19 października 2016
To badanie demonstruje chirurgiczne przygotowanie mięśnia cremaster szczura do wizualizacji warstwy wolnej od komórek in vivo. W pracy omówiono istotne czynniki wpływające na dokładność pomiaru szerokości warstwy bezkomórkowej.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przestrzenno-czasowych zmian szerokości wolnej od komórek warstwy (cell-free layer) in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrohemodynamiki, pozwalając lepiej zrozumieć rolę cell-philii w mikrokrążeniu. Główną zaletą tej metody jest fakt, że szerokość cell-philii in vivo może być mierzona bardziej spójnie i wygodnie niż w przypadku poprzednich technik pomiarów manualnych, które były bardzo czasochłonne.
Przed rozpoczęciem pomiaru szerokości warstwy wolnej od komórek uruchom skrypt wstępny pre-MatLab dla warstwy wolnej od komórek. Następnie kliknij otwórz plik, aby wybrać plik wideo do analizy, i dostosuj suwak obrotu, aby pionowo wyrównać ściany pojedynczego naczynia, korzystając z suwaka powiększenia do regulacji poziomu zoomu w razie potrzeby. Gdy naczynie znajdzie się w odpowiedniej pozycji, kliknij potwierdź edycję, a następnie kliknij ustaw ROI, aby przyciąć i zdefiniować obszar zainteresowania.
Wyrównany obraz zostanie wyświetlony w wyskakującym oknie. W razie potrzeby dostosuj prostokątny obszar wyboru na obrazie, a następnie dwukrotnie kliknij go, aby zatwierdzić obszar zainteresowania. Następnie kliknij Extract Images, aby wyeksportować wszystkie edytowane klatki wideo do kolejnych obrazów rastrowych, które zostaną zapisane w folderze o tej samej nazwie co wybrany plik wideo.
Aby zmierzyć szerokość warstwy wolnej od komórek, kliknij Select Folder i wybierz folder z obrazami. Pierwsza klatka obrazu pojawi się w panelu obrazów w skali szarości wraz z odpowiadającym jej histogramem intensywności szarości w panelu histogramu obrazu. Wybierz z listy odpowiednią klatkę obrazu, aby przeprowadzić analizę, a następnie kliknij Find Vessel Walls, aby zidentyfikować wewnętrzną ścianę naczynia na obrazie; zostanie ona wyznaczona jako miejsce, w którym szczyt profilu intensywności światła przechodzi z ciemnego w jasny w obrębie dwóch pikseli.
Zaznacz opcję median filter, aby zastosować filtr medianowy do obrazu w celu redukcji szumu typu „sól i pieprz”. Zaznacz opcję auto-contrast, aby przeprowadzić cyfrową regulację intensywności obrazu w celu poprawy jego kontrastu. Następnie wybierz z listy algorytm progowania, aby automatycznie określić wartość progu, która podzieli poziomy szarości na dwie klasy: piksele białe z poziomami szarości powyżej wartości progu oraz piksele czarne z poziomami szarości poniżej wartości progu.
Aby zmierzyć zmienność przestrzenną szerokości warstwy wolnej od komórek, wprowadź rozdzielczość pikseli w polu rozdzielczości pikseli. Następnie kliknij Oblicz, aby uzyskać zmienność przestrzenną szerokości warstwy wolnej od komórek, a następnie kliknij Eksportuj do .csv, aby wyeksportować dane dotyczące szerokości warstwy wolnej od komórek w formacie tabelarycznym.
Aby zmierzyć zmienność czasową szerokości warstwy wolnej od komórek wzdłuż konkretnej linii analizy w naczyniu, kliknij Temporal Variation i wprowadź informacje o częstotliwości klatek. W polach start frame oraz last frame wprowadź odpowiednio numery pierwszej i ostatniej klatki obrazów przeznaczonych do analizy. Przesuń suwak linii analizy, aby wybrać jej położenie wzdłuż naczynia, a następnie potwierdź pozycję linii analizy, korzystając z obrazów w skali szarości oraz obrazów binarnych.
