Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Ogólnym celem tej techniki jest szybkie badanie przesiewowe autoprzeciwciał w sposób multipleksowy. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych pytań w dziedzinie autoimmunizacji, takich jak to, które autoprzeciwciała są skorelowane z różnymi stanami chorobowymi. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że autoprzeciwciała można badać przesiewowo w sposób równoległy, potrzebne są tylko mikrolitry surowicy i potrzebne są tylko mikrogramy antygenu.

Aby wygenerować mikromacierze antygenów, zacznij od rozcieńczenia antygenów w PBS do końcowego stężenia 2 miligramów na mililitr. Skonfiguruj konfigurację mikromacierzy z dziewięcioma pinami, aby wydrukować do 162 unikalnych antygenów w dwóch egzemplarzach. Uwzględnij antygeny IgG i IgM w bibliotece antygenów jako kontrole pozytywne.

Włączyć PBS tylko jako kontrolę ujemną. Dodaj 20 mikrolitrów każdego antygenu do 384-dołkowej płytki źródłowej w grupach, które odzwierciedlają konfigurację głowicy drukującej. Użyj folii do przykrycia płyty źródłowej i zamroź płytę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowa do drukowania tablic.

Oczyść stałe szpilki mikromacierzy, inkubując je w kąpieli sonizacyjnej z wodą dejonizowaną trzy razy przez jedną minutę każdy. Umieść szpilki w stojaku do wyschnięcia. Następnie ułóż piny w głowicy drukującej mikromacierzy.

W przypadku dziewięciu pinów użyj konfiguracji trzy na trzy. Następnie zaprogramuj mikromacierz dla przebiegu drukowania, ustawiając liczbę pinów na głowicy drukującej, liczbę slajdów do wydrukowania, liczbę pól lutowniczych na każdym slajdzie oraz liczbę miejsc replikacji dla każdego antygenu. Ponadto należy zaprogramować mikromacierz tak, aby sonikowała szpilki w wodzie między różnymi grupami antygenów.

Następnie, po rozmrożeniu płytki źródłowej, odwiruj ją przez jedną minutę z prędkością 100 razy G. Umieść płytkę źródłową w wyznaczonym miejscu w mikroukładzie, a następnie usuń odcinek folii zakrywający pierwszą grupę antygenów do wydrukowania. Ułóż niezadrukowane slajdy na powierzchni tablicy i uruchom program drukowania. Drukuj preparaty w temperaturze pokojowej przy wilgotności ustawionej na matrycy na poziomie od 55 do 60%Po wydrukowaniu każdej grupy antygenów na wszystkich szkiełkach wstrzymaj mikromacierz.

Przykryj antygeny, które właśnie zostały wydrukowane, folią, aby zapobiec parowaniu, i odkryj następną grupę antygenów do wydrukowania. Następnie kontynuuj program drukowania. Po wydrukowaniu wszystkich antygenów przykryj płytkę źródłową nowym kawałkiem folii i zamroź ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Umieść wydrukowane szkiełka w pudełku na slajdy i zamknij je próżniowo. Slajdy mogą być używane następnego dnia lub do miesiąca później. Aby sondować mikromacierze z rozcieńczonymi surowicami za pomocą komór inkubacyjnych, umieść szkiełka w ramkach.

Następnie dodaj 700 mikrolitrów buforu blokującego do każdej powierzchni tablicy. Umieść folię samoprzylepną na ramie i przenieś ją do szczelnego pojemnika z kawałkiem mokrej chusteczki. Następnie inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza na bujaku przez noc.

Następnego dnia rozcieńczyć próbki surowicy w proporcji od 1 do 100 w buforze blokującym. Następnie odessać roztwór blokujący z matryc i dodać 500 mikrolitrów rozcieńczonej próbki do każdej powierzchni matrycy. Następnie przykryj matryce folią samoprzylepną i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, kołysząc przez godzinę.

Następnie odessać próbki surowicy z matryc i użyć buforu do płukania, aby przepłukać powierzchnie matrycy czterokrotnie, wylewając bufor na szkiełka i szybko go strzepując. Użyj 700 mikrolitrów buforu blokującego do umycia każdej powierzchni macierzy i inkubuj 10 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Następnie dodaj 500 mikrolitrów rozcieńczonego przeciwciała wtórnego do każdej powierzchni szkiełka i użyj folii samoprzylepnej, aby ją przykryć.

