Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy
16 stycznia 2026
Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.
Zakres badań naszego laboratorium polega na zgłębieniu mechanizmów jaskry i mikrogleju w remodelowaniu synaps podczas rozwoju. Obecne wyzwania eksperymentalne dotyczą tego, czy mikroglej aktywnie rozkłada synapsy komórek zwojowe siatkówki, czy tylko biernie usuwa zanieczyszczenia. Zacznij od siatkówki myszy umieszczonej na papierze filtracyjnym i wysusz ją laboratoryjną chusteczką.
Odwróć siatkówkę na szalkę Petriego MatTek. Obciąż siatkówkę metalowymi kulkami lub pierścionem. Następnie dodaj od trzech do pięciu kropli sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego.
Umieść próbkę pod obracającym się mikroskopem konfokalnym i dostosuj ustawienia, aby podglądać siatkówkę. Zbieraj obrazy wzdłuż osi Z na głębokości całkowitej od 10 do 20 mikrometrów, używając kroku 0,3 mikrometra. Utrzymuj odstęp czasu między klatkami na poziomie 20 do 30 sekund, aby umożliwić niezawodne śledzenie komórek.
Aby wykonać renderowanie powierzchni mikroglej, przekonwertuj plik timelapse na format IMS za pomocą oprogramowania do konwertera plików. Wprowadź rozmiary wokseli na podstawie wcześniej nadanych właściwości obrazu. W oprogramowaniu analitycznym kliknij folder obserwowania, aby otworzyć przekonwertowany plik i upewnić się, że obraz jest w widoku 3D.
Aby wykryć pojedynczy mikroglej, kliknij ikonę dodaj nową powierzchnię w pasku narzędzi obiektów. Wybierz segment tylko obszar zainteresowania, śledź powierzchnie w czasie, klasyfikuj powierzchnie oraz statystyki obiekt-obiekt w ustawieniach algorytmu. Następnie kliknij niebieski przycisk play, aby przejść dalej.
Wybierz kanał do renderowania powierzchni. Opcjonalnie włącz wygładzanie, aby wygładzić tworzenie powierzchni i wprowadzić detale powierzchni. W kategorii progowej wybierz segmentację uczenia maszynowego do wykrywania komórek.
W sekcji danych treningowych użyj narzędzi do pędzla do tła i pierwszego planu. Rysuj pociągnięcia pędzla, wybierając wybrany pędzel i używając shifta oraz lewego przycisku myszy. Upewnij się, że wyświetlanie interpolacji jest włączone, następnie wybierz train and predict.
Użyj żółtego wskaźnika na środku, aby nawigować wzdłuż osi Z. Narysuj wiele kresek na płaszczyznach X, Y i Z oraz w kilku przedziałach czasowych. Używaj od trzech do pięciu krótkich pociągów na wpis, iteracyjnie dostosowując powierzchnię, aż uzyskamy dokładną powierzchnię.
Użyj żółtego prostokąta, aby przełączać się między wyświetlaczem treningowym a faktyczną powierzchnią utworzoną jako ostateczny kontrol. Sprawdź też, czy powierzchnia pokrywa się z morfologią komórki. Po zakończeniu odznacz podzielone obiekty.
Dostosuj próg histogramu wokselowego, aby usunąć małe, niepołączone obiekty niebędące częścią powierzchni głównej. Następnie ręcznie edytuj powierzchnię, aby usunąć zbędne obiekty lub wycięte krawędzie za pomocą narzędzia nożycowego. Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw dla obiektu i wybierz algorytm śledzenia dla poruszającej się komórki.
Filtruj obiekty niezwiązane z główną powierzchnią. Po zakończeniu ustaw wyświetlanie ruchomych komórek na przezroczysty profil, aby zwizualizować punkty dla kolejnych kroków. Aby wykryć pojedyncze punkty PSD95, kliknij na ikonę niebieskiej powierzchni w pasku narzędzi obiektów.
Następnie wybierz miejsca na torze w czasie, sklasyfikuj je oraz statystyki obiekt-obiekt i naciśnij play. Wybierz kanał źródłowy dla markera synaptycznego. Wyłącz slicer i inne kanały, aby wizualizować tylko PSD95.
Użyj przycisku Control oraz narzędzia do wyboru wskaźnika, aby oszacować średnicę XY punkty. Wybierz kilka jasnych punktów, które utrzymują się na wszystkich klatkach i wyłącz odejmowanie tła. Następnie dodaj filtr na podstawie jakości punktu.
Dostosuj histogram, aby uwzględniał dokładne punkty PSD95 we wszystkich przedziałach czasowych. Usuń fałszywie pozytywne miejsca przez edycję. Przełącz kursor sześcianu lub kółka, aby usunąć miejsca trwające tylko jedną lub dwie klatki.
Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych przerw i wybierz algorytm śledzenia dla plam synaptycznych. Filtruj ślady punktowe niepowiązane z prawdziwymi punktami, używając progu histogramu, aby wykluczyć ślady małych obiektów. Zdefiniuj klasyfikacje na podstawie klasyfikacji najkrótszej odległości do powierzchni.
Otoczony jako każdy punkt poniżej zera mikrometrów, kontaktowany w odległości od zera do 0,5 mikrometra od powierzchni, a niekontaktowany jako 0,5 mikrometra i ponad 0,5 mikrometra. Przypisz etykiety zdarzeniom, korzystając z klasyfikacji, które zostały znalezione powyżej. Gdy powierzchnie i plamy odpowiednio reprezentują mikroglej i punkty, wyeksportuj wszystkie statystyki w zakładce statystyk.
Mikroglej wykazywał wydłużony czas przesunięcia procesu po nadciśnieniu ocznym wywołanym laserem w porównaniu do grupy kontrolnej. Szybkość mikrogleju była istotnie wyższa w oczach leczonych laserowo niż u grup kontrolnych. Liczba zdarzeń kontaktowych między mikroglejem a PSD95 puncta wzrosła po leczeniu laserowym.
Nagrania poklatkowe wykazały, że siatkówki poddane laserowi wykazywały większą ruchliwość mikrogleju oraz zwiększoną interakcję z PSD95 puncta w porównaniu z siatkówkami kontrolnymi. Nasze istotne wyniki wykazały wzrost liczby mikroglejów, złożoności i ruchliwości oraz synaptycznej kolokalizacji po przejściowym podniesieniu ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Nasz protokół oferuje obrazowanie ex vivo, co pomaga uniknąć problemów z zaćmą i nieprzezroczystością rogówki, umożliwiając łatwiejsze przygotowanie do szybszych eksperymentów i ogólnie wyższą przepustowość.
Nasze wyniki wspierają badania, umożliwiając wizualizację interakcji mikroglej-neuron, komunikacji komórkowej i dynamiki za pomocą transgenicznych linii fluorescencjowych, a także obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
This protocol describes an ex vivo mouse retina explant model to study microglia dynamics and their interactions with synaptic proteins. Using spinning disk confocal microscopy and advanced image analysis, the method enables detailed quantification of microglial motility and synaptic contacts under both homeostatic and injury conditions. The approach is particularly useful for investigating microglia-mediated synaptic pruning in retinal neurodegenerative disease models.
Key Study Components
Area of Science
- Neuroscience
- Cell Biology
- Imaging
Background
- Microglia are the resident macrophages of the CNS, involved in immune responses and synaptic pruning.
- Synaptic pruning by microglia is crucial for neural circuit refinement during development and disease.
- The mechanisms of microglia-mediated synaptic pruning in neuroinflammation and neurodegeneration are not fully understood.
- Retinal explant models allow for controlled ex vivo studies of microglial behavior.
Purpose of Study
- To visualize and quantify microglia motility and their interactions with postsynaptic proteins in the mouse retina.
- To compare microglial dynamics in homeostatic versus injury (laser-induced ocular hypertension) conditions.
- To provide a protocol for high-throughput, high-resolution imaging of microglia-synapse interactions.
Methods Used
- Preparation of mouse retina explants and mounting on filter paper in Petri dishes.
- Labeling of synapses with AAV-PSD95-RFP.
- Time-lapse spinning disk confocal microscopy to capture microglia and synaptic protein dynamics.
- 3D surface and spot reconstruction using image analysis software with machine learning segmentation.
- Quantitative analysis of microglia displacement, process speed, and contact with PSD95 puncta.
Main Results
- Microglia in laser-treated retinas showed increased process displacement length and higher motility compared to controls.
- The number of contact events between microglia and PSD95 puncta increased after laser-induced injury.
- Time-lapse imaging revealed greater microglial complexity and synaptic colocalization following transient intraocular pressure elevation.
- The protocol enabled efficient, high-throughput imaging and analysis, overcoming limitations of in vivo approaches.
Conclusions
- This ex vivo protocol allows detailed visualization and quantification of microglia-synapse interactions in the retina.
- Microglial motility and synaptic contacts are enhanced following neuronal injury.
- The method facilitates studies of microglia-mediated synaptic pruning in neurodegenerative disease models.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative live imaging of microglia-synapse interactions in ex vivo murine retina provides a high-throughput, reproducible platform for interrogating neuroimmune mechanisms relevant to neurodegenerative disease. This approach enables precise measurement of microglial motility and synaptic contact dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The protocol's scalability and imaging fidelity facilitate robust portfolio triage and translational continuity for CNS therapeutic programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-mediated synaptic remodeling under homeostatic and injury conditions.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing active synapse disassembly from debris clearance.
- Provides quantitative metrics for functional target validation in neuroinflammation and neurodegeneration models.
- Facilitates predictive confidence in pathway interrogation for CNS disease targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible imaging outputs for downstream screening workflows.
- Standardizes quantification of microglia motility and synaptic contact events for assay development.
- Enables high-throughput, scalable analysis of cellular interactions using machine learning segmentation.
- Prepares robust biological systems for compound evaluation in neuroimmune modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns ex vivo findings with disease-relevant mechanisms in retinal neurodegeneration models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by quantifying microglia-synapse dynamics post-injury.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for neuroprotective and immunomodulatory strategies.
- Provides translational biomarker candidates based on dynamic cellular interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis protocol integrates from early discovery through preclinical research, bridging mechanistic studies and translational validation in CNS disease models.
- Discovery Biology: Quantifies microglia-synapse interactions to clarify neuroimmune pathways and support hypothesis testing.
- Screening: Establishes reproducible, quantitative imaging assays for evaluating candidate interventions.
- Analytics: Extracts displacement, speed, and contact frequency metrics to enable condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo cellular dynamics to disease-relevant endpoints in neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse CNS and neuroimmune research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroimmune target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in imaging-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal imaging, image analysis, and neurobiology.
- Demands access to spinning disk confocal microscopy and advanced analysis software with machine learning segmentation.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data extraction protocols.
- Adaptable to other CNS tissues or disease models with appropriate labeling strategies.
- Throughput and scalability are limited by imaging infrastructure and data processing capacity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:24
Time-Lapse Imaging of Mouse Retina for Tracking Analysis of Microglia and Synaptic Puncta
1:14
Microglial Surface Rendering and Tracking Analysis
3:56
Spot Classification for Postsynaptic Density Protein-95 (PSD95) to Detect Synaptic Puncta
5:54
Results
6:35
Conclusion
