Name: Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę badania związku kandydackich związków przeciwwirusowych z NTCP przy użyciu kalorymetrii izotermicznej. Protokół umożliwia ocenę skuteczności inhibitorów wnikania wirusa zapalenia wątroby typu B.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt badawczy jest wspierany przez Uniwersytet Mahidol oraz Tajlandzkie Studia Naukowe i Innowacje (TSRI) oddzielnie przyznane A. Wongkajornsilpowi i K. Sa-ngiamsuntorn. Prace te były wspierane finansowo przez Biuro Krajowego Szkolnictwa Wyższego, Radę ds. Polityki Naukowej, Badawczej i Innowacyjnej za pośrednictwem Jednostki Zarządzania Programem ds. Konkurencyjności (grant nr C10F630093). A. Wongkajornsilp jest stypendystą Wydziału Lekarskiego Szpitala Siriraj Uniwersytetu Mahidol w ramach stypendium Chalermprakiat. Autorzy pragną podziękować Pani Sawinee Seemakhan (Excellent Center for Drug Discovery, Faculty of Science, Mahidol University) za jej pomoc w technice ITC.

<ol><li>Levrero, M., Zucman-Rossi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+HBV-induced+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).</li>
<li>Kim, K. -H., Kim, N. D., Seong, B. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+development+of+anti-HBV+agents+and+their+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance.</a> Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).</li>
<li>Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+for+hepatitis+B%3A+New+treatment+options+necessitate+reappraisal+of+traditional+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints.</a> Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).</li>
<li>Volz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entry+inhibitor+Myrcludex-B+efficiently+blocks+intrahepatic+virus+spreading+in+humanized+mice+previously+infected+with+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus.</a> Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).</li>
<li>Mak, L. -Y., Seto, W. -K., Yuen, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antivirals+in+clinical+development+for+chronic+hepatitis+B+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection.</a> Viruses. 13 (6), 1169(2021).</li>
<li>Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HBV+and+HDV%3A+New+Treatments+on+the+Horizon%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">HBV and HDV: New Treatments on the Horizon.</a> Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054(2021).</li>
<li>Iwamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+identification+of+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+using+HepG2+cells+overexpressing+a+membrane+transporter+NTCP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).</li>
<li>Tong, S., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NTCP+as+an+HBV+receptor%3A+the+beginning+of+the+end+or+the+end+of+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning.</a> Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).</li>
<li>Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+HepG2-derived+cells+expressing+cytochrome+P450s+for+assessing+metabolism-associated+drug-induced+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity.</a> Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).</li>
<li>Thongsri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+inhibited+hepatitis+B+viral+entry+through+NTCP+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding.</a> Scientific Reports. 11 (1), 19125(2021).</li>
<li>Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immortalized+hepatocyte-like+cell+line+%28imHC%29+accommodated+complete+viral+lifecycle%2C+viral+persistence+form%2C+cccDNA+and+eventual+spreading+of+a+clinically-isolated+HBV%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV.</a> Viruses. 11 (10), 952(2019).</li>
<li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter%2C+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li>
<li>Kaneko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tricyclic+polyketide%2C+Vanitaracin+A%2C+specifically+inhibits+the+entry+of+hepatitis+B+and+D+viruses+by+targeting+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide.</a> Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).</li>
<li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay%3A+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+of+the+Na%2B-taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).</li>
