 84 (11), 2784-2806 (2021).</li>
<li>Vaezi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+3D+micro-additive+manufacturing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Adv+Manuf+Technol%22%5BJournal%5D)">A review on 3D micro-additive manufacturing technologies.</a> Int J Adv Manuf Technol. 67 (5-8), 1721-1754 (2013).</li>
<li>Guo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microlens+fabrication+by+means+of+femtosecond+two-photon+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Microlens fabrication by means of femtosecond two-photon photopolymerization.</a> Opt Express. 14 (2), 810(2006).</li>
<li>Malinauskas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtosecond+laser-induced+two-photon+photopolymerization+technique+for+structuring+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Opt%22%5BJournal%5D)">A femtosecond laser-induced two-photon photopolymerization technique for structuring microlenses.</a> J Opt. 12 (3), 035204(2010).</li>
<li>Siegle, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+aspherical+singlet+and+doublet+micro-optics+by+grayscale+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Complex aspherical singlet and doublet micro-optics by grayscale 3D printing.</a> Opt Express. 31 (3), 4179(2023).</li>
<li>Gissibl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+direct+laser+writing+of+ultracompact+multi-lens+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Two-photon direct laser writing of ultracompact multi-lens objectives.</a> Nat Photonics. 10 (8), 554-560 (2016).</li>
<li>Thiele, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+printed+stacked+diffractive+microlenses%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">3D printed stacked diffractive microlenses.</a> Opt Express. 27 (24), 35621(2019).</li>
<li>Balli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hybrid+achromatic+metalens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A hybrid achromatic metalens.</a> Nat Commun. 11 (1), 17646(2020).</li>
<li>Gonzalez-Hernandez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+3D+printing+of+inorganic+free-form+micro-optics%5BTitle%5D)+AND+%22Photonics%22%5BJournal%5D)">Laser 3D printing of inorganic free-form micro-optics.</a> Photonics. 8 (12), 577(2021).</li>
<li>Ovsianikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-low+shrinkage+hybrid+photosensitive+material+for+two-photon+polymerization+microfabrication%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultra-low shrinkage hybrid photosensitive material for two-photon polymerization microfabrication.</a> ACS Nano. 2 (11), 2257-2262 (2008).</li>
<li>Madden, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proangiogenic+scaffolds+as+functional+templates+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Proangiogenic scaffolds as functional templates for cardiac tissue engineering.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (34), 15211-15216 (2010).</li>
<li>Raimondi, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomater. 9 (1), 4579-4584 (2013).</li>
<li>Guillaume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+spheroid+microscaffolds+as+modular+tissue+units+to+build+macro-tissue+assemblies+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Hybrid spheroid microscaffolds as modular tissue units to build macro-tissue assemblies for tissue engineering.</a> Acta Biomater. 165, 72-85 (2023).</li>
<li>Ovsianikov, A., Mironov, V., Stampf, J., Liska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+3D+cell-culture+matrices%3A+Multi-photon+processing+technologies+for+biological+and+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Med+Devices%22%5BJournal%5D)">Engineering 3D cell-culture matrices: Multi-photon processing technologies for biological and tissue engineering applications.</a> Expert Rev Med Devices. 9 (6), 613-633 (2012).</li>
<li>Noskovicova, N., Hinz, B., Pakshir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+fibrosis+and+the+underappreciated+role+of+myofibroblasts+in+the+foreign+body+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Implant fibrosis and the underappreciated role of myofibroblasts in the foreign body reaction.</a> Cells. 10 (7), 1794(2021).</li>
<li>Zandrini, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-foci+laser+microfabrication+of+3D+polymeric+scaffolds+for+stem+cell+expansion+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multi-foci laser microfabrication of 3D polymeric scaffolds for stem cell expansion in regenerative medicine.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-9 (2019).</li>
<li>Rey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tissue+engineering+and+innovative+fabrication+techniques+for+3D+structures%3A+Translational+applications+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Advances in tissue engineering and innovative fabrication techniques for 3D structures: Translational applications in neurodegenerative diseases.</a> Cells. 9 (7), 1636(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Aby zapewnić dokładne zobrazowanie żądanego obszaru 3,6 w oknie mikrostrukturalnym, konieczne jest precyzyjne ustawienie dwóch struktur (mikrorusztowania i mikrosoczewek). Stanowi to główne wyzwanie proponowanego protokołu, ponieważ wysoka rozdzielczość 2PP jest ściśle związana z ograniczeniem głębokości produkcji 3,6. Odwrócenie próbki podczas produkcji w celu sekwencyjnego wystawienia obu powierzchni na działanie wiązki laserowej może być opcją, ale komplikuje ponowne wyrównanie i jest czasochłonne5. Wprowadziłoby to również trudności w znalezieniu tego samego systemu odniesienia, a tym samym zagroziłoby dobremu dopasowaniu między elementami mikrooptycznymi a mikrorusztowaniami. Prowadzenie całego procesu w sposób ciągły bez demontażu próbki utrzymuje spójny system odniesienia, ułatwiając w ten sposób i gwarantując dokładne wyrównanie struktur. W tym celu używamy obiektywu o dużym zasięgu roboczym (2,5 mm), który dzięki dużej aperturze numerycznej utrzymuje dobrą rozdzielczość (krok 1.1). Takie podejście również znacznie skraca czas wytwarzania, ponieważ oszczędza wyrównanie próbki po jej odwróceniu3. Ponadto obchodzenie się z próbkami stanowi kolejne wyzwanie ze względu na ich niewielkie rozmiary i kruchość, co sprawia, że manipulacja i precyzyjne wyrównanie są jeszcze bardziej krytyczne.
W procesach 2PP niezbędne jest szerokie badanie procesu produkcyjnego w celu ustalenia kluczowych parametrów, takich jak optymalna długość fali lasera, szerokość impulsu, a także moce lasera i ruchy sceniczne 9,10,11. W związku z tym przeprowadzono kompleksową charakterystykę procesu 2PP, nawet biorąc pod uwagę różne konfiguracje układu eksperymentalnego, aby najpierw zapewnić wysoce stabilne struktury 3D o wysokiej rozdzielczości ze szczegółami w skali komórkowej do zastosowań biologicznych, 27,28,29,30. Dodatkowo, zminimalizowanie chropowatości powierzchni wszczepialnych mikrosoczewek miało kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości mikrooptyki o pożądanych cechach optycznych, zmniejszając w ten sposób odpowiedź immunologiczną na implant 19,22,31. W związku z tym wyzwanie procesu polega na dostosowaniu parametrów, takich jak moc i szerokość impulsu, w oparciu o czynniki eksperymentalne, takie jak współczynnik załamania światła i objętość materiału światłoczułego, warunki środowiskowe (np. wilgotność i temperatura) oraz wydajność lasera. Wymagana była również obszerna charakterystyka, aby czas i intensywność ekspozycji na promieniowanie UV w pełni usieciować całą objętość mikrosoczewek, zapewniając ich stabilność. Ustawienia te muszą być dostosowane do źródła promieniowania UV, odległości roboczej i objętości właściwej elementu, który ma być polimeryzowany promieniami UV.
Podstawowym ograniczeniem procesu 2PP jest jego niska przepustowość ze względu na niezwykle wysoką rozdzielczość, jaką oferuje. Biorąc to pod uwagę, cechy spolimeryzowane są bardzo małe, od setek nanometrów do kilku mikrometrów 9,26. W związku z tym czas produkcji znacznie się wydłuża przy produkcji konstrukcji w skali setek mikrometrów, które są stosunkowo duże jak na standardy 2PP, zwłaszcza w przypadku konstrukcji wielkogabarytowych. W efekcie tworzenie zintegrowanych urządzeń z wieloma konstrukcjami o tak dużych gabarytach może zająć kilka godzin. W tym kontekście hybrydowy protokół UV-2PP zaproponowany do produkcji mikrosoczewek przyczynił się do skrócenia czasu produkcji pojedynczej mikrosoczewki o 98% w porównaniu z 2 warstwami soczewek w całej ich objętości. Pozwoliło to na zwiększenie precyzji skanowania 2PP zewnętrznej powłoki mikrosoczewki, zmniejszając chropowatość powierzchni przy jednoczesnym uzyskaniu powłoki mikrosoczewki wystarczająco grubej, aby zapewnić stabilność soczewki, a wszystko to w znośnym czasie produkcji. Aby jeszcze bardziej przyspieszyć ten proces, w przyszłości zostanie zaproponowane podejście równoległe, które umożliwi jednoczesny zapis wielu struktur32. Strategia ta polegałaby na podziale wiązki laserowej na wiele wiązek w celu stworzenia kilku punktów ogniskowych, co umożliwiłoby równoległą produkcję, a tym samym znacznie skróciłoby całkowity czas produkcji.
W przeciwieństwie do najpopularniejszych technik miękkiej litografii, jedną z kluczowych zalet 2PP jest to, że jest to metoda wytwarzania przyrostowego bez maski, która umożliwia wytwarzanie dowolnych struktur w objętości materiału światłoczułego11. Ta zdolność pozwala na produkcję złożonych trójwymiarowych i porowatych struktur o wysokim potencjale dostosowywania. Ponadto, w oparciu o zasadę absorpcji nieliniowej, 2PP pozwala osiągnąć rozdzielczość poniżej granicy dyfrakcji, co jest nieosiągalne przy użyciu standardowych technik druku 3D lub modelowania osadzania topionego (FDM), na przykład33. Jest to szczególnie cenne przy tworzeniu porowatych rusztowań 3D z funkcjami w skali komórkowej w celu wspierania wzrostu komórek, rekrutacji i integracji tkanek.
Produkcja mikrostrukturalnych urządzeń do implantacji ze zintegrowaną optyką w ramach proponowanego tutaj procesu może znacząco wpłynąć na zastosowania obejmujące mechanobiologię, modelowanie chorób in vitro i inżynierię tkankową (ryc. 7 i ryc. 8). Przedstawiony protokół umożliwia wytworzenie wysokiej jakości urządzenia technicznego wyposażonego w mikrostruktury wspomagające integrację tkankową, a jednocześnie pełniące funkcję punktów odniesienia do obrazowania in vivo . Dodatkowo, te odpowiednio zaprojektowane mikrosoczewki usprawniły zaawansowane obrazowanie nieliniowe, korygując aberracje sferyczne spowodowane przez tkankę otaczającą implant4. Wszechstronność procesu pozwala nam bowiem na dostosowanie konstrukcji urządzenia, jak na przykład tworzenie rusztowań i konstrukcji referencyjnych o geometrii zoptymalizowanej pod kątem konkretnych zastosowań, pomagając zarówno w rekonstrukcjach 3D, jak i korekcji aberracji obrazowych w post-processingu. Wreszcie, dostosowanie konstrukcji mikrosoczewek w oparciu o tkankowe współczynniki załamania światła usprawnia obrazowanie specyficzne dla aplikacji, skutecznie tworząc soczewkę optyczną in situ w urządzeniu.

