Name: Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj cytometrię przepływową i analizę pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy. Ta metoda pozwala zrozumieć rolę mikrogleju w rozwoju mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (487354) oraz Fonds de Recherche du Québec (333845).

<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie występuje konflikt interesów.

Badanie to przedstawia szczegółowy i zoptymalizowany protokół, który łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) w celu izolacji i charakterystyki komórek mikrogleju podczas wczesnego rozwoju mózgu po urodzeniu. Chociaż cytometria przepływowa pozostaje opłacalną i dostępną techniką, jej integracja z transkryptomiką pojedynczych komórek zapewnia uzupełniające informacje poprzez powiązanie ekspresji markerów na poziomie białka z profilami transkrypcyjnymi na poziomie genu. Protokół odnosi się do wyzwań technicznych specyficznych dla niedojrzałej tkanki mózgowej, w tym skutecznej dysocjacji, usuwania zanieczyszczeń i mieliny oraz zoptymalizowanych strategii barwienia immunologicznego, aby zapewnić odtwarzalność i wiarygodność w analizie populacji mikrogleju w kluczowych punktach czasowych rozwoju.
Cytometria przepływowa została wykorzystana do identyfikacji podzbiorów mikrogleju na podstawie ekspresji wybranych markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Zamiast wnioskować o stanach funkcjonalnych, podzbiory rozróżniano na podstawie ich profili ekspresji markerów, takich jak CD80+/CD86+/iNOS+ ; CD206+/ARG1+ ; Fenotypy CD86+/CD64+ lub CD163+/CD206+ . Te zdefiniowane markerami populacje odzwierciedlają heterogeniczność molekularną w obrębie przedziału mikrogleju i zapewniają praktyczne podejście do wysokoprzepustowej charakterystyki. Chociaż te klasyfikacje oparte na markerach powierzchniowych mogą nie oddawać pełnej złożoności różnorodności mikrogleju, pozostają pouczające, zwłaszcza w kontekstach, w których wielowymiarowe narzędzia molekularne mogą nie być dostępne. Celowo unikano klasyfikacji binarnych, takich jak paradygmat M1/M2, ze względu na widmowy, zależny od kontekstu charakter fenotypów mikrogleju, jak opisano w najnowszej literaturze12.
Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami podkreślającymi rolę mikrogleju zarówno w prawidłowym dojrzewaniu mózgu, jak i w odpowiedzi na bodźce środowiskowe lub patologiczne13,14. Zdolność do różnicowania heterogeniczności mikrogleju dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób polaryzacja komórek mikrogleju może przyczyniać się do zaburzeń neurorozwojowych15,16.
Chociaż sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje wyższą rozdzielczość i umożliwia identyfikację odrębnych transkrypcyjnie subpopulacji komórek mikrogleju, jego koszt i złożoność analityczna ograniczają jego dostępność. W obecnym zestawie danych zebranym w 15. dniu po urodzeniu po urazie okołoporodowym szczyt odpowiedzi zapalnej jest w dużej mierze ustąpiony, co skutkuje niską liczbą aktywowanego mikrogleju. W związku z tym techniki redukcji wymiarowości, takie jak UMAP, nie pozwoliły na odzyskanie dobrze oddzielonych podklastrów mikrogleju, a analiza transkrypcyjna na poziomie klastra nie została uwzględniona w tym manuskrypcie protokołu.
Istotną innowacją tego protokołu jest jego optymalizacja pod kątem izolowania i charakteryzowania komórek mikrogleju z móżdżku we wczesnych stadiach postnatalnych (P3 do P30). Ten region i kontekst specyficzny dla wieku stanowią wyraźne wyzwania, w tym niską wydajność komórek, zawartość mieliny i zwiększoną kruchość tkanek. Aby rozwiązać te problemy, protokół łączy dostosowany przebieg dysocjacji, skuteczne usuwanie zanieczyszczeń i mieliny oraz starannie dostrojone warunki barwienia immunologicznego odpowiednie dla tkanki móżdżku o małej objętości. Pomimo coraz powszechniejszego uznawania mikrogleju móżdżku za funkcjonalnie i transkrypcyjnie odrębny od tych w innych obszarach mózgu, szczegółowe protokoły ich izolacji i analizy pozostają ograniczone. Obecna metoda oferuje niezawodny i dostępny przebieg pracy, szczególnie dostosowany do badań rozwojowych mikrogleju móżdżku.
