Name: Wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura. Technika ta umożliwia dokładniejsze pomiary mikrohemodynamiki in vivo niż ręczne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Medical Research Council (NMRC)/Cooperative Basic Research Grant (CBRG)/0078/2014.

To badanie jest zgodne z Narodowym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (zatwierdzony protokół nr R15-0225).
1. Chirurgiczne przygotowanie modelu zwierzęcego
<ol>
	<li>Kaniulacje naczyń
	<ol>
		<li>Znieczulenie samców szczurów Sprague-Dawley (w wieku 6-7 tygodni) o wadze (203 ± 20) g koktajlem ketaminy (37,5 mg/ml) i ksylazyny (5 mg/ml) należy wprowadzić do środka otrzewnowego (i.p.) (2 ml/kg). Nie należy ponownie nakręcać nakrętki igły ani wyjmować jej ze strzykawki po wstrzyknięciu.</li>
		<li>Po znieczuleniu zwierzęcia (potwierdzonym uszczypnięciem palca u nogi) umieść je na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie 37 °C. Delikatnie ogol włosy na łopatkach, przedniej części szyjki macicy, dolnej części brzucha, przyśrodkowej tylnej nodze i worku mosznowym. Delikatnie przymocuj nogi za pomocą samoprzylepnych taśm papierowych.</li>
		<li>Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuj za pomocą nożyczek do mikrodysekcji i kleszczy kątowych, oglądając przez mikroskop stereoskopowy. Umieść wszystkie ostre narzędzia chirurgiczne na tacce odpornej na przebicie, aby zapobiec obrażeniom podczas operacji.</li>
		<li>Przed wykonaniem nacięcia wyszoruj wszystkie miejsca operowane 3 razy naprzemiennie jodem i 70% alkoholem. Przepłukać wszystkie cewniki 30 j.m./ml roztworu soli fizjologicznej.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej na łopatkach o długości 1 - 1,5 cm za pomocą nożyczek chirurgicznych nad prawą żyłą szyjną. Oddziel powięź rozwarstwieniem, aby odsłonić żyłę szyjną i kaniulować ją rurką polietylenową (PE-50) wypełnioną heparyną-solą fizjologiczną za pomocą jedwabnych szwów 5-0. W razie potrzeby podać znieczulenie uzupełniające (1/3 do 1/2 dawki początkowej, dożylnie (iv)) przez cały czas trwania operacji i eksperymentu.</li>
		<li>Wykonaj tracheostomię, aby utrzymać drożność dróg oddechowych. Wykonaj nacięcie 1 - 1,5 cm w przedniej części szyjki macicy. Kankaniutować tchawicę za pomocą rurki polietylenowej (PE-205) z jedwabnymi szwami 2-0, aby zabezpieczyć cewnik na miejscu.</li>
		<li>Monitoruj ciśnienie krwi poprzez kaniulację w tętnicy udowej. Wykonaj nacięcie 1 - 1,5 cm na lewej przyśrodkowej powierzchni tylnej nogi. Oddziel tętnicę udową przez rozwarstwienie. Kanulować tętnicę udową rurką polietylenową (PE-10) wypełnioną heparyną-solą fizjologiczną za pomocą szwów jedwabnych 5-0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cremaster Przygotowanie mięśni i wizualizacja przepływu
	<ol>
		<li>Przełóż jedwabny szew 5-0 przez wierzchołek worka mosznowego, aby go przedłużyć. Wykonaj nacięcie wzdłuż brzusznej powierzchni worka mosznowego. Regularnie nakładaj ciepły roztwór izotoniczny (37 °C; pH 7,4) na odsłonięty mięsień.</li>
		<li>Ostrożnie i dokładnie usuń otaczające tkanki łączne za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.</li>
		<li>Przełóż jedwabny szew 5-0 przez wierzchołek mięśnia cremaster. Przetnij szew na dwie części o równej długości i zawiąż węzeł z każdej strony. Przetnij mięsień między dwoma węzłami i rozciągnij go na niestandardowej przezroczystej platformie z pleksiglasu, delikatnie pociągając za szew. Przymocuj koniec szwu do platformy za pomocą blue tack. 
		UWAGA: Dokładne usunięcie otaczających tkanek łącznych ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnego kontrastu obrazu.</li>
		<li>Powtarzaj krok 1.2.3, aż zostanie wykonanych 5 do 6 utrwaleń. Ostrożnie usuń mięsień cremaster z najądrza za pomocą kauteryzacji wysokotemperaturowej. Superflej ciepły roztwór izotoniczny do odsłoniętego mięśnia, aby zapobiec odwodnieniu tkanki.
		<ol>
			<li>Otocz mięsień cremaster złożonymi kawałkami gazy. Przykryj odsłonięty mięsień folią poliwinylową. Kawałki gazy wraz z folią tworzą płytką miskę, w której znajduje się ciepły roztwór izotoniczny do obiektywu mikroskopu zanurzeniowego w wodzie (ryc. 1A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieść zwierzę na stadium zwierzęce mikroskopu przyżyciowego (ryc. 1C). Podłącz kaniulację tętniczą do systemu gromadzenia danych fizjologicznych w celu ciągłego monitorowania ciśnienia (ryc. 1E).</li>
		<li>Utrzymuj temperaturę mięśni na poziomie 35 °C za pomocą elementu grzejnego umieszczonego pod platformą zwierzęcia (rysunek 1B). Umieść sondę temperatury obok mięśnia, aby zapewnić ujemne sprzężenie zwrotne do regulatora mocy elementu grzejnego (rysunek 1D).</li>
		<li>Pozostaw zwierzę na scenie na 15 minut, aby zrównoważyć się z otoczeniem.</li>
		<li>Wizualizuj przepływ krwi pod mikroskopem przyżyciowym z obiektywem 40-krotnym zanurzeniem w wodzie i długo pracującym skraplaczem.</li>
		<li>Wybierz tętniczkę nierozgałęzioną (< 60 μm) w oparciu o wyraźną ostrość obrazu i kontrast między rdzeniem RBC, CFL i ścianami naczynia, aby ustawić ostrość mikroskopu na płaszczyźnie średnicowej naczynia krwionośnego. Obróć kamerę zamontowaną na mikroskopie, aby wyrównać ściankę naczynia w pionie.</li>
		<li>Nagrywaj przepływ krwi za pomocą szybkiej kamery wideo z szybkością 3 000 klatek na sekundę przez 1 sekundę. Zapisz nagrane wideo jako nieskompresowany 8-bitowy format AVI w skali szarości, aby zachować jakość obrazu. 
		UWAGA: Zalecana jest minimalna liczba klatek na sekundę wynosząca 3,000 klatek/s, aby zapewnić, że pomiar CFL można wykonać co najmniej raz na RBC w fizjologicznych warunkach przepływu tętniczek.</li>
		<li>Użyj niebieskiego filtra z transmisją szczytową przy długości fali 394 nm i pasmem widmowym przy 310 - 510 nm, aby zwiększyć kontrast między erytrocytami a plazmą. 
		UWAGA: Upewnij się, że widmo światła przechodzące przez niebieski filtr z mikroskopijnego źródła światła (halogen lamp 100 W) ma niskie natężenie światła, aby zapobiec potencjalnemu uszkodzeniu tkanek.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu poddaj zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania pentobarbitalu sodu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Obróbka wstępna do pomiaru szerokości świetlówki kompaktowej
	<ol>
		<li>Otwórz MATLAB i uruchom plik "CFL_pre.m". (Ten i inne pliki MATLAB można znaleźć w <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54550/CFL_MATLAB_script.zip">Uzupełniające archiwum MATLAB</a>.)</li>
		<li>Kliknij "Otwórz plik", aby wybrać plik wideo do analizy.</li>
		<li>Dostosuj suwak "Obrót", aby wyrównać ścianki naczynia w pionie. 
		UWAGA: Użytkownicy mogą wyświetlić pomocnicze linie siatki dla wyrównania statku, wybierając przycisk radiowy "Siatka włączona" i dostosować poziom powiększenia obrazu, przesuwając suwak "Powiększenie".</li>
		<li>Kliknij przycisk "Potwierdź edycję", aby potwierdzić wyrównanie statku.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Ustaw ROI do przycięcia", aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI). Wyrównany obraz zostanie wyświetlony w wyskakującym okienku. Dostosuj prostokątny obiektyw na obrazie i kliknij dwukrotnie, aby potwierdzić zwrot z inwestycji. Pomiń ten krok, jeśli przycinanie obrazu nie jest wymagane. 
		UWAGA: Uwzględnij tylko jedno naczynie w ROI, aby przeanalizować szerokość CFL od statku. Kliknij przycisk "Resetuj obraz", aby w razie potrzeby przywrócić obraz do jego pierwotnej postaci.</li>
		<li>Kliknij przycisk "Wyodrębnij obrazy", aby wyodrębnić wszystkie edytowane klatki wideo do kolejnych obrazów map bitowych (8-bitowy format "bmp" w skali szarości). Wyodrębnione obrazy można znaleźć w folderze o tej samej nazwie, co wybrany plik wideo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar szerokości świetlówki kompaktowej
	<ol>
		<li>Otwórz MATLAB i uruchom plik "CFL_measure.m".</li>
		<li>Kliknij "Wybierz folder", aby wybrać folder zawierający wyodrębnione obrazy.</li>
		<li>Kliknij folder zawierający obrazy i kliknij "Wybierz folder". Pierwsza ramka obrazu w folderze zostanie załadowana i wyświetlona w panelu "Obraz w skali szarości" wraz z histogramem intensywności szarości w panelu "Histogram obrazu".</li>
		<li>Wybierz żądaną ramkę obrazu z listy, aby przeprowadzić analizę, w przeciwnym razie zostanie wybrana pierwsza ramka obrazu.</li>
		<li>Kliknij "Znajdź ściany naczynia", aby zidentyfikować wewnętrzną ścianę naczynia na obrazie, która jest określana w miejscu, w którym szczyt profilu natężenia światła przechodzi z ciemnego do jasnego w ciągu dwóch pikseli.</li>
		<li>Zaznacz opcję "Filtr mediany", aby zastosować filtr mediany do obrazu w celu zmniejszenia szumu "soli i pieprzu".</li>
		<li>Zaznacz opcję "Automatyczny kontrast", aby cyfrowo dostosować intensywność obrazu w celu zwiększenia kontrastu obrazu.</li>
		<li>Wybierz algorytm progowy z listy, który automatycznie określa wartość progową (τ) dzielącą poziomy szarości na dwie klasy — białe piksele z poziomami szarości powyżej τ (CFL) i czarne piksele z poziomami szarości poniżej τ (rdzeń RBC). 
		UWAGA: Jako alternatywną metodę należy użyć ręcznego progowania, jeśli żaden z algorytmów automatycznego progowania nie zapewnia odpowiedniego progowania obrazu. Kliknij przycisk opcji "Ręcznie" i dostosuj suwak, aby zdefiniować wartość ręcznego progowania.</li>
		<li>Aby zmierzyć przestrzenną zmienność szerokości CFL, wprowadź rozdzielczość pikseli w polu "Rozdzielczość pikseli" (rozdzielczość przy tej eksperymentalnej konfiguracji wynosiła 0,42 μm/piksel).</li>
		<li>Kliknij przycisk "Oblicz", aby uzyskać przestrzenną zmienność szerokości CFL. Kliknij "Eksportuj .csv", aby wyeksportować dane o szerokości CFL w formacie tabelarycznym.</li>
		<li>Aby zmierzyć czasową zmienność szerokości CFL na określonej linii analizy wzdłuż statku, kliknij przycisk opcji "Zmienność czasowa" i wprowadź informacje o liczbie klatek na sekundę (liczba klatek na sekundę użyta w tej eksperymentalnej konfiguracji wynosiła 3,000 klatek/s).</li>
		<li>Wprowadź pierwszą i ostatnią klatkę obrazów do analizy odpowiednio w polach "Klatka początkowa" i "Ostatnia klatka".</li>
		<li>Wybrać położenie linii analitycznej wzdłuż zbiornika, przesuwając suwak 'Linia analizy'. Potwierdź położenie linii analizy, która jest zilustrowana zarówno na 'Obrazie w skali szarości', jak i 'Obrazie binarnym'.</li>
		<li>Kliknij "Oblicz", aby uzyskać czasową zmianę szerokości CFL. Kliknij "Eksportuj .csv", aby wyeksportować dane o szerokości CFL w formacie tabelarycznym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+variations+of+cell-free+layer+width+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial variations of cell-free layer width in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), H1526-H1535 (2007).</li>
<li>Ong, P. K., Namgung, B., Johnson, P. C., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+erythrocyte+aggregation+and+flow+rate+on+cell-free+layer+formation+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of erythrocyte aggregation and flow rate on cell-free layer formation in arterioles.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 298 (6), H1870-H1878 (2010).</li>
<li>Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+uneven+red+cell+influx+on+formation+of+cell-free+layer+in+small+venules%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of uneven red cell influx on formation of cell-free layer in small venules.</a> Microvasc Res. 92, 19-24 (2014).</li>
<li>Goldsmith, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microcirculatory+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Eugene+M.+Landis+Award+Lecture.+The+Microrheology+of+Human-Blood.+Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">The Microcirculatory Society.</a> Eugene M. Landis Award Lecture. The Microrheology of Human-Blood. Microvasc Res. 31 (2), 121-142 (1986).</li>