<a href="https://app.jove.com/t/6637">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/67975">10.3791/67975</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/67975">Microfabrication of Implantable Optics Integrated in a Microstructured Imaging Window for Advanced In Vivo Imaging</a>. The Authors&#160;section was updated.

Erratum: Microfabrication of Implantable Optics Integrated in a Microstructured Imaging Window for Advanced In Vivo Imaging

Mikroskopia przyżyciowe umożliwia badanie procesów biologicznych u żywych zwierząt poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym. W połączeniu z fluorescencyjnymi metodami obrazowania nieliniowego może nawet osiągnąć rozdzielczość w skali subkomórkowej1. W związku z tym stał się ważnym narzędziem w wielu dziedzinach, takich jak testy immunologiczne czy badania nad nowotworami, gdzie ważna jest obserwacja komórek w ich rzeczywistym środowisku fizjologicznym.
Powszechne podejścia do kontroli przyżyciowej, takie jak komory grzbietowych fałdów skórnych lub okna obrazowania czaszki i brzucha, są wysoce inwazyjne i stwarzają trudności dla długotrwałych kontroli tego samego punktu. W związku z tym pożądane są nowe metody obrazowania in vivo, które zmniejszają stres zwierząt i umożliwiają łatwą zmianę położenia widoku optycznego2.
W tym ramie, możliwe jest rozwinięcie nowatorskiego, zminiaturyzowanego okna obrazowania opartego na szklanym podłożu, które zawiera stronę obrazowania z mikrosoczewkami optycznymi oraz stronę odniesienia tkankowego z trójwymiarowymi (3D) mikro-rusztowaniami. To zminiaturyzowane okienko obrazowania może być wszczepione "podskórnie" zwierzęciu i będzie funkcjonować jako "wewnętrzny" obiektyw mikroskopu. Zasada działania urządzenia będzie polegała na wykorzystaniu mikrosoczewek sprzężonych z zewnętrznym obiektywem mikroskopu o niskiej aperturze numerycznej (NA) do wykonywania nieliniowego obrazowania in vivo procesów biologicznych zachodzących wewnątrz rusztowań. Mikrosoczewki skompensują aberrację sferyczną spowodowaną obrazowaniem przez niejednorodne podłoże jako tissue3,4, podczas gdy mikro-rusztowanie będzie napędzać regenerację tkanek i będzie działać jako latarnie optyczne5,6,7, umożliwiając w ten sposób długotrwałą inspekcję tego samego punktu.
Podstawowe elementy urządzenia, tj. mikro-rusztowania i mikrosoczewki, zostały już zademonstrowane osobno, ale ich integracja w tym samym urządzeniu stwarza kilka wyzwań ze względu na ich naturę 3D, ich mikrometrowy rozmiar i potrzebę idealnego optycznego wyrównania między nimi. Mikrorusztowania, składające się z prostokątnych prostopadłościennych siatek, o reprezentatywnych wymiarach całkowitych ~ 500 μm x 500 μm x 100 μm i rozmiarach porów ~ 50 μm x 50 μm x 20 μm, mogą kierować rekrutacją komórek i nowym unaczynieniem, sprzyjając w ten sposób integracji tkanek. Ponadto, ze względu na ich autofluorescencję, mikrorusztowania działają jako latarnia fluorescencyjna in situ, umożliwiając w ten sposób szybką zmianę położenia i wyrównanie pod mikroskopem, a nawet korekcję aberracji sferycznych podczas obrazowania nieliniowego, aby umożliwić obserwacje podłużne in vivo o wysokiej rozdzielczości5. Mikrosoczewki o dużej aperturze numerycznej, o profilach sferycznych lub quasi-parabolicznych i ogniskowych rzędu kilkuset mikrometrów, wykazały swoje możliwości w zakresie liniowego i nieliniowego obrazowania próbek biologicznych w połączeniu z mikroskopem konfokalnym lub dwufotonowym3,4.
Mikrosoczewki i mikro-rusztowania są wytwarzane za pomocą laserowej inskrypcji 3D, znanej również jako polimeryzacja dwufotonowa (2PP). W 2PP wiązka lasera femtosekundowego w podczerwieni jest ściśle skupiona wewnątrz fotorezystu utwardzanego promieniami UV, a dzięki absorpcji wielu fotonów w ognisku powstaje zamknięty woksel spolimeryzowanego materiału o rozmiarze submikrometrowym (~100 nm). Przesuwając ognisko lasera względem próbki fotorezystu, można uzyskać trójwymiarowe struktury materiału spolimeryzowanego po wypłukaniu materiału niespolimeryzowanego8. Proces ten charakteryzuje się wysoką rozdzielczością i charakterem 3D, co pozwala na pozyskiwanie mikrostruktur 3D, takich jak rusztowania i soczewki, o dobrej stabilności i wysokiej jakości powierzchni9,10,11. Istnieją różne techniki wytwarzania porowatych mikrorusztowań, takie jak druk 3D, nanoimprinting lub elektroprzędzenie12,13,14,15. Wszystkie te techniki mają główną wadę; Nie są one w stanie osiągnąć rozdzielczości w zakresie submikrometrowym, dając tym samym struktury o rozmiarach porów (~100 μm) większych niż rozmiar komórkowy i nie naśladują macierzy zewnątrzkomórkowej, która jest niezbędna do dobrej regeneracji tkanek. Do wytwarzania mikrosoczewek można podejść metodami opartymi na replikacji soczewki z formy lub maski, takimi jak formowanie wtryskowe, wytłaczanie na gorąco lub formowanie UV, lub metodami bezpośrednimi, takimi jak rozpływ termiczny, wytłaczanie mikroplastiku lub natryskiwanie mikrokropelkami16,17. Wszystkie z nich mają ograniczenia w morfologii powierzchni, które można uzyskać, i są trudne do zintegrowania z przepływem produkcyjnym, w którym konieczne jest również wyprodukowanie mikrorusztowań. Z drugiej strony, 2PP wykazał swoją wszechstronność w wytwarzaniu złożonych komponentów optycznych18,19, takich jak soczewki sferyczne lub paraboliczne, soczewki dyfrakcyjne, a nawet kombinacje różnych soczewek w tym samym komponencie optycznym20,21,22,23,24. W tym kontekście 2PP wydaje się być najlepszą techniką wytwarzania całości, która zawiera zarówno soczewki, jak i mikrorusztowania.
Pomimo tego, że jest to unikalny wybór do realizacji tych struktur 3D z rozdzielczością mikrometrów, 2PP ma dwa główne ograniczenia, tj. jest to czasochłonne podejście dla struktur o stosunkowo dużej objętości i przedstawia ograniczoną głębokość produkcji (wzdłuż osi optycznej) ze względu na krótką odległość roboczą obiektywów mikroskopowych używanych do ciasnego ustawiania ostrości.
Ten artykuł proponuje unikalny protokół wytwarzania mikro-rusztowań i mikrosoczewek po przeciwnych stronach szklanego podłoża w procesie napromieniania w jednym kroku podłużnym, który gwarantuje dobre wyrównanie obu elementów i pokonuje ograniczenia głębokości produkcji. Protokół jest również zoptymalizowany pod kątem czasu produkcji; z jednej strony jednoetapowe naświetlanie oszczędza czas wyrównania, a zastosowanie podejścia hybrydowego, które łączy 2PP powłoki soczewki i utwardzanie UV wewnętrznych fotorezystorów, skraca czas naświetlania soczewek o dużej objętości<klasa SUP="xref">25. Zdolność 2PP do wytwarzania struktur 3D o dowolnym kształcie pozwala na wykorzystanie tego protokołu do dowolnego projektu mikrosoczewek i mikrorusztowań, wzmacniając w ten sposób obecną metodę.

