Name: Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Naucz się generować dwukolorowe mikromacierze antygenowe do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM z próbek ludzkich i mysich. Ta metoda umożliwia szybki, wysokoprzepustowy przesiew autoprzeciwciał.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.C. był wspierany przez stypendium podoktorskie z Heart and Stroke Foundation of Canada oraz Program Szkoleniowy w Medycynie Regeneracyjnej (Canadian Institutes of Health Research). F.Y.Y.H. był wspierany przez Program Szkoleniowy w Medycynie Regeneracyjnej. Praca ta została sfinansowana z grantu Astellas Pharma Canada. Chcielibyśmy również podziękować dr Markowi Menenghini (University of Toronto) za korzystanie z jego skanera Axon Microarray Scanner.

1. Rozcieńczanie antygenów i generowanie mikromacierzy antygenów
<ol>
	<li>Rozcieńczyć antygeny w PBS do końcowego stężenia 0,2 mg/ml. Wydrukuj do 162 unikalnych antygenów w dwóch egzemplarzach za pomocą konfiguracji mikromacierzy z 9 pinami. Uwzględnij antygeny IgG i IgM w bibliotece antygenów jako kontrole pozytywne. Włączyć PBS tylko jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Dodać 20 μl każdego antygenu do płytki źródłowej 384 dołków. Dodaj antygeny do płyty źródłowej w grupach, które odzwierciedlają konfigurację głowicy drukującej (np. ułóż antygeny w grupach po 9, gdy do drukowania używanych jest 9 pinów).</li>
	<li>Przykryj płytę źródłową folią i zamroź w temperaturze -80 °C do momentu, aż będą gotowe do drukowania matryc.</li>
	<li>Oczyść stałe piny mikromacierzy, inkubując je w kąpieli sonizacyjnej z wodą dejonizowaną przez 3 x 1 min. Umieść piny w stojaku do wyschnięcia, a następnie ułóż piny w głowicy drukującej z mikromatrycą. W przypadku 9 pinów użyj konfiguracji 3 x 3.</li>
	<li>Zaprogramuj mikromacierz do drukowania, ustawiając liczbę pinów na głowicy drukującej, liczbę slajdów do wydrukowania, liczbę pól lutowniczych na każdym slajdzie i liczbę miejsc replik dla każdego antygenu. Zazwyczaj używa się 9 szpilek, 70 szkiełek, 2 padów/szkiełko i 2 miejsca replikacji dla każdego antygenu. Zaprogramuj mikromacierz do sonizacji pinów w wodzie między różnymi grupami antygenów.</li>
	<li>Rozmrozić płytkę źródłową, a następnie odwirować płytkę przez 1 minutę przy 100 x g. Umieścić płytkę źródłową w wyznaczonym miejscu w mikroukładzie. Usuń fragment folii, który zakrywa pierwszą grupę antygenów do wydrukowania.</li>
	<li>Ułóż niezadrukowane slajdy na powierzchni tablicy i uruchom program drukowania. Drukuj slajdy w temperaturze RT z wilgotnością ustawioną na matrycy na 55 - 60% za pomocą wbudowanego nawilżacza urządzenia matrycowego.</li>
	<li>Po wydrukowaniu każdej grupy antygenów na wszystkich szkiełkach zatrzymaj mikromacierz. Przykryj antygeny, które właśnie zostały wydrukowane, folią (aby zapobiec parowaniu) i odkryj następną grupę antygenów do wydrukowania. Kontynuuj program drukowania.</li>
	<li>Po wydrukowaniu wszystkich antygenów przykryj płytkę źródłową nowym kawałkiem folii i zamroź w temperaturze -80 °C. Umieść wydrukowane preparaty w pudełku na szkiełka i zamknij próżniowo. Ze slajdów można korzystać następnego dnia lub do miesiąca później.</li>
</ol>
2. Sondowanie mikromacierzy antygenowych z rozcieńczonymi surowicami
<ol>
	<li>Umieść szkiełka w ramkach za pomocą komór inkubacyjnych. Dodać 700 μl buforu blokującego (2,5% [vol/vol] surowicy cielęcej płodu (FCS), 0,1% [vol/vol] Tween 20 w PBS) do każdej powierzchni matrycy.</li>
	<li>Umieść folię samoprzylepną na ramie i umieść w szczelnie zamkniętym pojemniku z kawałkiem mokrej chusteczki. Inkubować O/N w temperaturze 4 °C na bujaku.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbki surowicy w stosunku 1:100 w buforze blokującym. Odessać roztwór blokujący z matryc i dodać 500 μl rozcieńczonej próbki do każdej powierzchni matrycy.</li>
	<li>Przykryj folią samoprzylepną i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4°C z kołysaniem.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w buforze blokującym. W przypadku badań na ludziach rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG znakowane Cy3 do 0,33 μg/ml i kozie przeciwciało anty-ludzkie IgM znakowane Cy5 do 0,25 μg/ml. W przypadku badań na myszach należy rozcieńczyć kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Cy3 do 0,38 μg/ml i kozie przeciwciało anty-mysie IgM znakowane Cy5 do 0,7 μg/ml.</li>
	<li>Odessać próbki z matryc i przepłukać powierzchnie matrycy 4 razy za pomocą buforu płuczącego (0,1% Tween 20 w PBS). Wlej bufor na szkiełka i szybko strzepnij.</li>