<li>Buerk, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Model+Nitric+Oxide+Biotransport%3F+A+Survey+of+Mathematical+Models+for+a+Simple+Diatomic+Molecule+with+Surprisingly+Complex+Biological+Activities%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Can We Model Nitric Oxide Biotransport? A Survey of Mathematical Models for a Simple Diatomic Molecule with Surprisingly Complex Biological Activities.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3 (1), 109-143 (2001).</li>
<li>Tateishi, N., Suzuki, Y., Soutani, M., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+of+erythrocytes+in+microvessels+of+isolated+rabbit+mesentery%3A+cell-free+layer+and+flow+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics of erythrocytes in microvessels of isolated rabbit mesentery: cell-free layer and flow resistance.</a> J Biomech. 27 (9), 1119-1125 (1994).</li>
<li>Ong, P. K., Cho, S., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cell-free+layer+formation+on+NO%2FO2+bioavailability+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of cell-free layer formation on NO/O2 bioavailability in small arterioles.</a> Microvasc Res. 83 (2), 168-177 (2012).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NO+bioavailability+by+temporal+variation+of+the+cell-free+layer+width+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Modulation of NO bioavailability by temporal variation of the cell-free layer width in small arterioles.</a> Ann Biomed Eng. 39 (3), 1012-1023 (2011).</li>
<li>Park, S. W., Intaglietta, M., Tartakovsky, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+stochastic+fluctuations+in+the+cell+free+layer+on+nitric+oxide+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Comput+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impact of stochastic fluctuations in the cell free layer on nitric oxide bioavailability.</a> Front Comput Neurosci. 9, 131(2015).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+transient+model+for+prediction+of+arteriolar+NO%2FO2+modulation+by+spatiotemporal+variations+in+cell-free+layer+width%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional transient model for prediction of arteriolar NO/O2 modulation by spatiotemporal variations in cell-free layer width.</a> Microvasc Res. 97, 88-97 (2015).</li>
<li>Sriram, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+small+changes+in+hematocrit+on+nitric+oxide+transport+in+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Sign%22%5BJournal%5D)">The effect of small changes in hematocrit on nitric oxide transport in arterioles.</a> Antioxid Redox Sign. 14 (2), 175-185 (2011).</li>
<li>Hightower, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiovascular+regulation+by+the+blood%2Fendothelium+cell-free+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiovascular regulation by the blood/endothelium cell-free layer.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 3 (4), 458-470 (2011).</li>
<li>Ng, Y. C., Namgung, B., Leo, H. L., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+aggregation+may+promote+uneven+spatial+distribution+of+NO%2FO+in+the+downstream+vessel+of+arteriolar+bifurcations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte aggregation may promote uneven spatial distribution of NO/O in the downstream vessel of arteriolar bifurcations.</a> J Biomech. , (2015).</li>
<li>Ong, P. K., Jain, S., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+the+cell-free+layer+width+may+enhance+NO+bioavailability+in+small+arterioles%3A+Effects+of+erythrocyte+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of the cell-free layer width may enhance NO bioavailability in small arterioles: Effects of erythrocyte aggregation.</a> Microvasc Res. 81 (3), 303-312 (2011).</li>
<li>Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+rheology+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte rheology in microcirculation.</a> Jpn J Physiol. 46 (1), Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8743714</a> 1-14 (1996).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels+-+Influence+of+Erythrocyte+Aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels - Influence of Erythrocyte Aggregation.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), Available from:
 <a target="_blank" href="http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959">http://ajpheart.physiology.org/content/268/5/H1959</a> H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Kim, S., Kong, R. L., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-based+method+for+determination+of+the+cell-free+layer+width+in+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">A computer-based method for determination of the cell-free layer width in microcirculation.</a> Microcirculation. 13 (3), 199-207 (2006).</li>
<li>Soutani, M., Suzuki, Y., Tateishi, N., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Evaluation+of+Flow+Dynamics+of+Erythrocytes+in+Microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Influence+of+Erythrocyte+Aggregation.+Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Evaluation of Flow Dynamics of Erythrocytes in Microvessels.</a> Influence of Erythrocyte Aggregation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 268 (5), H1959-H1965 (1995).</li>
<li>Namgung, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+histogram-based+thresholding+methods+for+the+determination+of+cell-free+layer+width+in+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">A comparative study of histogram-based thresholding methods for the determination of cell-free layer width in small blood vessels.</a> Physiol Meas. 31 (9), N61-N70 (2010).</li>
<li>Ong, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+method+for+cell-free+layer+width+determination+in+small+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Meas%22%5BJournal%5D)">An automated method for cell-free layer width determination in small arterioles.</a> Physiol Meas. 32 (3), N1-N12 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+Selection+Method+from+Gray-Level+Histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Prewitt, J. M., Mendelsohn, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+cell+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The analysis of cell images.</a> Ann N Y Acad Sci. 128 (3), 1035-1053 (1966).</li>
<li>Ridler, T. W., Calvard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picture+Thresholding+Using+an+Iterative+Selection+Method%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.%2C+Man%2C+Cybern%22%5BJournal%5D)">Picture Thresholding Using an Iterative Selection Method.</a> IEEE Trans. Syst., Man, Cybern. 8 (8), 630-632 (1978).</li>
<li>Shanbhag, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+Information+Measure+as+a+Means+of+Image+Thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22Cvgip-Graph+Model+Im%22%5BJournal%5D)">Utilization of Information Measure as a Means of Image Thresholding.</a> Cvgip-Graph Model Im. 56 (5), 414-419 (1994).</li>
<li>Bishop, J. J., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+erythrocyte+aggregation+and+venous+network+geometry+on+red+blood+cell+axial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of erythrocyte aggregation and venous network geometry on red blood cell axial migration.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (2), H939-H950 (2001).</li>
<li>Yamaguchi, S., Yamakawa, T., Niimi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+plasma+layer+in+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Cell-free plasma layer in cerebral microvessels.</a> Biorheology. 29 (2-3), 251-260 (1992).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Pomiar szerokości świetlówki kompaktowej jest niezbędny do lepszego zrozumienia hemodynamiki w mikrokrążeniu. W szczególności pomiar szerokości CFL został wykonany w mikrokrążeniach krezkowych6, rdzeniowo-trapezowych24 i mózgowych25 . Konwencjonalne pomiary szerokości świetlówek kompaktowych in vivo ograniczały się do szacunków poprzez ręczną kontrolę zarejestrowanych klatek wideo. Pomiary manualne wymagały uśrednienia kilku kolejnych klatek wideo przed wizualnym określeniem gran...

Badania na zwierzętach in vivo są kluczowe dla podstaw nauki dla zrozumienia ludzkiej fizjologii i patologii. W szczególności badania mikrohemodynamiczne in vivo mogą wyjaśnić potencjalne upośledzenie funkcji mikrokrążenia zmienione przez nieprawidłowe warunki reologiczne krwi. W wielu wcześniejszych badaniach mikrohemodynamicznych1 wykorzystano model mięśniowy cremaster szczura do wizualizacji mikronaczyniowego przepływu krwi. Mięsień cremaster to cienka warstwa mięśnia prążkowanego otaczającego jądra. W ten sposób przepływ krwi w mięśniach można uwidocznić za pomocą mikroskopu trans-illumination za pomocą ekspozycji chirurgicznej. Dzięki temu możemy uzyskać obrazy przepływu krwi in vivo bez użycia jakichkolwiek środków fluorescencyjnych lub kontrastowych. Ponadto cała perfuzja krwi w sieci mięśniowej może być kontrolowana poprzez zmniejszenie przepływu krwi w górę za pomocą okluzji aortybrzusznej 2. Dzięki tym zaletom model mięśniowy cremaster jest szeroko stosowany do badania tworzenia się warstwy bezkomórkowej (CFL) w mikronaczyniach1,3. 
Szerokość CFL jest ważnym parametrem hemodynamicznym w mikrokrążeniu, który cieszy się dużym zainteresowaniem ze względu na jego ważną rolę w regulacji funkcji mikrokrążenia. CFL powstaje w wyniku indukowanej ścinaniem poprzecznej wewnętrznej migracji czerwonych krwinek (RBC) w kierunku centrum przepływu4. W konsekwencji migracja ta prowadzi do zubożenia erytrocytów w pobliżu ścian naczyń, co ostatecznie prowadzi do powstania bezkomórkowej warstwy plazmy. W związku z tym ciemieniowa świetlówka kompaktowa w naturalny sposób staje się barierą dyfuzyjną dla dostarczania tlenu (O2) z rdzenia RBC do tkanek oraz dla wychwytywania tlenku azotu (NO) przez RBC5,6. Ponadto produkcja NO może być również modulowana przez dynamiczne zmiany szerokości CFL7,8. Dlatego rola CFL zarówno w transporcie gazów, jak i regulacji homeostazy w mikrokrążeniu musi być w pełni ustalona, aby lepiej zrozumieć przepływ krwi w mikrokrążeniu. Ostatnie badania koncentrowały się na łączeniu funkcji hemodynamiki i transportu gazów świetlówki kompaktowej ze scaloną elektroniką w mikrokrążeniu9-12. Ponadto w oddzielnym zestawie badań zbadano również, w jaki sposób patologiczne zwiększenie agregacji RBC moduluje tworzenie CFL i jego wpływ na biodostępność O2 i NO w tkankach13,14. 
Rola CFL staje się bardziej znacząca w mikrokrążeniu, gdzie względna wielkość szerokości CFL do średnicy naczynia jest widoczna. Wymaga to skutecznego podejścia do ilościowego określania CFL w przepływie krwi in vivo. W szczególności akwizycja obrazu i analiza obrazu to dwa kluczowe elementy decydujące o dokładności pomiaru szerokości świetlówek kompaktowych. Skuteczna wizualizacja przepływu krwi w tkankach powinna być poprzedzona odpowiednim przygotowaniem chirurgicznym modelu zwierzęcego. Ponadto potrzebna jest odpowiednia technika analizy obrazu, aby przezwyciężyć ograniczenia konwencjonalnych pomiarów ręcznych, które są w większości spowodowane błędami ludzkimi15,16. Dzięki postępom w oprzyrządowaniu optycznym i mocy obliczeniowej do cyfrowego przetwarzania obrazu, możliwe jest teraz osiągnięcie dokładniejszego i bardziej spójnego pomiaru szerokości CFL17-19. Niemniej jednak dokładność tych pomiarów, opartych na obrazie, nadal ostatecznie zależy od jakości obrazów.
Dlatego też w tym badaniu badane są czynniki wpływające na pomiar szerokości świetlówki kompaktowej in vivo. Skupiliśmy się w szczególności na zademonstrowaniu przygotowania chirurgicznego i cyfrowej analizy obrazu do pomiarów szerokości CFL w tętniczkach mięśnia cremaster szczura.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop przyżyciowy</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Kamera szybkoobrotowa</td><td>Photron</td><td>1024PCI</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Filtr niebieski</td><td>HOYA</td><td>B390</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt Czujnik ciśnienia i system biopac</td><td>System Biopac</td><td>TSD104A, MP100</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Shimaden</td><td>SR 1</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Plasma Lyte A</td><td>Baxter</td><td>NDC: 0338-0221</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna 0,9%</td> <td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparyna (5,000 IU/ml)</td><td>LEO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE-10 rurka polietylenowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>427400.024</td><td>" OD x .011" ID&nbsp;</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE-50</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427411.038 "OD x .023" ID</td></tr><tr><td>Rurka polietylenowa PE-205</td><td>Becton Dickinson</td><td></td> <td>427446.082" OD x .062" ID</td></tr><tr><td>2-0 niewchłanialny jedwabny szew</td><td>Deknatel</td><td>113-S</td><td></td></tr><tr><td>5-0 niewchłanialny jedwabny szew</td><td>Deknatel</td><td>106-S</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza z cyrkulacją wody</td><td>Gaymar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp 205</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Sterylna gaza bawełniana&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-415-468</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-124</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>Kent Scientific INS14188</td><td></td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Mikrokleszcze preparacyjne</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15915</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki 1 x 2 zęby</td><td>Kent Scientific</td><td>INS15917</td><td>Chirurgiczny instrument</td></tr><tr><td>Kleszcze do kaniulacji naczyń</td><td>Kent Scientific</td><td>INS500377</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14177</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysa</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14225</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>Klips do naczyń</td><td>Kent Scientific</td><td>INS14120</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr><tr><td>System kauteryzacji Gemini</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>Instrument chirurgiczny</td></tr></tbody></table>

wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia cremaster szczura

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Warstwa bezkomórkowa jest zdefiniowana jako warstwa plazmy ciemieniowej w przepływie mikronaczyń, która jest pozbawiona czerwonych krwinek. Pomiar szerokości warstwy wolnej od komórek in vivo i jej zmian czasoprzestrzennych może zapewnić kompleksowe zrozumienie hemodynamiki w mikrokrążeniu. W tym badaniu użyliśmy mikroskopijnego systemu przyżyciowego w połączeniu z szybką kamerą wideo, aby określić ilościowo szerokości warstw bezkomórkowych w tętniczkach in vivo. Mięsień cremaster szczurów Sprague-Dawley został chirurgicznie uzewnętrzniony, aby uwidocznić przepływ krwi. Opracowano również specjalnie opracowany skrypt obrazowania, aby zautomatyzować przetwarzanie obrazu i analizę szerokości warstwy wolnej od komórek. Takie podejście umożliwia ilościowe określanie zmian czasoprzestrzennych w sposób bardziej spójny niż wcześniejsze pomiary ręczne. Dokładność pomiaru zależy jednak częściowo od zastosowania filtra niebieskiego i doboru odpowiedniego algorytmu progowania. W szczególności oceniliśmy kontrast i jakość obrazów uzyskanych z użyciem filtra niebieskiego i bez niego. Ponadto porównaliśmy pięć różnych algorytmów progowania opartych na histogramie obrazu (Otsu, minimum, intermode, selekcja iteracyjna i progowanie entropii rozmytej) i zilustrowaliśmy różnice w ich określaniu szerokości warstwy wolnej od komórek.

Wizualizacja CFL in vivo w dużej mierze zależy od przygotowania chirurgicznego zwierzęcia. Nadmierna utrata krwi lub przedłużony czas trwania operacji mogą doprowadzić do wystąpienia wstrząsu oraz zaburzeń przepływu krwi u zwierzęcia. Utrzymanie temperatury tkanek za pomocą mata grzewczego, a także zastosowanie dostosowanej platformy podczas operacji i eksperymentu, jest również kluczowe dla zachowania fizjologicznych warunków u szczura. Dzięki zastosowaniu lampy halogenowej o mocy 100 W w systemie mikroskopowym...