Głównym celem tego manuskryptu jest zapewnienie powtarzalnych i elastycznych ram metodologicznych, a nie przedstawienie konkretnych odkryć biologicznych. Przepływ pracy nadaje się do adaptacji do innych etapów rozwojowych lub modeli eksperymentalnych, w których transkrypcyjnie odmienne stany mikrogleju mogą być bardziej widoczne. W takich kontekstach cytometria przepływowa pozostaje cennym narzędziem, zwłaszcza gdy jest zintegrowana z testami uzupełniającymi.
Jedną z kluczowych zalet tego protokołu jest jego zdolność adaptacji na różnych etapach rozwoju, od 3. dnia po urodzeniu (P3) do 30. dnia po urodzeniu (P30). Pozwala to na podłużną analizę fenotypu mikrogleju w miarę postępu dojrzewania mózgu. Połączone zastosowanie cytometrii przepływowej i sekwencjonowania scRNA umożliwia badanie nie tylko markerów powierzchniowych, ale także wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w komórki mikrogleju.
Niemniej jednak trawienie enzymatyczne może wpływać na ekspresję niektórych markerów powierzchniowych, co wymaga starannej optymalizacji warunków trawienia dla określonych celów eksperymentalnych 17,18. Ponadto ani cytometria przepływowa, ani sekwencjonowanie pojedynczych komórek nie dostarczają danych na poziomie populacji, które mogą nie uchwycić w pełni przestrzennych i funkcjonalnych niuansów interakcji komórek mikrogleju w ich natywnym środowisku. Włączenie technik przestrzennych pojedynczych komórek może pomóc w rozwiązaniu tego problemu poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego komórek mikrogleju. Przyszłe badania łączące ten protokół z technikami obrazowania, takimi jak immunohistochemia, obrazowanie in vivo, western blot lub transkryptomika przestrzenna pojedynczej komórki, mogą dostarczyć uzupełniających informacji na temat dynamiki komórek mikrogleju.
Metoda ta otwiera nowe możliwości badania, w jaki sposób urazy we wczesnym okresie życia, takie jak stan zapalny, niedotlenienie lub stresory środowiskowe, wpływają na fenotypy komórek mikrogleju i przyczyniają się do długoterminowych wyników neurorozwojowych. Umożliwiając precyzyjną i wiarygodną charakterystykę stanów aktywacji komórek mikrogleju, ułatwia identyfikację celów terapeutycznych w celu modulowania odpowiedzi mikrogleju we wczesnym okresie życia, mając na celu zapobieganie zaburzeniom neurorozwojowym lub ich łagodzenie.
Podsumowując, protokół ten oferuje solidne i dostępne ramy do badania różnorodności komórek mikrogleju we wczesnym rozwoju mózgu. Połączenie cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki pozwala na elastyczne zastosowanie na różnych etapach rozwoju i modelach eksperymentalnych, ułatwiając głębszą eksplorację biologii mikrogleju zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym.

Wczesny okres poporodowy jest krytyczną fazą rozwoju mózgu, charakteryzującą się złożonymi procesami komórkowymi i molekularnymi, które stanowią podstawę funkcji poznawczych, emocjonalnych i behawioralnych1. Jednak okres ten jest również naznaczony podatnością, ponieważ zakłócenia mogą zmienić trajektorie neurorozwojowe i prowadzić do długotrwałych zaburzeń neurologicznych lub psychiatrycznych. Mikroglej, rezydujące w mózgu komórki odpornościowe, odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu rozwijającego się mózgu poprzez przycinanie synaptyczne, fagocytozę, nadzór immunologiczny i reakcje na zniewagi środowiskowe 2,3. Komórki te wykazują niezwykłą plastyczność, przyjmując profile transkrypcyjne, które różnią się w zależności od regionu mózgu, etapu rozwoju i kontekstu patologicznego 4,5.
