Name: Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-16T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Odkryj metodę obrazowania na żywo mikrogleju i synaps w siatkówce myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej z dyskiem obrotowym oraz analizy obrazu z uczeniem maszynowym. Protokół umożliwia szczegółowe badanie dynamiki mikrogleju w warunkach homeostazy i uszkodzenia nerwu wzrokowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PSD-95pTagRFP był prezentem od Johannesa Hella (Addgene plasmid #52671; RRID: Addgene_52671), natomiast wersja kapsydowa, 7m8, była prezentem od Johna Flannery'ego i Davida Schaffera (plazmid Addgene #64839; RRID: Addgene_64839). Chcielibyśmy podziękować Aparnie Lakkaraju za umożliwienie nam korzystania z wirującego mikroskopu dysku w ich laboratorium oraz Nilsie La Cunza za wskazówki w zakresie obrazowania na żywo. Chcielibyśmy również podziękować Felice Dunn, Annice Balraj i Luca Della Santina za pomocne dyskusje i uwagi dotyczące tego rękopisu. Dziękujemy Suling Wang za pomoc w analizie danych dotyczących Imaris. Prace te zostały sfinansowane przez NIH-NEI EY028148 i EY034973 dla Y.O., nagrodę ARVO Davida L. Epsteina dla Y.O. oraz NIH-NEI EY034973-S1 dla C.F.. Badania te były również częściowo wspierane przez wspólne zasoby NUT UCSF Vision Core EY002162/EY037668 NIH-NEI P30 oraz nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness z Nowego Jorku. Rysunek 1 został stworzony na biorender.com.

<ol><li>Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mechanisms+regulate+distinct+aspects+of+cortical+circuit+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li>
<li>Rosin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+microglia+interact+with+hypothalamic+radial+glia+during+development+and+upregulate+the+TAM+receptors+MERTK+and+AXL+following+an+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult.</a> Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).</li>
<li>Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+microglia+development+on+the+plasticity+of+the+developing+visual+cortex+circuit+in+juvenile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).</li>
<li>Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+developing+retina+couple+phagocytosis+with+the+progression+of+apoptosis+via+P2RY12+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling.</a> Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).</li>
<li>Brown, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+dispensable+for+experience-dependent+refinement+of+mouse+visual+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry.</a> Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+use+TAM+receptors+to+detect+and+engulf+amyloid+%CE%B2+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques.</a> Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microglial+SIRP%CE%B1+promotes+synaptic+pruning+in+preclinical+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration.</a> Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+mediate+synaptic+material+clearance+at+the+early+stage+of+rats+with+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa.</a> Front Immunol. 10, 912(2019).</li>
<li>Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+target+synaptic+sites+early+during+excitatory+circuit+disassembly+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration.</a> iScience. 28 (4), 112201(2025).</li>
<li>Xu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+changes+and+the+response+of+microglia+in+a+light-induced+photoreceptor+degeneration+model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model.</a> Mol Vis. 27, 206-220 (2021).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+a+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+weakening-induced+caspase-3+activity+confers+specificity+to+microglia-mediated+synapse+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+transient+microglia+recruitment+and+functional+recovery+of+photoreceptor+signaling+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).</li>
<li>Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorless+adaptive+optics+multimodal+en-face+small+animal+retinal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging.</a> Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).</li>
<li>Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+specific+retinal+ganglion+cell+types+and+synapses+after+transient+ocular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension.</a> J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).</li>
<li>Della Santina, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disassembly+and+rewiring+of+a+mature+converging+excitatory+circuit+following+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury.</a> Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).</li>
<li>Ramírez, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+changes+in+the+early+aging+stage+in+a+healthy+retina+and+an+experimental+glaucoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model.</a> Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).</li>
<li>de Hoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+early+activation+of+retinal+microglial+cells+in+a+mouse+model+of+unilateral+laser-induced+experimental+ocular+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension.</a> Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).</li>
<li>Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+survey+of+excitatory+synapses+reveals+sublamina-specific+and+asymmetric+synapse+disassembly+in+a+neurodegenerative+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit.</a> iScience. 26 (8), 107262(2023).</li>
<li>Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+production+everywhere%3A+a+simple%2C+fast%2C+and+reliable+protocol+for+in-house+AAV+vector+production+based+on+chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction.</a> Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).</li>
<li>Imaris reference manual. , 
 <a target="_blank" href="https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf">https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf</a> (2024).</li>
<li>Joseph, A., Power, D., Schallek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+dynamics+of+individual+processes+of+microglia+in+the+living+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo.</a> Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+in+mouse+spinal+cord+reveals+that+microglia+prevent+degeneration+of+injured+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons.</a> Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).</li>
<li>Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+dynamic+imaging+of+retinal+microglia+using+time-lapse+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Protokół ten umożliwia wizualizację i śledzenie interakcji poszczególnych mikroglejów z miejscami postsynaptycznymi wzdłuż dendrytów RGC. W chorobie neurodegeneracyjnej, takiej jak jaskra, mikroglej współlokalizuje się z synapsami w wewnętrznej warstwie pleksiformowej (IPL) siatkówki. Rola mikrogleju w rozkładzie synaps nie jest dobrze poznana. Jednak mikroglej potencjalnie przyczynia się do tego poprzez kilka potencjalnych mechanizmów, w tym aberracyjne pochłanianie synaps, pasywne usuwanie zanieczyszczeń z komórek apop...

Funkcja obwodu i homeostaza opierają się na silnie regulowanym wyładowaniu synaps oraz innych unikalnych interakcjach między różnymi typami komórek1. Mikroglej pełni rolę rezydujących makrofagów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), to populacja nieneuronalna w siatkówce, która odgrywa unikalną rolę w przycinaniu synaptycznym. Podczas rozwoju OUN mikroglej przycina niefunkcjonalne lub słabe synapsy, aby udoskonalić obwody nerwowe2. Mikroglej w rozwijającym się mózgu obserwuje swoje otoczenie i jest przygotowany do roli neuroprotekcyjnej w krytycznych okresach3. W rozwoju układu wzrokowego mikroglej jest kluczowym regulatorem rozwoju neuronów korowych i interneuronów, a także wykazuje zmiany morfologiczne podczas krytycznych okresów przebudowywania synaptyki4. Podobnie w rozwijającej się siatkówce mikroglej oczyszcza komórki apoptotyczne, tworząc miejsce dla nowych połączeń synaptycznych, co potwierdzono wzrostem poziomu homeostatycznego markeru P2Ry12 podczas tych procesów oczyszczania5. Jednak najnowsze odkrycia wskazują, że mikroglej może nie odgrywać ostatecznej roli w udoskonalaniu obwodów nerwowych w rozwijającym się układzie wzrokowym6, podkreślając kontrowersje dotyczące roli mikrogleju w rozwoju obwodów wzrokowych.
W kontekstach urazów mikroglej zmienia morfologię w stan aktywny i może pełnić rolę neurodegeneracyjną. Na przykład mikroglej w modelach choroby Alzheimera wykazał zwiększone zajatynie blaszek amyloid-beta7 oraz markerów synaptycznych, takich jak SPH i PSD958. W neurodegeneracji siatkówki wiele grup badawczych stwierdziło mikroglej z pochłaniającym materiałem synaptycznym, ale brak wyraźnych dowodów na aktywne pochłonięcie nienaruszonych synaps 9,10,11,12,13. Na przykład He i in. stwierdzili, że liczba mikrogleju wzrasta i zwiększa objętość pochłoniętego materiału synaptycznego w modelu retinitis pigmentosa9, ale nie jest jasne, czy doszło do fagocytozy nienaruszonych synaps, czy do usuwania zanieczyszczeń. Dodatkowo, tradycyjne klasyfikacje mikroglejów — takie jak "spoczynkowy vs. aktywowany" czy "M1 vs. M2" — są zbyt uproszczone i coraz mniej dokładne w świetle współczesnych wniosków. Mikroglej występuje w gradiencie stanów, a nie w kategoriachdyskretnych 12. Dlatego Paolicelli i in. wezwali do przesunięcia się od przestarzałych klasyfikacji binarnych na bardziej zniuansowaną, rygorystycznie zdefiniowaną nomenklaturę stanów mikroglejowych, aby lepiej zrozumieć i zdefiniować morfologię oraz aktywność mikrogleju12. Dlatego strategie oceny funkcji mikrogleju ex vivo i in vivo zwiększą zdolność tej dziedziny do rozpoznawania stanów i aktywności mikrogleju zarówno w kontekście rozwoju, jak i choroby.
Chociaż istnieją strategie badania funkcji mikrogleju zarówno ex vivo, jak i in vivo, obrazowanie na żywo ex vivo przynosi kilka korzyści. Po pierwsze, przejrzystość rogówki lub rozwój zaćmy nie utrudniają obrazowania siatkówki, umożliwiając wyraźną wizualizację drobnych procesów i punktów synaptycznych. Ponadto obrazowanie in vivo wymaga więcej umiejętności technicznych przy przygotowaniu, co sprawia, że przygotowania ex vivo są o wyższej przepustowości, co skutkuje większą liczbą zdjęć zwierząt na eksperyment. Pomimo teoretycznych korzyści, jakie może umożliwić obrazowanie in vivo, do rejestrowania ruchliwości mikrogleju potrzebna jest wysoka moc laserowa (100-230 μW) do obrazowania podłużnego14,15. Jednak obrazowanie mikrogleju ex vivo z niższą mocą lasera i odpowiednim medium obrazowym może zapewnić taką samą jakość obrazowania jak in vivo przy odpowiednim przygotowaniu, choć tkanka nie jest już na swoim miejscu.
Wykazano, że mikroglej zwiększa liczebność, złożoność i ruch procesów po przejściowym ciśnieniu wewnątrzgałkowym (IOP) napoziomie 10. W tkance usztywnionej mikroglejoza skutkuje zwiększoną kolokalizacją z białkami synaptycznymi10. Wcześniejsze badania wykazały również wczesną utratę synaps i degenerację dendrytów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w modelu nadciśnienia oczu indukowanego laserem u myszy (LIOH) oraz innych modelach neurodegeneracyjnych 10,16,17,18,19,20. Jednak nadal nie wiadomo, czy odgrywają aktywną rolę w przycinaniu synaps, czy raczej bardziej pasywną w usuwaniu zaniedbań komórkowych, w tym rozłożonych synaps. Ponieważ rozkład synaps jest wczesnym znakiem rozpoznawczym neurodegeneracji, zrozumienie dynamiki mikrogleju i jego roli w rozkładaniu synaps jest kluczowe 8,10. Tutaj wykorzystujemy obrazowanie na żywo, aby zrozumieć dynamikę mikrogleju i ich interakcję z pobudzającym białkiem gęstości postsynaptycznej-95 (PSD95) na dendrytach RGC.

<table><tbody><tr><td>Igła 25 gauge</td><td>Alcon</td><td>8065420920</td><td></td></tr><tr><td>26s Gauge 10 & micro; Strzykawka L</td><td>Hamilton</td><td>701RNWG</td><td></td></tr><tr><td>7m8</td><td>Addgene</td><td>64839</td><td>http://n2t.net/addgene:64839</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny drut ze stali nierdzewnej 304 Bend-and-Stay</td><td>Stanford Advanced Materials</td><td>SS3368</td><td>Drut stalowy do produkcji pierścieni</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia Heksahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcjonujący</td><td>Amscope</td><td></td><td>Do sekcji i montowania siatkówki</td></tr><tr><td>Nożyce do sekcji</td><td>FST</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11252-21</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 10.0.2</td><td>Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>Konwerter plików Imaris</td><td>Instrumenty Oksfordzkie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loctite Super Glue Ultra Gel Control</td><td>Loctite</td><td>1363589</td><td>Klej do robienia pierścieni</td></tr><tr><td>Chlorek magnezu – heksahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-100G</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtrujący membranę MCE (13 mm)</td><td>Millipore</td><td>HABG01300</td><td>0,45 &mu; m Rozmiar porów</td></tr><tr><td>Komora mikrośrodowiskowa</td><td>Tokai Hit</td><td>STXG-TIZBX-SET</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elementy NIS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna i polimyksyna B sulfae oraz maść okulowa z bacitracyną cynkową, USP</td><td>Bausch + Lomb</td><td>24208-780-55</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel rozmiar 00</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 8.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>USP roztwór chlorowodorku proparakainy, 0,5%</td><td>Sandoz</td><td>61314-0016-01</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego pokryta powłoką PDL (35 mm)</td><td>Matek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td>Nr 1.5 Slip</td></tr><tr><td>PSD95_pTagRFP</td><td>Addgene</td><td>52671</td><td>http://n2t.net/addgene:52671</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Monozasadowy fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Live Imaging and Characterization of Microglia Dynamics and Interactions with Synapses in Diseased Murine Retina