<table><tbody><tr><td>Beam Expander</td><td>Thorlabs, Niemcy</td><td>GBE03-C</td><td>3X Achromatyczny ekspander wiązki Galileusza, pokryty AR: 650 - 1050 nm (GBE03-C)</td></tr><tr><td>Sterowany zmotoryzowany rotator</td><td>Aerotech, USA</td><td>MPS50GR</td><td>MPS50GR-TTM-G80-DC-LMO-PLOTS</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Menzel-Glaser, Niemcy</td><td>CB00120RA1</td><td>okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm i grubości od 170 do 230 &mikro; m (#1.5)</td></tr><tr><td>Rozwiązanie rozwojowe</td><td>Sigma Aldrich, Stany Zjednoczone.</td><td>Roztwór niestandardowy</td><td>50% v/v 2-pentanon, 50% v/v roztwór alkoholu izopropylowego&nbsp;</td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne (1030 nm)</td><td>Eskma Optics, Litwa</td><td>810-1030D</td><td>&Oslash; 1-calowe krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne, 805 nm Cutoff</td></tr><tr><td>Laser femtosekundowy</td><td>Satsuma, amplituda</td><td>Satsuma Series</td><td>Femtosecond Ytterbium (Yb) laser światłowodowy (&lambda; = 1030nm, 1MHz, przy minimalnym czasie trwania impulsu = 230 fs,</td></tr> <tr><td>Gimbal</td><td>Thorlabs, Niemcy</td><td>GMB100</td><td>Gimbal Mounts 100</td></tr><tr><td>Płyta półfalowa</td><td>Thorlabs, Niemcy</td><td>AHWP05M-980</td><td>&lambda;/2 przy 690-1200 nm (AHWP05M-980)</td></tr><tr><td>Widzenie maszynowe</td><td>Thorlabs, Niemcy</td><td>DCU223M/DCU223C</td><td>Kamera CCD&nbsp; zamontowana za zwierciadłem dichroicznym</td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy</td><td>Nikon, Japonia</td><td>MRD71100</td><td>plan CFI 100 razy; Obiektyw C WI z aperturą numeryczną&nbsp; 1.1</td></tr><tr><td>System ruchu</td><td>Aerotech, USA</td><td>ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY</td><td>ANT130-035-L-ZS; ANT95-50-XY</td></tr><tr><td>NIR Tarcze otworkowe do wyrównywania</td><td>, Niemcy</td><td>VRC1D1</td> <td>i Oslash; 1-calowy dysk wykonany z wolno blaknącego materiału fosforowego z otworem 1,5 mm pośrodku</td></tr><tr><td>Photoresist SZ2080</td><td>Forth, Grecja</td><td>SZ2080</td><td>Fotorezystor utwardzany promieniami UV SZ2080 + Irgacure-369 Pipeta fotoinizatora</td></tr><tr><td></td><td>Gilson, USA</td><td>F123615</td> Skaningowy mikroskop elektronowy <td>Pipetman 100G</td></tr><tr><td>(SEM)</td><td>Phenom World, Holandia</td><td>Phenom Pro</td><td>PHENOM PRO</td></tr><tr><td>Oprogramowanie CNC</td><td>Aerotech, USA</td><td>A3200</td><td>Automation 3200 Interfejs operatora CNC Lampa</td></tr><tr><td>UV</td><td>Hamamatsu, Japonia</td><td>LC-L1V3</td><td>LIGHTNINGCURE, LC-L1V3</td></tr></tbody></table>

mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Microfabrication of Implantable Optics Integrated in a Microstructured Imaging Window for Advanced In Vivo Imaging