Dokładna analiza aktywacji mikrogleju w rozwijającym się mózgu wymaga solidnych i powtarzalnych metodologii zdolnych do analizy ich dynamicznych fenotypów w kontekście niedojrzałych tkanek mózgowych. Cytometria przepływowa stanowi niezawodne rozwiązanie, umożliwiające wysokoprzepustową charakterystykę populacji komórkowych i ekspresję markerów6. Jednak jego zastosowanie w badaniu mikrogleju z mózgów wczesnych postnatalnych jest technicznie trudne ze względu na delikatną naturę tkanki i potrzebę skutecznych protokołów izolacji i wzbogacania komórek 7,8.
Przedstawiony tutaj protokół łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) w celu wyizolowania i scharakteryzowania mikrogleju z wczesnych postnatalnych mózgów myszy, ze szczególnym uwzględnieniem móżdżku od 3. dnia po urodzeniu (P3) do 30. dnia po urodzeniu (P30)9, regionu i etapu rozwoju, dla którego szczegółowe odniesienia metodologiczne pozostają ograniczone. 
Ten przepływ pracy obejmuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie w gradionym gradieniu gęstości w celu usunięcia zanieczyszczeń i wzbogacenia komórek oraz barwienie immunologiczne przy użyciu panelu markerów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Aby scharakteryzować różnorodność mikrogleju, stosuje się szereg markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych10,11. Zamiast przypisywać stałe znaczniki (zapalne lub naprawcze), protokół definiuje subpopulacje w oparciu o dyskretne profile ekspresji markerów. Na przykład mikroglej z ekspresją CD80, CD86 i iNOS, CD206 i Arg1, CD86 i CD64 lub CD163 i CD206 są identyfikowane i analizowane jako molekularnie odrębne podzbiory. Markery te odzwierciedlają różne aktywowane stany mikrogleju10,11 i są prezentowane jako profile ekspresji.
Ta wieloparametryczna strategia bramkowania umożliwia precyzyjną identyfikację podzbiorów mikrogleju w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych, oferując usprawnione ramy do analizy heterogeniczności immunologicznej podczas poporodowego rozwoju mózgu. Aby rozszerzyć profilowanie fenotypowe i odkryć różnorodność transkrypcyjną, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki przeprowadza się po izolacji komórki. Badanie to ustanawia spójny i skalowalny przepływ pracy w celu pogłębienia wiedzy na temat procesów neurorozwojowych i długoterminowego wpływu aktywacji mikrogleju. Integrując zoptymalizowaną cytometrię przepływową i sekwencję scRNA w ramach opartych na rozwoju i regionie, protokół ten służy jako potężne narzędzie do badania biologii mikrogleju we wczesnym okresie życia i jej znaczenia dla wyników neurorozwojowych.

<table><tbody><tr><td>140 i mikro; M Filtr z siatki metalowej&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Zobacz materiał S3895 powiedział:</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 5 ml</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa ze stożkowym dnem&nbsp;</td><td>Sarstedt powiedział:</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>Arginaza 1 - Sprzężony Pecy7 - Klon : A1exF5</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki fluorescencyjne stabilne laboratoryjnie</td><td>Invitrogen</td><td>Numer referencyjny A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - Sprzężony Fitc - Klon : M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - Sprzężony SB600 - Klon : TNKUPJ</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206 - Sprzężony APC - Klon : C068C2</td><td>Legenda biologiczna</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - Sprzężony A700 - Klon : 30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64 - Sprzężenie&nbsp; PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - Sprzężony SB436 - Klon : 16-10A1</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - Sprzężony Pe - Klon : GL-1</td><td>Legenda biologiczna</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma&ndash; Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca (FBS)</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (zbilansowany roztwór soli Hanka) 10x</td><td>Bioprodukty żubra&nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>VWR Polska</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPESY</td><td>Bioprodukty żubra&nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - Sprzężony PE- eF610 - Klon : CXNFT</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>Kcl</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Żywy/martwy amcyjan</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Pożywki do hodowli komórek mikrogleju</td><td>Technologie życiowe</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Zawartość NaCl</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał P6148</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty mysz CD16/CD32</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma&ndash; Aldrich&nbsp;</td><td>Zobacz materiał S7900</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteki scRNAseq</td><td>10X Genomika</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże koloidalne na bazie krzemionki</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td>Zobacz materiał BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Gibco (firma Gibco)</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

Mikroglej, rezydujące w mózgu komórki odpornościowe, wykazują profile transkrypcyjne specyficzne dla regionu i kontekstu podczas rozwoju i choroby. Protokół ten przedstawia dwie uzupełniające się metody badania populacji mikrogleju w tkance móżdżku myszy: cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.