<li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors%2C+proanthocyanidin+and+its+analogs%2C+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li>
<li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li>
<li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li>
<li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li>
<li>Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+characterization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins.</a> Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+virtual+screening+protocol+for+in+silico+identification+of+potential+thyroid+disrupting+chemicals+targeting+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin.</a> Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).</li>
<li>Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+for+measuring+macromolecule-ligand+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796(2011).</li>
<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+protein-ligand+interactions%3A+mechanisms%2C+models%2C+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144(2016).</li>
<li>Sureau, C., Salisse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformational+heparan+sulfate+binding+site+essential+to+infectivity+overlaps+with+the+conserved+hepatitis+B+virus+A-determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant.</a> Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).</li>
<li>Herrscher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+entry+into+HepG2-NTCP+cells+requires+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis.</a> Cellular Microbiology. 22 (8), 13205(2020).</li>
<li>Gripon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+a+human+hepatoma+cell+line+by+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).</li>
<li>Mayati, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+polarization+of+human+hepatoma+HepaRG+cells+in+response+to+forskolin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16115(2018).</li>
<li>Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+hepatitis+B+virus+particles+in+Hep+G2+cells+transfected+with+cloned+hepatitis+B+virus+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).</li>
<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Srivastava, V. K., Yadav, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrivastava%2C+VK+%22Data+Processing+Handbook+for+Complex+Biological+Data+Sources%22">Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources</a>. Misra, G. , Academic Press. 125-137 (2019).</li>
<li>Seeger, C., Mason, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-dependent+taurocholic+cotransporting+polypeptide%3A+a+candidate+receptor+for+human+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus.</a> Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).</li>
<li>Seeger, C., Sohn, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+hepatitis+B+virus+with+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216(2014).</li>
<li>Ni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+and+D+viruses+exploit+sodium+taurocholate+co-transporting+polypeptide+for+species-specific+entry+into+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes.</a> Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).</li>
<li>Chai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+subviral+particles+of+hepatitis+B+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Properties of subviral particles of hepatitis B virus.</a> Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).</li>
<li>Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+interplay+between+uptake+transport+and+CYP3A4+induction+in+micropatterned+cocultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes.</a> Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).</li>
<li>Parvez, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-derived+antiviral+drugs+as+novel+hepatitis+B+virus+inhibitors%3A+Cell+culture+and+molecular+docking+study%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Zakażenie HBV rozpoczyna się poprzez wiązanie o niskim powinowactwie z proteoglikanami siarczanu heparanu (HSPG) na hepatocytach25, a następnie wiązanie się z NTCP z następczą internalizacją przez endocytozę26. Ponieważ NTCP jest kluczowym receptorem dla wnikania HBV, celowanie w wnikanie HBV może być klinicznie przełożone na zmniejszenie zakażenia de novo , transmisji z matki na dziecko (MTCT) i nawrotu po przeszczepieniu wątroby. Przerwanie wnikania wirusa byłoby...

