Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Protokół ten ma na celu sprawdzenie, czy potencjalny związek anty HBV hamuje wnikanie wirusa, zwłaszcza poprzez blokowanie wiązania NTCP. Technika ta ma na celu zbadanie, czy wnikanie wirusa HBV lub początkowy etap zakażenia może zostać przerwany przez którykolwiek z substancji kandydujących. Procedurę zademonstruje Piyanoot Thongsri, student PSP z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć pomiar polipeptydu kotransportującego taurocholan sodu lub NTCP, należy inkubować dojrzałe hepatocyty z ośmioma lub więcej kwasem etylenodiaminotetraoctowym lub EDTA przez 15 minut. Zbierz granulki komórek i napraw hepatocyty, dodając 300 mikrolitrów 3,7% paraformaldehydu do PBS przez 15 minut. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej, aby odwirować je w temperaturze 300 G i 25 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Przemyć komórki dwukrotnie za pomocą 700 mikrolitrów PBS zawierającego 1% płodowej surowicy bydlęcej lub FBS w wirówce przez 10 minut, jak opisano powyżej. Następnie przeniknij komórki 300 mikrolitrami 0,05% Triton X 100 w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po odwirowaniu wykonać trzy płukania po jednej minucie każde, używając 700 mikrolitrów PBS zawierającego 1% FBS.

Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko NTCP w stosunku jeden do 100, a następnie trzy płukania buforem do przemywania trwałej ondulacji i odwirowanie. Wybarwić komórki drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z Alexa Fluor 488 przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i powtórzyć trzy płukania buforem do przemywania trwałej ondulacji przez jedną minutę każde. Po odwirowaniu w stężeniu 300 G ponownie zawiesić osad komórkowy z 200 mikrolitrami PBS zawierającego 1% FBS.

W oprogramowaniu wybierz parametry pomiarowe do analizy cytometrii przepływowej, w tym FSC, SSC, FITC lub PE. Ustaw automatyczną korektę kompensacji i dołącz elementy sterujące kompensacją, jak wyjaśniono w manuskrypcie. Następnie uruchom niebarwioną próbkę ze średnim natężeniem przepływu płynu wynoszącym 60 mikrolitrów na minutę. Dostosuj próg rozproszenia do przodu i do przodu do momentu, aż pokryją populację komórek będących przedmiotem zainteresowania.

Zaznacz region bramki w tym obszarze i zastosuj go do wszystkich kontrolek kompensacji. Ustaw lampę powielacza fotograficznego lub fluorescencję PMT za pomocą niezabarwionego elementu sterującego i wyreguluj napięcie PMT FITC lub PE w ujemnym kwadrancie. Uruchomić dodatnio barwioną próbkę i wyregulować FITC lub PE w dodatniej skali kwadrantowej.

Uruchom kontrole niebarwione, barwione FITC lub PE, oblicz kompensację i zastosuj ją do ustawień próbki. Następnie uruchom próbkę hepatocytów, aby zmierzyć poziom NTCP. Następnie rozpocznij analizę barwionych hepatocytów, wybierając kolejno okna BD FACSuite, probówkę kontrolną, a następnie zakładkę źródła danych.

Poczekaj, aż pojawią się nieprzetworzone dane. Następnie w zakładce arkusza roboczego po prawej stronie kliknij przycisk bramki elipsy, wybierz populację komórek i SSC oraz wykres punktowy FSC za pomocą kursora myszy. Następnie poczekaj, aż pojawi się kółko P1.

Kliknij przycisk bramki interwałowej i zaznacz obszar na histogramie barwionym izotiocyjanianem fluoresceiny. Zaczynając od najwyższej wartości intensywności fluorescencji w prawą stronę. Na ekranie pojawi się linia P2.

Kliknij probówkę eksperymentu i obserwuj, że zmieniają się dane na karcie arkusza. Kliknij przycisk statystyk, a następnie puste miejsce i arkusz roboczy. Następnie obserwuj wartości statystyczne populacji polipeptydów kotransportujących taurocholan sodu.

Odessać pożywkę ze 100% zlewających się płytek studzienkowych MHC i dodać cztery mikromolowe cyklosporyny A rozcieńczone pożywką E Williama przez dwie godziny. Następnie odessać potencjalny inhibitor wnikania wirusa zapalenia wątroby typu B, aby zastąpić go jednym mililitrem pożywki Williams E zawierającej 4% glikolu polietylenowego. Następnie inkubować pożywkę hodowlaną z cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu B przy wielokrotności infekcji 100 na studzienkę przez 18 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie wyrzuć supernatant z dwoma mililitrami zimnego PBS i delikatnie zamieszaj, aby spłukać starą pożywkę z niezwiązanym wirusem zapalenia wątroby typu B. Po wyhodowaniu komórek dwoma mililitrami kompletnego William's E Medium przez siedem dni, umyj komórki PBS i utrwal je 3,7% aldehydem paraform i PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Sekwencyjnie inkubować zakażone komórki z roztworem blokującym IF przez 60 minut w temperaturze pokojowej w przeciwciałie pierwszorzędowym w rozcieńczeniu od jednego do 200 w roztworze blokującym przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie wykonać trzy płukania po jedną minutę przy użyciu roztworu do przemywania przed inkubacją komórek z przeciwciałem drugorzędowym w rozcieńczeniu od jednego do 500 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym umyciu zamontuj próbkę za pomocą środka do mocowania zapobiegającego blaknięciu za pomocą DAPI i przykryj ją szklanym szkiełkiem nakrywkowym. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry DAPI i PE wykryj sygnał fluorescencji za pomocą soczewki obiektywowej o 20 x w celu określenia aktywności anty HBV wprowadzanych przez związki kandydujące.