Jako pierwsza zastosowana metoda, protokół oparty na cytometrii przepływowej jest zoptymalizowany pod kątem mózgów we wczesnym okresie poporodowym, zapewniając solidną izolację komórek i spójność w warunkach eksperymentalnych. Rozpoczyna się od dysocjacji tkanek za pomocą trawienia enzymatycznego, a następnie usuwania mieliny poprzez wirowanie w gradiacji gęstości Percoll w celu uzyskania wysokiej jakości zawiesiny komórek nerwowych oraz strategii bramkowania opartej na ekspresji CD45 i CD11b. Barwienie żywe/martwe zapewnia żywotność komórek, a przeciwciała sprzężone z fluorochromem są wykorzystywane do profilowania ekspresji wybranych markerów powierzchniowych na mikrogleju. Kontrole kompensacyjne są wykonywane przy użyciu kulek lateksowych ze zwalidowanymi strategiami bramkowania przy użyciu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).
Druga metoda polega na sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki przy użyciu 10X Genomics, zgodnie z tymi samymi etapami izolacji, które umożliwiają profilowanie transkryptomiczne mikrogleju w różnych warunkach. Klastry mikrogleju identyfikuje się za pomocą analizy ekspresji genów, a analizę różnicową ekspresji przeprowadza się między grupami eksperymentalnymi. Losowy klasyfikator lasu jest stosowany wyłącznie do rozróżniania próbek męskich i żeńskich podczas multipleksowania.
Razem, te powtarzalne i adaptowalne protokoły zapewniają solidne ramy do badania różnorodności mikrogleju w móżdżku podczas wczesnego rozwoju mózgu i jego potencjalnych zmian w wyniku eksperymentalnych perturbacji.

Protokół ten skutecznie wykorzystuje cytometrię przepływową do scharakteryzowania populacji komórek mikrogleju w próbkach mózgu myszy, w oparciu o ekspresję wybranych markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Poniższe sekcje szczegółowo opisują wyniki uzyskane z kluczowych etapów przepływu pracy, podkreślając rozmieszczenie i niejednorodność podzbiorów mikrogleju w odpowiedzi na warunki eksperymentalne.
Walidacja strategii kompensacji i bramkowania Kulki kompensacyjne wykorzystano do kalibracji sygnałów fluorescencyjnych i skorygowania nakładania się widmowego między fluorochromami. Populacje dodatnie i ujemne dla każdego fluorochromu zostały wyraźnie oddzielone, co umożliwiło dokładne wygenerowanie matrycy kompensacyjnej. Progi bramkowania zostały początkowo zweryfikowane przy użyciu kontroli Fluorescence Minus One (FMO) podczas optymalizacji panelu, aby odróżnić prawdziwy sygnał od tła, szczególnie w przypadku słabych lub nakładających się znaczników. Progi te zostały następnie ponownie wykorzystane w eksperymentach przy użyciu tych samych ustawień panelu barwienia i cytometru, aby zapewnić spójność. Włączono kontrole izotypu w celu monitorowania potencjalnego niespecyficznego wiązania, szczególnie w przypadku markerów wewnątrzkomórkowych, ale nie były one wykorzystywane do podejmowania decyzji o bramkowaniu.
Identyfikacja komórek mikrogleju Strategia bramkowania komórek żywych/martwych (Amcyjan) skutecznie wykluczyła martwe komórki. Strategia bramkowania skutecznie izolowała populacje komórek mikrogleju w oparciu o ekspresję CD45 (AF700) i CD11b (FITC). Parametry rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) zostały zoptymalizowane (FSC = 300, SSC = 200) w celu wyśrodkowania populacji mikrogleju na wykresie kropkowym (ryc. 5).