	<li>Dodać 700 μl buforu blokującego, aby przemyć każdą powierzchnię matrycy i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem. Powtórz krok prania jeszcze dwa razy.</li>
	<li>Dodać 500 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego do każdej powierzchni szkiełka i przykryć folią klejącą. Inkubować 45 minut w temperaturze 4°C z kołysaniem.</li>
	<li>Odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych ze szkiełek i spłukać 4 razy, jak powyżej. Przemyć szkiełka 3 razy 700 μl buforu blokującego/rozcieńczającego, jak wyżej.</li>
	<li>Wyjmij slajdy z ram i umieść w metalowym stojaku na slajdy, który jest zanurzony w PBS. Inkubować 20 minut w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem orbitalnym. Umieścić w nowym pojemniku PBS i inkubować kolejne 20 minut z wytrząsaniem.</li>
	<li>Umieść stojak na szkiełka w pojemniku z wodą dejonizowaną na 15 sekund. Umieść stojak w nowym pojemniku z wodą i inkubuj kolejne 15 sekund.</li>
	<li>Aby wysuszyć szkiełka, umieść stojak na szkiełka na adapterze płytki ELISA w wirówce i wiruj z prędkością 220 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy.</li>
	<li>Umieść szkiełka w szczelnym pudełku, aż będą gotowe do skanowania.</li>
</ol>
3. Skanowanie mikromacierzy antygenowych i eksportowanie danych
<ol>
	<li>Skanuj szkiełka za pomocą skanera z mikromacierzą, który może wykrywać sygnały fluorescencyjne Cy3 i Cy5. Aby dostosować poziomy fotopowielacza (PMT) skanera, należy wstępnie zeskanować szkiełko, które było sondowane tylko za pomocą przeciwciał drugorzędowych. 
	Uwaga: Na tym slajdzie powinna być wydrukowana pełna biblioteka antygenów, w tym kontrole dodatnie (IgG i IgM) oraz ujemne (PBS). Skanowanie wstępne to skanowanie w niskiej rozdzielczości, które pozwala użytkownikowi szybko znaleźć optymalne ustawienia PMT.</li>
	<li>Ustaw wartości PMT tak, aby cechy ludzkiej IgG (na kanale Cy3) i cechy ludzkiej IgM (na kanale Cy5) miały podobną medianę intensywności fluorescencji minus tło (MFI-B) (zwykle 40 000). Poziomy PMT ustawia się poprzez naciśnięcie przycisku "sprzęt". Po ustawieniu utrzymuj te ustawienia PMT na stałym poziomie.</li>
	<li>Zeskanuj eksperymentalne slajdy na dwóch kanałach, naciskając przycisk "skanuj". Zapisz obrazy slajdów (oba kanały) po każdym skanowaniu.</li>
	<li>Załaduj szkiełko do analizy do oprogramowania mikromacierzy za pomocą przycisku "plik".</li>
	<li>Załaduj plik z listą macierzy genów (GAL) za pomocą przycisku "plik". Plik GAL zawiera układ tablicy z tożsamościami funkcji tablicy.</li>
	<li>Umieść szablon tablicy na zeskanowanym obrazie tak, aby cechy tablic były jak najbardziej zgodne z szablonem.</li>
	<li>Wyrównaj elementy we wszystkich blokach z szablonem, naciskając przycisk "wyrównaj". Program zazwyczaj znajdzie kontur okrągłych elementów, ale mogą być konieczne pewne ręczne korekty. Regulacji tych można dokonać, przechodząc do trybu funkcji. Następnie oprogramowanie obliczy MFI-B dla każdego z antygenów.</li>
	<li>Użyj przycisku "plik", aby wyeksportować te wyniki jako plik tekstowy.</li>
</ol>
4. Analiza danych tablicowych z analizą istotności mikrotablic (SAM)
<ol>
	<li>Załaduj poszczególne pliki tekstowe do programu Excel i zidentyfikuj kolumny, które mają MFI-B dla kanałów Cy3 i Cy5.</li>
	<li>Oblicz średnią dla zduplikowanych obiektów.</li>
	<li>W przypadku dowolnej ujemnej MFI-B zastąp liczbę ujemną liczbą 10. Przekształć dane, dzieląc nieprzetworzoną MFI-B przez 100, a następnie obliczając podstawę logarytmu 2.</li>
	<li>Analizowanie danych przekształconych w dziennik za pomocą analizy istotności mikrotablic (SAM) zgodnie z wcześniejszym opisem7.</li>
	<li>W przypadku badania z udziałem dwóch grup (np. zdrowa grupa kontrolna kontra pacjenci), oznacz jedną grupę jako "1", a grupę jako "2". Użyj dwuklasowej, niesparowanej analizy w SAM, aby zidentyfikować reaktywności antygenów, które znacznie różnią się między dwiema grupami (wartość q < 0,05).</li>
	<li>Użyj oprogramowania do tworzenia klastrów i map cieplnych, aby tworzyć obrazy do prezentacji8.</li>
</ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwala na ilościowe określenie autoprzeciwciał przy użyciu techniki mikromacierzy antygenowej. Mikromacierze antygenowe mają kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnym testem ELISA w badaniach przesiewowych na obecność autoprzeciwciał. Przede wszystkim różne antygeny, w tym kwasy nukleinowe, białka, peptydy i lizaty komórkowe, można ułożyć na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą, co pozwala na multipleksowane badania przesiewowe autoprzeciwciał. Ponadto do wygenerowania macierzy potrzebne są tylko m...