W kontekście badań biomateriałów i leków na modelach zwierzęcych, to badanie przedstawia uproszczony protokół wytwarzania nowatorskiego zintegrowanego okna obrazowania implantowalnego. Mikrourządzenie składa się z zaawansowanego systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami zaprojektowanymi specjalnie do ilościowego oznaczania odpowiedzi immunologicznej in vivo przy użyciu zaawansowanej nieliniowej mikroskopii wzbudzenia. Protokół opiera się na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080, co umożliwia wytwarzanie mikrorusztowań i mikrosoczewek w ciągłej sekwencji w celu zwiększenia wydajności i precyzji produkcji. Aby jeszcze bardziej poprawić szybkość, dokładność i integralność strukturalną, wdrożono hybrydowe podejście do produkcji optyki, obejmujące 2PP zewnętrznej powłoki mikrosoczewki, a następnie sieciowanie UV w rdzeniu wewnętrznym. Ta innowacyjna technika optymalizuje właściwości optyczne mikrosoczewek, jednocześnie usprawniając proces produkcji. Powstałe w ten sposób mikrourządzenie charakteryzuje się wysoką powtarzalnością i stabilnością mechaniczną, co czyni je skuteczną metodą prototypowania mikroskalowych systemów optycznych do szeregu zastosowań biomedycznych.