Fenotypowanie komórek mikrogleju Analiza wykresu punktowego umożliwiła identyfikację subpopulacji mikrogleju w oparciu o zróżnicowaną ekspresję markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Korzystając ze specyficznych strategii bramkowania w oprogramowaniu FlowJo, zidentyfikowano podzbiór komórek mikrogleju wyrażających CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) i iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). Podwójne bramkowanie wykorzystano również do zdefiniowania podzbiorów wyrażających CD206 (APC) i Arg1 (PE-Cy7) (patrz rysunek 6B). Dodatkowe populacje charakteryzowały się koekspresją CD86 (PE) i CD64 (PerCP-eFluor 710), a także CD163 (Super Bright 600) i CD206 (APC) (Figura 6C, D). Te profile fenotypowe odzwierciedlają zdefiniowaną markerami heterogeniczność w populacji mikrogleju i pokazują zdolność tego protokołu do rozróżniania wielu podzbiorów odrębnych transkrypcyjnie i immunologicznie bez wnioskowania o ustalonych stanach funkcjonalnych.
Analiza pojedynczych komórek mikrogleju Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wykorzystano do wizualizacji heterogeniczności komórkowej i identyfikacji klastrów komórek mikrogleju wśród innych typów komórek mózgowych. Każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę, a klaster jest oznaczony kolorem na podstawie podobieństwa transkrypcji (rysunek 2).
Przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji w klastrze mikrogleju w celu zidentyfikowania genów modulowanych w warunkach eksperymentalnych. Geny o skorygowanej wartości P ≤ 0,05 uznano za wyrażone w różny sposób.
Wygenerowano wykres wulkanu, aby zobrazować te geny o zróżnicowanej ekspresji komórek mikrogleju, podkreślając te z dużą zmianą krotności i istotnością statystyczną (ryc. 4).
Aby porównać wyniki tych pojedynczych komórek z danymi cytometrii przepływowej, zbadano ekspresję markerów mikrogleju CD45 i CD11b (Ptprc i Itgam). UMAP pokazuje ich ekspresję w różnych populacjach komórek (ryc. 7).
Na koniec oceniono ekspresję wybranych markerów związanych z odpornością w celu scharakteryzowania heterogeniczności transkrypcji wśród komórek mikrogleju. Wykres skrzypcowy przedstawia ekspresję genów, takich jak CD80 i NOS-, a także Mrc1, Arg1, Fcgr1 i CD163 na poziomie pojedynczej komórki (ryc. 8). Te wzorce ekspresji markerów pozwalają na porównanie z profilowaniem opartym na cytometrii przepływowej i podkreślają różnorodność molekularną podzbiorów mikrogleju w warunkach eksperymentalnych.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Kontrola jakości danych transkryptomicznych z pojedynczej komórki. (A) Dystrybucja zawartości mitochondrialnego RNA w komórkach. Komórki z &gt;30% mitochondrialnym RNA zostały wykluczone w celu usunięcia potencjalnie zestresowanych lub umierających komórek. (B) Komórki o log10GenesPerUMI &gt; 0,75 zostały odfiltrowane, aby zapewnić stały stosunek genów do UMI i zredukować szum z bibliotek o niskiej złożoności. (C) Komórki z mniej niż 500 wykrytymi transkryptami (nUMI) lub więcej niż 300 wykrytymi genami (nGENE) zostały również wykluczone w celu wyeliminowania komórek o niskiej jakości lub wielu komórek. (D) Wykres korelacji NUMI w stosunku do nGene ilustrujący wpływ progów filtrowania. Wykryte dublety zostały usunięte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Wizualizacja UMAP transkryptomów jednokomórkowych. Wykres UMAP przedstawiający rozmieszczenie pojedynczych komórek na podstawie profili transkryptomicznych uzyskanych od dwóch pojedynczych zwierząt. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę oznaczoną kolorem według tożsamości klastra. Klaster komórek mikrogleju jest identyfikowany wśród innych populacji komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Krzywa ROC klasyfikatora lasu losowego oceniana za pomocą walidacji krzyżowej. Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) ilustrująca wydajność modelu Random Forest używanego do odróżniania mikrogleju od innych typów komórek mózgowych na podstawie profili ekspresji genów. Model został przeszkolony na zestawie ~1000 komórek ze znanymi etykietami i oceniony przy użyciu 10-krotnej walidacji krzyżowej. Spośród pięciu testowanych modeli statystycznych (las losowy, regresja logistyczna, naiwny algorytm Bayesa, maszyna wektorów nośnych i drzewo decyzyjne) model lasu losowego osiągnął najwyższą wydajność klasyfikacji. Pole pod krzywą (AUC) odzwierciedla dokładność modelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg"> 
Rycina 4: Różnicowa analiza ekspresji genów w komórkach mikrogleju. Wykres wulkaniczny reprezentujący log2-krotną zmianę w funkcji skorygowanej wartości P dla genów różnie wyrażanych w mikrogleju między dwiema grupami eksperymentalnymi (kontrola vs. uszkodzenie mózgu móżdżku). Gen o podwyższonej regulacji jest bardziej ekspresjonowany w grupie zainteresowania (ident.1), a geny o obniżonej regulacji wykazują zmniejszoną ekspresję w porównaniu z grupą referencyjną (ident.2). Znakowane są kluczowe geny o istotnej zróżnicowanej ekspresji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg"> 
Rycina 5: Strategia bramkowania do identyfikacji mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Strategia bramkowania zastosowana do komórek móżdżku od myszy kontrolnej po urodzeniu 3 dnia (P3). (B) Podkoszulki zostały wybrane tak, aby wykluczyć dublety. (C) Żywe komórki zidentyfikowano za pomocą barwnika żywotności; zdarzenia o niskim FSC-A zostały wykluczone w celu usunięcia zanieczyszczeń i zapewnienia analizy nienaruszonych komórek. (D) Mikroglej zidentyfikowano jako CD45 + i CD11b + z dwiema odrębnymi populacjami: CD45o niskiej zawartości CD11bdla spoczynkowego mikrogleju i CD45int -CD11bwysoki dla aktywowanego mikrogleju. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg"> 
Rysunek 6. Charakterystyka profili ekspresji markerów mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Sekwencyjne bramkowanie komórek CD45 + CD11b + w oparciu o ekspresję CD80, CD86 i iNOS. (B) Identyfikacja podzbioru wyrażającego CD206, po którym następuje bramkowanie na podstawie wyrażenia Arg1. (C) Identyfikacja podzbioru wyrażającego CD86, a następnie bramkowanie oparte na ekspresji CD64. (D) Identyfikacja podzbioru eksprymującego CD163, a następnie bramkowanie na podstawie ekspresji CD206. Te strategie bramkowania ilustrują fenotypową heterogeniczność populacji mikrogleju w oparciu o powierzchniową i wewnątrzkomórkową ekspresję markerów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg"> 
Rycina 7: Potwierdzenie tożsamości mikrogleju za pomocą ekspresji Itgam i Ptprc w danych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. UMAP wyświetla krajobraz transkrypcyjny komórek móżdżku w P15, z ekspresją genów Itgam i Ptprc nałożoną na klastry. Koekspresja tych kanonicznych markerów szpikowych wspiera identyfikację populacji mikrogleju i jest zgodna z markerami stosowanymi w cytometrii przepływowej, zapewniając walidację krzyżową między analizami transkryptomicznymi i na poziomie białka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg"> 
Rycina 8: Profile ekspresji wybranych genów związanych z odpornością w komórkach mikrogleju zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Wykresy skrzypcowe pokazują rozkład ekspresji genów CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 i CD163 w poszczególnych komórkach mikrogleju. Markery te są powszechnie związane z procesami związanymi z układem odpornościowym i ilustrują niejednorodność transkrypcji obserwowaną w populacji mikrogleju. Przedstawiono dane dotyczące zarówno stanu kontrolnego, jak i uszkodzenia mózgu móżdżku (CBI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1: Skład roztworów stosowanych do izolacji i barwienia komórek nerwowych. Poniższa tabela zawiera szczegółowy skład roztworów wymaganych do izolacji i barwienia komórek, w tym ich odpowiednie stężenia i składniki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 2: Stężenia mieszaniny przeciwciał do barwienia zewnątrzkomórkowego. Poniższa tabela zawiera szczegółowe informacje na temat stężeń przeciwciał i żywego/martwego roztworu stosowanego do barwienia zewnątrzkomórkowego, określając wymagane objętości i rozcieńczenia dla każdego przeciwciała w mieszaninie barwiącej dla jednej próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela 3: Stężenia mieszaniny przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego. Poniższa tabela zawiera szczegółowe informacje na temat stężeń przeciwciał stosowanych do barwienia wewnątrzkomórkowego, określając wymagane objętości i rozcieńczenia dla każdego przeciwciała w mieszaninie barwiącej dla jednej próbki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Microglia, the brain's resident immune cells, exhibit region and context-specific transcriptional profiles during development and disease. This protocol ...

Nasze badania badają, w jaki sposób mikroglej wpływa na naprawę mózgu po prenatalnym uszkodzeniu mózgu. Naszym celem jest ustalenie, czy modulowanie aktywności komórek mikrogleju może poprawić długoterminowe wyniki neurologiczne. Uważam, że jest to złożoność odpowiedzi komórek mikrogleju i wyzwania związane z opisaniem tych reakcji w najdokładniejszy sposób, aby odzwierciedlić fizjologiczne, ale także patologiczne reakcje i choroby.Używamy różnych metod, takich jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki i eksperymenty z cytometrią przepływową, aby scharakteryzować stany mikrogleju i funkcję w rozwijającym się mózgu po urazie prenatalnym. Głównym wyzwaniem jest zachowanie żywotności komórek i tożsamości mikrogleju podczas izolacji, zwłaszcza w punktach czasowych noworodków, kiedy liczba komórek móżdżku jest ograniczona. Rodzi to pytania o to, w jaki sposób uszkodzenia móżdżku we wczesnym okresie życia prowadzą do zmian transkrypcji w subpopulacji mikrogleju i jak terapie celowane mogą modulować te zmiany.Aby rozpocząć, w razie potrzeby przeanalizuj określony obszar mózgu myszy. Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na małą szalkę Petriego zawierającą pożywkę do hodowli komórek mikrogleju umieszczoną na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek. Za pomocą pipety usunąć pożywkę do hodowli komórek mikrogleju z szalki Petriego.Następnie, za pomocą skalpela, drobno przeciąć tkankę mózgową na tej samej szalce Petriego. Przenieś homogenizowaną tkankę mózgową do pięciomililitrowych probówek w celu trawienia enzymatycznego. Dodaj dwa mililitry zbilansowanego roztworu soli Hanksa uzupełnionego kolagenazą D i DNazą 1 do każdej probówki i szczelnie zamknij nakrętki Parafilmem.Następnie inkubuj probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, potrząsając nimi co pięć minut. Aby zatrzymać trawienie, umieść rurki na lodzie. Następnie przepuść homogenat przez metalowy filtr siatkowy o grubości 140 mikrometrów, aby usunąć duże zanieczyszczenia.Za pomocą szklanego tłuczka delikatnie oddziel pozostałe komórki na filtrze. Kilkakrotnie umyj metalowy filtr siatkowy trzema mililitrami pożywki do hodowli komórek mikrogleju na każde mycie. Teraz za pomocą 10-mililitrowej pipety zbierz filtrat i przenieś go do 15-mililitrowej probówki.Następnie odwiruj probówkę o masie 500 g przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie odwróć probówkę, aby wyrzucić supernatant. Za pomocą stojaka delikatnie zeskrob rurkę, aby ponownie zawiesić pellet.Następnie dodaj 10 mililitrów 37% roztworu pożywki koloidalnej na bazie krzemionki do zawieszonych komórek. Odwiruj roztwór o stężeniu 500 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy minimalnej sile zrywającej. Za pomocą 10-mililitrowej pipety odessać warstwę mieliny od góry roztworu.Aby umyć komórki, dodaj 10 mililitrów zbilansowanego roztworu soli Hanksa i odwiruj probówkę z 500 g przez siedem minut w czterech stopniach Celsjusza. Po odrzuceniu supernatantu i ponownym zawieszeniu osadu, dodać do probówki 10 mililitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Po odwirowaniu ponownie zawiesić końcowe osady w pozostałym buforze do dalszych zastosowań.Przenieś wszystkie wyizolowane komórki na 96-dołkową płytkę ze stożkowym dnem. Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko odwróć płytkę jednym ruchem, aby wyrzucić supernatant.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 25 mikrolitrach roztworu blokującego i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby przygotować zewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, należy odwirować probówki z przeciwciałami o masie 10 000 g w celu usunięcia agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu.Używając aktywowanego fluorescencyjnie bufora do sortowania komórek, dostosuj całkowitą objętość do 25 mikrolitrów. Teraz dodaj 25 mikrolitrów zewnątrzkomórkowej mieszanki barwiącej przeciwciała do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodać 150 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki.Odwirować płytkę o masie 500 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie szybko odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem. Zawiesić osad komórkowy w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek i odwirować, jak pokazano wcześniej.Ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach buforu saponinowo-paraformaldehydowego, aby utrwalić i przeniknąć komórki. Następnie inkubować płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Bez mieszania dodaj 100 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki.Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem i ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach buforu saponin. Następnie przygotuj kontrole kompensacyjne, dodając 20 mikrolitrów koralików do 11 pustych studzienek.Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał, odwirować probówki z przeciwciałami o wadze 10 000 g w celu usunięcia potencjalnych agregatów. Nie naruszając osadu, odessać wymaganą objętość z supernatantu. Dostosuj objętość do 50 mikrolitrów za pomocą buforu saponinowego.Następnie ponownie zawieś osad komórkowy w 50 mikrolitrach wewnątrzkomórkowej mieszanki przeciwciał. Dodaj jeden mikrolitr każdego przeciwciała do odpowiednich studzienek perełkowych i inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Bez mieszania dodaj 150 mikrolitrów buforu saponin do każdej studzienki zawierającej próbki komórek.Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek do każdej studzienki kompensacyjnej, aby umyć kulki. Po odwirowaniu płytki ponownie zawiesić osad komórkowy i kontrole odpowiednio w 200 mikrolitrach buforu saponin i aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Odwirować płytkę o masie 500 g przez sześć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant.Ponownie zawiesić zarówno próbki komórek, jak i kontrole kompensacyjne w 200 mikrolitrach aktywowanego fluorescencyjnie buforu do sortowania komórek. Przenieść zawiesiny do znakowanych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki zidentyfikowało odrębny klaster mikrogleju oddzielony od innych typów komórek mózgowych na podstawie profili transkrypcyjnych.Analiza ekspresji różnicowej ujawniła znacznie podwyższoną regulację genów w mikrogleju, w tym Csf1r, Fcrls, Fyb, Adap2 i P2ry12. Komórki mikrogleju udało się wyizolować z żywych próbek mózgu w oparciu o ich wyraźną ekspresję markerów CD45 i CD11b. Odrębne subpopulacje mikrogleju zidentyfikowano na podstawie kombinacji markerów aktywacji, w tym CD80, CD86, iNOS, CD206 i Arg1, CD86 i CD64 oraz CD163 z CD206.Ekspresja genów markerowych Ptprc i Itgam została zlokalizowana specyficznie w klastrze mikrogleju w projekcji umap, potwierdzając tożsamość tych komórek. Analiza wykresu skrzypcowego wykazała niższą ekspresję markerów przeciwzapalnych, takich jak Fcgr1 i Cd86, w leczonym mikrogleju w porównaniu z kontrolą nośnika.

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Ta praca opisuje protokół do kwantyfikacji globalnych modyfikacji histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu. Praca zawiera również protokół izolacji mikrogleju, który został wykorzystany do zebrania danych.

Kwantyfikacja globalnych modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą wewnątrzjądrowej cytometrii przepływowej w izolowanym mikrogleju mózgu myszy

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Obecny protokół opisuje, jak izolować i oczyszczać pierwotny mikroglej hipokampa od dorosłych myszy, a następnie instrukcje dotyczące przeprowadzania zapisów całokomórkowych na tych ostro izolowanych komórkach.

Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

Poznaj cytometrię przepływową i analizę pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy. Ta metoda pozwala zrozumieć rolę mikrogleju w rozwoju mózgu.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów