Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie szczegółowej metodologii badania poziomej transmisji DNA w Staphylococcus aureus poprzez zajęcie się trzema głównymi szlakami transferu. Koniugacja, transdukcja i naturalna transformacja. Metoda ta polega na poziomym transferze genów oporności na antybiotyki w ludzkim patogenie gronkowca złocistego.

Główną zaletą wprowadzonych tu technik jest to, że możemy przetestować trzy główne sposoby transferu, w tym niedawno odkrytą naturalną transformację genetyczną. Aby rozpocząć eksperyment, przygotuj pięć mililitrów nocnej kultury bakterii dawcy i biorcy w tryptycznym bulionie sojowym. Lub pożywka TSB odpowiednio z 32 miligramami na litr chloramfenikolu i bez niego.

Z wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dostosuj gęstość optyczną nocnych kultur do gęstości ze świeżą pożywką TSB. Wymieszaj 0,5 mililitra kultury dawcy z 0,5 mililitra kultury biorcy.

I dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do mieszaniny. Następnie za pomocą systemu pomp próżniowych przenieś mieszaninę bakterii na membranę filtracyjną o średnicy 0,45 mikrometra. Umieść membrany filtracyjne na płytce z agarem z krwią owczą.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden dzień. Wyjmij membranę filtracyjną z płytki i zawieś ją w 10 mililitrach PBS. Wiruj mieszaninę przez około minutę, aby zebrać wszystkie bakterie przyczepione do membrany.

Wykonaj seryjne 10-krotne rozcieńczenie zawiesiny bakteryjnej świeżym TSB. Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczonych próbek 0, 10, 4 na agarze TSB. Lub płytki TSA uzupełnione 32 miligramami na litr chloramfenikolu i ośmioma miligramami na litr tetracykliny w celu wybrania transkoniugantów.

Umieść 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny na płytkach TSA z ośmioma miligramami na litr samej tetracykliny. Aby policzyć łączną liczbę adresatów. Po inkubacji przeanalizuj podwójnie odporne kolonie pod kątem obecności genu CFR za pomocą colony PCR i ich profili podatności.

Oznaczyć antybiogram, mierząc minimalne stężenia hamujące (MIC) odpowiednich antybiotyków zgodnie ze standardową metodą mikrorozcieńczenia lub metodą dyfuzji krążkowej. Profil wrażliwości transkoniugantów musi być identyczny z profilem biorcy. Z wyjątkiem chloramfenikolu i innych związków, na które wpływa gen CFR.

Aby wykluczyć oporność na tetracyklinę wywodzącą się ze szczepu dawcy. Przygotuj nocną kulturę N315-45 w pięciu mililitrach bulionu odżywczego uzupełnionego 3,6 milimola wapnia. Przygotuj subkultury, rozcieńczając kulturę przez noc od jednego do 1 000 w końcowej objętości 10 mililitrów w szklanych fiolkach o pojemności 50 mililitrów.

Hoduj bakterie przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem, 180 obrotów na minutę. Następnie należy przygotować serię rozcieńczonych fagów MR83a w pożywce NB z chlorkiem wapnia. Dodać 20 mikrolitrów rozcieńczonego faga do kultury bakteryjnej.

Przygotuj kulturę kontrolną bez infekcji fagowej, która posłuży jako pozytywna kontrola wzrostu komórek bakteryjnych. Następnie hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie potrząsając z prędkością 100 obrotów na minutę przez noc. Następnego dnia należy wybrać jedną lub dwie oczyszczone fiolki hodowlane o najwyższym rozcieńczeniu dodanego faga.

Przenieś kultury do 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Dodaj 250 mikrolitrów chloroformu do probówek i dokładnie wymieszaj kulturę, odwracając je. Odwirować kulturę w temperaturze 5 000 razy G przez 20 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Przenieś supernatanty do świeżych probówek i przechowuj je w temperaturze 4 stopni Celsjusza do czasu użycia. Przygotuj pożywkę bulionową, pożywkę agarową i utrzymuj ją w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza. Dodać autoklalawowany 0,5 molowy roztwór chlorku wapnia do pożywki do końcowego stężenia 3,6 milimola.

Wlej go do 90-milimetrowych szalek Petriego NB płytki z chlorkiem wapnia. Przygotuj przez noc kulturę N315 w pięciu mililitrach chlorku wapnia NB w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Następnego dnia dodaj 10 mikrolitrów nocnej kultury do 200 mikrolitrów chlorku wapnia NB i równomiernie rozprowadź go na płytce z chlorkiem wapnia NB.

Przestań się rozprowadzać, gdy powierzchnia płytki zostanie pokryta płynem. Następnie pozostaw płytkę do wyschnięcia na pięć minut. Wykonać seryjne rozcieńczenie od 1 do 10 wcześniej przygotowanego faga za pomocą pożywki NB z chlorkiem wapnia.

Umieścić trzy mikrolitry każdego rozcieńczenia faga na płytce pokrytej bakteriami. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Następnego ranka policz liczby blaszek i oblicz miano faga, korzystając z poniższego równania.

Przygotuj nocną hodowlę N315, COL lub MU50 w pięciu mililitrach chlorku wapnia NB w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obrotów na minutę. Po całonocnej hodowli rozcieńczyć faga w chlorku wapnia NB do 109 PFU na mililitr. W szklanej fiolce o pojemności 50 mililitrów wymieszaj 500 mikrolitrów kultury przez noc, 500 mikrolitrów świeżego chlorku wapnia NB i jeden mililitr faga 109 PFU na mililitr.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie wstrząsając z prędkością 100 obrotów na minutę przez 30 minut. Po inkubacji dodaj do kultur 50 mikrolitrów 20% cytrynianu trisodowego. Kontynuuj delikatne wstrząsanie przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przygotuj stopiony napar z serca mózgu lub podłoże agarowe BHI i przechowuj je w łaźni wodnej o temperaturze 55 stopni Celsjusza, a następnie potraktuj podłoże agarowe 32 miligramami na litr chloramfenikolu. Następnie przenieś mieszaninę fagów bakterii do kolby o pojemności 100 mililitrów. Dodaj 50 mililitrów ciepłego agaru BHI uzupełnionego 32 miligramami na litr chloramfenikolu i dobrze wymieszaj.

Wlej mieszaninę do 90-milimetrowych szalek Petriego. Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dalej przetestuj wygenerowane kolonie, transdukty, pod kątem odporności, przenosząc kolonie na nowe płytki agarowe BHI uzupełnione 32 miligramami na litr chloramfenikolu.

Potwierdź obecność genu CFR za pomocą PCR kolonii. Hoduj komórkę biorczą przez noc w pięciu mililitrach TSB w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem. Następnego ranka przenieś 0,5 mililitra nocnej kultury do 1,5 mililitrowej probówki.

Wytrącić komórki przez odwirowanie. Następnie zawieś komórki z 10 mililitrami pożywki CS2 w 50-mililitrowej probówce. Następnie hoduj bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem z prędkością 180 obrotów na minutę przez osiem godzin, aż do późnej fazy wykładniczej.

Zbierz komórki przez odwirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach świeżej pożywki CS2. Dodać 10 mikrogramów oczyszczonego plazmidu lub genomowego DNA do zawiesiny komórki.

Potrząśnij kulturą z prędkością 180 obrotów na minutę. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić komórki w 10 mililitrach pożywki BHI.

Wymieszaj zawiesinę komórkową z 90 mililitrami stopionego suplementu agarowego BHI Z 32 miligramami na litr chloramfenikolu i pięcioma mikrogramami na litr tetracykliny w eksperymencie kontrolnym. Wlej mieszaninę do 90-milimetrowych szalek Petriego, szybko ostudź i pozwól agarowi zastygnąć. Replikuj kolonie za pomocą wykałaczek na płytki zawierające odpowiednie antybiotyki, aby potwierdzić ich charakterystykę oporności.

Protokół koniugacji jest przydatny w przypadku transmisji wewnątrzgatunkowej, w której jako dawca CFR użyto Staphylococcus epidermidis. Jako biorcę użyto szczepu Staphylococcus aureus N315. Protokół stosowany do transmisji międzygatunkowej daje podobne wyniki przy użyciu tego samego wektora koniugacyjnego u różnych dawców koniugacyjnych.

Jest to pierwsza praca, w której opisano szczegóły naturalnej transformacji. Przedstawiona metodologia byłaby przydatna dla badacza do zbadania przenoszenia i rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki, a także głównego czynnika determinującego ludzki patogen gronkowca złocistego.