Autoprzeciwciała są obecne w wielu stanach chorobowych i często mogą mieć bezpośrednią aktywność patogenną1. Identyfikacja autoprzeciwciał jest ważna w diagnostyce niektórych chorób, dla rokowania w wyniku choroby oraz dla klasyfikacji pacjentów, którzy mogą odnieść korzyści z określonych terapii2. Autoprzeciwciała są zwykle identyfikowane w surowicy pacjenta przy użyciu techniki ELISA; Jednak badania przesiewowe na obecność wielu antygenów za pomocą tej techniki są pracochłonne i pochłaniają dużą ilość próbki pacjenta. Potrzebne są zatem nowe technologie, które umożliwią profilowanie autoprzeciwciał na większą skalę.
Technika mikromacierzy antygenowej to technologia proteomiczna, która pozwala na profilowanie autoprzeciwciał w sposób multipleksowy3. W pierwszym etapie tego procesu biblioteka antygenów jest umieszczana na powierzchni szkiełka za pomocą zrobotyzowanej mikromacierzy. Szkiełka są badane rozcieńczoną surowicą, a następnie dodaje się przeciwciała drugorzędowe znakowane fluorescencyjnie. Reaktywności przeciwciał są wizualizowane poprzez skanowanie szkiełek za pomocą skanera mikromacierzowego i oznaczane ilościowo za pomocą intensywności fluorescencji. Mikromacierze antygenowe mają wiele zalet w porównaniu z techniką ELISA w badaniach przesiewowych pod kątem autoprzeciwciał: 1) wymagają tylko mikrolitrów surowicy do profilowania autoprzeciwciał przeciwko wielu antygenom jednocześnie, 2) używają antygenu oszczędnie, ponieważ na tablicach wykrywane są tylko nanolitry antygenu, 3) mają zwiększoną czułość3 w porównaniu z ELISA i 4) pozwalają na jednoczesne, ale oddzielne wykrywanie więcej niż jednego izotypu przeciwciała. Mikromacierze antygenowe zostały wykorzystane do profilowania autoprzeciwciał w chorobach autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie rozsiane i toczeń rumieniowatyukładowy 4-6. We wszystkich tych trzech chorobach uzyskano nowe informacje na temat patogenezy choroby dzięki profilowaniu autoprzeciwciał na dużą skalę za pomocą macierzy. 
Tutaj opisujemy protokół generowania mikromacierzy antygenowych za pomocą szkiełek pokrytych nitrocelulozą. Za pomocą tej techniki można ułożyć na szkiełkach różne antygeny, w tym białka, peptydy i lizaty komórkowe. Tablice można łatwo dostosować, umieszczając interesujące antygeny na płytce źródłowej, która zawiera bibliotekę antygenów. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać parę przeciwciał drugorzędowych do rozdzielenia reaktywności IgG i IgM na tej samej powierzchni szkiełka. Teraz zoptymalizowaliśmy tę technikę, aby mierzyć autoprzeciwciała zarówno u ludzi, jak i myszy.