Do testu wiązania komórek należy przygotować komórki, jak pokazano wcześniej, i inkubować je z cząstkami wirusa zapalenia wątroby typu B w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez dwie godziny. Po wyrzuceniu pożywki przepłukać komórki dwoma mililitrami zimnego PBS delikatnym zawirowaniem. Następnie zbierz zainfekowane komórki za pomocą skrobaka do komórek i rozbij komórki za pomocą buforu do lizy.

Przenieś lizat komórkowy do probówki zbiorczej w celu ekstrakcji całkowitego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy przy użyciu warunków temperaturowych opisanych w manuskrypcie. Po przygotowaniu komórek, jak wykazano wcześniej, inkubować hepatocyty w roztworze kwasu taurocholowego sodu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odessać roztwór i trzykrotnie przemyć komórki zimnym HEPES. Następnie dodaj od 300 do 500 mikrolitrów zimnego HEPES, aby zebrać komórki za pomocą skrobaków do komórek na lodzie.

Homogenizować komórki za pomocą ultradźwięków w temperaturze 20 kiloherców przez 20 sekund i inkubować na lodzie przez pięć minut. Po odwirowaniu w stężeniu 10 000 G zebrać supernatant i ocenić wewnątrzkomórkowe stężenie kwasu taurocholowego za pomocą zestawu do oznaczania ELISA dla kwasu taurocholowego. Aby umyć komórki i strzykawkę w przyrządzie do izotermicznego miareczkowania, kalorymetrii lub ITC, uruchom oprogramowanie ITC.

Na karcie wyróżniania uruchamiania eksperymentu wybierz metodę mikrokalibracji dla 19 punktów iniekcyjnych ITCM i kliknij przycisk Otwórz. Gdy otworzy się nowe okno, kliknij kartę Wyczyść iw oknie metody czyszczenia wybierz przycisk mycia dla metody czyszczenia komórek i przycisk płukania dla metody czyszczenia strzykawki. Kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie.

Po załadowaniu próbki do ITC kliknij przycisk ładowania znajdujący się pod zakładką uruchamiania eksperymentu. Następnie kliknij Dalej i postępuj zgodnie z instrukcjami wideo, aż ten krok ładowania zostanie zakończony. Za pomocą strzykawki napełnić komórkę referencyjną buforem roztworu w komorze próbki z 15 mikromolowymi NTCP w buforze.

Usuń nadmiar roztworu, a następnie napełnij strzykawkę 150-mikromolowym roztworem ligandu kurkuminy, unikając pęcherzyków powietrza. Uruchom przykład, klikając przycisk uruchamiania na karcie uruchamiania eksperymentu. Informacje eksperymentalne i ustawienia zostaną wyświetlone po lewej stronie.

Wprowadź szczegółowe informacje na temat stężenia białek ligandowych i temperatury. Kliknij start, aby wykonać proces wstrzykiwania. Poczekaj 1,4 godziny na zakończenie interakcji liganda białkowego.

Po zakończeniu wstrzykiwania wybierz podświetlony przycisk analizy, aby przeanalizować surowe dane za pomocą oprogramowania do analizy. Następnie kliknij na przegląd, aby wyświetlić surowe dane i wybierz model dopasowania jako jeden zestaw miejsca wiązania. Zaobserwowano cechy dojrzewania wątroby, w tym komórki dwujądrowe i morfologię w kształcie wielokąta, zwłaszcza w zróżnicowanym stadium MHC.

Duży wzrost ekspresji NTCP zaobserwowano w zróżnicowanym HepaRG i zróżnicowanym MHC. Wysoce glikozylowana forma NTCP została wykryta bardziej w zróżnicowanym MHC niż w zróżnicowanym HepaRG. Poziomy NTCP były wyższe w zróżnicowanych komórkach MHC niż w komórkach niezróżnicowanych.

Barwienie immunofluorescencyjne wirusa oceniało aktywność wnikania przeciwciał przeciwko HBV w siódmym dniu po zakażeniu, a poziom wiązania wirusa na receptorze na powierzchni komórki oceniano za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym. Analiza wychwytu kwasu taurocholowego sugerowała, że karna aktywność hamująca związków kandydujących zmniejszała wiązanie wirusa zapalenia wątroby typu B poprzez NTCP. Zmianę kolorymetryczną wykryto przy ciągłym wstrzykiwaniu do komórki próbki.

Standardowa nieliniowa regresja metodą najmniejszych kwadratów została wykreślona w oparciu o jedno miejsce wiązania dobrze dopasowane do danych. Linia ciągła wskazywała najlepsze dopasowanie do wartości doświadczalnych dla wiązania SBB jako a oraz że komórki i cząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu B są inkubowane w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aktualizację kwasu taurocholowego można ocenić za pomocą techniki radioaktywnej.

Poziom radioaktywnego kwasu taurocholowego można określić ilościowo za pomocą licznika symulacyjnego cieczy. Ta technika jest prosta i szybka do przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem wnikania wirusa do aktywności badawczej dowolnego schematu przeciwwirusowego, który pomógłby zapobiec infekcji lub ponownemu zakażeniu.