To badanie demonstruje chirurgiczne przygotowanie mięśnia cremaster szczura do wizualizacji warstwy wolnej od komórek in vivo. W pracy omówiono istotne czynniki wpływające na dokładność pomiaru szerokości warstwy bezkomórkowej.

Wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie przestrzenno-czasowych zmian szerokości wolnej od komórek warstwy (cell-free layer) in vivo. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrohemodynamiki, pozwalając lepiej zrozumieć rolę cell-philii w mikrokrążeniu. Główną zaletą tej metody jest fakt, że szerokość cell-philii in vivo może być mierzona bardziej spójnie i wygodnie niż w przypadku poprzednich technik pomiarów manualnych, które były bardzo czasochłonne.Przed rozpoczęciem pomiaru szerokości warstwy wolnej od komórek uruchom skrypt wstępny pre-MatLab dla warstwy wolnej od komórek. Następnie kliknij otwórz plik, aby wybrać plik wideo do analizy, i dostosuj suwak obrotu, aby pionowo wyrównać ściany pojedynczego naczynia, korzystając z suwaka powiększenia do regulacji poziomu zoomu w razie potrzeby. Gdy naczynie znajdzie się w odpowiedniej pozycji, kliknij potwierdź edycję, a następnie kliknij ustaw ROI, aby przyciąć i zdefiniować obszar zainteresowania.Wyrównany obraz zostanie wyświetlony w wyskakującym oknie. W razie potrzeby dostosuj prostokątny obszar wyboru na obrazie, a następnie dwukrotnie kliknij go, aby zatwierdzić obszar zainteresow

visualization-quantification-cell-free-layer-arterioles-rat-cremaster

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano przygotowanie tkanki do wizualizacji i manipulacji eksperymentalnej żywego mikrokrążenia. U znieczulonych samców myszy przygotowano cienki, silnie unaczyniony mięsień kremaster do mikroskopii przyżyciowej w celu badania sieci mikronaczyniowych, w tym tętniczek, kapilar i żyłek. Metoda ta może być łatwo dostosowana do szczurów i chomików.

Przygotowanie mięśnia kremastra myszy do obrazowania intravitalnego mikrokrążenia

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Cyfrowa intravitalna mikroskopia epifluorescencyjna żyłek posutniczych w mikrokrążeniu mięśnia dźwigacza jest wygodną metodą pozwalającą na uzyskanie wglądu w interakcje leukocytowo-śródbłonkowe in vivo w przypadku uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (IRI) prążkowanej tkanki mięśniowej. Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół bezpiecznego wykonania tej techniki oraz omawiamy jej zastosowania i ograniczenia.

Obrazowanie cyfrowe w czasie rzeczywistym oddziaływania leukocytów z nabłonkiem śródbłonkowym w urazie niedokrwienno-reperfuzji (IRI) mięśnia kremaster szczura

Pokazujemy nowy model podwiązania tętniczego w mięśniu rdzeniowo-trapezowym myszy, w tym procedurę krok po kroku i opis wymaganego oprzyrządowania. Opisujemy operację i istotne pomiary wyników związane z przebudową sieci naczyniowej i funkcjonalnym rozszerzeniem naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii przyżyciowej i konfokalnej.

Mysi model rdzeniowo-trapezowy do oceny wpływu podwiązania tętniczek na funkcję i przebudowę mikrokrążenia

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Mikroskopia przyżyciowa myszy M. cremaster microcirculation oferuje unikalny i dobrze ustandaryzowany model in vivo do analizy migracji komórek macierzystych szpiku kostnego obwodowego.

Mikroskopia przyżyteczna mikrokrążenia w mięśniu Cremaster myszy do analizy migracji obwodowych komórek macierzystych

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Poznaj metodę wizualizacji i kwantyfikacji warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura. Technika ta umożliwia dokładniejsze pomiary mikrohemodynamiki in vivo niż ręczne metody.

Wizualizacja i kwantyfikacja warstwy bezkomórkowej w tętniczkach mięśnia Cremaster szczura

Przeglądaj więcej filmów