Badanie wektorów wirusowych w trójwymiarowym modelu wątroby wypełnionym ludzką linią komórkową raka wątrobowokomórkowego HepG2

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie trójwymiarowego modelu wątroby do badania wirusów i wektorów wirusowych. Metoda ta pozwala na badanie procesów biologicznych w unaczynionym trójwymiarowym układzie z komórkami ludzkimi, które różnią się fizjologią od komórek gryzoni w modelu mysim lub szczurzym. Ponadto jest to krok w kierunku poprawy dobrostanu zwierząt, ponieważ pozwala uniknąć eksperymentów na żywych zwierzętach i w dłuższej perspektywie ma na celu całkowite zastąpienie komponentów pochodzenia zwierzęcego.

Chociaż opracowaliśmy tę metodę do badania wektorów wirusowych do transferu genów, można ją również zastosować do badania zakaźnych wirusów życiowych i innych obszarów badawczych, takich jak badania nad rakiem. Procedurę zademonstruje Viola Rohrs, technik z mojego laboratorium. Ze względu na dobrostan zwierząt, do niniejszego badania wykorzystano tylko nadwyżki zwierząt, które zostały poświęcone do innych eksperymentów na zwierzętach, tj.

żadne dodatkowe zwierzęta nie były potrzebne do uzyskania rusztowań wątroby. Aby rozpocząć, najpierw rozwiń linię komórek wątroby Hep G2. Umieść 15 milionów komórek w butelkach T175 w 30 mililitrach pożywki zawierającej 10% płodowej surowicy cielęcej i dwa milimole gulatyminy, penicyliny i streptomycyny. Po czterech dniach hodowli użyj pięciu minut ekspozycji na roztwór trypsyny w warunkach hodowli, aby poluzować komórki, a następnie je zbierz.

Następnie wiruj komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Następnie ponownie zawieś je w czterech mililitrach PBS i uzyskaj liczbę komórek. Z każdej butelki powinno wyprodukować około 45 milionów komórek.

Do recelularizacji ECM wątroby szczura potrzeba 600 milionów komórek. Aby zrekomórkaryzować ECM, najpierw skonfiguruj system bioreaktora zawierający komorę rozlewu wątroby, system profuzji, zbiornik pożywki i pułapkę bąbelkową. Procedura recelularyzacji składa się z dwóch kluczowych etapów.

Jednym z nich jest unikanie uwięzienia pęcherzyków powietrza w systemie obfitości. Po drugie, cały system musi być utrzymywany w sterylności. Najpierw sterylizuj te elementy systemu bioreaktora w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po drugie, napełnij rurki i wysterylizowaną komorę obfitości pożywką. Następnie umieść pozbawione komórek rusztowanie wątroby szczura w komorze obfitości wątroby. Następnym krokiem jest użycie klipsów rurkowych do połączenia kanonulowanej żyły wrotnej z systemem profuzji.

Teraz umieść system bioreaktora w inkubatorze i podłącz go do pompy perystaltycznej. Następnie zrównoważ rusztowanie ze 150 mililitrami uzupełnionej pożywki przez pięć dni. Ustaw przepływ na 1,25 mililitra na minutę.

Po pięciu dniach odłącz system bioreaktora od pompy i przenieś go do sterylnego okapu. Odłączyć rusztowanie wątroby od obwodu mediów. Następnie załaduj do strzykawki pięć mililitrów pożywki zawierającej 300 milionów komórek WZW G2 i wstrzyknij komórki przez żyłę wrotną, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.

Następnie pozwól komórkom ponownie zapełnić ECM przez godzinę bez uruchamiania pompy. Po godzinie uruchom pompę z prędkością 1,25 mililitra na minutę. Po 10 minutach zwiększ ciśnienie do 2,5 mililitra na minutę.

Po kolejnych 20 minutach ustaw pompę na prędkość roboczą 3,75 mililitra na minutę. Po 30 minutach pracy z pełną prędkością pompy wyłącz pompę, dodaj kolejne 300 milionów komórek i pozwól komórkom wypełnić ECM przez godzinę. Po godzinie stopniowo zwiększaj cyrkulację, stopniowo dostosowując prędkość pompy, tak jak poprzednio.

Teraz pozwól kulturze zrekomórkaryzować wątrobę przez dwa tygodnie. Co drugi dzień wymieniaj 50 mililitrów pożywki i mierz parametry fizjologiczne z próbki użytej pożywki. Produkcja wektorów AAV to skomplikowana procedura składająca się z wielu kroków, które są podsumowane w protokole tekstowym.

W tej części filmu przedstawiono niektóre z kluczowych kroków. Najpierw wyprodukuj, oczyść i określ ilościowo wektory AAV. Krótko wytworzyć wektory AAV w butelkach rolkowych i oczyścić je przez wirowanie w gradiacji jodiksanolu.

Usunąć resztki jodiksanolu przez filtrację przez żelowe kolumny filtracyjne PD10. Następnie określ stężenie wektora AAV za pomocą QPCR, używając genomowego DNA AAV jako standardu. Na każdy model potrzeba łącznie 27 bilionów wektorów AAV.

Teraz przetłumacz model wątroby. Po pierwsze, pobierz 27 bilionów wektorów w pięciu mililitrach PBS załadowanych do strzykawki. Czerwień fenolową można dodawać w ilości 5 mikrogramów na mililitr.

Następnie odłączyć wątrobę od obwodu pożywki i wstrzyknąć wektory do systemu. Po wstrzyknięciu należy inkubować system przez godzinę bez pompowania. Następnie stopniowo zwiększaj przepływ, jak opisano wcześniej.

Później, gdy transdukowana wątroba jest inkubowana przez sześć dni, zmieniaj 50 mililitrów pożywki co drugi dzień. Za pomocą skalpela pokrój próbki z każdego płata wątroby o grubości około pół centymetra i długości od 1,5 do dwóch centymetrów. Inkubuj plastry w 4% paraformaldehydzie z 4% sacharozą przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie przemyć próbkę trzy razy PBS przez jedną minutę na pranie. Postępuj zgodnie z przemyciami, inkubując próbki przez noc w 8% sacharozie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia załaduj próbki do krioform zawierających trochę podłoża utrwalającego.

Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza. Po załadowaniu całkowicie przykryj próbki utrwalaczem i umieść je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po zamrożeniu przygotuj kriosekcje o grubości 10 mikronów z próbek za pomocą kriotomu.

W razie potrzeby wybarwić próbki, aby potwierdzić recelularyzację. Do analizy ekspresji genów należy pobrać próbki za pomocą czteromilimetrowego stempla biopsyjnego. Aby ocenić recelularyzację, kriosekcje barwiono hematoksyliną i eozyną.

Płaty z dwóch transdukowanych wątrob i jednej wątroby kontrolnej, która została zrekomórkowana, ale nie została transdukowana, zostały ponownie zasiedlone komórkami WZW G2. Ekspresję RNA i miano wektora określono ilościowo na podstawie 28 biopsji dziurkowania z każdego modelu wątroby. W dwóch transdukowanych modelach wątroby zmierzono 55 i 90 genomów wektorowych na komórkę, co jest wystarczającym wektorem do wywołania wyciszenia genów.

Zgodnie z oczekiwaniami w grupie kontrolnej nie zmierzono żadnych genomów. Ekspresję EmGFP analizowano za pomocą RT-PCR i western blot. Większość biopsji wykazała ekspresję mRNA EmGFP i ekspresję białka EmGFP.

Analiza immunologiczna kriosekcji wykazała, że wszędzie tam, gdzie model został pomyślnie zrecelularyzowany, można było również zaobserwować ekspresję EmGFP. Wskazuje to na dobrą ekspresję genu AAV. Następnie za pośrednictwem AAV knockdown ludzkiej cyklofiliny B analizowano za pomocą ilościowego RT-PCR.

Średni knockdown ludzkiej cyklofiliny B wynosił od 70 do 90% we wszystkich płatach dwóch transdukowanych wątrob. Po jej opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania rozmieszczenia wirusów i wektorów wirusowych w unaczynionym, trójwymiarowym układzie narządów. Takie badania przyczynią się do udoskonalenia obecnych technik transferu genów i pomogą w opracowaniu nowych strategii przeciwwirusowych.