Wykorzystanie mikromacierzy antygenu grypy do pomiaru szerokości przeciwciał w surowicy w różnych podtypach wirusa

Mikromacierz antygenu grypy umożliwia jednoczesny pomiar wielu izotypów przeciwciał przeciwko ponad 300 szczepom grypy z małej próbki krwi o objętości zaledwie jednego mikrolitra. Mikromacierz umożliwia wysokoprzepustowy pomiar szerokości przeciwciał grypy w krajobrazie antygenowym szczepów grypy. Charakteryzując przeciwciała grypy bardziej szczegółowo niż było to wcześniej możliwe, ta mikromacierz może pomóc w ustaleniu, dlaczego u niektórych osób rozwija się zakażenie grypą, a u innych nie.

Technika mikromacierzy antygenowej została zastosowana do 35 różnych patogenów w naszym laboratorium, umożliwiając pomiar przeciwciał przeciwko 60 000 celów antygenowych i z 50 000 próbek surowicy pobranych od pacjentów z chorobami zakaźnymi i zdrowych osób z grupy kontrolnej na całym świecie. Ucząc tej techniki podczas osobistych warsztatów, odkryliśmy, że możliwość wizualnego zademonstrowania tej techniki ma kluczowe znaczenie dla jej zrozumienia i działania. Procedurę zademonstrują Al Jasinskas i Rafael De Assis, naukowcy z naszego laboratorium.

Aby wydrukować antygeny za pomocą drukarki mikromatrycowej, wybierz drukarkę z kołkami do mikromacierzy o małej objętości, które mogą zasysać antygeny z 384-dołkowej płytki źródłowej do kanału próbki i osadzać antygeny poprzez bezpośredni kontakt i działanie kapilarne na 16 szkiełkach pokrytych nitrocelulozą. W oprogramowaniu do drukowania wprowadź liczbę płyt próbnych, które zostaną użyte w polu tekstowym Liczba płyt i wybierz typ płyty, która zostanie użyta do analizy. Wybierz konfigurację pinów i ustaw przesunięcia punktu początkowego na odległości między początkiem slajdu a miejscem, w którym kołki drukowania rozpoczną drukowanie na slajdach.

Na karcie projektu macierzy zdefiniuj rozmiar i kształt tablic oraz wybierz parametry sposobu, w jaki kołki drukujące będą pobierać i dozować próbki. Skonfiguruj protokoły czyszczenia pinów i blottingu oraz zdefiniuj kolejność, w jakiej bloki próbki są drukowane na szkiełkach. Oprogramowanie macierzy skonstruuje plik indeksu siatki z adnotacjami, aby opisać rozmieszczenie antygenów w każdej mikromacierzy.

Po zaprogramowaniu oprogramowania drukującego z żądanym protokołem rozpocznij drukowanie. Po zakończeniu umieść niesondowane szkiełka mikromacierzy w odpornym na światło pudełku w szafie eksykatora w temperaturze pokojowej. Aby sondować surowice na obecność przeciwciał w mikromacierzy, użyj klipsów, aby przymocować szkiełka do mikromacierzy stroną do góry na komorach sondujących i umieść komory w ramkach.

Zachowaj ostrożność podczas montażu prowadnic, ponieważ łatwo się łamią i sprawdź, czy po ponownym nawodnieniu nie ma wycieków. W razie potrzeby zdemontuj i ponownie zmontuj prowadnice, aby naprawić nieszczelności. Ponownie uwodnić szkiełka za pomocą 100 mikrolitrów przefiltrowanego buforu blokującego na studzienkę i rozcieńczyć surowice w stosunku jeden do 100 w 100 mikrolitrach buforu blokującego na próbkę.

Następnie inkubować ponownie uwodnione szkiełka mikromacierzy i rozcieńczone surowice przez 30 minut w temperaturze pokojowej i od 100 do 250 obrotów na minutę na wytrząsarce orbitalnej. Pod koniec inkubacji użyć końcówek pipet połączonych z przewodem próżniowym z wtórną kolbą zbiorczą, aby ostrożnie zassać bufor blokujący z rogu każdej komory, nie dotykając elektrod, a następnie natychmiast dodać rozcieńczoną surowicę do podpasek, nie dopuszczając do wyschnięcia elektrod. Następnie umieść przykryte ramki na tacach zawierających wilgotne ręczniki papierowe szczelnie zamknięte w celu utrzymania wilgotności i inkubuj ramki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołyszącym się shakerze.

W przypadku znakowania przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z kropkami kwantowymi, ostrożnie zassać surowice, jak właśnie pokazano, i przepłukać szkiełka trzema płukaniami w 100 mikrolitrach świeżego buforu TTBS na studzienkę przez pięć minut każdy na wytrząsarce orbitalnej. Szkiełka są następnie inkubowane z mieszaniną przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z kropkami kwantowymi, a następnie przemywane trzykrotnie, jak opisano w protokole, przy użyciu tej samej techniki, którą właśnie zademonstrowano. Po ostatnim umyciu ostrożnie wyjmij szkiełka z komór i delikatnie spłucz szkiełka przefiltrowaną wodą podwójnie destylowaną, a następnie umieść każde szkiełko w 50-mililitrowej probówce.

Następnie wysuszyć szkiełka przez odwirowanie. Aby uzyskać obrazy szkiełek z mikromatrycą, najpierw włącz przenośny imager i ostrożnie umieść szkiełko, które ma być obrazowane, stroną zadrukowaną w uchwycie szkiełek w komorze obrazowania. Otwórz oprogramowanie do obrazowania i na karcie konfiguracji imagera wybierz odpowiednią konfigurację slajdu.

Na karcie sterowania obrazem wybierz odpowiedni kanał fluorescencyjny i dostosuj czas ekspozycji i akwizycji w zależności od reaktywności sera. Następnie kliknij przycisk przechwytywania, aby rozpocząć pobieranie obrazu. Pod koniec akwizycji użyj siatek zorientowanych na znacznikach odniesienia, aby wykryć plamy tablicy.

Aby zmierzyć intensywność plamki, w panelu informacji o pliku prześlij plik gal i określ folder, w którym mają zostać zapisane pliki wyjściowe analizy w sekcji opcji analizy. Na karcie kontroli obrazu otwórz jeden z uzyskanych obrazów, które mają zostać określone ilościowo, i wybierz opcję auto. W sekcji analizy tablicowej utwórz szablon odniesienia zgodnie z instrukcjami oprogramowania.

Kliknij opcję Analiza wsadowa, aby wybrać folder zawierający obrazy, które mają zostać określone ilościowo, a następnie wybierz szablon odniesienia, który został właśnie utworzony. Oprogramowanie przeanalizuje każdy obraz i określi ilościowo intensywność plamki. Następnie przeanalizuj surowe dane, aby porównać wiązanie przeciwciał między antygenami i próbkami surowicy.

W tym reprezentatywnym badaniu zastosowano przeciwciała drugorzędowe Kozie Anty-Ludzkie IgG skoniugowane z kropką kwantową emitującą na wysokości 800 nanometrów oraz Kozie Anty-Ludzkie IgA skoniugowane z kropką kwantową emitującą na głębokości 585 nanometrów do multipleksowego wykrywania odpowiednio przeciwciał IgG i IgA. Na wynikowej mapie cieplnej tylko klinicznie istotne podtypy o wysokiej reprezentacji zostały oznaczone znakiem plus oznaczającym wszystkie pozostałe podtypy o wyższej liczbie, aby zaoszczędzić miejsce. IgA i IgG w surowicy pogrupowano według ich form molekularnych i podtypów hemaglutyniny i neuraminidazy.

Wykazanie wysokiej swoistości przeciwciał grupy głowowej hemaglutyniny dla podtypów klinicznych oraz wysokiej reaktywności krzyżowej całych przeciwciał hemaglutyniny i triameryzowanych całych hemaglutynin z włączeniem obszaru podstawowego. Odpowiedzi przeciwciał przeciwko grypie mierzone na mikromacierzy można potwierdzić tradycyjnymi technikami, w tym hamowaniem hemaglutynacji i testami mikroneutralizacji. Technika ta pozwoliła uzyskać wgląd w swoistość podtypów przeciwciał przeciwko grupie głównej grypy oraz względne znaczenie przeciwciał IgA i IgG dla podatności na grypę.

Chociaż żaden z materiałów nie jest wyjątkowo niebezpieczny, wszystkie próbki surowicy ludzkiej powinny być traktowane zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego.