Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie procedury bezpośredniego zamykania miazgi u myszy. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii miazgi, takie jak to, jak goi się miazga lub jak tworzy się naprawcza zębina, gdy umieszcza się uwięzione materiały pokrywające miazgę na odsłoniętej miazdze. Główną zaletą tej techniki jest to, że rzeczywista procedura bezpośredniego pokrywania miazgi wykonywana u ludzi może być również wykonywana u myszy, dokładnie w ten sam sposób.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku poprawy właściwości materiału w celu ratowania zębów, które w przeciwnym razie byłyby skazane na bardziej inwazyjne leczenie, takie jak leczenie kanałowe. Po odpowiednim znieczuleniu myszy do zabiegu, umieść uchwyt na usta w jej ustach, a drugi koniec przymocuj do stołu tak, aby głowa była skierowana do góry. Używając dobrego oświetlenia i stereoskopu, obserwuj pierwszy ząb trzonowy szczęki.

Następnie, używając ćwiartki okrągłego wiertła w szybkoobrotowej rękojeści przy 200 000 obr./min, usuń centralny obszar szkliwa zęba, aż miazga będzie widoczna przez przezroczystą zębinę. Uważaj, aby nie wniknąć w miazgę. Następnie, używając nie.

15 pilnik endodontyczny k, przebić przez zębinę i odsłonić miazgę. Nie wpychaj żadnych zanieczyszczeń do miazgi; Można tego uniknąć, obracając pilnik k co kwartał, a następnie wyciągając plik k. Teraz przygotuj MTA i za pomocą eksploratora dostarcz MTA, a następnie zapakuj go w odsłonięty obszar, używając tylnej strony papierowego punktu i delikatnego stuknięcia.

Następnie, za pomocą strzykawki wypełnionej 35% wytrawiaczem kwasu fosforowego, pokryj ząb wytrawiaczem, omijając tkanki dziąseł, i pozwól wytrawianiu działać przez 15 sekund. Po 15 sekundach odessaj wytrawiacz z zęba i użyj bawełnianego aplikatora zwilżonego wodą, aby zetrzeć pozostały wytrawiacz. Ssać i wycierać, aż cały wytrawiacz zostanie usunięty.

Następnie nakładaj kleje dentystyczne za pomocą tylnej strony papierowego punktu. Spraw, aby warstwa kleju była cienka, przedmuchując ją sprężonym powietrzem przez kilka sekund. Następnie utwardzaj klej przez 30 sekund odpowiednim światłem.

Teraz umieść niewielkie ilości kompozytu na zębie za pomocą końcówki eksploratora, aby wpłynąć kompozyt do rowków zęba. Po nałożeniu utwardź kompozyt przez 30 sekund. Po eutanazji myszy i usunięciu całej szczęki, umieść szczękę w 4% paraformaldehydzie w PBS o pH 7,4.

Trzymaj tkankę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, a następnego ranka przenieś ją do 70% etanolu w celu przechowywania, aż będzie można ją przetworzyć. Aby wykonać mikrotomografię komputerową szczęki, najpierw zabezpiecz ją gazą nasączoną 70% etanolem, a następnie zapakuj do 15-mililitrowej probówki do hodowli komórkowej. Następnie zamontuj rurkę na stoliku do skanowania mikro CT.

Następnie ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego tak, aby dostarczało prąd o natężeniu 145 mikroamperów i szczytowym napięciu 55 kilowoltów przez 200 milisekund. Za pomocą filtra aluminiowego o średnicy 0,5 milimetra uzyskaj obrazy o rozdzielczości 20 mikronów. Po zakończeniu skanów rozpocznij odwapnianie szczęki za pomocą 5% EDTA i 4% sacharozy w PBS, przy pH 7,4.

Pozwól tej reakcji trwać przez dwa tygodnie w 4 stopniach Celsjusza. Po osadzeniu szczęki ułóż plastry o grubości pięciu mikronów. Obszary przykrycia miazgi zwykle pokrywają się z dystalnym korzeniem podniebiennym, który może służyć jako punkt orientacyjny.

Określ dokładny obszar zainteresowania, badając histologię pod mikroskopem świetlnym i porównując wyniki ze skanami mikro CT. W przypadku barwienia H&E usuń parafinę i ponownie nawodnij szkiełka za pomocą dwóch kąpieli w ksylenie przez kilka minut każda. Następnie przepuść je przez serię seryjnie rozcieńczonego etanolu.

Każda kąpiel powinna być stosowana tylko przez jedną minutę. Po nawodnieniu przepłukać powietrze. A następnie nałóż roztwór hemotoksyliny na dwie i pół minuty.

Usuń barwnik za pomocą płukanki, a następnie umieść szkiełka w 95% etanolu na jedną minutę. Następnie zabarwić szkiełka roztworem eozyny przez minutę, a następnie spłukać je. Odwróć etapy hydratacji, aby odwodnić poplamione tkanki, zaczynając od etanolu.

Następnie potraktuj je ksylenem. Slajdy można następnie zamontować i zobrazować. Korzystając z opisanych procedur, na 8-tygodniowych myszach przeprowadzono zakrywanie miazgi

Sześć tygodni później pobrano i zbadano ich szczęki. Co ciekawe, barwienie H&E ujawniło tworzenie się zębiny w całej komorze miazgi i kanałach korzeniowych. Dla porównania, niezasklepiony ząb trzonowy nie wykazywał takiej samej formacji zębiny.

W ząbkowatym zębie trzonowym stwierdzono cechy charakterystyczne zarówno formacji zębinowej, jak i kostnej, ponieważ zarówno kanaliki zębinowe, jak i osteocyty znaleziono w zębinie naprawczej, co sugeruje, że uszkodzona miazga może być mineralizowana zarówno przez rezydujące odontoblasty, jak i imigrujące osteoblasty. Zastosowanie barwienia immunohistochemicznego DMP1 dodatkowo potwierdziło zwiększoną aktywność komórek tworzących zębinę naprawczą. Podobnie jak w prawdziwych stomatologicznych praktykach klinicznych, posiadanie asystenta jest niezwykle pomocne.

Na przykład z asystentem tę technikę można wykonać w zaledwie dziesięć minut, po opanowaniu. Co ważne, odsłaniając miazgę, pamiętaj, aby używać endofile, a nie wiertła. A kiedy wręczasz MTA, bądź ostrożny.

Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami, takimi jak paraformaldehyd, może być bardzo niebezpieczna. Należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.