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) jest uważane za chorobę zagrażającą życiu na całym świecie. Przewlekłe zakażenie HBV wiąże się z ryzykiem marskości wątroby i raka wątrobowokomórkowego1. Obecne leczenie anty-HBV koncentruje się głównie na wniknięciu wirusa po jego wejściu przy użyciu analogów nukleozy (NA) i interferonu alfa (IFN-α)2,3. Odkrycie inhibitora wnikania wirusa HBV, Myrcludex B, zidentyfikowało nowy cel dla czynników anty-HBV4. Połączenie inhibitorów wejścia i NAs w przewlekłym zakażeniu HBV znacznie zmniejszyło wiremię w porównaniu z tymi, które są ukierunkowane na samą replikację wirusa5,6. Jednak klasyczny model hepatocytów do badań przesiewowych inhibitorów wnikania HBV jest ograniczony przez niski poziom receptorów wirusowych (polipeptyd kotransportujący taurocholan sodu, NTCP). Nadekspresja hNTCP w komórkach wątrobiaka (tj. HepG2 i Huh7) poprawia zakaźność HBV7,8. Niemniej jednak te linie komórkowe wyrażają niskie poziomy enzymów metabolizujących leki fazy I i II i wykazują niestabilność genetyczną9. Modele hepatocytów, które mogą pomóc w celowaniu w różne mechanizmy potencjalnych związków anty-HBV, takie jak wnikanie prewirusa, wiązanie NTCP i wnikanie wirusa, przyspieszyłyby identyfikację i rozwój skutecznych schematów skojarzonych. Badanie nad aktywnością kurkuminy przeciwko HBV wyjaśniło hamowanie wnikania wirusa jako nowy mechanizm oprócz przerwania wnikania wirusa. Ten protokół szczegółowo opisuje model gospodarza do badań przesiewowych cząsteczek anty-HBV10.
Celem tej metody jest zbadanie potencjalnych związków anty-HBV do hamowania wnikania wirusa, szczególnie blokowania wiązania i transportu NTCP. Ponieważ ekspresja NTCP jest krytycznym czynnikiem wnikania i infekcji HBV, zoptymalizowaliśmy protokół dojrzewania hepatocytów, aby zmaksymalizować poziomy NTCP11. Ponadto protokół ten może różnicować hamujący wpływ na wnikanie HBV jako hamowanie przyłączenia HBV w porównaniu z hamowaniem internalizacji. Test wychwytu kwasu taurocholowego (TCA) został również zmodyfikowany przy użyciu metody opartej na ELISA zamiast radioizotopu, aby reprezentować transport NTCP12,13. Interakcja receptora i liganda została potwierdzona przez ich struktury 3D14,15. Inhibicję funkcji NTCP można ocenić, mierząc aktywność absorpcji TCA16. Jednak technika ta nie dostarczyła bezpośrednich dowodów na wiązanie NTCP z kandydującymi inhibitorami. W związku z tym wiązanie można badać za pomocą różnych technik, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy17, ELISA, test przesunięcia termicznego oparty na fluorescencji (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen i różne inne metody20. Wśród tych technik, ITC jest standardem w analizie wiązań, ponieważ może obserwować absorpcję lub emisję ciepła w prawie każdej reakcji21. Powinowactwo wiązania (KD) NTCP i związków kandydujących oceniano bezpośrednio za pomocą ITC; Te wartości powinowactwa były bardziej precyzyjne niż te uzyskane przy użyciu modelu predykcji in silico22.
Ten protokół obejmuje techniki dojrzewania hepatocytów, infekcji HBV i badań przesiewowych w kierunku inhibitora wejścia HBV. Krótko mówiąc, opracowano model hepatocytów w oparciu o linie komórkowe imHC i HepaRG. Wyhodowane komórki zróżnicowano w dojrzałe hepatocyty w ciągu 2 tygodni. Regulacja w górę poziomów NTCP została wykryta za pomocą PCR w czasie rzeczywistym, western blot i cytometrii przepływowej11. Wirus zapalenia wątroby typu B (HBVcc) został wyprodukowany i pobrany z wirusa HepG2.2.15. Zróżnicowany imHC lub HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) leczono profilaktycznie kandydatami anty-HBV na 2 godziny przed inokulacją wirionem HBV. Oczekiwanym rezultatem eksperymentu była identyfikacja czynników zmniejszających komórkową wartość HBV i zakaźność. Aktywność anty-NTCP oceniano za pomocą testu wychwytu TCA. Działanie NTCP może być pomijane przez agentów, którzy konkretnie powiązali protokół NTCP. Technika ITC została wykorzystana do zbadania wykonalności interaktywnego wiązania, które mogłoby przewidywać inhibitory i ich docelowe białka, określając powinowactwo wiązania (KD) liganda do receptora poprzez niekowalencyjne interakcje kompleksu biomolekularnego23,24. Na przykład KD ≥ 1 × 103 mM oznacza słabe wiązanie, KD ≥ 1 ×10 6 μM oznacza umiarkowane wiązanie, a KD ≤ 1 × 109 nM oznacza silne wiązanie. ΔG jest bezpośrednio skorelowane z oddziaływaniami wiążącymi. W szczególności reakcja z ujemnym ΔG jest reakcją egzergoniczną, co wskazuje, że wiązanie jest procesem spontanicznym. Reakcja z ujemnym ΔH wskazuje, że procesy wiązania zależą od wiązań wodorowych i sił Van der Waalsa. Zarówno wychwyt TCA, jak i dane ITC mogą być wykorzystywane do badań przesiewowych pod kątem obecności czynników anty-HBV. Wyniki tych protokołów mogą stanowić podstawę nie tylko do badań przesiewowych przeciwko HBV, ale także do interakcji z NTCP ocenianej na podstawie powinowactwa wiązania i funkcji transportu. W artykule opisano przygotowanie i charakterystykę komórek gospodarza, projekt eksperymentalny i ocenę wejścia anty-HBV wraz z powinowactwem wiązania NTCP.

<table><tbody><tr><td><silne>Linie komórkowe< / silne></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>komórki hepaRK, kriokonserwowane</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HPRGC10</td><td></td></tr><tr><td>Hep-G2/2.2.15 Ludzka linia komórkowa hepatoblastoma</td><td>Merck</td><td>SCC249</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Bufor buforowy fosforanu paraformadehydu</td><td>FUJIFLIM Wako chemiczny</td><td>163-20145</td><td></td></tr><tr><td>BD Bufor do trwałej ondulacji/płukania</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Bufor do trwałej ondulacji/płukania</td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>abcam</td><td>59865-13-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>8 mM</td></tr><tr><td>G 418 sól dwusiarczanowa</td><td>Merck</td><td>108321-42-2</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy zatrzymujących&nbsp; Bez EDTA (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>ilustrilustracjeTM Zestawy do izolacji RNAspin Mini RNA</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>ilustracja Zestaw do izolacji RNAspin Mini RNA</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>System odwrotnej transkrypcji ImProm-II</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Zestaw FAST qPCR</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator Lenti-X</td><td>Koncentrator</td><td>Takara bio</td><td>PT4421-2</td></tr><tr><td>Luminata crescendo Zachodnie podłoże HRP</td><td>Merck</td><td>WBLUR0100</td><td></td></tr><tr><td>Master Mix (2x) Uniwersalny</td><td>zestaw do ekstrakcji DNA Nucleospin Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr><tr><td></td><td>macherey-nagel</td><td>1806/003</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000</td><td>Merck</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany klon chmury NTCP</td><td></td><td>RPE421Hu02</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy RIPA (10x)</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma</td><td>345909-26-4</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw TCA Elisa</td><td>Mybiosource</td><td>MB2033685</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Rozcieńczony do 0,125%</td></tr><tr><td><silne>przeciwciała</silne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Przeciwciało anty-NTCP1</td><td>Abcam</td><td>ab131084</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM4300</td><td>1:200 000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; Przeciwciało anty-królikowe kozie sprzężone z HRP</td><td>Abcam</td><td>ab205718</td><td>1:10 000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; Przeciwciało wtórne przeciw mysim kozie HRP</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td>1:10 000 rozcieńczenie</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500 rozcieńczenie</td></tr><tr><td><silny>Skład odczynnika</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&deg; Bufor do rozcieńczania przeciwciał</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x TBST&</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Stężenie robocze: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>199931</td><td>Stężenie robocze: 0,05%</td></tr><tr><td><silny>Pożywka wzrostu hepatocytów< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DME/F12</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% długopis/paciorkowiec</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Medium do dojrzewania wątrobowego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Williamsa E średni</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4125-1L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% długopis/paciorkowiec</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5 & mikro; g/mL&nbsp; Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 &mikro; M hydrokotyzon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0888-1g</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2% DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672-250ml</td><td></td></tr><tr><td>IF Roztwór blokujący</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x PBS</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3% BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td>Stężenie robocze: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0,2% Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Stężenie robocze: 0,2%</td></tr><tr><td>RIPA Liza Roztwór buforowy do lizy</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na3VO4</td><td></td><td></td><td>Stężenie końcowe: 1 mM</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PMSF</td><td></td><td></td><td>Stężenie końcowe: 1 mM</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaF</td><td></td><td></td><td>Stężenie końcowe: 10 mM</td></tr><tr><td>odczynnik Western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Animacja 20</td><td>Merck</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x TBST</td><td></td><td></td><td>0.1% Animacja 20</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x PBS</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Żel poliakrylamidowy</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0183</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>Stężenie końcowe: 0,05%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>Żel do układania w stosie: 0,1%, Resolwer żel: 0,05%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>WB Roztwór blokujący/ 2&deg; Bufor do rozcieńczania przeciwciał</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x TBST&</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5% Mleko odtłuszczone (odtłuszczone mleko w proszku)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td>Stężenie robocze: 5%</td></tr><tr><td><mocny>1x Bufor do biegania 1 L</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>14,4 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; SDS</td><td>Merck</td><td>7910</td><td>Stężenie robocze: 0,1%</td></tr><tr><td>Blot bufor transferowy 500 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buforowana sól fizjologiczna (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>Stężenie końcowe: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>7,2 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Metanol</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Łagodny roztwór do usuwania 1 l</td><td></td><td></td><td>Dostosuj pH do 2,2</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>15 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; SDS</td><td>Merck</td><td>7910</td><td>1 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Tween 20</td><td>Merck</td><td>9005-64-5</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL probówka wirówkowa</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Airstream Class II</td><td>Esco</td><td>2010621</td><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>CelCulture CO2 Inkubator</td><td>Esco</td><td>2170002</td><td>Nawilżany inkubator do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy detektor PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>FACSPerse cytometr</td><td>przepływowy BD Biosciences</td><td>651154</td><td></td></tr><tr><td>Pipety miarowe (10 ml)</td><td>Pipety miarowe Jet Biofil</td><td>GSP010010</td><td></td></tr> (<tr><td>5 ml)</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>MicroCal PEAQ-ITC</td><td>Malvern</td><td></td><td>Kalorymetry miareczkowania izotermicznego</td></tr><tr><td>Mini PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>Komora do elektroforezy</td></tr><tr><td>Mini bibuła filtracyjna absorpcyjna Trans-blot</td> System obrazowania <td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G</td><td>Aplegen</td><td>8418-10-0005</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet</td><td>Eppendorf</td><td>4430000.018</td><td>Easypet 3</td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>Zasilacz</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Kolba do</td> hodowli komórkowych Merck <td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>T-75</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha komórka transferowa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Półsucha komórka transferowa</td></tr><tr><td>Procesor ultradźwiękowy (Vibra-Cell VCX 130)</td><td>Sonics & Materiały</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa z chłodzeniem Versati</td><td>Esco</td><td>T1000R</td><td>Wirówka z wahadłowym obrotem kubełkowym</td></tr></tbody></table>

kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu b przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

Zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) zostało uznane za kluczowy czynnik ryzyka raka wątrobowokomórkowego. Obecne leczenie może jedynie zmniejszyć miano wirusa, ale nie spowodować całkowitej remisji. Skuteczny model hepatocytów do zakażenia HBV zapewniłby realistyczny cykl życia wirusa, który miałby kluczowe znaczenie dla badań przesiewowych środków terapeutycznych. Większość dostępnych środków anty-HBV jest ukierunkowana na etapy cyklu życiowego po wniknięciu wirusa, ale nie przed jego wniknięciem. Protokół ten szczegółowo opisuje wygenerowanie kompetentnego modelu hepatocytów zdolnego do badań przesiewowych pod kątem środków terapeutycznych ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa. Obejmuje to celowanie w wiązanie polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu (NTCP), tworzenie cccDNA, transkrypcję i składanie wirusa na podstawie imHC lub HepaRG jako komórek gospodarza. W tym przypadku test hamowania wnikania HBV wykorzystywał kurkuminę do hamowania funkcji wiązania i transportu HBV za pośrednictwem NTCP. Inhibitory oceniano pod kątem powinowactwa wiązania (K, D) z NTCP za pomocą kalorymetrii izotermicznej miareczkowej (ITC) - uniwersalnego narzędzia do badań przesiewowych leków HBV w oparciu o parametry termodynamiczne.

Zaobserwowano cechy dojrzewania wątrobowego, w tym obecność komórek dwątkrowych oraz morfologię o kształcie wielokątnym (Rysunek 1), szczególnie w stadium zróżnicowania imHC (Rysunek 1A). Odnotowano znaczny wzrost ekspresji NTCP w d-HepaRG oraz d-imHC, odpowiednio 7-krotny i 40-krotny (Rysunek 1B). Wysoko glikozylowana forma NTCP, która według przypuszczeń warunkuje podatność na wniknięcie HBV, była wykrywana częściej w d-imHC niż w...