Przedstawiono protokół wytwarzania dwustronnego implantowalnego urządzenia mikrostrukturalnego zawierającego układ optyczny i punkt odniesienia do analizy tkankowej. Proces wykorzystuje dwufotonową polimeryzację laserową do tworzenia mikrostruktur 3D i mikrooptyki po przeciwległej stronie tego samego podłoża. Zastosowanie obiektywu o dużej odległości roboczej umożliwia wytworzenie obu struktur bez konieczności odwracania podłoża, co eliminuje etap ponownego ustawiania i gwarantuje idealne wyrównanie obu komponentów. Urządzenie to usprawni zaawansowane obrazowanie in situ poprzez umożliwienie korekcji aberracji optycznych i wielokrotnych obserwacji tego samego obszaru, dzięki zastosowaniu mikrooptyki i mikrofabrykowanego układu odniesienia. Rysunek 1 przedstawia procedurę przygotowania obu powierzchni podłoża nośnego do późniejszego wytwarzania. Schemat układu eksperymentalnego wykorzystanego do mikrofabrykacji obu powierzchni próbki przedstawiono na Rysunku 2. Obraz pokazuje również złożony uchwyt obiektyw-próbka, w którym pierwszy jest skupiony na próbce oświetlonej systemem czerwonych diod LED, co pozwala na monitorowanie procesu wytwarzania w czasie rzeczywistym za pomocą wizji maszynowej. Rysunek 3 jakościowo demonstruje elastyczność protokołu w zakresie mikrofabrykacji różnych projektów mikrorusztowań i mikrosoczewek. Rysunek 4 wyróżnia funkcję ugięcia (sag) wykorzystaną do projektowania mikrosoczewek z asferycznym profilem parabolicznym oraz schemat reprezentatywnego projektu w korelacji z jego głównymi cechami w formie przykładu. Na Rysunku 5 opisano etapy wywoływania próbki i naświetlania UV, niezbędne do pełnego sieciowania całej objętości mikrosoczewek. Na koniec Rysunek 6 przedstawia przykłady wyników mikrofabrykacji. Przedstawiona procedura umożliwia polimeryzację mikrostruktur 3D na obu powierzchniach tego samego urządzenia, zapewniając doskonałą rozdzielczość i stabilność. Na koniec Rysunek 7 jest ilustracją przedstawiającą ogólny przebieg protokołu, kończącą się Rysunkiem 8, który pokazuje przykład końcowego zastosowania proponowanego urządzenia, tj. obrazowanie in vitro komórek hodowanych wewnątrz mikrorusztowania.
<img alt="Schemat metodologii odlewania kropelkowego z fotorezystem na szklanej lamellce po 48h. Przedstawiono uchwyt próbki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Protokół przygotowania próbki. Na obrazie przedstawiono schemat dwuetapowego procesu odlewania kropelkowego fotorezystu na wspierającej okrągłej szklanej lamellce (A). Po prawej stronie zaprezentowano zdjęcie próbki z wysuszonym fotorezystem naniesionym na obie strony (B). Próbka jest utrzymywana przez uchwyt próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ mikroskopii laserowej skupiony na próbce, pokazujący drogę optyczną; schemat analizy wzbudzenia fotonicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Układ do dwufotonowej polimeryzacji laserowej (2PP). Po prawej stronie przedstawiono reprezentatywny schemat układu produkcyjnego. Głównymi komponentami układu są źródło lasera femtosekundowego (długość fali 1030 nm, minimalna szerokość impulsu 230 fs i częstotliwość repetycji 1 MHz), stopień do kontroli mocy, rozszerzacz wiązki, lustro dichroiczne oraz obiektyw mikroskopowy o wysokiej aperturze numerycznej (100x, NA 1.1). Nad lustrem dichroicznym, w osi optycznej obiektywu, zamontowano kamerę CCD do monitorowania procesu produkcji. Po lewej stronie znajduje się powiększenie końcowej części układu optycznego, prezentujące zdjęcie złożonego systemu obiektyw/uchwyt próbki/oświetlenie LED dla systemów wizyjnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat projektu struktury sieciowej i 3D wykresy powierzchni do analizy mikrostruktury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Różnorodne projekty mikrostruktur 3D i mikrosoczewek. Na rycinie przedstawiono różne przykłady (A) mikrorusztowań oraz (B) mikrosoczewek, które mogą zostać wykonane przy użyciu proponowanej procedury. Wysoka elastyczność protokołu umożliwia wytwarzanie mikrostruktur o zróżnicowanych cechach geometrycznych, rozdzielczości, wymiarach i objętości, co wykazuje jego wszechstronność. Skala szarości w panelu (B) ma na celu podkreślenie zmniejszenia mocy lasera i prędkości zapisu w celu wygładzenia powierzchni i zminimalizowania jej chropowatości. Dokładne parametry wytwarzania są dobierane zgodnie z konkretnym projektem mikrosoczewki. Paski skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Równanie asferycznego profilu parabolicznego z indeksem refrakcji i schematem soczewki; parametry projektowe optyki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4Przykład wykonanej mikrosoczewki. Panel przedstawia reprezentatywny przykład asferycznego profilu parabolicznego, uwidaczniający opis parametryczny zakrzywionej powierzchni soczewki jako funkcję ugięcia z(r) (A). Tutaj Htot jest grubość soczewki, r to współrzędna radialna, a fn jest ogniskową parabolicznej soczewki refrakcyjnej, która różni się od jej ogniskowej efektywnej. Moc dioptryczna jest określona przez współczynnik załamania światła soczewki oraz różnicę między nim a współczynnikiem załamania ośrodka otaczającego. Po prawej stronie szkic projektowy uwidacznia dwie płaszczyzny główne znajdujące się w wierzchołku V1 oraz kilka µm powyżej powierzchni 2 (Π1 i Π2, linie przerywane) (B). Szkic przedstawia pojedynczą asferyczną mikrosoczewkę paraboliczną o średnicy 600 µm i wykonano na podłożu ze szkła N-BK7 (o grubości 170 µm). (C) podkreśla parametry geometryczne asferycznej soczewki parabolicznej, mikrofabrykowanej w fotorezyście SZ2080. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu wywoływania; naświetlanie lampą UV; wynik mikrostrukturyzacji; układ badania optycznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Protokoły wywoływania próbki i naświetlania UV. Na obrazie przedstawiono w formie szkicu wykonaną próbkę zanurzoną w roztworze wywoływującym (A). Próbka jest unoszona w roztworze za pomocą uchwytu, co umożliwia prawidłowe wywołanie obu stron próbki i otrzymanie dwustronnego urządzenia mikrostrukturalnego. Po prawej stronie przedstawiono zdjęcie konfiguracji układu do naświetlania próbki promieniami UV (B). Zdjęcie pokazuje lampę UV ustawioną prostopadle do powierzchni próbki. Zgodnie z kartą charakterystyki lampy UV, obecna odległość między lampą a próbką jest zgodna z roboczą odległością pracy lampy. Próbka poddawana promieniowaniu UV, zamocowana w uchwycie, została wyróżniona na powiększonym obrazie po prawej stronie. Pasek skali: 12 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obraz mikroskopowy struktur w skali mikro; topografia powierzchni, interfejs materiałowy, wzór siatki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (SEM) przedstawiające reprezentatywne wyniki procesu wytwarzania. Panel przedstawia dwustronne urządzenie w widoku bocznym (B) oraz dwa reprezentatywne wyniki wytworzonych mikrosoczewek (A) i mikro-rusztowań (C) na obrazach SEM. Dwie konstrukcje znajdujące się na przeciwnych stronach tego samego szklanego podłoża są wyraźnie widoczne na środkowym zdjęciu (B). Mikrosoczewki znajdują się na dolnej powierzchni szkła, natomiast mikro-rusztowania na górnej. Po prawej stronie przedstawiono obraz SEM wytworzonej mikrosoczewki o sferycznym kształcie jako przykład stabilnego i gładkiego wyniku procesu wytwarzania (A). Po lewej stronie obraz podkreśla reprezentatywny wynik porowatego mikro-rusztowania 2PP o dowolnej geometrii (C). Paski skali: (A,C) - 50 µm; (B) - 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig06large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat procesu mikrowytwarzania; obejmuje przygotowanie, mikrowytwarzanie 2PP, naświetlanie UV, wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Schematyczny przebieg protokołu i zastosowanie urządzenia: Na rycinie przedstawiono cały proces wytwarzania rozpisany krok po kroku. Rozpoczyna się on od przygotowania próbki poprzez sekwencyjne nanoszenie kropli fotorezystu na obie powierzchnie szklanego podłoża (1). Gdy fotorezyst osiągnie stan sol-żel, próbka jest gotowa do przetworzenia metodą dwufotonowej polimeryzacji laserowej (2). W związku z tym obie krople fotorezystu są naświetlane sekwencyjnie, najpierw w celu utworzenia mikrostruktur, a następnie mikrosoczewek. Następnie dwustronnie przetworzone podłoże poddawane jest procedurze wywoływania w celu usunięcia całego niepolimeryzowanego rezystu otaczającego konstrukcje (3). W tym celu próbkę moczy się w roztworze alkoholowym, a następnie delikatnie suszy. Następuje naświetlanie UV próbki poprzez szklane podłoże w celu całkowitego sieciowania niepolimeryzowanego rdzenia wewnętrznego mikrosoczewek (4). Na koniec przeprowadzana jest kontrola jakości przetworzonej próbki za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) w celu morfologicznej charakterystyki mikrostruktur (5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat układu obrazowania optycznego z próbką, obiektywami obrazującymi; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67975/67975fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Potencjalne zastosowanie mikrostrukturalnego okna obrazującego.Po lewej stronie reprezentacyjny schemat przedstawia układ optyczny składający się z urządzenia sprzężonego z zewnętrznym obiektywem mikroskopu w standardowym systemie skanującym (A). Jest to tak zwana konfiguracja wirtualna, wykorzystana w tym przypadku do obrazowania wzrostu żywych komórek wewnątrz mikro-rusztowania. Fibroblasty fluorescencyjne (oznaczone czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP)) zasiano na szklanej powierzchni urządzenia, która posiada mikrostruktury 3D. Konfokalne obrazy fluorescencyjne komórek wykonano w płaszczyźnie ogniskowej szklanej lamellki (B, zielony hashtag), zatem przy użyciu wyłącznie obiektywu zewnętrznego, oraz przez pojedynczą mikrosoczewkę w jej płaszczyźnie ogniskowej (A, fioletowy hashtag). Jądra komórkowe są widoczne na niebiesko (barwienie Hoechst), a cytoszkielet na czerwono (RFP). Paski skali: (B) - 100 µm; (C) - 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67975/67975fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje wytwarzanie wszczepialnego, zintegrowanego okna obrazowania za pomocą laserowego druku 3D. Okno składa się z systemu mikrosoczewek sprzężonych z mikrorusztowaniami. Metoda polega na polimeryzacji dwufotonowej (2PP) biokompatybilnego fotorezystu SZ2080 w ciągłej sekwencji, optymalizując wydajność produkcji i wyrównanie między różnymi komponentami.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

