Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy
October 3rd, 2025
Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.
Nasze badania badają, w jaki sposób mikroglej wpływa na naprawę mózgu po prenatalnym uszkodzeniu mózgu. Naszym celem jest ustalenie, czy modulowanie aktywności komórek mikrogleju może poprawić długoterminowe wyniki neurologiczne. Uważam, że jest to złożoność odpowiedzi komórek mikrogleju i wyzwania związane z opisaniem tych reakcji w najdokładniejszy sposób, aby odzwierciedlić fizjologiczne, ale także patologiczne reakcje i choroby.
Używamy różnych metod, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i eksperymenty z cytometrią przepływową, aby scharakteryzować stany mikrogleju i funkcję w rozwijającym się mózgu po urazie prenatalnym. Głównym wyzwaniem jest zachowanie żywotności komórek i tożsamości mikrogleju podczas izolacji, zwłaszcza w punktach czasowych noworodków, kiedy liczba komórek móżdżku jest ograniczona. Rodzi to pytania o to, w jaki sposób uszkodzenia móżdżku we wczesnym okresie życia prowadzą do zmian transkrypcji w subpopulacji mikrogleju i jak terapie celowane mogą modulować te zmiany.
Aby rozpocząć, w razie potrzeby przeanalizuj określony obszar mózgu myszy. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na małą szalkę Petriego zawierającą pożywkę do hodowli komórek mikrogleju umieszczoną na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek. Za pomocą pipety usunąć pożywkę do hodowli komórek mikrogleju z szalki Petriego.
Następnie, za pomocą skalpela, drobno przeciąć tkankę mózgową na tej samej szalce Petriego. Przenieś homogenizowaną tkankę mózgową do pięciomililitrowych probówek w celu trawienia enzymatycznego. Dodaj dwa mililitry zbilansowanego roztworu soli Hanksa uzupełnionego kolagenazą D i DNazą 1 do każdej probówki i szczelnie zamknij nakrętki Parafilmem.
Następnie inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, potrząsając nimi co pięć minut. Aby zatrzymać trawienie, umieść rurki na lodzie. Następnie przepuść homogenat przez metalowy filtr siatkowy o grubości 140 mikrometrów, aby usunąć duże zanieczyszczenia.
Za pomocą szklanego tłuczka delikatnie oddziel pozostałe komórki na filtrze. Kilkakrotnie umyj metalowy filtr siatkowy trzema mililitrami pożywki do hodowli komórek mikrogleju na każde mycie. Teraz za pomocą 10-mililitrowej pipety zbierz filtrat i przenieś go do 15-mililitrowej probówki.
Następnie odwiruj probówkę o masie 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant. Za pomocą stojaka delikatnie zeskrob rurkę, aby ponownie zawiesić pellet.
Następnie dodaj 10 mililitrów 37% roztworu pożywki koloidalnej na bazie krzemionki do zawieszonych komórek. Odwiruj roztwór o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy minimalnej sile zrywającej. Za pomocą 10-mililitrowej pipety odessać warstwę mieliny od góry roztworu.
Aby umyć komórki, dodaj 10 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanksa i odwiruj probówkę z 500 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu i ponownym zawieszeniu osadu, dodać do probówki 10 mililitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Po odwirowaniu ponownie zawiesić końcowe osady w pozostałym buforze do dalszych zastosowań.
Przenieś wszystkie wyizolowane komórki na 96-dołkową płytkę ze stożkowym dnem. Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko odwróć płytkę jednym ruchem, aby wyrzucić supernatant.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 25 mikrolitrach roztworu blokującego i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby przygotować zewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, należy odwirować probówki z przeciwciałami o masie 10 000 g w celu usunięcia agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu.
Używając aktywowanego fluorescencyjnie bufora do sortowania komórek, dostosuj całkowitą objętość do 25 mikrolitrów. Teraz dodaj 25 mikrolitrów zewnątrzkomórkowej mieszanki barwiącej przeciwciała do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodać 150 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki.
Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie szybko odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem. Zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek i odwirować, jak pokazano wcześniej.
Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu saponinowo-paraformaldehydowego, aby utrwalić i przeniknąć komórki. Następnie inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Bez mieszania dodaj 100 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki.
Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem i ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu saponin. Następnie przygotuj kontrole kompensacyjne, dodając 20 mikrolitrów koralików do 11 pustych studzienek.
Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, odwirować probówki z przeciwciałami o wadze 10 000 g w celu usunięcia potencjalnych agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu. Dostosuj objętość do 50 mikrolitrów za pomocą buforu saponinowego.
Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 50 mikrolitrach wewnątrzkomórkowej mieszanki przeciwciał. Dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała do odpowiednich studzienek perełkowych i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodaj 150 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki zawierającej próbki komórek.
Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki kompensacyjnej, aby umyć kulki. Po odwirowaniu płytki ponownie zawiesić osad komórkowy i kontrole odpowiednio w 200 mikrolitrach buforu saponin i aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.
Ponownie zawiesić zarówno próbki komórek, jak i kontrole kompensacyjne w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Przenieść zawiesiny do znakowanych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki zidentyfikowało odrębny klaster mikrogleju oddzielony od innych typów komórek mózgowych na podstawie profili transkrypcyjnych.
Analiza ekspresji różnicowej ujawniła znacznie podwyższoną regulację genów w mikrogleju, w tym Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 i P2ry12. Komórki mikrogleju udało się wyizolować z żywych próbek mózgu w oparciu o ich wyraźną ekspresję markerów CD45 i CD11b. Odrębne subpopulacje mikrogleju zidentyfikowano na podstawie kombinacji markerów aktywacji, w tym CD80, CD86, iNOS, CD206 i Arg1, CD86 i CD64 oraz CD163 z CD206.
Ekspresja genów markerowych Ptprc i Itgam została zlokalizowana specyficznie w klastrze mikrogleju w projekcji umap, potwierdzając tożsamość tych komórek. Analiza wykresu skrzypcowego wykazała niższą ekspresję markerów przeciwzapalnych, takich jak Fcgr1 i Cd86, w leczonym mikrogleju w porównaniu z kontrolą nośnika.
Przegląd
Ten protokół łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek w celu izolowania i charakteryzacji stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Zastosowano dysocjację enzymatyczną i centryfugację Percoll, wraz z immunobarwieniem, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju, zwiększając rozumienie ich ról w rozwoju i chorobach móżdżku.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
Tło
- Mikroglej jest kluczowym elementem w rozwoju i funkcjonowaniu mózgu.
- Rozumienie dynamiki mikrogleju może wyjaśnić ich role w różnych chorobach.
- Charakteryzacja stanów mikrogleju jest istotna dla opracowania ukierunkowanych terapii.
- Analizy pojedynczych komórek dostarczają wglądu w heterogeniczność komórkową.
Cel badania
- Izolowanie i charakteryzowanie stanów mikrogleju w móżdżku.
- Zwiększenie rozumienia roli mikrogleju w rozwoju mózgu.
- Wspieranie wiedzy dotyczącej zaangażowania mikrogleju w procesy chorobowe.
Zastosowane metody
- Główną zastosowaną platformą jest cytometria przepływowa połączona z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych komórek.
- Modelem biologicznym są wczesne postnatalne mózgi myszy, koncentrujące się na mikrogleju móżdżku.
- Ważnymi krokami są dysocjacja enzymatyczna i centryfugacja Percoll w celu izolowaniu komórek.
- Zastosowano techniki immunobarwienia do dalszej analizy cech mikrogleju.
Główne wyniki
- Badanie z powodzeniem izolowała stany komórek mikrogleju, ujawniając ich heterogeniczność.
- Uzyskano wgląd w role mikrogleju podczas rozwoju móżdżku.
- Zwiększono zrozumienie implikacji mikrogleju w mechanizmach chorobowych.
Wnioski
- To badanie demonstruje solidną metodologię analizy stanów mikrogleju.
- Wnosi znaczący wkład w zrozumienie mechanizmów neuronowych i potencjalnych modeli chorobowych.
- Wyniki mogą przełożyć się na przyszłe strategie terapeutyczne ukierunkowane na funkcje mikrogleju.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution characterization of microglial activation states in early postnatal mouse brain development is critical for de-risking neuroinflammation targets and understanding developmental mechanisms. Integrating flow cytometry and single-cell RNA sequencing enables robust, quantitative profiling of microglial heterogeneity, supporting predictive confidence in target validation and translational research. These methods provide a reproducible framework for advancing neuroimmune discovery programs and informing portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microglial activation states and population diversity.
- Supports functional target validation by linking surface marker expression to transcriptomic profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways in early development.
- Provides quantitative data for triaging neuroinflammation targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated cell isolation and gating strategies for reproducible microglia assays.
- Standardizes live/dead discrimination and marker profiling for downstream screening workflows.
- Enables scalable preparation of high-quality neural cell suspensions for compound evaluation.
- Supports platform reuse across multiple experimental conditions and perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial phenotyping with disease-relevant transcriptomic signatures.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of neurodevelopmental and neurodegenerative models.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in microglia-driven pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-method workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling robust microglial profiling from cell isolation to transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and diversity during brain development.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for microglial marker expression and viability.
- Analytics: Delivers high-dimensional single-cell data and differential gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects microglial phenotypes to disease-relevant states and experimental perturbations.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse brain regions and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of microglial profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, single-cell RNA sequencing, and neural tissue handling.
- Demands access to advanced instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell isolation and gating protocols.
- Adaptable to other brain regions with protocol optimization for tissue-specific characteristics.
- Dependent on validated antibodies and careful control of cell viability and state during processing.
