Name: Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę bezpośredniego pokrywania miazgi u myszy do badania gojenia tkanek zęba i tworzenia zębiny naprawczej. Technika ta pozwala oceniać biologię miazgi in vivo oraz testować materiały stomatologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez R01DE023348 (RHK) z NIDCR/NIH oraz Grant Badawczy Wydziału (RHK) z Rady ds. Badań Senatu Akademickiego Wydziału Los Angeles Uniwersytetu Kalifornijskiego.

Myszy zakupiono w Jackson Laboratory i trzymano w wolnym od patogenów wiwarium na Wydziale Medycyny Zwierząt Laboratoryjnych UCLA (DLAM). Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi instytucjonalnymi Komitetu Badań nad Zwierzętami Kanclerza (ARC#2016-037).
1. Znieczulenie myszy
<ol>
	<li>Użyj ośmiotygodniowych samic myszy C57 / BL6 (n = 3).</li>
	<li>Znieczulić myszy roztworami ketaminy (80-120 mg/kg masy myszy)/ksylazyny (5 mg/kg masy myszy) i podawać dootrzewnowo (ip) w dawce 10 ml/kg.</li>
	<li>Przygotować roztwory ketaminy (80 - 120 mg/kg)/ksylazyny (5 mg/kg) i podawać je dootrzewnowo (ip) w dawce 10 ml/kg.</li>
	<li>Upewnij się, że myszy są w pełni znieczulone, wykonując szczypanie palca u nogi.</li>
</ol>
2. Procedura zamykania miazgi
<ol>
	<li>Umieść uchwyt na usta w ustach myszy.</li>
	<li>Zamocuj uchwyt na usta na stole tak, aby głowa była skierowana do góry.</li>
	<li>Umieść mikroskop (10X) na górze jamy ustnej tak, aby pierwszy ząb trzonowy szczęki był w pełni widoczny.</li>
	<li>Używając wiertła 1/4-round w szybkoobrotowej rękojeści o prędkości 200 000 obr./min, usuń szkliwną część zęba pośrodku, aż miazga będzie widoczna przez przezroczystą zębinę. Nie odsłaniaj miazgi za pomocą wiertła.</li>
	<li>Za pomocą pilnika endodontycznego K #15 (średnica 150 μm) przebić zębinę i odsłonić miazgę. 
	UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby resztki zębiny nie dostały się do miazgi. Można tego uniknąć, obracając pilnik K co kwartał, a następnie wyciągając plik K.</li>
	<li>Wymieszać MTA ze sterylnymH2Ozgodnie z instrukcjami producenta. Dostarcz i umieść MTA na odsłoniętej miazdze za pomocą końcówki eksploratora. Użyj tylnej strony papierowego punktu (drobnego), aby zapakować MTA do odsłoniętej miazgi, delikatnie stukając. Grubsza strona papierowego punktu jest płaska, co pozwala na odpowiednią kondensację MTA w odsłoniętej masie celulozowej.</li>
	<li>Wytrawiaj ząb przez 15 sekund, umieszczając 35% wytrawiacz kwasem fosforowym w miejscu, w którym pokrywa on ząb. Należy zachować szczególną ostrożność, aby ograniczyć umieszczanie wytrawiacza, ponieważ może on podrażniać tkanki dziąseł. 
	UWAGA: Wytrawiacz jest dostarczany w strzykawce i służy do szorstkowania powierzchni zębów, tak aby kleje dentystyczne mogły napływać, pośrednicząc w mikromechanicznym wiązaniu zęba. Ponieważ są lepkie, można je samodzielnie kontrolować, nakładając niewielkie ilości bezpośrednio na ząb.</li>
	<li>Użyj ssania podciśnieniowego, aby usunąć wytrawiacz. Użyj bawełnianej granulki, która jest lekko nasączonaH2O, aby usunąć pozostałości wytrawiacza. Powtarzaj ten krok, aż wytrawiacz zostanie całkowicie usunięty z zęba.</li>
	<li>Za pomocą miotełki do kurzu na sprężone powietrze delikatnie osusz ząb.</li>
	<li>Nałóż kleje dentystyczne za pomocą tylnej strony papierowego punktu.</li>
	<li>Cienkiej warstwę kleju za pomocą sprężonego powietrza przez 3 sekundy.</li>
	<li>Utwardzaj kleje dentystyczne przez 20 sekund za pomocą utwardzacza z lampą.</li>
	<li>Umieść płynny kompozyt w małych ilościach na zębie, który został pokryty MTA. Użyj końcówki eksploratora, aby wlać kompozyt do rowków zębów.</li>
	<li>Utwardzaj kompozyt przez 30 s za pomocą urządzenia światłoutwardzalnego do jego polimeryzacji. Upewnij się, że kompozyt jest w pełni utwardzony i twardy za pomocą eksploratora.</li>
</ol>
3. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Karprofen (5 mg/kg) należy podawać podskórnie (sc) bezpośrednio po zabiegu pokrywania miazgi.</li>
	<li>Umieść myszy na poduszce grzewczej o niskiej mocy, aby zwierzęta były ciepłe, zanim się obudzą.</li>
	<li>Zwróć myszy do wiwarium w celu schronienia.</li>
</ol>
4. Pobieranie tkanek
<ol>
	<li>Po 5-6 tygodniach poddać myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w stanie całkowitego znieczulenia izofluranem.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij szczękę z podstawy czaszki i włóż ją do probówki o pojemności 50 ml. Zamocuj całą szczękę, która zawiera zarówno ząb pokryty miazgą, jak i przeciwległy ząb niezamknięty, w 4% paraformaldehydzie w PBS, pH 7,4, w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie przechowuj go w 70% roztworze etanolu. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i rakotwórczy. Właściwe stosowanie paraformaldehydu powinno być monitorowane zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi (SOP).</li>
	<li>Zeskanuj szczęki myszy za pomocą tomografii komputerowej μCT. Aby zabezpieczyć szczęki podczas skanowania, owiń próbki gazą nasączoną 70% etanolem i umieść je w probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml.</li>
</ol>
5. Skanowanie μCT
<ol>
	<li>Przygotuj próbki do skanowania μCT. Krótko owiń próbki gazą nasączoną 70% etanolem i zabezpiecz je w ogólnej stożkowej probówce do hodowli komórkowej o pojemności 15 ml. Zamontuj rurkę na stoliku skanowania μCT, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego na prąd 145 μA, napięcie 55 kVp i czas ekspozycji 200 ms.</li>
	<li>Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą skanera μCT o rozdzielczości 20 μm i z filtrem Al 0,5 mm.</li>
	<li>Zrekonstruuj obraz i zwizualizuj go11.</li>
	<li>Po zakończeniu badania μCT rozpocznij odwapnianie za pomocą 5% EDTA i 4% sacharozy w PBS (pH 7,4) przez 2 tygodnie.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie i barwienie tkanek
<ol>
	<li>Odwapnione tkanki zanurzyć w parafinie. Przed osadzeniem przyciąć szczękę, wykonując strzałkowe cięcie bezpośrednio przed pierwszym zębem trzonowym. Podczas osadzania należy ustawić tę powierzchnię w dół, tak aby przekrój podłużny pierwszego zęba trzonowego był powierzchnią cięcia.</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu przygotuj szkiełka o grubości 5 μm. Obszary przykrycia miazgi zwykle pokrywają się z korzeniem dystalnym (DP), który może być używany jako punkt orientacyjny. Określ dokładny obszar zainteresowania, badając histologię pod mikroskopem świetlnym i porównując obrazy μCT.</li>
	<li>W przypadku barwienia H&E należy odparafinować i ponownie uwodnić szkiełka ksylenem (2x) i seryjnie rozcieńczonym etanolem (100% EtOH 2x, 95% EtOH 2x i 70% EtOH 1x).</li>
	<li>Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu.</li>
	<li>Plamić roztworem Hematoxyliny przez 2,5 minuty i spłukać wodą z kranu.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w 95% etanolu na 1 minutę.</li>
	<li>Plamić roztworem Eozyny przez 1 minutę i spłukać wodą z kranu.</li>
	<li>Odwodnić seryjnie rozcieńczonym etanolem (70% EtOH 1x, 95% EtOH 2x i 100% EtOH 3x) i ksylenem (3x).</li>
	<li>Zamontuj prowadnice za pomocą rozwiązania montażowego.</li>
</ol>

<ol><li>Dye, B., Thornton-Evans, G., Li, X., Iafolla, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+caries+and+tooth+loss+in+adults+in+the+United+States%2C+2011-2012%5BTitle%5D)+AND+%22NCHS+Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Dental caries and tooth loss in adults in the United States, 2011-2012.</a> NCHS Data Brief. (197), 197(2015).</li>
<li>Bagramian, R. A., Garcia-Godoy, F., Volpe, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+increase+in+dental+caries.+A+pending+public+health+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Dent%22%5BJournal%5D)">The global increase in dental caries. A pending public health crisis.</a> Am J Dent. 22 (1), 3-8 (2009).</li>
<li>Koliniotou-Koumpia, E., Tziafas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulpal+responses+following+direct+pulp+capping+of+healthy+dog+teeth+with+dentine+adhesive+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent%22%5BJournal%5D)">Pulpal responses following direct pulp capping of healthy dog teeth with dentine adhesive systems.</a> J Dent. 33 (8), 639-647 (2005).</li>
<li>Tarim, B., Hafez, A. A., Cox, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulpal+response+to+a+resin-modified+glass-ionomer+material+on+nonexposed+and+exposed+monkey+pulps%5BTitle%5D)+AND+%22Quintessence+Int%22%5BJournal%5D)">Pulpal response to a resin-modified glass-ionomer material on nonexposed and exposed monkey pulps.</a> Quintessence Int. 29 (8), 535-542 (1998).</li>
<li>Tziafa, C., Koliniotou-Koumpia, E., Papadimitriou, S., Tziafas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentinogenic+responses+after+direct+pulp+capping+of+miniature+swine+teeth+with+Biodentine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endod%22%5BJournal%5D)">Dentinogenic responses after direct pulp capping of miniature swine teeth with Biodentine.</a> J Endod. 40 (12), 1967-1971 (2014).</li>
<li>Dammaschke, T., Stratmann, U., Fischer, R. J., Sagheri, D., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histologic+investigation+of+direct+pulp+capping+in+rodents+with+dentin+adhesives+and+calcium+hydroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Quintessence+Int%22%5BJournal%5D)">A histologic investigation of direct pulp capping in rodents with dentin adhesives and calcium hydroxide.</a> Quintessence Int. 41 (4), 62-71 (2010).</li>
<li>Jegat, N., Septier, D., Veis, A., Poliard, A., Goldberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+effects+of+amelogenin+gene+splice+products+A%2B4+and+A-4+implanted+in+the+exposed+rat+molar+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Head+Face+Med%22%5BJournal%5D)">Short-term effects of amelogenin gene splice products A+4 and A-4 implanted in the exposed rat molar pulp.</a> Head Face Med. 3, 40(2007).</li>
<li>Paterson, R. C., Radford, J. R., Watts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+the+rat+molar+pulp+of+two+proprietary+calcium+hydroxide+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Dent+J%22%5BJournal%5D)">The response of the rat molar pulp of two proprietary calcium hydroxide preparations.</a> Br Dent J. 151 (6), 184-186 (1981).</li>
<li>Sela, J., Ulmansky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+of+normal+and+inflamed+dental+pulp+to+Calxyl+and+zinc+oxide+and+eugenol+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Reaction of normal and inflamed dental pulp to Calxyl and zinc oxide and eugenol in rats.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 30 (3), 425-430 (1970).</li>
<li>Maurice, C. G., Schour, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cavity+preparations+in+the+molar+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental cavity preparations in the molar of the rat.</a> J Dent Res. 34 (3), 429-434 (1955).</li>
<li>Skyscan, N. V. NRecon user manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf">http://bruker-microct.com/next/NReconUserGuide.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sohn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ORAI1+in+the+Odontogenic+Differentiation+of+Human+Dental+Pulp+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The Role of ORAI1 in the Odontogenic Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells.</a> J Dent Res. 94 (11), 1560-1567 (2015).</li>
<li>Kim, S., Shin, S. J., Song, Y., Kim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Experiments+with+Dental+Pulp+Stem+Cells+for+Pulp-Dentin+Complex+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">In Vivo Experiments with Dental Pulp Stem Cells for Pulp-Dentin Complex Regeneration.</a> Mediators Inflamm. 2015, 409347(2015).</li>
<li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (25), 13625-13630 (2000).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odontogenic+capability%3A+bone+marrow+stromal+stem+cells+versus+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Odontogenic capability: bone marrow stromal stem cells versus dental pulp stem cells.</a> Biol Cell. 99 (8), 465-474 (2007).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+dental+pulp+stem+cells+and+platelet-rich+plasma+for+pulp+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endod%22%5BJournal%5D)">Transplantation of dental pulp stem cells and platelet-rich plasma for pulp regeneration.</a> J Endod. 38 (12), 1604-1609 (2012).</li>
<li>Iohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+regeneration+by+dental+pulp+stem+cell+therapy+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2.</a> J Dent Res. 83 (8), 590-595 (2004).</li>
<li>Saito, K., Nakatomi, M., Ida-Yonemochi, H., Ohshima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteopontin+Is+Essential+for+Type+I+Collagen+Secretion+in+Reparative+Dentin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Osteopontin Is Essential for Type I Collagen Secretion in Reparative Dentin.</a> J Dent Res. , (2016).</li>
<li>Hunter, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Acts+as+a+Pro-Survival+Signal+to+Enhance+Dentin+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Wnt Acts as a Pro-Survival Signal to Enhance Dentin Regeneration.</a> J Bone Miner Res. , (2015).</li>
<li>Goldberg, M., Kulkarni, A. B., Young, M., Boskey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin%3A+structure%2C+composition+and+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Elite+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Dentin: structure, composition and mineralization.</a> Front Biosci (Elite Ed). 3, 711-735 (2011).</li>
<li>Nascimento, A. B., Fontana, U. F., Teixeira, H. M., Costa, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+of+a+resin-modified+glass-ionomer+cement+applied+as+pulp+capping+in+human+teeth%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Dent%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility of a resin-modified glass-ionomer cement applied as pulp capping in human teeth).</a> Am J Dent. 13 (1), 28-34 (2000).</li>
<li>Bogen, G., Kim, J. S., Bakland, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+pulp+capping+with+mineral+trioxide+aggregate%3A+an+observational+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Dent+Assoc%22%5BJournal%5D)">Direct pulp capping with mineral trioxide aggregate: an observational study.</a> J Am Dent Assoc. 139 (3), 305-315 (2008).</li>
<li>Miller, R. A., Nadon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+animal+use+for+gerontological+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Principles of animal use for gerontological research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 55 (3), 117-123 (2000).</li>
<li>Shah, A., Song, M., Cao, Y., Kang, M. K., Kim, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+absent+in+pulpal+and+periapical+inflammatory+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are absent in pulpal and periapical inflammatory lesions.</a> J Dent Res. 95, 1503(2016).</li>
<li>Williams, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+bone+resorption+and+woven+bone+formation+are+associated+with+development+of+osteonecrosis+of+the+jaw-like+lesions+by+bisphosphonate+and+anti-receptor+activator+of+NF-kappaB+ligand+antibody+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Impaired bone resorption and woven bone formation are associated with development of osteonecrosis of the jaw-like lesions by bisphosphonate and anti-receptor activator of NF-kappaB ligand antibody in mice).</a> Am J Pathol. 184 (11), 3084-3093 (2014).</li>
<li>McPherson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+map+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A physical map of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 934-941 (2001).</li>
<li>Gregory, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+map+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A physical map of the mouse genome.</a> Nature. 418 (6899), 743-750 (2002).</li>
<li>Hilton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keys+to+clinical+success+with+pulp+capping%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Oper+Dent%22%5BJournal%5D)">Keys to clinical success with pulp capping: a review of the literature.</a> Oper Dent. 34 (5), 615-625 (2009).</li>
<li>Holmdahl, R., Bockermann, R., Backlund, J., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+pathogenesis+of+collagen-induced+arthritis+in+mice--a+model+for+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">The molecular pathogenesis of collagen-induced arthritis in mice--a model for rheumatoid arthritis.</a> Ageing Res Rev. 1 (1), 135-147 (2002).</li>
<li>Kalu, D. N., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovariectomized+murine+model+of+postmenopausal+calcium+malabsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ovariectomized murine model of postmenopausal calcium malabsorption.</a> J Bone Miner Res. 14 (4), 593-601 (1999).</li>
<li>Yokochi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+experimental+murine+model+for+lipopolysaccharide-mediated+lethal+shock+with+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">A new experimental murine model for lipopolysaccharide-mediated lethal shock with lung injury.</a> Innate Immun. 18 (2), 364-370 (2012).</li>
<li>Abe, T., Hajishengallis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+ligature-induced+periodontitis+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of the ligature-induced periodontitis model in mice.</a> J Immunol Methods. 394 (1-2), 49-54 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecnie dostępnych jest kilka różnych modeli eksperymentalnych do walidacji wpływu in vivo materiałów dentystycznych, rusztowań lub czynników wzrostu na zębopochodne różnicowanie komórek macierzystych miazgi zębowej (DPSC)13. Modele te obejmują ektopowe autologiczne przeszczepienie DPSC do narządu, takiego jak torebka nerkowa, lub podskórne przeszczepienie DPSC myszom z obniżoną odpornością z rusztowaniami14,15. Metody te są jednak ograniczone, ponieważ ich zębopochodne działanie na DPSC ni...

Próchnica zębów jest jedną z najbardziej rozpowszechnionych chorób jamy ustnej i główną przyczyną interwencji chirurgicznych w uzębienie u prawie wszystkich osób1,2. Rokowanie w przypadku interwencji chirurgicznych i odbudowy zęba w dużej mierze zależy od prawidłowej odpowiedzi miazgi i pomyślnego gojenia się ran. Rzeczywiście, próchnica, która wnika głęboko przez szkliwo i zębinę, często prowadzi do odsłonięcia leżącej pod spodem tkanki miazgi, która często jest "pokryta" materiałami dentystycznymi, takimi jak wodorotlenek wapnia (Ca(OH)2) lub hydrauliczne cementy krzemianowo-wapniowe (HCSC), w tym agregaty trójtlenku mineralnego (MTA). Ostatecznym celem takiej procedury pokrywania miazgi jest przyspieszenie gojenia się ran miazgi poprzez regenerację naprawczej zębiny, fizycznej bariery, która działa jak "biologiczna pieczęć" chroniąca leżącą pod spodem tkankę miazgi i wydłużająca oczekiwaną długość życia zęba oraz ogólny stan zdrowia jamy ustnej. Jednak mechanizm leżący u podstaw gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia się zębiny nie jest w pełni poznany.
Aby lepiej zrozumieć mechanizmy gojenia się ran miazgowych i naprawczego tworzenia zębiny in vivo, wcześniej wykorzystano kilka zwierząt, w tym małpy, psy i świnie3-5. Wśród nich często wykorzystywane są szczury, ponieważ są stosunkowo mniejsze w porównaniu z innymi zwierzętami, ale ich zęby są wystarczająco duże, aby wykonać bezpośrednie pokrycie miazgi bez żadnych trudności technicznych6-10. Te modele zwierzęce są idealną alternatywą dla badań na ludziach w celu zbadania reakcji miazgi i naprawczego tworzenia zębiny. Jednak ich wykorzystanie jest ograniczone do badań obserwacyjnych na poziomie komórkowym i prawie nie dostarczają mechanistycznych wglądów podczas naprawczego tworzenia zębiny na poziomie molekularnym.
Ostatnie osiągnięcia techniczne w inżynierii genetycznej dostarczyły nieocenionych i niezbędnych narzędzi badawczych - myszy, które posiadają gen, który jest albo nadmiernie eksprymowany, albo usunięty - które są instrumentalne do badania molekularnych mechanizmów chorób ludzkich in vivo. Liczba różnych szczepów myszy transgenicznych lub nokautujących, które są strategicznie indukowane w sposób specyficzny dla komórki, stale rośnie w społeczności naukowej. Dlatego badanie gojenia się ran miazgi i naprawczej regeneracji zębiny u tych myszy znacznie pomogłoby w zrozumieniu tych procesów na poziomie molekularnym. Jednak wykorzystanie myszy jest znacznie ograniczone, ponieważ wykonanie procedury pokrywania miazgi na zębie myszy jest technicznie trudne ze względu na jego miniaturowe rozmiary. W tym miejscu przedstawiamy naszą powtarzalną metodę wykonywania bezpośredniego pokrywania miazgi u myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy BM-LED</td><td>Mikroskop MEIJI Techno</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Optima MCX-LED&nbsp;</td><td>Bien Air Dental</td><td>1700588-001</td><td>Silnik elektryczny</td></tr><tr><td>izofluran</td><td>Henry schein zdrowie zwierząt</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td></td></tr><tr><td>1/4 okrągłego wiertła</td><td>Brasseler</td><td>001092T0</td><td></td></tr><tr><td>Pilnik endodontyczny K</td><td>Roydent</td><td>98947</td><td></td></tr><tr><td>ProRoot MTA</td><td>Dentsply</td><td>PROROOT5W</td><td>MTA</td></tr><tr><td>Papierowy punkt</td><td>Henry schein</td><td>100-3941</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Etch</td><td>Ultradent produkt Inc.</td><td></td><td>Wytrawiacz kwasem fosforowym</td></tr><tr><td>OptiBond SoloPlus</td><td>Kerr</td><td>29669</td><td>Kleje</td></tr><tr><td>Coltolux LED</td><td>Coltene/whaledent Inc.</td><td>C7970100115</td><td>Jednostka utwardzająca</td></tr><tr><td>Odcień charakteryzacji</td><td>Bisco</td><td>T-14012</td><td>Płynny kompozytowy</td></tr><tr>skaner<td>Skyscan</td><td>Breuker</td><td>1275</td><td>uCT</td></tr><tr><td>Microm</td><td>Thermo</td><td>HM355S</td><td>Microtome</td></tr><tr><td>Hematoxyline-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>7221</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Thermo Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-16</td><td>Rozwiązanie montażowe</td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice

Miazga zębowa jest ważnym organem zęba w pełni chronionym przez szkliwo i zębinę. Kiedy miazga jest odsłonięta z powodu urazów próchnicotwórczych lub jatrogennych, często jest pokryta materiałami biokompatybilnymi w celu przyspieszenia gojenia się ran miazgowych. Ostatecznym celem jest regeneracja regenerującej zębiny, fizycznej bariery, która działa jak "biologiczna pieczęć" i chroni leżącą pod nią tkankę miazgi. Chociaż ta bezpośrednia procedura pokrywania miazgi jest od dawna stosowana w stomatologii, mechanizm molekularny leżący u podstaw gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia się zębiny jest nadal słabo poznany. Aby wywołać naprawczą zębinę, pokrywanie miazgi przeprowadzono eksperymentalnie u dużych zwierząt, ale w mniejszym stopniu u myszy, prawdopodobnie ze względu na ich małe rozmiary i wynikające z tego trudności techniczne. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową, krok po kroku metodę wykonywania zabiegu zakładania miazgi u myszy, w tym przygotowanie ubytku podobnego do ubytku klasy I, umieszczenie materiałów do pokrywania miazgi oraz procedurę odbudowy przy użyciu kompozytu dentystycznego. Nasz mysi model pokrywki miazgi odegra zasadniczą rolę w badaniu podstawowych mechanizmów molekularnych gojenia się ran miazgi w kontekście naprawczej zębiny in vivo, umożliwiając wykorzystanie myszy transgenicznych lub knockoutowych, które są powszechnie dostępne w społeczności naukowej.

W niniejszym materiale przedstawiono krok po kroku procedury wykonywania opracowania miazgi w zębach myszy. Jednym z kluczowych aspektów opracowania miazgi u myszy jest posiadanie odpowiedniego sprzętu. W związku z tym niezbędne jest zastosowanie mikroskopu z 10-krotnym powiększeniem (Rysunek 1A). W celu wykonania w zębie preparacji przypominającej klasę I, zastosowano wiertło kuliste ¼ w elektrycznej końcówce wysokobiegowej przy prędkości 200 000 rpm (Rysunek 1B<...

Opisujemy krok po kroku metodę bezpośredniego pokrywania miazgi na zębach myszy w celu oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny in vivo.

Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Dental pulp is a vital organ of a tooth fully protected by enamel and dentin. When the pulp is exposed due to cariogenic or iatrogenic injuries, it is ...

Ogólnym celem tego protokołu jest przedstawienie procedury bezpośredniego zamykania miazgi u myszy. Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii miazgi, takie jak to, jak goi się miazga lub jak tworzy się naprawcza zębina, gdy umieszcza się uwięzione materiały pokrywające miazgę na odsłoniętej miazdze. Główną zaletą tej techniki jest to, że rzeczywista procedura bezpośredniego pokrywania miazgi wykonywana u ludzi może być również wykonywana u myszy, dokładnie w ten sam sposób.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku poprawy właściwości materiału w celu ratowania zębów, które w przeciwnym razie byłyby skazane na bardziej inwazyjne leczenie, takie jak leczenie kanałowe. Po odpowiednim znieczuleniu myszy do zabiegu, umieść uchwyt na usta w jej ustach, a drugi koniec przymocuj do stołu tak, aby głowa była skierowana do góry. Używając dobrego oświetlenia i stereoskopu, obserwuj pierwszy ząb trzonowy szczęki.Następnie, używając ćwiartki okrągłego wiertła w szybkoobrotowej rękojeści przy 200 000 obr./min, usuń centralny obszar szkliwa zęba, aż miazga będzie widoczna przez przezroczystą zębinę. Uważaj, aby nie wniknąć w miazgę. Następnie, używając nie.15 pilnik endodontyczny k, przebić przez zębinę i odsłonić miazgę. Nie wpychaj żadnych zanieczyszczeń do miazgi; Można tego uniknąć, obracając pilnik k co kwartał, a następnie wyciągając plik k. Teraz przygotuj MTA i za pomocą eksploratora dostarcz MTA, a następnie zapakuj go w odsłonięty obszar, używając tylnej strony papierowego punktu i delikatnego stuknięcia.Następnie, za pomocą strzykawki wypełnionej 35% wytrawiaczem kwasu fosforowego, pokryj ząb wytrawiaczem, omijając tkanki dziąseł, i pozwól wytrawianiu działać przez 15 sekund. Po 15 sekundach odessaj wytrawiacz z zęba i użyj bawełnianego aplikatora zwilżonego wodą, aby zetrzeć pozostały wytrawiacz. Ssać i wycierać, aż cały wytrawiacz zostanie usunięty.Następnie nakładaj kleje dentystyczne za pomocą tylnej strony papierowego punktu. Spraw, aby warstwa kleju była cienka, przedmuchując ją sprężonym powietrzem przez kilka sekund. Następnie utwardzaj klej przez 30 sekund odpowiednim światłem.Teraz umieść niewielkie ilości kompozytu na zębie za pomocą końcówki eksploratora, aby wpłynąć kompozyt do rowków zęba. Po nałożeniu utwardź kompozyt przez 30 sekund. Po eutanazji myszy i usunięciu całej szczęki, umieść szczękę w 4% paraformaldehydzie w PBS o pH 7,4.Trzymaj tkankę w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez noc, a następnego ranka przenieś ją do 70% etanolu w celu przechowywania, aż będzie można ją przetworzyć. Aby wykonać mikrotomografię komputerową szczęki, najpierw zabezpiecz ją gazą nasączoną 70% etanolem, a następnie zapakuj do 15-mililitrowej probówki do hodowli komórkowej. Następnie zamontuj rurkę na stoliku do skanowania mikro CT.Następnie ustaw źródło promieniowania rentgenowskiego tak, aby dostarczało prąd o natężeniu 145 mikroamperów i szczytowym napięciu 55 kilowoltów przez 200 milisekund. Za pomocą filtra aluminiowego o średnicy 0,5 milimetra uzyskaj obrazy o rozdzielczości 20 mikronów. Po zakończeniu skanów rozpocznij odwapnianie szczęki za pomocą 5% EDTA i 4% sacharozy w PBS, przy pH 7,4.Pozwól tej reakcji trwać przez dwa tygodnie w 4 stopniach Celsjusza. Po osadzeniu szczęki ułóż plastry o grubości pięciu mikronów. Obszary przykrycia miazgi zwykle pokrywają się z dystalnym korzeniem podniebiennym, który może służyć jako punkt orientacyjny.Określ dokładny obszar zainteresowania, badając histologię pod mikroskopem świetlnym i porównując wyniki ze skanami mikro CT. W przypadku barwienia H&E usuń parafinę i ponownie nawodnij szkiełka za pomocą dwóch kąpieli w ksylenie przez kilka minut każda. Następnie przepuść je przez serię seryjnie rozcieńczonego etanolu.Każda kąpiel powinna być stosowana tylko przez jedną minutę. Po nawodnieniu przepłukać powietrze. A następnie nałóż roztwór hemotoksyliny na dwie i pół minuty.Usuń barwnik za pomocą płukanki, a następnie umieść szkiełka w 95% etanolu na jedną minutę. Następnie zabarwić szkiełka roztworem eozyny przez minutę, a następnie spłukać je. Odwróć etapy hydratacji, aby odwodnić poplamione tkanki, zaczynając od etanolu.Następnie potraktuj je ksylenem. Slajdy można następnie zamontować i zobrazować. Korzystając z opisanych procedur, na 8-tygodniowych myszach przeprowadzono zakrywanie miazgi.Sześć tygodni później pobrano i zbadano ich szczęki. Co ciekawe, barwienie H&E ujawniło tworzenie się zębiny w całej komorze miazgi i kanałach korzeniowych. Dla porównania, niezasklepiony ząb trzonowy nie wykazywał takiej samej formacji zębiny.W ząbkowatym zębie trzonowym stwierdzono cechy charakterystyczne zarówno formacji zębinowej, jak i kostnej, ponieważ zarówno kanaliki zębinowe, jak i osteocyty znaleziono w zębinie naprawczej, co sugeruje, że uszkodzona miazga może być mineralizowana zarówno przez rezydujące odontoblasty, jak i imigrujące osteoblasty. Zastosowanie barwienia immunohistochemicznego DMP1 dodatkowo potwierdziło zwiększoną aktywność komórek tworzących zębinę naprawczą. Podobnie jak w prawdziwych stomatologicznych praktykach klinicznych, posiadanie asystenta jest niezwykle pomocne.Na przykład z asystentem tę technikę można wykonać w zaledwie dziesięć minut, po opanowaniu. Co ważne, odsłaniając miazgę, pamiętaj, aby używać endofile, a nie wiertła. A kiedy wręczasz MTA, bądź ostrożny.Nie zapominaj, że praca z utrwalaczami, takimi jak paraformaldehyd, może być bardzo niebezpieczna. Należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej.

development-direct-pulp-capping-model-for-evaluation-pulpal-wound

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film prezentuje technikę tworzenia wspólnej kultury neuronów trójdzielnych i pierwotnych komórek miazgi zębowej za pomocą filtra transwell. W tym fizycznie oddzielonym stanie komórki mezenchymalne uzyskane z tkanki miazgi zęba wydzielają parakrynne cząsteczki sygnałowe, które przechodzą przez pory, promując różnicowanie i migrację neuronów w kierunku komórek mezenchymalnych, tworząc system kohodowli.

Ustanowienie wspólnej hodowli komórek miazgi zębowej i neuronów trójdzielnych do komunikacji krzyżowej

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Tutaj prezentujemy protokół miejscowego wywoływania wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy. Pokazujemy, jak wywiercić otwór w zębie myszy i odsłonić jego miazgę, aby wywołać miejscowy stan zapalny. Przedstawiono również metody analityczne mające na celu zbadanie charakteru tego zapalenia, takie jak mikrotomografia komputerowa i histologia.

Wywoływanie wierzchołkowego zapalenia przyzębia u myszy

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Ten protokół krok po kroku pokazuje, jak wydobyć pierwszy ząb trzonowy żuchwy u myszy. Stanowi alternatywną metodę dla badaczy zajmujących się gojeniem i regeneracją kości szczęki.

Opracowanie modelu gojenia zębodołu po ekstrakcji zębów trzonowych żuchwy u myszy

Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół tworzenia modelu zapalenia miazgi u myszy za pomocą innowacyjnego knebla ustnego, po którym następuje analiza histologiczna.

Opracowanie modelu ekspozycji miazgi mysiej z nowatorskim kneblem do badań nad zapaleniem miazgi

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Mikrotwardość jest właściwością mechaniczną i parametrem informacyjnym do oceny patofizjologii tkanek twardych. Tutaj demonstrujemy znormalizowany protokół (przygotowanie próbki, polerowanie, płaska powierzchnia i miejsca wgłębień) do analizy mikrotwardości kości zębów i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni, a mianowicie fluorozy zębów i resorpcji kości przyzębia wywołanej ligaturą.

Pomiary mikrotwardości kości zęba i wyrostka zębodołowego w modelach chorób jamy ustnej gryzoni

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

Aby zbadać łączoną allotransplantację narządów litych i unaczynionych kompozytów, opisujemy nowy heterotopowy model przeszczepu en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i serca u myszy przy użyciu techniki mankietu szyjki macicy bez szwów.

Nowatorski model mikrochirurgiczny do heterotopowego, en bloc ściany klatki piersiowej, grasicy i przeszczepu serca u myszy

Poznaj metodę bezpośredniego pokrywania miazgi u myszy do badania gojenia tkanek zęba i tworzenia zębiny naprawczej. Technika ta pozwala oceniać biologię miazgi in vivo oraz testować materiały stomatologiczne.

Opracowanie modelu bezpośredniego pokrywania miazgi do oceny gojenia się ran miazgi i naprawczego tworzenia zębiny u myszy

Przeglądaj więcej filmów