Następnie kliknij Calculate, aby uzyskać zmienność czasową szerokości warstwy wolnej od komórek, a następnie kliknij Export. csv, aby wyeksportować dane dotyczące szerokości warstwy wolnej od komórek w formacie tabelarycznym. Przedstawiono tutaj typowy przepływ erytrocytów w niegałęziującej się tętnicy w mięśniu opuszkowym szczura, gdzie warstwę wolną od komórek można zaobserwować pomiędzy rdzeniem RBC a wewnętrzną ścianą naczynia.
Odpowiedni kontrast pomiędzy tymi komponentami jest kluczowy dla zapewnienia dokładności pomiarów szerokości warstwy wolnej od komórek. Pierwsza faza analizy obrazu obejmowała detekcję wewnętrznej ściany naczynia. Poprzez pozyskanie profilu natężenia światła wzdłuż linii analizy prostopadłej do naczynia, lokalizacja jest przybliżana w punkcie szczytowym, w którym następuje przejście z ciemnego obszaru do jasnego w obrębie dwóch pikseli.
Następnie, z wykorzystaniem algorytmu progowania obrazu, wykrywane są granice rdzenia RBC, co pozwala na obliczenie szerokości CFL. Ponieważ erytrocyty w warstwie wolnej od komórek charakteryzują się różną przepuszczalnością światła, różnicę poziomów szarości można podzielić na dwie klasy. Jednakże identyfikacja dokładnej wartości progu pomiędzy dwoma pikiem na histogramie obrazu może być utrudniona ze względu na niską jakość oraz słaby kontrast obrazu.
Aby poprawić kontrast między erytrocytami a warstwą wolną od komórek, można zastosować filtr niebieski. Jest to jeszcze bardziej widoczne na tych obrazach, gdzie granice rdzeni erytrocytów zostały dokładniej zidentyfikowane przy użyciu filtra niebieskiego. Algorytm progowania może również wpływać na pomiar szerokości warstwy wolnej od komórek, co widać na tych obrazach, w których różne algorytmy progowania doprowadziły do zidentyfikowania różnych granic rdzeni erytrocytów, a tym samym różnych szerokości warstw wolnych od komórek.
Pomiar szerokości warstwy wolnej od komórek in vivo jest bardzo wrażliwy na jakość obrazów. Należy therefore przeprowadzić operację z należytą starannością i skorzystać z odpowiedniego wspomagania optycznego, aby uzyskać wysoką jakość obrazu. Ponadto niezbędny jest wybór odpowiedniego algorytmu progowania obrazu, aby zapewnić dokładny i spójny pomiar szerokości warstwy wolnej od komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejsze badanie przedstawia chirurgiczne przygotowanie mięśnia żylnego (cremaster) szczura w celu wizualizacji warstwy wolnej od komórek in vivo. Metoda ta umożliwia spójną i wygodną kwantyfikację szerokości warstwy wolnej od komórek, odpowiadając na kluczowe pytania z zakresu mikrohemodynamiki.
Ilościowa wizualizacja warstwy wolnej od komórek w naczyniach mikrokrążenia umożliwia precyzyjną analizę hemodynamiki mikrokrążenia, wspierając mechanistyczne ograniczanie ryzyka w biologii naczyniowej i poszukiwaniu nowych leków. Zautomatyzowany, powtarzalny pomiar szerokości warstwy wolnej od komórek zwiększa pewność prognostyczną w ramach wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz dostarcza danych dla translacyjnych modeli przepływu krwi. Możliwość ta jest strategicznie istotna dla zespołów biofarmaceutycznych poszukujących wiarygodnych, ilościowych punktów końcowych w procesach badawczych nad mikrokrążeniem.
Ta metoda integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych, dostarczając zestandaryzowanych, ilościowych pomiarów mikrokrążenia, które są istotne zarówno dla wczesnego etapu odkryć, jak i dla badań translacyjnych.