Inkubuj szkiełka w temperaturze czterech stopni Celsjusza, kołysząc przez 45 minut. Po inkubacji odessać wtórną mieszaninę przeciwciał ze szkiełek i spłukać czterokrotnie, jak właśnie pokazano. Następnie przemyć szkiełka 700 mikrolitrami buforu blokującego rozcieńczającego, trzy razy po 10 minut każde.

Wyjmij slajdy z ramek, a następnie umieść je w metalowym stojaku na slajdy i zanurz je w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem orbitalnym przez 20 minut. Umieść ruszt do szkiełków w pojemniku z wodą dejonizowaną na 15 sekund.

Następnie umieść stojak w nowym pojemniku z wodą i inkubuj przez kolejne 15 sekund. Aby wysuszyć szkiełka, umieść stojak na szkiełka na adapterze płytki ELISA w wirówce i wiruj w temperaturze 220 razy G i temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść szkiełka w lekkim, szczelnym pudełku, aż będą gotowe do skanowania.

Aby zeskanować szkiełka, użyj skanera mikromatrycowego, który może wykryć sygnały fluorescencyjne SI trzy i SI pięć. Określ optymalną probówkę mnożnika lub ustawienia PMT, wstępnie skanując pełny slajd biblioteki antygenów, który był badany tylko za pomocą przeciwciał drugorzędowych. Ustaw wartości PMT używane przez naciśnięcie przycisku sprzętowego tak, aby ludzkie cechy IgG na trzech kanałach SI, a ludzkie cechy IGM na pięciu kanałach SI miały podobną medianę intensywności fluorescencji minus tło lub MFIB, która zwykle wynosi 40 000.

Następnie zeskanuj eksperymentalne slajdy na dwóch kanałach, naciskając przycisk skanowania. Zapisz obrazy slajdów w obu kanałach po każdym skanowaniu. Za pomocą przycisku pliku załaduj szkiełko, które ma być analizowane, do oprogramowania mikromacierzy.

Następnie użyj przycisku pliku, aby załadować listę tablic genowych lub plik GAL, który zawiera układ tablicy, z tożsamościami cech tablicy. Umieść szablon tablicy na zeskanowanym obrazie, tak aby cechy tablic były jak najbardziej zgodne z szablonem. Naciśnij przycisk wyrównania, aby wyrównać elementy we wszystkich blokach z szablonem.

Oprogramowanie następnie oblicza MFI minus tło dla każdego z antygenów. Na koniec użyj przycisku pliku, aby wyeksportować wyniki jako plik tekstowy i przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Na tym rysunku, pokazującym szkiełka kontroli dodatniej i ujemnej, szkiełko ujemne jest badane tylko za pomocą przeciwciał wtórnych, a szkiełko kontroli dodatniej jest badane surowicą od pacjenta z toczniem rumieniowatym układowym.

Jak wskazano tutaj, wykazano, że pozytywna surowica kontrolna, o znanej reaktywności na ryboP, ma przeciwciała IgM przeciwko jednoniciowemu DNA i przeciwciała IgG przeciwko ryboP. Odpowiedzi liniowe obserwowano z IgM we wszystkich rozcieńczeniach surowicy oraz z IgG do MFI minus tło około 30 000. W tym eksperymencie matryca jest badana ludzką surowicą od pacjenta z krioglobulinicznym zapaleniem naczyń, z udokumentowanym czynnikiem reumatoidalnym, który jest przeciwciałem IgM przeciwko IgG.

Cecha IgG jest żółto-zielona ze względu na wiązanie IgM w surowicy pacjenta z unieruchomioną IgG na matrycy. Stosując same przeciwciała drugorzędowe, nie obserwuje się reaktywności IgM wobec IgG, która jest zauważona na matrycy. Pokazane tutaj, mysie IgM i IgG zauważone na matrycy, są wykrywane tylko z anty-mysimi przeciwciałami drugorzędowymi odpowiednio przeciwko IgM i IgG.

Na tym rysunku przedstawiono wyrównanie siatki szablonu na zeskanowanym obrazie macierzy przy użyciu oprogramowania do analizy mikromacierzy. Po wyrównaniu cechy tablicy można przeanalizować w celu uzyskania mediany intensywności fluorescencji minus tło dla każdej cechy. Po opanowaniu, sondowanie mikromacierzy antygenowych można wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak ELISA, w celu walidacji wyników uzyskanych z mikromacierzy antygenowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak drukować mikromacierze antygenów, jak sondować mikromacierze antygenów za pomocą surowicy i jak skanować mikromacierze antygenowe za pomocą skanera. Nie zapominaj, że praca z ludzką surowicą może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy podjąć uniwersalne środki ostrożności.