Mikroglej to makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które reagują na infekcje tkankowe i urazy. Oprócz roli w stanie zapalnym, mikroglej odgrywa rolę rozwojową w udoskonalaniu obwodów poprzez przycinanie synaptyczne. Jednak mechanizmy przycinania synaptycznego w neurozapaleniu i neurodegeneracji pozostają nieznane. W tym protokole używamy modelu explantowego siatkówki myszy do badania dynamiki mikrogleju ex vivo. Aby zbadać ruchliwość mikrogleju i ich interakcje z białkami postsynaptycznymi, oznaczamy synapsy AAV-PSD95-RFP oraz nagrywamy filmy poklatkowe ruchomych mikrogleju współlokalizowanych z białkami postsynaptycznymi za pomocą mikroskopii konfokalnej z obracającym się dyskiem. Następnie tworzymy rekonstrukcje powierzchniowe i punktowe mikrogleju oraz PSD95 za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Dane takie jak długość przemieszczenia mikrogleju, szybkość procesu oraz kontakt z punktami postsynaptycznymi mogą być następnie wyodrębniane z tych powierzchni, aby zrozumieć zachowanie mikrogleju zarówno w stanach homeostatycznych, jak i po uszkodzeniu neuronów. Protokół ten może być przydatny do badania roli mikrogleju w przycinaniu synaptycznym w chorobach neurodegeneracyjnych siatkówki.

Mikroglej z siatkówki myszy CX3CR1-GFP zostały zobrazowane za pomocą opisanego protokołu. Myszy miały wartość od P30 do P60 w momencie podania AAV-PSD95-RFP, a co najmniej 21 dni umożliwiało ekspresję AAV. Reprezentatywne obrazy mikrogleju oraz ich interakcji z PSD95 puncta przed i po analizie przedstawiono na Rysunku 2. Aby wywołać aktywację mikrogleju, zastosowaliśmy model nadciśnienia oczu indukowanego laserem myszy (LIOH), który tymczasowo podnosi ciśnien...

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Microglia are the resident macrophages of the central nervous system (CNS) that respond to tissue infection and injury. In addition to their role in ...

Zakres badań naszego laboratorium polega na zgłębieniu mechanizmów jaskry i mikrogleju w remodelowaniu synaps podczas rozwoju. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą tego, czy mikroglej aktywnie rozkłada synapsy komórek zwojowe siatkówki, czy tylko biernie usuwa zanieczyszczenia. Zacznij od siatkówki myszy umieszczonej na papierze filtracyjnym i wysusz ją laboratoryjną chusteczką.Odwróć siatkówkę na szalkę Petriego MatTek. Obciąż siatkówkę metalowymi kulkami lub pierścionem. Następnie dodaj od trzech do pięciu kropli sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.Umieść próbkę pod obracającym się mikroskopem konfokalnym i dostosuj ustawienia, aby podglądać siatkówkę. Zbieraj obrazy wzdłuż osi Z na głębokości całkowitej od 10 do 20 mikrometrów, używając kroku 0,3 mikrometra. Utrzymuj odstęp czasu między klatkami na poziomie 20 do 30 sekund, aby umożliwić niezawodne śledzenie komórek.Aby wykonać renderowanie powierzchni mikroglej, przekonwertuj plik timelapse na format IMS za pomocą oprogramowania do konwertera plików. Wprowadź rozmiary wokseli na podstawie wcześniej nadanych właściwości obrazu. W oprogramowaniu analitycznym kliknij folder obserwowania, aby otworzyć przekonwertowany plik i upewnić się, że obraz jest w widoku 3D.Aby wykryć pojedynczy mikroglej, kliknij ikonę dodaj nową powierzchnię w pasku narzędzi obiektów. Wybierz segment tylko obszar zainteresowania, śledź powierzchnie w czasie, klasyfikuj powierzchnie oraz statystyki obiekt-obiekt w ustawieniach algorytmu. Następnie kliknij niebieski przycisk play, aby przejść dalej.Wybierz kanał do renderowania powierzchni. Opcjonalnie włącz wygładzanie, aby wygładzić tworzenie powierzchni i wprowadzić detale powierzchni. W kategorii progowej wybierz segmentację uczenia maszynowego do wykrywania komórek.W sekcji danych treningowych użyj narzędzi do pędzla do tła i pierwszego planu. Rysuj pociągnięcia pędzla, wybierając wybrany pędzel i używając shifta oraz lewego przycisku myszy. Upewnij się, że wyświetlanie interpolacji jest włączone, następnie wybierz train and predict.Użyj żółtego wskaźnika na środku, aby nawigować wzdłuż osi Z. Narysuj wiele kresek na płaszczyznach X, Y i Z oraz w kilku przedziałach czasowych. Używaj od trzech do pięciu krótkich pociągów na wpis, iteracyjnie dostosowując powierzchnię, aż uzyskamy dokładną powierzchnię.Użyj żółtego prostokąta, aby przełączać się między wyświetlaczem treningowym a faktyczną powierzchnią utworzoną jako ostateczny kontrol. Sprawdź też, czy powierzchnia pokrywa się z morfologią komórki. Po zakończeniu odznacz podzielone obiekty.Dostosuj próg histogramu wokselowego, aby usunąć małe, niepołączone obiekty niebędące częścią powierzchni głównej. Następnie ręcznie edytuj powierzchnię, aby usunąć zbędne obiekty lub wycięte krawędzie za pomocą narzędzia nożycowego. Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw dla obiektu i wybierz algorytm śledzenia dla poruszającej się komórki.Filtruj obiekty niezwiązane z główną powierzchnią. Po zakończeniu ustaw wyświetlanie ruchomych komórek na przezroczysty profil, aby zwizualizować punkty dla kolejnych kroków. Aby wykryć pojedyncze punkty PSD95, kliknij na ikonę niebieskiej powierzchni w pasku narzędzi obiektów.Następnie wybierz miejsca na torze w czasie, sklasyfikuj je oraz statystyki obiekt-obiekt i naciśnij play. Wybierz kanał źródłowy dla markera synaptycznego. Wyłącz slicer i inne kanały, aby wizualizować tylko PSD95.Użyj przycisku Control oraz narzędzia do wyboru wskaźnika, aby oszacować średnicę XY punkty. Wybierz kilka jasnych punktów, które utrzymują się na wszystkich klatkach i wyłącz odejmowanie tła. Następnie dodaj filtr na podstawie jakości punktu.Dostosuj histogram, aby uwzględniał dokładne punkty PSD95 we wszystkich przedziałach czasowych. Usuń fałszywie pozytywne miejsca przez edycję. Przełącz kursor sześcianu lub kółka, aby usunąć miejsca trwające tylko jedną lub dwie klatki.Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw i wybierz algorytm śledzenia dla plam synaptycznych. Filtruj ślady punktowe niepowiązane z prawdziwymi punktami, używając progu histogramu, aby wykluczyć ślady małych obiektów. Zdefiniuj klasyfikacje na podstawie klasyfikacji najkrótszej odległości do powierzchni.Otoczony jako każdy punkt poniżej zera mikrometrów, kontaktowany w odległości od zera do 0,5 mikrometra od powierzchni, a niekontaktowany jako 0,5 mikrometra i ponad 0,5 mikrometra. Przypisz etykiety zdarzeniom, korzystając z klasyfikacji, które zostały znalezione powyżej. Gdy powierzchnie i plamy odpowiednio reprezentują mikroglej i punkty, wyeksportuj wszystkie statystyki w zakładce statystyk.Mikroglej wykazywał wydłużony czas przesunięcia procesu po nadciśnieniu ocznym wywołanym laserem w porównaniu do grupy kontrolnej. Szybkość mikrogleju była istotnie wyższa w oczach leczonych laserowo niż u grup kontrolnych. Liczba zdarzeń kontaktowych między mikroglejem a PSD95 puncta wzrosła po leczeniu laserowym.Nagrania poklatkowe wykazały, że siatkówki poddane laserowi wykazywały większą ruchliwość mikrogleju oraz zwiększoną interakcję z PSD95 puncta w porównaniu z siatkówkami kontrolnymi. Nasze istotne wyniki wykazały wzrost liczby mikroglejów, złożoności i ruchliwości oraz synaptycznej kolokalizacji po przejściowym podniesieniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Nasz protokół oferuje obrazowanie ex vivo, co pomaga uniknąć problemów z zaćmą i nieprzezroczystością rogówki, umożliwiając łatwiejsze przygotowanie do szybszych eksperymentów i ogólnie wyższą przepustowość.Nasze wyniki wspierają badania, umożliwiając wizualizację interakcji mikroglej-neuron, komunikacji komórkowej i dynamiki za pomocą transgenicznych linii fluorescencjowych, a także obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości.

live-imaging-characterization-microglia-dynamics-interactions-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Bosco, A., et al.  In Vivo Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy. J. Vis. Exp. (2015) Ten film przedstawia obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry. Transgeniczna mysz z mikroglejem siatkówki wykazującym ekspresję białka fluorescencyjnego jest umieszczana pod oftalmoskopem. Oświetlenie w podczerwieni służy do zlokalizowania głowy nerwu wzrokowego (ONH), a...

Obrazowanie in vivo mikrogleju siatkówki w mysim modelu jaskry

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Ten protokół opisuje, jak techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak optyczna koherentna tomografia w domenie spektralnej i skaningowa oftalmoskopia laserowa, mogą być wykorzystane u małych gryzoni, przy użyciu systemu platformy obrazowania okulistycznego, aby uzyskać informacje odpowiednio o grubości siatkówki i rozmieszczeniu komórek mikrogleju.

In vivo (in vivo) Obrazowanie myszy reporterowych Cx3cr1gfp/gfp z optyczną koherentną tomografią w domenie spektralnej i skaningową oftalmoskopią laserową

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Opisujemy metodę wielokrotnej wizualizacji mikrogleju mysiego oraz monocytów krążących in vivo w czasie liczonym w godzinach, dniach lub tygodniach, z wykorzystaniem transkranialnej mikroskopii dwufotonowej. Demonstrujemy sposób przygotowania okna z cienkiej czaszki, które umożliwia przerywaną obserwację spoczywającego mikrogleju, który może zostać aktywowany poprzez sąsiednią stereotaktyczną iniekcję białka regulatorowego Tat wirusa HIV-1.

Technika cienkiej okienkowej czaszki do przewlekłego obrazowania dwufotonowego in vivo mikrogleju mysiego w modelach neurozapalenia

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Odkryj metodę obrazowania na żywo mikrogleju i synaps w siatkówce myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej z dyskiem obrotowym oraz analizy obrazu z uczeniem maszynowym. Protokół umożliwia szczegółowe badanie dynamiki mikrogleju w warunkach homeostazy i uszkodzenia nerwu wzrokowego.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Przeglądaj więcej filmów