<table><tbody><tr><td>Rybosomalny P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td><td>rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>ludzki IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-003</td><td>rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>ludzki IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td><td>rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>mysi IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td><td>rozcieńczony do 0,2 mg/ml w PBS</td></tr><tr><td>mysi IgM</td><td>Biolegend</td><td>401601</td><td>rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w</td></tr><tr><td>dwuniciowym DNA</td> PBS <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td>rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w</td></tr><tr><td>PBS jednoniciowym DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899</td><td>rozcieńczyć do 0,2 mg/ml w</td></tr><tr><td>mikromacierzy</td> PBS <td>Virtek</td><td>VersArray Chipwriter Pro</td><td>wiele typów tablic jest odpowiednich</td></tr><tr><td>solidnych kołków drukarskich</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie do mikromacierzy robotycznej</td><td>Virtek</td><td>Chipwriter Pro&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice FAST (2 Pad)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>ramka FAST Komory</td> inkubacyjne <td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>FAST (2 Pad)</td><td>Płytki GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384 dołki Zgrzewarki</td> do płytek <td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywy</td><td></td><td></td> płyt foliowych VWR 60941-062 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 koza anty-ludzka IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td><td>użyj materiału roboczego w 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 koza anty-ludzka IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td><td>użyj materiału roboczego w 50% kozy glyercol</td></tr><tr><td>Cy3 anty-mysie IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-165-071</td><td>użyj zapasu roboczego w 50% glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 koza anty-mysia IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>użyj zapasu roboczego w 50% glyercol</td></tr><tr><td>Skaner mikromacierzy</td><td>Urządzenia molekularne</td> Oprogramowanie Microarray <td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do klastrowania</td><td>eisenlab.org</td>Oprogramowanie do tworzenia map cieplnych <td>Cluster 3.0</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne do mikromacierzy</td><td>Uniwersytet Stanforda</td><td>SAM 4.0 (analiza istotności mikromacierzy)</td><td></td></tr></tbody></table>

generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał igg i igm

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoprzeciwciała, które są przeciwciałami przeciwko własnym antygenom, są obecne w wielu stanach chorobowych i mogą służyć jako markery aktywności choroby. Poziomy autoprzeciwciał przeciwko określonym antygenom są zwykle wykrywane za pomocą techniki testu immunoenzymatycznego (ELISA). Jednak badania przesiewowe w kierunku wielu autoprzeciwciał za pomocą testu ELISA mogą być czasochłonne i wymagają dużej ilości próbki pacjenta. Technika mikromacierzy antygenowej jest alternatywną metodą, którą można wykorzystać do badań przesiewowych w kierunku autoprzeciwciał w sposób multipleksowy. W tej technice antygeny są umieszczane na specjalnie powlekanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą zrobotyzowanej mikromacierzy. Szkiełka są badane próbkami surowicy pacjenta, a następnie dodaje się znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe w celu wykrycia wiązania autoprzeciwciał w surowicy z antygenami. Reaktywności autoprzeciwciał są ujawniane i określane ilościowo poprzez skanowanie szkiełek za pomocą skanera, który może wykrywać sygnały fluorescencyjne. W tym miejscu opisano metody generowania niestandardowych mikromacierzy antygenowych. Nasze obecne tablice są drukowane z 9 solidnymi pinami i mogą zawierać do 162 antygenów wykrytych w dwóch egzemplarzach. Matryce można łatwo dostosować, zmieniając antygeny w płytce źródłowej, która jest używana przez mikromacierz. Opracowaliśmy dwukolorowy schemat wykrywania przeciwciał wtórnych, który może rozróżnić reaktywności IgG i IgM na tej samej powierzchni szkiełka. System detekcji został zoptymalizowany pod kątem badania wiązania autoprzeciwciał ludzkich i mysich.

Antygeny są rozmieszczone na płytce 384-dołkowej i naniesione na slajdy przez robotyczny mikroarrayer, jak pokazano na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia slajdy umieszczone w ramce z komorami inkubacyjnymi oraz zeskanowany slajd po przetworzeniu. Rysunek 3 przedstawia slajdy kontrolne dodatnie i ujemne. Slajd ujemny jest poddawany inkubacji tylko z przeciwciałami wtórnymi, a slajd kontrolny dodatni z surowicą pacjenta z toczniem rumieniowat...

Opisujemy tutaj metodę generowania konfigurowalnych mikromacierzy antygenowych, które mogą być używane do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM w surowicy od ludzi i myszy. Macierze te pozwalają na wysokoprzepustowe i ilościowe wykrywanie przeciwciał przeciwko dowolnemu antygenom lub epitopom.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Ogólnym celem tej techniki jest szybka analiza przesiewowa autoprzeciwciał w sposób multipleksowy. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych zagadnień w dziedzinie autoimmunologii, takich jak określenie, które autoprzeciwciała korelują z różnymi stanami chorobowymi. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość równoległego przesiewania autoprzeciwciał, potrzeba użycia jedynie mikrolitrów surowicy oraz zapotrzebowanie na zaledwie mikrogramy antygenu.Aby przygotować mikrotablice antygenowe, należy rozpocząć od rozcieńczenia antygenów w PBS do stężenia końcowego 2 mg/mL. Skonfigurować mikroaplikator z dziewięcioma pinami, aby nanieść do 162 unikalnych antygenów w duplikacie. W bibliotece antygenów należy uwzględnić antygeny IgG oraz IgM jako kontrole pozytywne.W качестве kontroli negatywnej należy zastosować wyłącznie PBS. Do płyty źródłowej z 384 dołkami należy dodać 20 µL każdego antygenu w grupach odpowiadających konfiguracji głowicy drukującej. Płytę źródłową należy przykryć folią i zamrozić w temperaturze -80 °C do momentu rozpoczęcia drukowania macierzy.Oczyść piny macierzy mikroarray, inkubując je trzykrotnie przez jedną minutę w kąpieli ultradźwiękowej z wodą dejonizowaną. Umieść piny w statywie do wysuszenia. Następnie zamontuj piny w głowicy drukującej macierzy mikroarray.W przypadku dziewięciu pinów zastosuj konfigurację trzy na trzy. Następnie zaprogramuj urządzenie do tworzenia mikromacierzy dla cyklu drukowania, ustawiając liczbę pinów w głowicy drukującej, liczbę slajdów do wydrukowania, liczbę pól na każdym slajdzie oraz liczbę powtórzeń dla każdego antygenu. Dodatkowo zaprogramuj urządzenie do sonikacji pinów w wodzie pomiędzy różnymi grupami antygenów.Następnie, po rozmrożeniu płytki źródłowej, odwiruj ją przez jedną minutę przy 100 ×g. Umieść płytkę źródłową w wyznaczonym miejscu w mikroarrayerze, a następnie usuń fragment folii pokrywający pierwszą grupę antygenów do naniesienia. Ułóż niezadrukowane szkiełka na powierzchni arrayera i uruchom program drukowania. Drukuj szkiełka w temperaturze pokojowej, przy wilgotności ustawionej w arrayerze na poziomie od 55 do 60%. Po naniesieniu każdej grupy antygenów na wszystkie szkiełka wstrzymaj pracę mikroarrayera.Przykryj właśnie naniesione antygeny folią, aby zapobiec ich odparowaniu, a następnie odsłoń kolejną grupę antygenów do naniesienia. Kontynuuj program nanoszenia. Po naniesieniu wszystkich antygenów przykryj płytkę źródłową nowym kawałkiem folii i zamroź ją w temperaturze minus 80 °C.Umieść wydrukowane preparaty w kasecie na szkiełka i zapakuj je próżniowo. Preparaty można wykorzystać następnego dnia lub w ciągu miesiąca. W celu przeprowadzenia analizy mikromacierzy z użyciem rozcieńczonych surowic w komorach inkubacyjnych, umieść szkiełka w ramkach.Następnie dodaj 700 µL buforu blokującego na powierzchnię każdego matrycy. Nałóż folię samoprzylepną na ramkę i przenieś ją do szczelnego pojemnika z kawałkiem zwilżonej chusteczki. Następnie inkubuj preparaty w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez noc.Następnego dnia rozcieńcz próbki surowicy w stosunku 1:100 w buforze blokującym. Następnie odessij roztwór blokujący z macierzy i dodaj 500 µl rozcieńczonej próbki na powierzchnię każdej macierzy. Następnie przykryj macierze folią przylepną i inkubuj w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę w wytrząsarce.Następnie odessać próbki surowicy z matryc i wypłukać powierzchnie matryc cztery razy buforem płuczącym, wlewając bufor na szkiełka i szybko go strzepując. Użyć 700 µL buforu blokującego do przemycia każdej powierzchni matrycyy, a następnie inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy stałym kołysaniu. Następnie dodać 500 µL rozcieńczonego przeciwciała wtórnego na powierzchnię każdego szkiełka i przykryć ją folią przylepną.Inkubować preparaty w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym kołysaniu przez 45 minut. Po inkubacji odessać mieszaninę przeciwciał wtórnych z preparatów i wypłukać je czterokrotnie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Następnie przemyć preparaty 700 mikrolitrami buforu blokującego, trzykrotnie przez 10 minut za każdym razem.Wyjmij preparaty z ramek, następnie umieść je w metalowym statywie do szkiełek i zanurz w PBS. Inkubuj w temperaturze pokojowej przy wstrząsaniu orbitalnym przez 20 minut. Umieść statyw ze szkiełkami w pojemniku z wodąy dejonizowaną na 15 sekund.Następnie umieść statyw w nowym pojemniku z wodą i inkubuj przez kolejne 15 sekund. Aby osuszyć preparaty, umieść statyw z nasuwnikami na adapterze do płytek ELISA w wirówce i wiruj przy 220 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Przechowuj preparaty w szczelnym przed światłem pudełku do momentu rozpoczęcia skanowania.Do skanowania preparatów należy użyć skanera mikromacierzy zdolnego do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych SI three i SI five. Optymalne ustawienia mnożnika, czyli PMT, należy wyznaczyć poprzez wstępne skanowanie preparatu z pełną biblioteką antygenów, który został poddany inkubacji wyłącznie z przeciwciałami wtórnymi. Wartości PMT ustawia się za pomocą przycisku sprzętowego w taki sposób, aby cechy ludzkiego IgG w kanale SI three oraz cechy ludzkiego IGM w kanale SI five miały podobną medianę intensywności fluorescencji pomniejszoną o tło, czyli MFIB, która zazwyczaj wynosi 40 000.Następnie, zeskanuj preparaty eksperymentalne w dwóch kanałach, naciskając przycisk skanowania. Po każdym skanowaniu zapisz obrazy preparatów w obu kanałach. Używając przycisku pliku, wczytaj preparat do analizy do oprogramowania do mikromacierzy.Następnie należy użyć przycisku pliku, aby wczytać listę macierzy genów, czyli plik GAL, który zawiera układ macierzy wraz z identyfikatorami jej elementów. Nałożone należy dopasować szablon macierzy do zeskanowanego obrazu w taki sposób, aby elementy macierzy jak najdokładniej odpowiadały szablonowi. Należy nacisnąć przycisk wyrównania, aby dopasować elementy we wszystkich blokach do szablonu.Oprogramowanie obliczy następnie MFI pomniejszone o tło dla każdego z antygenów. Na koniec należy użyć przycisku eksportu pliku, aby zapisać wyniki w formacie tekstowym, a następnie przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Na tej rycinie, przedstawiającej preparaty kontrolne pozytywne i negatywne, preparat negatywny został poddany inkubacji jedynie z przeciwciałami wtórnymi, natomiast preparat kontrolny pozytywny z surowicą pobraną od pacjenta z toczniem układowym.Jak wskazano tutaj, surowica kontroli pozytywnej o znanej reaktywności względem riboP wykazuje obecność przeciwciał IgM przeciwko jednoniciowemu DNA oraz przeciwciał IgG przeciwko riboP. Odpowiedzi liniowe zaobserwowano dla IgM przy wszystkich rozcieńczeniach surowicy, a dla IgG do poziomu MFI pomniejszonego o tło wynoszącego około 30 000. W tym doświadczeniu macierz jest badana z użyciem ludzkiej surowicy pobranej od pacjenta z zapaleniem naczyń w przebiegu krioglobulinemii, z udokumentowanym czynnikiem reumatoidalnym, który jest przeciwciałem IgM przeciwko IgG.Prążek IgG ma kolor żółto-zielony z powodu wiązania się IgM z surowicy pacjenta z unieruchomionym IgG na matrycy. Przy zastosowaniu wyłącznie przeciwciał wtórnych nie obserwuje się reaktywności IgM przeciwko IgG naniesionemu na matrycę. Przedstawione tutaj IgM i IgG mysie, naniesione na matrycę, są wykrywane odpowiednio tylko za pomocą przeciwciał wtórnych anty-mysich przeciwko IgM i IgG.Rysunek ten przedstawia dopasowanie siatki szablonu do zeskanowanego obrazu macierzy przy użyciu oprogramowania do analizy mikromacierzy. Po dopasowaniu cechy macierzy mogą zostać przeanalizowane w celu uzyskania medianowej intensywności fluorescencji pomniejszonej o tło dla każdej cechy. Po opanowaniu techniki, badanie mikromacierzy antygenowych może zostać przeprowadzone w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne techniki, takie jak ELISA, w celu walidacji wyników uzyskanych z mikromacierzy antygenowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak nanosić mikromacierze antygenowe, jak przeprowadzać inkubację mikromacierzy antygenowych z surowicą oraz jak skanować mikromacierze antygenowe za pomocą skanera. Należy pamiętać, że praca z ludzką surowicą może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy przestrzegać uniwersalnych środków ostrożności.

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje technikę testu immunologicznego wykorzystującą fluorescencyjne kulki magnetyczne lub mikrosfery w połączeniu z różnymi antygenami do jednoczesnego wykrywania różnych izotypów przeciwciał w próbce surowicy. Test jest pomocny w zrozumieniu serokonwersji podczas infekcji lub po szczepieniu.

Multianalitowy test immunobealikowy: Technika testu immunologicznego oparta na przepływie do jednoczesnego wykrywania wielu podtypów przeciwciał w próbce ludzkiej surowicy

W tym filmie pokazujemy proces wykrywania izotypów przeciwciał w wielu próbkach ludzkiej surowicy za pomocą szkiełka mikromatrycowego wydrukowanego z antygenowymi podtypami szczepów wirusa grypy.

Test mikromacierzy antygenu wirusowego do wykrywania izotypów przeciwciał w surowicy przeciwko antygenowi wirusowemu

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Film prezentuje implementację technologii chipów snap do wielowarstwowych testów immunologicznych bez reaktywności krzyżowej. Prosta czynność polegająca na zatrzaśnięciu dwóch szkiełek mikromacierzy, z których każdy zawiera inne odczynniki, zapewnia transfer odczynnika bez zanieczyszczenia krzyżowego i pomaga w wykrywaniu wielu białek za pomocą testu immunologicznego typu sandwich.

Technologia Snap Chip do wielowarstwowego testu immunologicznego bez reaktywności krzyżowej

Demonstrujemy technologię chipową do wykonywania testów immunologicznych typu sandwich bez reaktywności krzyżowej, po prostu pstrykając dwa slajdy. Aparat zatrzaskowy służy do niezawodnego przenoszenia odczynników z mikromacierzy do mikromacierzy. Chip zatrzaskowy może być stosowany do wszelkich reakcji biochemicznych wymagających kolokalizacji różnych odczynników bez zanieczyszczenia krzyżowego.

Snap Chip do multipleksowanych testów immunologicznych typu sandwich wolnych od reaktywności krzyżowej i Spotterów

Tutaj przedstawiliśmy metody wykrywania autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych za pomocą testów elektrochemiluminescencyjnych (ECL). Protokół, stosowany do przewidywania cukrzycy typu 1, może być rozszerzony o wykrywanie autoprzeciwciał przeciwko innym chorobom autoimmunologicznym.

Testy elektrochemiluminescencyjne dla autoprzeciwciał ludzkich wysp trzustkowych

Przedstawiamy protokół użycia mikromatrycy białkowej zbudowanej przez drukowanie antygenów grypy na szkiełkach pokrytych nitrocelulozą do jednoczesnego sondowania surowicy pod kątem wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 250 antygenom z różnych szczepów wirusa, umożliwiając w ten sposób pomiar szerokości przeciwciał w surowicy dla różnych podtypów wirusa.

Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Modelujemy prosty multipleksowany test ECL, który łączy ze sobą 7 testów autoprzeciwciał. Test jest w stanie przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu innych chorób autoimmunologicznych jednocześnie, w tym celiakii, autoimmunologicznej choroby tarczycy i autoimmunologicznego zespołu wielogruczołowego 1.

Wysokoprzepustowy test elektrochemiluminescencyjny 7-plex do jednoczesnego badania przesiewowego w kierunku cukrzycy typu 1 i wielu chorób autoimmunologicznych

System analizy przepływu dla testów multipleksowych opartych na koralikach, który zapewnia odczyt z dwoma reporterami, został wykorzystany do opracowania multipleksowych testów serologicznych i neutralizacji przeciwciał, które mogą jednocześnie mierzyć neutralizujące przeciwciała IgG i IgM dla SARS-CoV-2.

Szybki, multipleksowy test neutralizacji IgG i IgM SARS-CoV-2 z podwójnym reporterem dla multipleksowanego systemu analizy przepływu opartego na kulkach

Trzykanałowy system analizy przepływu fluorescencji z podwójnym reporterem został wykorzystany do opracowania multipleksowego testu immunologicznego opartego na koralikach, który jednocześnie ocenia próbki surowicy pod kątem IgG i IgM wywołanych przez wiele antygenów różnych gatunków Borrelia, które powodują boreliozę z Lyme w Europie i Ameryce Północnej.

Jednoczesne wykrywanie różnych klas przeciwciał w multipleksowanym teście serologicznym

Naucz się generować dwukolorowe mikromacierze antygenowe do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM z próbek ludzkich i mysich. Ta metoda umożliwia szybki, wysokoprzepustowy przesiew autoprzeciwciał.

Generacja dwukolorowych mikromacierzy antygenowych do jednoczesnego wykrywania autoprzeciwciał IgG i IgM

Przeglądaj więcej filmów