Name: Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metody badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus obejmujące konjugację, transdukcję i transformację naturalną. Protokoły te umożliwiają analizę rozprzestrzeniania genów oporności na antybiotyki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution i JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

UWAGA: Szczepy i materiały użyte w tej pracy są wymienione odpowiednio w Tabeli 1 i Tabeli Materiałów. W eksperymentach transmisyjnych jako donory genu cfr wykorzystano pochodne N315 i COL cfr-dodatnie (N315-45 i COL-45). Szczepy te zostały wcześniej uzyskane przez koniugację, przy użyciu jako dawcy klinicznego cfr-dodatniego szczepu Staphyloccocus epidermidis (ST2), zgodnie ze standardowym protokołem koniugacji (patrz poniżej). Szczep ten zawierał gen cfr na plazmidzie7 podobnym do pSCFS7.
1. Koniugacja metodą łączenia filtrów
UWAGA: Jako dawca użyto szczepu S. aureus N315 z genem cfr (N315-45)7 (CmR). Jako odbiorcy użyto szczepów COL8 lub Mu509 (TetR, CmS). Podwójnie odporne kolonie (TetR, CmR) zdolne do wzrostu w obecności 32 mg/L chloramfenikolu i 8 mg/L tetracykliny uznano za przypuszczalne transkoniuwanty i przeanalizowano je w celu określenia obecności cfr metodą colony PCR oraz określenia profilu wrażliwości biorcy.
<ol>
	<li>Wykonaj koniugację zgodnie z wcześniej opisanym protokołem10 z kilkoma modyfikacjami:
	<ol>
		<li>Przygotować 5 ml całonocnej hodowli dawcy i biorcy w pożywce z bulionu sojowego tryptycznego (TSB) (odpowiednio z 32 mg/l chloramfenikolu i bez niego), wstrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dostosuj gęstość optyczną (OD600) nocnych kultur do 1 (OD600 = 1,0) używając świeżej pożywki TSB. Wymieszaj 0,5 ml kultury dawcy (N315-45) z 0,5 ml kultury biorcy (COL lub Mu50). Dodać 1 ml PBS do mieszanki.</li>
		<li>Przenieś mieszaninę bakterii na membranę filtracyjną 0,45 μm za pomocą systemu pompy próżniowej.</li>
		<li>Umieść membrany filtracyjne na płytce z agarem z krwią owczą. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 dzień. 
		UWAGA: Na tym etapie konieczne jest wzbogacenie pożywki, aby umożliwić wzrost komórek podwójnie odpornych.</li>
		<li>Wyjąć membranę filtracyjną z płytki i zawiesić w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dobrze zawiruj, aby zebrać wszystkie bakterie przyczepione do membrany.</li>
		<li>Wykonać seryjne 10-krotne rozcieńczenie zawiesiny bakteryjnej przy użyciu świeżego TSB. Płytka 100 μl rozcieńczonych 0-10-4 próbek na płytkach z agarem TSB (TSA) uzupełniona 32 mg/l chloramfenikolu i 8 mg/l tetracykliny do wyboru transkoniugantów. Umieścić 100 μl rozcieńczonej zawiesiny (10-5-10-6) na płytkach TSA z samą tetracykliną 8 mg/l, aby policzyć całkowitą liczbę biorców. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.</li>
		<li>Analiza kolonii podwójnie opornych (przypuszczalnych transkoniugantów) pod kątem obecności genu cfr za pomocą PCR7 i ich profili wrażliwości (antybiogram).</li>
		<li>Określić antybiogram, mierząc minimalne stężenia hamujące (MIC) odpowiednich antybiotyków zgodnie ze standardową metodą mikrorozcieńczenia lub metodą dyfuzji krążkowej11. Profil wrażliwości transkoniugantów musi być identyczny dla biorcy, z wyjątkiem chloramfenikolu (i innych związków, na które wpływa gen cfr). To oznaczenie jest niezbędne, aby wykluczyć oporność na tetracykliny wywodzącą się ze szczepu dawcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Transdukcja fagów
UWAGA: Bakteriofag MR83a należący do rodziny Siphoviridae (zapas laboratoryjny) został użyty w eksperymentach transdukcji. N315-45 był używany jako dawca cfr w przypadku infekcji fagowej. Jako biorców użyto szczepów N315, COL lub Mu50. Nabycie cfr zostało określone na podstawie zdolności szczepu biorcy do wzrostu w obecności 32 mg/l chloramfenikolu. Kolonie rosnące w tych warunkach analizowano w celu określenia obecności cfr (by colony PCR) oraz określenia profilu podatności w celu wykluczenia potencjalnego zanieczyszczenia.
<ol>
	<li>Amplifikacja faga na dawcy
	<ol>
		<li>Przygotować nocną kulturę N315-45 w 5 ml bulionu odżywczego uzupełnionego 3,6 mM Ca2+ (NBCaCl2) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min). 
		UWAGA: Wapń jest niezbędny do infekcji fagowej. Zobacz tabelę materiałów. Bulion odżywczy innych firm może mieć problemy, takie jak wytrącanie się wapnia.</li>
		<li>Przygotować subkultury, rozcieńczając nocną kulturę w stosunku 1:1 000 w końcowej objętości 10 ml NBCaCl2 w 50 ml szklanych kolbach lub szklanych fiolkach. Hoduj bakterie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min).</li>
		<li>Przygotować serię rozcieńczonych fagów MR83a w pożywce NBCaCl2 (10-2, 10-3, 10-4, 10-5 i 10-6). Dodać 20 μl rozcieńczonego faga do kultury bakteryjnej. Należy również przygotować kulturę kontrolną bez infekcji fagowej, która służy jako pozytywna kontrola wzrostu komórek bakteryjnych i może być wykorzystana do określenia miana faga następnego dnia.</li>
		<li>Hodować kultury w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (100 obr./min) przez noc. 
		UWAGA: Komórki będą rosły do pewnego stopnia, gdy infekujący nie będzie w nadmiarze; Następnie wejdą w fazę lizy z powodu amplifikacji faga w cyklu litycznym. Hodowla bez faga wykaże pełny wzrost, podczas gdy kultury z fagiem będą wykazywać wyraźne wskaźniki przezroczystości.</li>
		<li>Wybrać jedną lub dwie oczyszczone fiolki hodowlane o najwyższym rozcieńczeniu dodanego faga.</li>
		<li>Przenieść kultury do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml. Dodać 250 μl chloroformu i dokładnie wymieszać, odwracając probówki.</li>
		<li>Odwirować probówki o masie 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatanty do świeżych probówek i przechowywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: jest stabilny przez co najmniej kilka miesięcy, ale zbyt długie przechowywanie preparatu fagowego zmniejsza miano i wydajność transdukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar miana faga (test płytki fagowej)
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę z bulionu agarowego (1,5% agaru); utrzymywać go w cieple w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C. Dodać autoklawowany roztwór 0,5 M CaCl2 do pożywki do końcowego stężenia 3,6 mM. Wlej go do szalek Petriego o średnicy 90 mm (NBCaCl2 płytki).</li>
		<li>Przygotować całonocną hodowlę N315 w 5 ml NBCaCl2 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem; można ją zastąpić kulturą kontrolną opisaną powyżej (etap 2.1.3).</li>
		<li>Dodać 10 μl kultury na noc do 200 μl NBCaCl2 i równomiernie rozprowadzić na płytce NBCaCl2. Zatrzymaj rozprowadzanie, gdy powierzchnia płytki zostanie pokryta płynem. Pozostaw talerz do wyschnięcia.</li>
		<li>Wykonać seryjne rozcieńczenie 1:10 (od 10-5-10-10) wcześniej przygotowanego faga (krok 2.1.8) przy użyciu pożywki NBCaCl2.</li>
		<li>Umieścić 3 μl każdego rozcieńczenia faga na płytce pokrytej bakteriami.</li>
		<li>Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C.</li>
		<li>Policz liczbę blaszek i oblicz miano faga, korzystając z następującego równania: Jednostka tworząca płytkę miażdżycową (pfu)/ml = liczba blaszek x współczynnik rozcieńczenia/objętość plamki (3 x 10-3 ml)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdukcja fagów 
	UWAGA: Pula fagów przygotowana w poprzednim kroku (2.1.8) służy do badania transdukcji genu cfr do szczepów S. aureus. W tym eksperymencie jako biorców użyto szczepów N315, COL lub Mu50.
	<ol>
		<li>Przygotować nocną hodowlę N315, COL lub Mu50 w 5 ml NBCaCl2 w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min).</li>
		<li>Rozcieńczyć faga w NBCaCl2 do ~109 pfu/ml.</li>
		<li>W szklanej fiolce o pojemności 50 ml wymieszać 500 μl hodowli na noc, 500 μl świeżego NBCaCl2 i 1 ml faga (~109 pfu/ml); oczekiwana wielokrotność infekcji (MOI) nie może przekraczać 1. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając (100 obr./min) przez 30 min. 
		UWAGA: Obróbka cieplna komórek biorczych tuż przed dodaniem faga (52 °C przez 2 minuty w celu inaktywacji endogennych enzymów restrykcyjnych) może zwiększyć wydajność12.</li>
		<li>Dodaj 50 μl 20% Na3-Citrate. Kontynuować delikatne wstrząsanie przez 30 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Cytrynian 3 Na działa jako umiarkowany chelator wapnia.</li>
		<li>Przygotować stopiony napar mózgowo-sercowy (BHI) z agaru (1,5% agaru) i przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 55 °C.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę bakterii i fagów do kolby o pojemności 100 ml, dodać 50 ml ciepłego agaru BHI uzupełnionego 32 mg/l chloramfenikolu i dobrze wymieszać. Wlej mieszaninę do szalek Petriego o średnicy 90 mm. 
		UWAGA: Ta metoda umożliwia wykrycie niewielkiej liczby rosnących kolonii (przypuszczalnych transduktantów).</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 24-48 godzin.</li>
		<li>Dalsze testowanie wytworzonych kolonii (transduktantów) pod kątem odporności poprzez przeniesienie kolonii na nowe płytki agarowe BHI uzupełnione 32 mg/l chloramfenikolu. Potwierdź obecność genu cfr za pomocą PCR7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Naturalna transformacja
UWAGA: Test naturalnej transformacji u S. aureus został przeprowadzony zgodnie z metodą opisaną w naszym poprzednim badaniu2. Jako odbiorca użyto pochodnej N315, N2-2.12,7. W tym szczepie locus sigH został zduplikowany tak, aby konstytutywnie wyrazić SigH2. Szczegółowe procedury dotyczące izolowania wariantów kompetencji wyrażających SigH można znaleźć w poprzednim opisie2. Jeśli marker rezystancji, który ma zostać przeniesiony, nie jest chloramfenikolem, pRIT-sigH (CmR) może być użyty do wyrażenia SigH, jak opisano wcześniej2. Oczyszczony plazmid lub ekstrakt z całego DNA z S. aureus pozyskanego przez cfr COL-457 jest używany jako DNA dawcy do transformacji.
<ol>
	<li>Przygotowanie DNA dawcy
	<ol>
		<li>Uprawiać COL-45 przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C w kolbie o pojemności 300 ml zawierającej 50 ml TSB uzupełnionej 32 mg/l chloramfenikolu. Kultura E. coli HST04 przenosząca plazmid pHY300 (TetR) w celu ekstrakcji plazmidu do eksperymentu kontrolnego. 
		UWAGA: HST04 (dam-/dcm-) nie ma genów metylazy DNA13. Inne konwencjonalne szczepy z metylazą DNA mogą być również używane do przygotowania dawcy DNA, ponieważ stan metylacji DNA nie wpływa na wydajność transformacji. Alternatywnie, plazmid pT181 oczyszczony ze szczepu S. aureus COL może być również użyty jako kontrola pozytywna dla testu transformacji2.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Wyodrębnij plazmidy za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidowego DNA lub konwencjonalnej metody oczyszczania DNA w celu oczyszczenia całego DNA.</li>
		<li>Oznaczyć ilościowo oczyszczone DNA za pomocą spektrometru i utrzymywać je w temperaturze 4 °C do momentu użycia. 
		UWAGA: Do testu transformacji należy użyć świeżego preparatu DNA, zwykle młodszego niż tydzień. Stare preparaty DNA obniżają efektywność przemiany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test transformacyjny
	<ol>
		<li>Hodować komórkę biorczą (N2-2,1) przez noc w 5 ml TSB w temperaturze 37 °C, wstrząsając.</li>
		<li>Przenieść 0,5 ml kultury na noc do probówki o pojemności 1,5 ml. Wytrącić komórki przez odwirowanie (10 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Zawiesić komórki z 10 ml pożywki CS2 w probówce o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Pożywka CS2 jest kompletnym podłożem syntetycznym, które indukuje kompetencję do naturalnej przemiany w S. aureus2 (patrz skład podłoża w Tabeli Materiałów). Inne standardowe podłoża laboratoryjne, takie jak TSB lub BHI, nie nadają się do transformacji2,13.</li>
		<li>Hodować bakterie w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) aż do późnej fazy wykładniczej (około 8 godzin).</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Zawiesić komórki w 10 ml świeżej pożywki CS2.</li>
		<li>Dodać 10 μg oczyszczonego plazmidu lub genomu DNA (krok 3.1.4) do zawiesiny komórki. Wstrząsać w temperaturze 37 °C i 180 obr./min przez 2,5 godz. 
		UWAGA: Krótszy czas inkubacji z DNA (<2,5 godziny) skutkuje niższymi częstotliwościami transformacji.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (5 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki BHI. Zmieszać zawiesinę komórkową z 90 ml stopionego agaru BHI (55 °C) z dodatkiem 32 mg/l chloramfenikolu (lub 5 mg/l tetracykliny w doświadczeniu kontrolnym). Wlej mieszaninę na szalki Petriego o średnicy 90 mm. Szybko ostudź i pozwól agarowi stężeć.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Replikacja wygenerowanych kolonii (transformantów) poprzez przeniesienie kolonii (za pomocą wykałaczek) na nowe płytki agarowe BHI zawierające odpowiednie antybiotyki w celu potwierdzenia ich charakterystyki oporności. Potwierdź nabyty gen oporności (cfr lub tetM) za pomocą PCR7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+variation+and+evolution+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus.</a> IJMM. 300, 98-103 (2010).</li>
<li>Morikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+cryptic+secondary+sigma+factor+gene+unveils+natural+competence+for+DNA+transformation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus.</a> PLoS Pathog. 8, e1003003(2012).</li>
<li>Caryl, J. A., O'Neill, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+pGO1%2C+the+prototype+conjugative+plasmid+from+the+Staphylococci%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci.</a> Plasmid. 62, 35-38 (2009).</li>
<li>Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phage-related+chromosomal+islands+of+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria.</a> Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).</li>
<li>Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+nanotubes+mediate+bacterial+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intercellular nanotubes mediate bacterial communication.</a> Cell. 144, 590-600 (2011).</li>
<li>Dubey, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+Characteristics+of+Bacterial+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+cell%22%5BJournal%5D)">Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes.</a> Dev cell. 36, 453-461 (2016).</li>
<li>Cafini, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+gene+transmission+of+the+cfr+gene+to+MRSA+and+Enterococcus%3A+role+of+Staphylococcus+epidermidis+as+a+reservoir+and+alternative+pathway+for+the+spread+of+linezolid+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance.</a> J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).</li>
<li>Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penicillinase+production+and+intrinsic+resistance+to+penicillins+in+Staphylococcus+aures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures.</a> Lancet. 1, 835-838 (1966).</li>
<li>Kuroda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+sequencing+of+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Lancet. 357, 1225-1240 (2001).</li>
<li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322, 1843-1845 (2008).</li>
<li>Clinical Laboratory Standards Institute. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+for+Dilution+Antimicrobial+Susceptibility+Tests+for+Bacteria+that+Growth+Aerobically+-+Seventh+Edition%3A+Approved+Standard+M7-A7%22">Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically - Seventh Edition: Approved Standard M7-A7</a>. , CLSI. Wayne, PA, USA. (2006).</li>
<li>Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+DNA+transfer+efficiency+by+temporary+inactivation+of+host+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction.</a> BioTechniques. 26, 892-894 (1999).</li>
<li>Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-affecting+antibiotics+modulate+natural+transformation+in+SigH-expressing+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antibiot%22%5BJournal%5D)">Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus.</a> J. Antibiot. , (2015).</li>
<li>Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cfr+rRNA+methyltransferase+confers+resistance+to+Phenicols%2C+Lincosamides%2C+Oxazolidinones%2C+Pleuromutilins%2C+and+Streptogramin+A+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).</li>
<li>Ando, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-modification+system+differences+in+Helicobacter+pylori+are+a+barrier+to+interstrain+plasmid+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer.</a> Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).</li>
<li>Evans, B. A., Rozen, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+variation+in+transformation+frequency+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae.</a> ISME J. 7, 791-799 (2013).</li>
<li>Wilson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+the+natural+transformation+frequency+of+Campylobacter+jejuni+in+liquid+shake+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture.</a> Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).</li>
<li>McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+temperate+bacteriophage%3A+carriage+and+horizontal+gene+transfer+is+lineage+associated%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, 6(2012).</li>
<li>Lindsay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+genomics+and+the+impact+of+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22IJMM%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer.</a> IJMM. 304, 103-109 (2014).</li>
<li>Uchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intragenus+generalized+transduction+in+Staphylococcus+spp.+by+a+novel+giant+phage%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage.</a> ISME J. 8, 1949-1952 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisano trzy główne metody badania HGT uwarunkowań genetycznych u S. aureus. Chociaż transdukcja i koniugacja są badane od dziesięcioleci, istnienie naturalnej transformacji zostało dostrzeżone dopieroniedawno2. W związku z tym S. aureus jest wyposażony we wszystkie trzy główne tryby HGT, a przetestowanie wszystkich z nich jest wymagane w celu wyjaśnienia możliwych ścieżek rozprzestrzeniania się uwarunkowań genetycznych. Celem niniejszej pracy jest opracowanie ...

Staphylococcus aureus to komensalna bakteria Gram-dodatnia, która naturalnie zamieszkuje skórę i jamę nosową ludzi i zwierząt. Ten gatunek bakterii jest główną przyczyną zakażeń szpitalnych w szpitalach i placówkach opieki zdrowotnej. Co więcej, jej zdolność do rozwijania oporności na różne związki przeciwdrobnoustrojowe sprawiła, że zarządzanie infekcjami wywoływanymi przez tę bakterię stało się globalnym problemem.
Znane są dwie główne ścieżki związane z rozprzestrzenianiem się fenotypów oporności: klonalne rozprzestrzenianie się odpornych genotypów i rozprzestrzenianie się genetycznych determinantów wśród puli bakteryjnej. W przypadku S. aureus stwierdzono, że różne geny oporności na antybiotyki (a także determinanty wirulencji) są związane z ruchomymi elementami genetycznymi (MGE)1. Obecność tych elementów w genomie S. aureus wskazuje, że pozyskiwanie i przenoszenie materiału genetycznego w populacji bakterii może odgrywać ważną rolę w adaptacji i ewolucji S. aureus.
Materiał genetyczny może być wymieniany przez trzy dobrze znane mechanizmy HGT u bakterii Gram-dodatnich: transformację, koniugację i transdukcję fagów. Transformacja polega na wychwytywaniu wolnego DNA. Aby pozyskać obce DNA, komórki bakteryjne muszą rozwinąć specjalną fazę fizjologiczną: etap kompetencji. Po osiągnięciu tego etapu kompetentne komórki są zdolne do transportu DNA do cytoplazmy, uzyskując nowe determinanty genetyczne. W przypadku S. aureus wykazano niedawno istnienie naturalnej transformacji2. W związku z tym nasza grupa rzuciła światło na znaczenie ekspresji czynnika SigH (tajemniczego wtórnego czynnika transkrypcyjnego sigma) na etapie rozwoju kompetencji oraz na to, w jaki sposób jego konstytutywna ekspresja sprawia, że S. aureus jest zdolny do osiągnięcia etapu kompetencji, co pozwala na nabycie odpornych fenotypów w drodze naturalnej transformacji2.
Koniugacja to proces polegający na przekazywaniu DNA z jednej żywej komórki (dawcy) do drugiej (biorcy). Obie komórki muszą być w bezpośrednim kontakcie, co pozwala na wymianę DNA, a jednocześnie jest chronione przez specjalne struktury, takie jak rurki lub pory. Transfer DNA tą metodą wymaga maszynerii koniugacyjnej. U S. aureus prototypem plazmidu koniugacyjnego jest PGO1, który zawiera operon koniugacyjny TraA3.
Transdukcja fagów polega na przenoszeniu DNA z komórki do komórki poprzez infekcję bakteriofagową i implikuje pakowanie bakteryjnego DNA, zamiast wirusowego, do kapsydu faga. Większość izolatów S. aureus jest lizogenizowana przez bakteriofagi1. W warunkach stresowych profagi mogą zostać wycięte z genomu bakteryjnego i przejść do cyklu litycznego.
To są trzy dobrze znane mechanizmy transmisji DNA u S. aureus. Istnieje kilka dodatkowych mechanizmów transferu, takich jak "pseudo-transformacja"2 i systemy podobne do fagów w transferze wysp patogenicity4. Niedawno jedna grupa poinformowała, że "nanorurki" są zaangażowane w przenoszenie materiałów komórkowych (w tym plazmidowego DNA) między sąsiednimi komórkami5,6, ale do tej pory nie pojawiło się badanie uzupełniające z innych grup.
Ta praca dostarcza niezbędnej metodologii do badania HGT u S. aureus, zajmując się trzema głównymi szlakami transferu: koniugacją, transdukcją i naturalną transformacją. Wyniki uzyskane za pomocą tych metodologii wykorzystano do zbadania transmisji genu cfr (oporność na chloramfenikol/florfenikol) wśród szczepów S. aureus7. Te trzy techniki są wszechstronnymi narzędziami do badania transmisji MGE u S. aureus.

<table><tbody><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy (TSB)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>211825</tr><tr><td>Napar z mózgu i serca (BHI)</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td></td><td></td>211059</tr><tr><td>Bulion odżywczy nr 2</td><td>Oxoid</td><td>CM0067</td><td></td></tr><tr><td>Agar z krwią owczą</td><td>Eiken Chemical Co., Ltd.</td><td>E-MR96</td><td>Tryptyczny agar sojowy z dodatkiem 5% (v/v) krwi owczej według producenta.</td></tr><tr><td>Agar w proszku</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>010-08725</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu (dihydrat cytrynianu trisodowego)</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>191-01785</td><td></td></tr><tr><td>Ester celulozy siatkowany 0,45 &mu; L Filtr HAWG</td><td>Merck Milipore</td><td>HAWG 02500</td><td></td></tr><tr><td>QIAfilter Zestaw Plasmid Midi</td><td>QIAGEN</td><td>12243</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia badania horyzontalnego transferu genów u staphylococcus aureus

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

Jedną z ważnych cech głównego oportunistycznego ludzkiego patogenu Staphylococcus aureus jest jego niezwykła zdolność do szybkiego nabywania odporności na antybiotyki. Badania genomiczne ujawniają, że S. aureus jest nosicielem wielu genów wirulencji i oporności zlokalizowanych w ruchomych elementach genetycznych, co sugeruje, że horyzontalny transfer genów (HGT) odgrywa kluczową rolę w ewolucji S. aureus. Nadal jednak brakuje pełnego i szczegółowego opisu metodologii zastosowanej do badania HGT u S. aureus, zwłaszcza w odniesieniu do naturalnej przemiany, która została ostatnio zgłoszona w tej bakterii. W niniejszej pracy opisano trzy protokoły, które są przydatne w badaniach in vitro HGT u S. aureus: koniugacja, transdukcja fagowa i naturalna transformacja. W tym celu wykorzystano gen cfr (oporność na chloramfenikol/florfenikol), który nadaje fenotyp oporności na fenotyp fenotypów fenikolsów, linkozamidów, oksazolidynonów, pleuromutylin i streptograminy A (PhLOPSA). Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których S. aureus przenosi materiał genetyczny do innych szczepów, ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia szybkiego nabywania oporności i pomaga wyjaśnić sposoby rozprzestrzeniania się zgłaszane w programach nadzoru lub dokładniej przewidzieć sposób rozprzestrzeniania się w przyszłości.

Przedstawione tutaj wyniki zostały wcześniej opublikowane (zaadaptowano z referencji7 za zgodą wydawcy). Zbadaliśmy potencjalne drogi transmisji genu cfr, który powoduje niskopoziomową oporność na linezolid oraz ekspresję fenotypu oporności PhLOPSA14,15 w szczepach S. aureus, analizując trzy mechanizmy HGT.
Rysunek 1</str...

Opisujemy tutaj trzy różne protokoły do badania in vitro koniugacji, transdukcji i naturalnej transformacji u Staphylococcus aureus.

Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Ogólnym celem tej procedury jest zapewnienie szczegółowej metodologii badania poziomej transmisji DNA w Staphylococcus aureus poprzez zajęcie się trzema głównymi szlakami transferu. Koniugacja, transdukcja i naturalna transformacja. Metoda ta polega na poziomym transferze genów oporności na antybiotyki w ludzkim patogenie gronkowca złocistego.Główną zaletą wprowadzonych tu technik jest to, że możemy przetestować trzy główne sposoby transferu, w tym niedawno odkrytą naturalną transformację genetyczną. Aby rozpocząć eksperyment, przygotuj pięć mililitrów nocnej kultury bakterii dawcy i biorcy w tryptycznym bulionie sojowym. Lub pożywka TSB odpowiednio z 32 miligramami na litr chloramfenikolu i bez niego.Z wstrząsaniem w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dostosuj gęstość optyczną nocnych kultur do gęstości ze świeżą pożywką TSB. Wymieszaj 0,5 mililitra kultury dawcy z 0,5 mililitra kultury biorcy.I dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS do mieszaniny. Następnie za pomocą systemu pomp próżniowych przenieś mieszaninę bakterii na membranę filtracyjną o średnicy 0,45 mikrometra. Umieść membrany filtracyjne na płytce z agarem z krwią owczą.I

methodology-for-study-horizontal-gene-transfer-staphylococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Cafini, F., et.al. Metodologia badania horyzontalnego transferu genów w Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukowany kompetencjami wychwyt DNA w Staphylococcus aureus poprzez naturalną transformację. Wrażliwy na chloramfenikol szczep zmodyfikowany w celu konstytutywnej ekspresji czynnika sigma jest hodowany w warunkach ograniczających składniki odżywcze w celu zwiększenia kompetencji, a następnie inkubowany z DNA dawcy zawierającym gen oporności. Udany transfer...

Wychwyt DNA indukowany kompetencjami w Staphylococcus aureus

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Mając na celu zrozumienie zachowań różnych bakteryjnych elementów koniugującego DNA w różnych warunkach, opisujemy protokół wykrywania różnic w częstotliwości koniugacji, z wysoką rozdzielczością, aby oszacować, jak skutecznie bakteria dawcy inicjuje koniugację.

Porównanie częstości koniugacji bakteryjnej w wysokiej rozdzielczości

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Ta analityczna platforma obliczeniowa dostarcza praktycznych wskazówek dla mikrobiologów, ekologów i epidemiologów zainteresowanych genomiką populacji bakteryjnej. W szczególności zaprezentowane tutaj prace pokazały, w jaki sposób można przeprowadzić: i) mapowanie hierarchicznych genotypów pod kierunkiem filogenezy; ii) analiza genotypów oparta na częstotliwości; iii) analizy pokrewieństwa i klonalności; iv) Identyfikacja loci akcesoryjnych różnicujących rodowód.

Eksploracja heurystyczna hierarchicznych genotypów i dodatkowych loci genomu w populacjach bakteryjnych

Koniugacja pośredniczy w poziomym transferze genów poprzez mobilizację plazmidowego DNA przez dwie różne komórki, ułatwiając rozprzestrzenianie korzystnych genów. W pracy opisano szeroko stosowaną metodę skutecznego wykrywania sprzęgającego transferu plazmidu, opartą na zastosowaniu markerów różnicowych u plazmidu koniugacyjnego, dawcy i biorcy w celu wykrycia transkoniugacji.

Wykrywanie horyzontalnego transferu genów, w którym pośredniczą naturalne plazmidy koniugacyjne w E. coli

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów w otwartych systemach przepływowych z zastosowaniem reaktorów z przepływem kropelkowym oraz reaktorów z obracającym się dyskiem.

Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia u szczura wywołanego przez gronkowiec złocisty (S. aureus) oporny na metycylinę.

Eksperymentalny model zapalenia wsierdzia wywołanego przez gronkowiec złocisty oporny na metycylinę (Staphylococcus aureus MRSA) u szczura

Poznaj metody badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus obejmujące konjugację, transdukcję i transformację naturalną. Protokoły te umożliwiają analizę rozprzestrzeniania genów oporności na antybiotyki.

Metodologia badania horyzontalnego transferu genów u Staphylococcus aureus

Przeglądaj więcej filmów