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

Protokół ten ma na celu sprawdzenie, czy potencjalny związek anty HBV hamuje wnikanie wirusa, zwłaszcza poprzez blokowanie wiązania NTCP. Technika ta ma na celu zbadanie, czy wnikanie wirusa HBV lub początkowy etap zakażenia może zostać przerwany przez którykolwiek z substancji kandydujących. Procedurę zademonstruje Piyanoot Thongsri, student PSP z mojego laboratorium.Aby rozpocząć pomiar polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu lub NTCP, należy inkubować dojrzałe hepatocyty z ośmioma lub więcej kwasem etylenodiaminotetraoctowym lub EDTA przez 15 minut. Zbierz granulki komórek i napraw hepatocyty, dodając 300 mikrolitrów 3,7% paraformaldehydu do PBS przez 15 minut. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby odwirować je w temperaturze 300 G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut.Przemyć komórki dwukrotnie za pomocą 700 mikrolitrów PBS zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS w wirówce przez 10 minut, jak opisano powyżej. Następnie przeniknij komórki 300 mikrolitrami 0,05% Triton X 100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po odwirowaniu wykonać trzy płukania po jednej minucie każde, używając 700 mikrolitrów PBS zawierającego 1% FBS.Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko NTCP w stosunku jeden do 100, a następnie trzy płukania buforem do przemywania trwałej ondulacji i odwirowanie. Wybarwić komórki drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 488 przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórzyć trzy płukania buforem do przemywania trwałej ondulacji przez jedną minutę każde. Po odwirowaniu w stężeniu 300 G ponownie zawiesić osad komórkowy z 200 mikrolitrami PBS zawierającego 1% FBS.W oprogramowaniu wybierz parametry pomiarowe do analizy cytometrii przepływowej, w tym FSC, SSC, FITC lub PE. Ustaw automatyczną korektę kompensacji i dołącz elementy sterujące kompensacją, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Następnie uruchom niebarwioną próbkę ze średnim natężeniem przepływu płynu wynoszącym 60 mikrolitrów na minutę. Dostosuj próg rozproszenia do przodu i do przodu do momentu, aż pokryją populację komórek będących przedmiotem zainteresowania.Zaznacz region bramki w tym obszarze i zastosuj go do wszystkich kontrolek kompensacji. Ustaw lampę powielacza fotograficznego lub fluorescencję PMT za pomocą niezabarwionego elementu sterującego i wyreguluj napięcie PMT FITC lub PE w ujemnym kwadrancie. Uruchomić dodatnio barwioną próbkę i wyregulować FITC lub PE w dodatniej skali kwadrantowej.Uruchom kontrole niebarwione, barwione FITC lub PE, oblicz kompensację i zastosuj ją do ustawień próbki. Następnie uruchom próbkę hepatocytów, aby zmierzyć poziom NTCP. Następnie rozpocznij analizę barwionych hepatocytów, wybierając kolejno okna BD FACSuite, probówkę kontrolną, a następnie zakładkę źródła danych.Poczekaj, aż pojawią się nieprzetworzone dane. Następnie w zakładce arkusza roboczego po prawej stronie kliknij przycisk bramki elipsy, wybierz populację komórek i SSC oraz wykres punktowy FSC za pomocą kursora myszy. Następnie poczekaj, aż pojawi się kółko P1.Kliknij przycisk bramki interwałowej i zaznacz obszar na histogramie barwionym izotiocyjanianem fluoresceiny. Zaczynając od najwyższej wartości intensywności fluorescencji w prawą stronę. Na ekranie pojawi się linia P2.Kliknij probówkę eksperymentu i obserwuj, że zmieniają się dane na karcie arkusza. Kliknij przycisk statystyk, a następnie puste miejsce i arkusz roboczy. Następnie obserwuj wartości statystyczne populacji polipeptydów kotransportujących taurocholan sodu.Odessać pożywkę ze 100% zlewających się płytek studzienkowych MHC i dodać cztery mikromolowe cyklosporyny A rozcieńczone pożywką E Williama przez dwie godziny. Następnie odessać potencjalny inhibitor wnikania wirusa zapalenia wątroby typu B, aby zastąpić go jednym mililitrem pożywki Williams E zawierającej 4% glikolu polietylenowego. Następnie inkubować pożywkę hodowlaną z cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu B przy wielokrotności infekcji 100 na studzienkę przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie wyrzuć supernatant z dwoma mililitrami zimnego PBS i delikatnie zamieszaj, aby spłukać starą pożywkę z niezwiązanym wirusem zapalenia wątroby typu B. Po wyhodowaniu komórek dwoma mililitrami kompletnego William's E Medium przez siedem dni, umyj komórki PBS i utrwal je 3,7% aldehydem paraform i PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Sekwencyjnie inkubować zakażone komórki z roztworem blokującym IF przez 60 minut w temperaturze pokojowej w przeciwciałie pierwszorzędowym w rozcieńczeniu od jednego do 200 w roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnie wykonać trzy płukania po jedną minutę przy użyciu roztworu do przemywania przed inkubacją komórek z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu od jednego do 500 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym umyciu zamontuj próbkę za pomocą środka do mocowania zapobiegającego blaknięciu za pomocą DAPI i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry DAPI i PE wykryj sygnał fluorescencji za pomocą soczewki obiektywowej o 20 x w celu określenia aktywności anty HBV wprowadzanych przez związki kandydujące.Do testu wiązania komórek należy przygotować komórki, jak pokazano wcześniej, i inkubować je z cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu B w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po wyrzuceniu pożywki przepłukać komórki dwoma mililitrami zimnego PBS delikatnym zawirowaniem. Następnie zbierz zainfekowane komórki za pomocą skrobaka do komórek i rozbij komórki za pomocą buforu do lizy.Przenieś lizat komórkowy do probówki zbiorczej w celu ekstrakcji całkowitego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu warunków temperaturowych opisanych w manuskrypcie. Po przygotowaniu komórek, jak wykazano wcześniej, inkubować hepatocyty w roztworze kwasu taurocholowego sodu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odessać roztwór i trzykrotnie przemyć komórki zimnym HEPES. Następnie dodaj od 300 do 500 mikrolitrów zimnego HEPES, aby zebrać komórki za pomocą skrobaków do komórek na lodzie.Homogenizować komórki za pomocą ultradźwięków w temperaturze 20 kiloherców przez 20 sekund i inkubować na lodzie przez pięć minut. Po odwirowaniu w stężeniu 10 000 G zebrać supernatant i ocenić wewnątrzkomórkowe stężenie kwasu taurocholowego za pomocą zestawu do oznaczania ELISA dla kwasu taurocholowego. Aby umyć komórki i strzykawkę w przyrządzie do izotermicznego miareczkowania, kalorymetrii lub ITC, uruchom oprogramowanie ITC.Na karcie wyróżniania uruchamiania eksperymentu wybierz metodę mikrokalibracji dla 19 punktów iniekcyjnych ITCM i kliknij przycisk Otwórz. Gdy otworzy się nowe okno, kliknij kartę Wyczyść iw oknie metody czyszczenia wybierz przycisk mycia dla metody czyszczenia komórek i przycisk płukania dla metody czyszczenia strzykawki. Kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.Po załadowaniu próbki do ITC kliknij przycisk ładowania znajdujący się pod zakładką uruchamiania eksperymentu. Następnie kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wideo, aż ten krok ładowania zostanie zakończony. Za pomocą strzykawki napełnić komórkę referencyjną buforem roztworu w komorze próbki z 15 mikromolowymi NTCP w buforze.Usuń nadmiar roztworu, a następnie napełnij strzykawkę 150-mikromolowym roztworem ligandu kurkuminy, unikając pęcherzyków powietrza. Uruchom przykład, klikając przycisk uruchamiania na karcie uruchamiania eksperymentu. Informacje eksperymentalne i ustawienia zostaną wyświetlone po lewej stronie.Wprowadź szczegółowe informacje na temat stężenia białek ligandowych i temperatury. Kliknij start, aby wykonać proces wstrzykiwania. Poczekaj 1,4 godziny na zakończenie interakcji liganda białkowego.Po zakończeniu wstrzykiwania wybierz podświetlony przycisk analizy, aby przeanalizować surowe dane za pomocą oprogramowania do analizy. Następnie kliknij na przegląd, aby wyświetlić surowe dane i wybierz model dopasowania jako jeden zestaw miejsca wiązania. Zaobserwowano cechy dojrzewania wątroby, w tym komórki dwujądrowe i morfologię w kształcie wielokąta, zwłaszcza w zróżnicowanym stadium MHC.Duży wzrost ekspresji NTCP zaobserwowano w zróżnicowanym HepaRG i zróżnicowanym MHC. Wysoce glikozylowana forma NTCP została wykryta bardziej w zróżnicowanym MHC niż w zróżnicowanym HepaRG. Poziomy NTCP były wyższe w zróżnicowanych komórkach MHC niż w komórkach niezróżnicowanych.Barwienie immunofluorescencyjne wirusa oceniało aktywność wnikania przeciwciał przeciwko HBV w siódmym dniu po zakażeniu, a poziom wiązania wirusa na receptorze na powierzchni komórki oceniano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Analiza wychwytu kwasu taurocholowego sugerowała, że karna aktywność hamująca związków kandydujących zmniejszała wiązanie wirusa zapalenia wątroby typu B poprzez NTCP. Zmianę kolorymetryczną wykryto przy ciągłym wstrzykiwaniu do komórki próbki.Standardowa nieliniowa regresja metodą najmniejszych kwadratów została wykreślona w oparciu o jedno miejsce wiązania dobrze dopasowane do danych. Linia ciągła wskazywała najlepsze dopasowanie do wartości doświadczalnych dla wiązania SBB jako a oraz że komórki i cząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu B są inkubowane w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aktualizację kwasu taurocholowego można ocenić za pomocą techniki radioaktywnej.Poziom radioaktywnego kwasu taurocholowego można określić ilościowo za pomocą licznika symulacyjnego cieczy. Ta technika jest prosta i szybka do przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem wnikania wirusa do aktywności badawczej dowolnego schematu przeciwwirusowego, który pomógłby zapobiec infekcji lub ponownemu zakażeniu.

a-competent-hepatocyte-model-examining-hepatitis-b-virus-entry

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Film demonstruje test z wykorzystaniem ludzkich komórek macierzystych CD8+ pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w celu zahamowania replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy. Te limfocyty T, zmodyfikowane za pomocą receptorów specyficznych dla HBV, są przenoszone do myszy transgenicznych. Kompetentne replikacyjnie plazmidy genomu HBV są następnie wstrzykiwane bezpośrednio do wątroby, umożliwiając wychwyt DNA wirusa. Gdy antygeny wirusowe ulegną...

Hamowanie replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B za pomocą limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Celem tego protokołu jest dostarczenie przewodnika krok po kroku do przeprowadzenia eksperymentów 3-D z wirusem zapalenia wątroby typu B.

Hodowle "wątroby na chipie" pierwotnych hepatocytów i komórek Kupffera w leczeniu zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B

Ten protokół ma na celu opisanie izolacji hepatocytów świń i dostarczania genów ex vivo w celu leczenia modeli chorób metabolicznych poprzez autologiczny przeszczep komórek. Chociaż ten konkretny model cieszy się wyjątkowymi zaletami, które sprzyjają skutecznej terapii, aplikacja jest istotną podstawą do zajęcia się dodatkowymi chorobami i wskazaniami.

Terapia genowa hepatocytów ex vivo za pośrednictwem wektora lentiwirusowego do autologicznego przeszczepu u świń

Ten protokół opisuje użycie jednołańcuchowych kompleksów MHC klasy I do badania interakcji molekularnych w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8+: generowanie zmodyfikowanych komórek prezentujących antygen wyrażających konstrukty jednołańcuchowe, hodowla klonu ludzkich komórek T CD8+ i eksperymenty z aktywacją limfocytów T.

Zastosowanie technologii jednołańcuchowej MHC do badania koagonizmu w aktywacji ludzkich limfocytów T CD8 +

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Tutaj prezentujemy metodę badania przesiewowego czynników przeciwwirusowych zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1 za pomocą systemu testów z podziałem lucyferazy. System ten pozwala na łatwe wykrywanie oddziaływań białko-białko i nadaje się do identyfikacji inhibitorów takich interakcji.

Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

Opisana tutaj jest skuteczna metoda wytwarzania zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) o wysokim mianie w celu skutecznego infekowania komórek wątroby. Dzięki przedstawionej metodzie można zbierać zarówno bezotoczkowe, jak i otoczkowe cząstki wirusa i wykorzystywać je do inokulacji różnych linii komórkowych.

Model hodowli komórkowej do produkcji zapasów wirusa zapalenia wątroby typu E o wysokim mianie

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Poznaj metodę badania związku kandydackich związków przeciwwirusowych z NTCP przy użyciu kalorymetrii izotermicznej. Protokół umożliwia ocenę skuteczności inhibitorów wnikania wirusa zapalenia wątroby typu B.

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny (Wideo) | JoVE Journal

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Przeglądaj więcej filmów