In the context of biomaterials and drug testing in animal models, this study presents a streamlined protocol for fabricating a novel implantable ...

Umożliwimy badanie procesów biologicznych u żywych zwierząt poprzez wizualizację w czasie rzeczywistym, wszczepiając zminiaturyzowany chip, wyprodukowany przez druk laserowy 3D z biokompatybilnego materiału.Głównym wyzwaniem jest dopracowanie parametrów produkcyjnych, takich jak moc i szybkość, biorąc pod uwagę różne warunki pisania, tymczasem mikrostruktura na obu powierzchniach tego samego podzbioru z precyzją i spójnością. Dokładnym rezultatem jest opracowanie wszechstronnego protokołu wytwarzania innowacyjnego, wszczepialnego, optycznego narzędzia do obrazowania, bezpośrednio sprzęgającego duże mikrosoczewki z obszarem docelowym mikrostruktury 3D do różnych zastosowań biologicznych.Teraz, gdy protokół produkcyjny został zoptymalizowany, pracujemy nad implantacją i demonstracją możliwości obrazowania chipa. Na przykład do badania miomateriałów in vivo.[Instruktor AI] Aby rozpocząć, włącz źródło lasera femtosekundowego w bliskiej podczerwieni. Ustaw ścieżkę optyczną wiązki laserowej, aż dotrze do obiektywu mikroskopu, przez szereg układów optycznych i luster zamontowanych na kinematycznych mocowaniach zwierciadła. Iteracyjnie obracaj lustra, aby wyśrodkować wiązkę w wyrównaniu w bliskiej podczerwieni. Otworki kierują wiązkę laserową prostopadle do uchwytu próbki, wyrównując ją za pomocą centrowania odbicia wstecznego. Aby zamontować próbkę na uchwycie próbki, użyj taśmy, aby przymocować podwójnie upuszczoną szklaną szkiełko nakrywkowe do uchwytu próbki, tak aby druga osadzona kropla była skierowana w dół. Następnie zamontuj uchwyt próbki na stolikach translacyjnych, ręcznie zamontuj uchwyt próbki, a następnie zamontuj obiektyw mikroskopu o dużej odległości roboczej na dedykowanym wsporniku na końcu ścieżki optycznej, blisko próbki i wyśrodkuj próbkę z obiektywem. Ustaw moc lasera na minimalną wartość, około pięciu miliwatów, wystarczającą do wizualizacji odbicia wiązki w oprogramowaniu kamery CCD. Skoncentruj wiązkę lasera na górnej powierzchni pierwszej kropli oporu. Postępuj zgodnie z zakrzywionym profilem kropli, aby zlokalizować krawędzie próbki wzdłuż kierunków x i y. Ustaw środek kropli jako odniesienie do zera bezwzględnego za pomocą oprogramowania. Skoncentruj wiązkę lasera na granicy faz między górną powierzchnią szkiełka nakrywkowego a podstawą pierwszej kropli fotorezystu w środku próbki. Ustaw to jako odniesienie zerowe na osi z. Przesuń do pozycji krawędzi w ujemnym kierunku osi x na około 3,5 milimetra, aby uzyskać 12-milimetrowy szkiełko nakrywkowe i skup się na tym samym interfejsie. Ustaw to jako odniesienie do zera bezwzględnego wzdłuż kierunku z. Powtórz to samo dla dodatniego kierunku osi x przez około 3,5 milimetra i skup się na tym samym interfejsie. Następnie przechyl próbkę, aby skorygować odchylenia w kierunku z między ujemną i dodatnią osią x. Wykonaj tę samą procedurę, jak pokazano wcześniej, wzdłuż osi x dla osi y. Po wyważeniu na obu osiach x i y wróć do pozycji środkowej i skup się na granicy faz między szkłem a rezystancją. Ustaw nową wartość z fokusu jako odniesienie zerowe na osi z. Włącz system oświetlenia czerwoną diodą LED, aby monitorować proces polimeryzacji w czasie rzeczywistym. Przy wyłączonym laserze przesuń obiektyw w kierunku z poniżej szkiełka nakrywkowego, aby zlokalizować drugi interfejs między dolną powierzchnią szkła a podstawą dolnego spadku oporu. Zwiększ moc lasera do 100 miliwatów, aby zainicjować polimeryzację dwufotonową. Dostosuj położenie ogniskowej, zwiększając z, aż do polimeryzacji prostej struktury odniesienia. Ustaw tę początkową pozycję ogniskowej jako odniesienie zerowe wzdłuż osi z. Ustaw moc polimeryzacji między 100 a 200 miliwatów i uruchom kod maszynowy jako komputerowy program sterujący numerycznie dla etapów translacji, aby wytworzyć pożądaną trójwymiarową strukturę. Następnie przesuń się wzdłuż osi z, aby powrócić do pierwszego interfejsu między górną powierzchnią szkła a górnym spadkiem fotorezystu. Polimeryzuj prostą strukturę referencyjną, aby zlokalizować interfejs. Ustaw pierwszą linię polimeryzacji jako odniesienie zerowe wzdłuż osi z. Dostosuj moc polimeryzacji w zakresie od 15 do 20 miliwatów i uruchom program kierujący ruchami etapu translacyjnego. Przy wyłączonym laserze wyłącz osie translacyjne x, y i z i wyjmij uchwyt próbki z zestawu do produkcji eksperymentalnej. Usuń taśmę klejącą i odłącz próbkę od uchwytu. Po wywołaniu próbki umieść szklane szkiełko nakrywkowe na uchwycie próbki zawieszonym na płaszczyźnie uziemienia, układając próbkę z mikrosoczewkami skierowanymi w dół. Umieścić próbkę pod źródłem promieniowania UV zorientowaną prostopadle do powierzchni szkiełka nakrywkowego. Wystaw próbkę na działanie promieniowania UV. Ustaw na 300 miliwatów na 120 sekund. Przechylić źródło promieniowania UV pod kątem plus i minus 45 stopni w stosunku do normalnego położenia płaszczyzny próbki i powtórzyć procedurę naświetlania. Umieść szklaną próbkę na uchwycie pod kątem 45 stopni w stosunku do orientacji kamery SEM. Powtórz proces akwizycji dla obu powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby zebrać trójwymiarowe obrazy SEM mikrorusztowań i mikrosoczewek. Przedstawiona procedura pozwala na polimeryzację mikrostruktur 3D obu powierzchni tego samego urządzenia, zapewniając doskonałą rozdzielczość i stabilność. Obrazowanie in vitro wykazało udany wzrost komórek wewnątrz mikrorusztowania, obrazowany przez mikrosoczewki, co stanowi przykład końcowego zastosowania proponowanego urządzenia.

microfabrication-implantable-optics-integrated-microstructured

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W wielu sytuacjach biologicznych i klinicznych korzystne jest badanie procesów komórkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. W niniejszym materiale opisujemy montaż i zastosowanie niedrogiego mikroskopu światłowodowego, który umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym w hodowlach komórkowych, badaniach na zwierzętach oraz w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów.

Wysokorozdzielcza mikroendoskopia światłowodowa do obrazowania komórkowego in situ

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

Opisano protokół wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z przezroczystymi otworami do obrazowania światłem widzialnym i podczerwonym.

Miękka procedura litograficzna do wytwarzania plastikowych urządzeń mikroprzepływowych z otworami widokowymi przezroczystymi dla światła widzialnego i podczerwonego

Ten protokół opisuje strategię produkcji opartą na rozwiązaniach dla wysokowydajnych, elastycznych, przezroczystych elektrod z w pełni wbudowaną, grubą metalową siatką. Elastyczne przezroczyste elektrody wytwarzane w tym procesie wykazują jedne z najwyższych zgłoszonych parametrów, w tym bardzo niską rezystancję arkusza, wysoką przepuszczalność optyczną, stabilność mechaniczną przy zginaniu, silną przyczepność podłoża, gładkość powierzchni i stabilność środowiskową.

Skalowalna strategia produkcji oparta na roztworze dla wysokowydajnych, elastycznych i przezroczystych elektrod z wbudowaną metalową siatką

Mikroiniekcja zarodków i larw danio pręgowanego jest kluczową, ale wymagającą techniką stosowaną w wielu modelach danio pręgowanego. W tym miejscu przedstawiamy szereg narzędzi w mikroskali, które pomagają w stabilizacji i orientacji danio pręgowanego zarówno do mikroiniekcji, jak i obrazowania.

Urządzenia mikrostrukturalne do zoptymalizowanej mikroiniekcji i obrazowania larw danio pręgowanego

Ten protokół opisuje wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych z MY133-V2000 w celu wyeliminowania artefaktów, które często powstają w mikrokanałach z powodu niezgodności współczynników załamania światła między strukturami mikrokanalików a roztworem wodnym. Protokół ten wykorzystuje akrylowy uchwyt do ściskania zamkniętego urządzenia, poprawiając przyczepność zarówno chemicznie, jak i mechanicznie.

Produkcja urządzeń o dopasowanym współczynniku załamania światła dla mikrofluidyki biomedycznej

Tutaj prezentujemy metodę dostarczania wektorów ekspresji wirusa do mózgu za pomocą jedwabnych folii fibroinowych. Ta metoda pozwala na ukierunkowane dostarczanie wektorów ekspresyjnych za pomocą światłowodów pokrytych jedwabiem/AAV, światłowodów stożkowych i okien czaszkowych.

In vivo (in vivo) Ukierunkowana ekspresja białek optogenetycznych za pomocą folii jedwabiu/AAV

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Nowo opracowany mikro-wzorzysty chip z okienkami z tlenku grafenu jest wytwarzany przy użyciu technik systemów mikroelektromechanicznych, umożliwiając wydajne i wysokoprzepustowe obrazowanie kriogenicznej mikroskopii elektronowej różnych biomolekuł i nanomateriałów.

Wytwarzanie mikrowzorzystego chipa o kontrolowanej grubości do wysokoprzepustowej kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Poznaj protokół mikrofabrykacji wszczepialnego okna obrazowania z mikro soczewkami przy użyciu druku 3D laserem. Ta metoda umożliwia badaczom zaawansowane obrazowanie procesów biologicznych in vivo z wysoką rozdzielczością.

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Mikrofabrykacja wszczepialnej optyki zintegrowanej z mikrostrukturalnym oknem obrazowania w celu zaawansowanego obrazowania in vivo

Przeglądaj więcej filmów