Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Ogólnym celem tej techniki jest szybka analiza przesiewowa autoprzeciwciał w sposób multipleksowy. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych zagadnień w dziedzinie autoimmunologii, takich jak określenie, które autoprzeciwciała korelują z różnymi stanami chorobowymi. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość równoległego przesiewania autoprzeciwciał, potrzeba użycia jedynie mikrolitrów surowicy oraz zapotrzebowanie na zaledwie mikrogramy antygenu.

Aby przygotować mikrotablice antygenowe, należy rozpocząć od rozcieńczenia antygenów w PBS do stężenia końcowego 2 mg/mL. Skonfigurować mikroaplikator z dziewięcioma pinami, aby nanieść do 162 unikalnych antygenów w duplikacie. W bibliotece antygenów należy uwzględnić antygeny IgG oraz IgM jako kontrole pozytywne.

W качестве kontroli negatywnej należy zastosować wyłącznie PBS. Do płyty źródłowej z 384 dołkami należy dodać 20 µL każdego antygenu w grupach odpowiadających konfiguracji głowicy drukującej. Płytę źródłową należy przykryć folią i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia drukowania macierzy.

Oczyść piny macierzy mikroarray, inkubując je trzykrotnie przez jedną minutę w kąpieli ultradźwiękowej z wodą dejonizowaną. Umieść piny w statywie do wysuszenia. Następnie zamontuj piny w głowicy drukującej macierzy mikroarray.

W przypadku dziewięciu pinów zastosuj konfigurację trzy na trzy. Następnie zaprogramuj urządzenie do tworzenia mikromacierzy dla cyklu drukowania, ustawiając liczbę pinów w głowicy drukującej, liczbę slajdów do wydrukowania, liczbę pól na każdym slajdzie oraz liczbę powtórzeń dla każdego antygenu. Dodatkowo zaprogramuj urządzenie do sonikacji pinów w wodzie pomiędzy różnymi grupami antygenów.

Następnie, po rozmrożeniu płytki źródłowej, odwiruj ją przez jedną minutę przy 100 ×g. Umieść płytkę źródłową w wyznaczonym miejscu w mikroarrayerze, a następnie usuń fragment folii pokrywający pierwszą grupę antygenów do naniesienia. Ułóż niezadrukowane szkiełka na powierzchni arrayera i uruchom program drukowania. Drukuj szkiełka w temperaturze pokojowej, przy wilgotności ustawionej w arrayerze na poziomie od 55 do 60%. Po naniesieniu każdej grupy antygenów na wszystkie szkiełka wstrzymaj pracę mikroarrayera.

Przykryj właśnie naniesione antygeny folią, aby zapobiec ich odparowaniu, a następnie odsłoń kolejną grupę antygenów do naniesienia. Kontynuuj program nanoszenia. Po naniesieniu wszystkich antygenów przykryj płytkę źródłową nowym kawałkiem folii i zamroź ją w temperaturze minus 80 °C.

Umieść wydrukowane preparaty w kasecie na szkiełka i zapakuj je próżniowo. Preparaty można wykorzystać następnego dnia lub w ciągu miesiąca. W celu przeprowadzenia analizy mikromacierzy z użyciem rozcieńczonych surowic w komorach inkubacyjnych, umieść szkiełka w ramkach.

Następnie dodaj 700 µL buforu blokującego na powierzchnię każdego matrycy. Nałóż folię samoprzylepną na ramkę i przenieś ją do szczelnego pojemnika z kawałkiem zwilżonej chusteczki. Następnie inkubuj preparaty w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez noc.

Następnego dnia rozcieńcz próbki surowicy w stosunku 1:100 w buforze blokującym. Następnie odessij roztwór blokujący z macierzy i dodaj 500 µl rozcieńczonej próbki na powierzchnię każdej macierzy. Następnie przykryj macierze folią przylepną i inkubuj w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę w wytrząsarce.

Następnie odessać próbki surowicy z matryc i wypłukać powierzchnie matryc cztery razy buforem płuczącym, wlewając bufor na szkiełka i szybko go strzepując. Użyć 700 µL buforu blokującego do przemycia każdej powierzchni matrycyy, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy stałym kołysaniu. Następnie dodać 500 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na powierzchnię każdego szkiełka i przykryć ją folią przylepną.

Inkubować preparaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym kołysaniu przez 45 minut. Po inkubacji odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych z preparatów i wypłukać je czterokrotnie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie przemyć preparaty 700 mikrolitrami buforu blokującego, trzykrotnie przez 10 minut za każdym razem.

Wyjmij preparaty z ramek, następnie umieść je w metalowym statywie do szkiełek i zanurz w PBS. Inkubuj w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu orbitalnym przez 20 minut. Umieść statyw ze szkiełkami w pojemniku z wodąy dejonizowaną na 15 sekund.

Następnie umieść statyw w nowym pojemniku z wodą i inkubuj przez kolejne 15 sekund. Aby osuszyć preparaty, umieść statyw z nasuwnikami na adapterze do płytek ELISA w wirówce i wiruj przy 220 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przechowuj preparaty w szczelnym przed światłem pudełku do momentu rozpoczęcia skanowania.

Do skanowania preparatów należy użyć skanera mikromacierzy zdolnego do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych SI three i SI five. Optymalne ustawienia mnożnika, czyli PMT, należy wyznaczyć poprzez wstępne skanowanie preparatu z pełną biblioteką antygenów, który został poddany inkubacji wyłącznie z przeciwciałami wtórnymi. Wartości PMT ustawia się za pomocą przycisku sprzętowego w taki sposób, aby cechy ludzkiego IgG w kanale SI three oraz cechy ludzkiego IGM w kanale SI five miały podobną medianę intensywności fluorescencji pomniejszoną o tło, czyli MFIB, która zazwyczaj wynosi 40 000.

Następnie, zeskanuj preparaty eksperymentalne w dwóch kanałach, naciskając przycisk skanowania. Po każdym skanowaniu zapisz obrazy preparatów w obu kanałach. Używając przycisku pliku, wczytaj preparat do analizy do oprogramowania do mikromacierzy.

Następnie należy użyć przycisku pliku, aby wczytać listę macierzy genów, czyli plik GAL, który zawiera układ macierzy wraz z identyfikatorami jej elementów. Nałożone należy dopasować szablon macierzy do zeskanowanego obrazu w taki sposób, aby elementy macierzy jak najdokładniej odpowiadały szablonowi. Należy nacisnąć przycisk wyrównania, aby dopasować elementy we wszystkich blokach do szablonu.

Oprogramowanie obliczy następnie MFI pomniejszone o tło dla każdego z antygenów. Na koniec należy użyć przycisku eksportu pliku, aby zapisać wyniki w formacie tekstowym, a następnie przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Na tej rycinie, przedstawiającej preparaty kontrolne pozytywne i negatywne, preparat negatywny został poddany inkubacji jedynie z przeciwciałami wtórnymi, natomiast preparat kontrolny pozytywny z surowicą pobraną od pacjenta z toczniem układowym.

Jak wskazano tutaj, surowica kontroli pozytywnej o znanej reaktywności względem riboP wykazuje obecność przeciwciał IgM przeciwko jednoniciowemu DNA oraz przeciwciał IgG przeciwko riboP. Odpowiedzi liniowe zaobserwowano dla IgM przy wszystkich rozcieńczeniach surowicy, a dla IgG do poziomu MFI pomniejszonego o tło wynoszącego około 30 000. W tym doświadczeniu macierz jest badana z użyciem ludzkiej surowicy pobranej od pacjenta z zapaleniem naczyń w przebiegu krioglobulinemii, z udokumentowanym czynnikiem reumatoidalnym, który jest przeciwciałem IgM przeciwko IgG.

Prążek IgG ma kolor żółto-zielony z powodu wiązania się IgM z surowicy pacjenta z unieruchomionym IgG na matrycy. Przy zastosowaniu wyłącznie przeciwciał wtórnych nie obserwuje się reaktywności IgM przeciwko IgG naniesionemu na matrycę. Przedstawione tutaj IgM i IgG mysie, naniesione na matrycę, są wykrywane odpowiednio tylko za pomocą przeciwciał wtórnych anty-mysich przeciwko IgM i IgG.

Rysunek ten przedstawia dopasowanie siatki szablonu do zeskanowanego obrazu macierzy przy użyciu oprogramowania do analizy mikromacierzy. Po dopasowaniu cechy macierzy mogą zostać przeanalizowane w celu uzyskania medianowej intensywności fluorescencji pomniejszonej o tło dla każdej cechy. Po opanowaniu techniki, badanie mikromacierzy antygenowych może zostać przeprowadzone w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak ELISA, w celu walidacji wyników uzyskanych z mikromacierzy antygenowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak nanosić mikromacierze antygenowe, jak przeprowadzać inkubację mikromacierzy antygenowych z surowicą oraz jak skanować mikromacierze antygenowe za pomocą skanera. Należy pamiętać, że praca z ludzką surowicą może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności.