Name: Zastosowanie reaktorów z przepływem kroplowym i obrotowym dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj metody hodowli biofilmów bakteryjnych Staphylococcus aureus w reaktorach z przepływem kroplowym i obrotowym dyskiem. Protokoły te umożliwiają analizę struktury biofilmu przy zastosowaniu sił ścinających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant NIAID K22AI081748.

1. Reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym
<ol>
<li>Reaktor biofilmu z przepływem kroplowym (dostępny w firmie Biosurface Technologies lub wersje projektowane na zamówienie, które zazwyczaj mogą zostać wykonane w uniwersyteckich warsztatach mechanicznych, patrz Rysunek 1) zostaje złożony i autoklawowany. Montaż polega na przymocowaniu kuponów w komorach i zabezpieczeniu pokryw komór. Komora, wraz z pożywką do biofilmu (bulion sojowo-tryptykowy 2 g/L i glukoza 2 g/L) oraz rurkami doprowadzającymi składniki odżywcze, są sterylizowane w autoklawie.</li>
<li>Inokulacja reaktora z przepływem kroplowym jest przeprowadzana poprzez ustawienie reaktora na płaskiej powierzchni, zaklemowanie linii rurek odpływowych, napełnienie każdej komory 10 mL bulionu sojowo-tryptykowego i dodanie 10 μL kultury S. aureus hodowanej przez noc w bulionie sojowo-tryptykowym. Zainokulowany reaktor jest następnie umieszczany w inkubatorze w temperaturze 37°C na 18 godzin.</li>
<li>Po 18 godzinach inkubacji rurki odpływowe zostają odblokowane, a reaktor jest ustawiany na drewnianym bloku dociętym pod kątem 10°.</li>
<li>Aseptycznie podłącz rurkę doprowadzającą składniki odżywcze do butelki zawierającej bulion odżywczy do przepływu ciągłego. Przeciągnij linię rurek przez pompę i zapowietrz rurki, uruchamiając pompę z maksymalną prędkością (różni się ona w zależności od modelu pompy).</li>
<li>Po zapowietrzeniu rurki doprowadzającej zatrzymaj pompę i przymocuj igły łączące (rozmiar 22G, 1 cal) do końca każdej rurki. Przetrzyj korek wlotowy komory chusteczką nasączoną etanolem i aseptycznie wprowadź igły przez korek wlotowy.</li>
<li>Włącz pompę i pozwól pożywce powoli kapać (szybkość przepływu ~125 μL/minuta) na kupony. Pożywka powinna spływać w dół wzdłuż kuponu od otworu korka wlotowego do otworu odpływowego. Eksploatuj reaktor w przepływie ciągłym przez 2-5 dni (w zależności od zastosowania), okresowo sprawdzając, czy w reaktorze zachodzi prawidłowy odpływ.</li>
<li>Aby zebrać biofilmy z reaktora z przepływem kroplowym, zatrzymaj pompę i ostrożnie wyjmij igły z reaktora. Reaktor można następnie ustawić na płaskiej powierzchni, a kupony aseptycznie usunąć za pomocą sterylnej pincety. Jeśli planowana jest mikroskopia, kupony można teraz odpowiednio przetworzyć (Rysunek 2B przedstawia mikrofotografię z elektronowego mikroskopu skanującego biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze biofilmu z przepływem kroplowym). Jeśli celem badania jest ilościowe określenie biomasy biofilmu lub badania fizjologiczne, biofilm można usunąć z kuponu za pomocą skrobaka do komórek. Trzymając kupony pincetą, delikatnie zeskrob biofilm z kuponu do probówki stożkowej zawierającej roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, używając skrobaka do komórek. Uwaga: aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie w biofilmach, konieczne jest zhomogenizowanie zebranych biofilmów za pomocą homogenizatora do tkanek w celu rozbicia grudek i utworzenia jednorodnej zawiesiny. Do tego zastosowania nadają się różne modele homogenizatorów do tkanek. My wykorzystujemy homogenizator Fisher Scientific Tissuemiser (produkt nr 15-338-420) przy pełnej prędkości przez 1 minutę w celu zhomogenizowania próbek biofilmu. Brak homogenizacji biofilmu spowoduje niedoszacowanie liczby jednostek tworzących kolonie obecnych w próbce.</li>
</ol>
2. Rotacyjny dyskowy bioreaktor biofilmu
<ol>
<li>Reaktor biofilmu z obracającym się dyskiem (dostępny w Biosurface Technologies lub wykonany na zamówienie, patrz Rycina 3) zostaje zmontowany i autoklawowany. Montaż reaktora polega na umieszczeniu kuponów dysku obrotowego w szczelinach dysku obrotowego, a następnie umieszczeniu go w 1-litrowym zlewce szklanym z otworem przelewowym. Jako zatyczka reaktora stosowany jest gumowy korek nr 15 z wywierconymi otworami umożliwiającymi przepływ pożywki i napowietrzanie. Następnie reaktor, pożywka do biofilmu (bulion sojowo-kazeinowy 2 g/L i glukoza 2 g/L) oraz rurki doprowadzające są sterylizowane w autoklawie.</li>
<li>Reaktor biofilmu z obracającym się dyskiem zostaje zaszczepiony poprzez wlanie 250 mL sterylnej pożywki do reaktora i dodanie 0,5 mL nocnej kultury S. aureus hodowanej w bulionie sojowo-kazeinowym. Reaktor jest następnie umieszczany na mieszadle magnetycznym ustawionym na 250 rpm i inkubowany przez noc w pożądanej temperaturze.</li>
<li>Po 16 godzinach inkubacji podłącz rurkę doprowadzającą do portu w zbiorniku z pożywką, a następnie do pompy perystaltycznej. Następnie uruchamia się pompę i ustawia przepływ na ~0,25 mL/min (przepływ można zmieniać w zależności od pożądanej szybkości wzrostu).</li>
<li>Po 24 godzinach zatrzymaj reaktor i aseptycznie wyjmij dysk, nie dotykając kuponów biofilmu. Wyjmij kupony za pomocą sterylnej pęsety i zanurz każdy z nich w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, aby usunąć luźno przytwierdzone bakterie.</li>
<li>W celu testowania związków przeciwdrobnoustrojowych chipy można umieścić w poszczególnych studzienkach płytki 96-dołkowej zawierającej badane związki. Po inkubacji chipy przenosi się do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL zawierających 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym i homogenizuje za pomocą homogenizatora tkankowego, aby rozproszyć nienaruszony biofilm.</li>
<li>Następnie komórki poddaje się rozcieńczeniom seryjnym i wysiewa na pożywkę agarową Nutrient Agar w celu oznaczenia żywych jednostek tworzących kolonie.</li>
<li>Uwaga: powyższy protokół można modyfikować na wiele sposobów. Na przykład kupony dysku obrotowego można powlekać potencjalnymi związkami przeciwbiofilmowymi lub wykonywać z nich, aby przetestować ich skuteczność. Można również oceniać środki rozpraszające biofilm, inkubując kupony w związkach rozpraszających i kwantyfikując bakterie przytwierdzone w stosunku do oderwanych.</li>
</ol>	 
3. Reprezentatywne wyniki
Przykład przygotowanego reaktora przepływowego typu kropelkowego przedstawiono na rysunku 1. Po trzech dniach przepływu na powierzchni kuponu nagromadzą się znaczne ilości biofilmu, rysunek 2A. Całkowita biomasa będzie się różnić w zależności od szczepów bakteryjnych i dokładnych warunków wzrostu. Mikrografia z elektronowego mikroskopu skaningowego biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze przepływowym typu kropelkowego przedstawiona jest na rysunku 2B.
Reaktor z obracającym się dyskiem przedstawiono na rysunku 3A. Opisany protokół można dostosować do konkretnych wymagań niemal każdego mikroorganizmu zdolnego do tworzenia biofilmu. Rysunek 3B przedstawia wirujący dysk z przymocowanymi 18 plastikowymi dyskami. Biofilmy hodowane na takich dyskach są szczególnie odpowiednie do testów przeciwdrobnoustrojowych i dają wysoce powtarzalne wyniki11.
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Układ reaktora przepływowego kroplowego do wzrostu biofilmu, z butelkami z pożywką, systemem pomp i pojemnikiem na odpady." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Układ reaktora przepływowego kroplowego. Oznaczono najważniejsze komponenty.
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Układ eksperymentalny korozji mikrobiologicznej i wynik SEM; degradacja metalu widoczna na obu obrazach." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Przykład biofilmu S. aureus w przepływie kropelkowym. A) Biofilm ten był hodowany przez trzy dni zgodnie z opisanym protokołem. Pokrywy z dwóch pierwszych komór reaktora zostały zdjęte, aby ukazać żółtą biomasę biofilmu S. aureus. B) Skaningowa mikrografia elektronowa biofilmu S. aureus wyhodowanego w reaktorze z przepływem kropelkowym.
<img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Układ reaktora z obracającym się dyskiem do przetwarzania medium; mieszadło magnetyczne, pompa, system utylizacji odpadów; widok z góry na kupony." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reaktor z obracającym się dyskiem. A) Przykład działającego reaktora z wirującym dyskiem. Oznaczono kluczowe komponenty. B) Zbliżenie na wirujący dysk.

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signaling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Micro%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li>
<li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li>
<li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+diversity+produces+%22insurance+effects%22+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li>
<li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li>
<li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Biofilmy hodowane w różnych reaktorach często wykazują odmienne charakterystyki, a każdy reaktor znajduje zastosowanie w innych obszarach. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie dwóch reaktorów do biofilmu: reaktora kroplowego (drip flow biofilm reactor) oraz reaktora z obracającym się dyskiem. Reaktory kroplowe są użyteczne do hodowli biofilmów o niskim ścinaniu na granicy fazy powietrze-ciecz i można je dostosować do różnych warunków. Okazują się one niezwykle wygodne w badaniach, w których pożądana jest duża ilość ...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Reaktory przepływowe kropelkowe</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Reaktory z dyskiem obrotowym</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu staphylococcus aureus

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Uważa się, że większość mikroorganizmów w naturze występuje w postaci wspólnot związanych z powierzchnią w obrębie biofilmów.1 Biofilmy bakteryjne są zamknięte w macierzy i przytwierdzone do powierzchni.2 Tworzenie i rozwój biofilmów są powszechnie badane w laboratorium z wykorzystaniem systemów okresowych, takich jak płytki mikrotitracyjne, lub systemów przepływowych, takich jak komory przepływowe. Metodologie te są przydatne do przesiewania bibliotek mutantów i związków chemicznych (płytki mikrotitracyjne)3 lub hodowli biofilmów do celów wizualizacji (komory przepływowe)4. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowe protokoły hodowli Staphylococcus aureus w dwóch dodatkowych typach przepływowych systemów do hodowli biofilmów: kroplowym reaktorze biofilmowym oraz reaktorze biofilmowym z obracającym się dyskiem.
Reaktory biofilmu z przepływem kropelkowym są przeznaczone do badania biofilmów hodowanych w warunkach niskiego ścinania.5 Reaktor z przepływem kropelkowym składa się z czterech równoległych kanałów testowych, z których każdy może pomieścić jeden kupon w rozmiarze standardnego szkiełka przedmiotowego, fragment cewnika lub stentu. Reaktor z przepływem kropelkowym jest idealny do monitorowania za pomocą mikrosensorów, ogólnych badań biofilmów, przygotowywania próbek do kriosekcjonowania biofilmu, wysokiej produkcji biomasy, oceny materiałów medycznych oraz testowania implantowanych urządzeń medycznych.6,7,8,9
Reaktor z obracającym się dyskiem składa się z teflonowego dysku zawierającego wgłębienia na wymienne kupony.10 Wymienne kupony mogą być wykonane z dowolnego materiału poddającego się obróbce skrawaniem. W dolnej części obracającego się dysku znajduje się magnes trwały, który umożliwia rotację dysku, wytwarzając ścinanie powierzchni cieczy nad kuponami zlicowanymi z powierzchnią. Cały dysk zawierający 18 kuponów jest umieszczany w szklanym naczyniu reaktora z bocznym wylotem o pojemności 1000 mL. Przez naczynie przepompowywane jest ciekłe medium wzrostowe, podczas gdy dysk jest obracany za pomocą mieszadła magnetycznego. Kupony są wyjmowane z naczynia reaktora, a następnie skrobane w celu pobrania próbki biofilmu do dalszych badań lub obrazowania mikroskopowego. Reaktory z obracającym się dyskiem są przeznaczone do laboratoryjnej oceny skuteczności biocydów, usuwania biofilmu oraz właściwości materiałów przeciwdziałających osadzaniu (anti-fouling).9,11,12,13

Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów w otwartych systemach przepływowych z zastosowaniem reaktorów z przepływem kropelkowym oraz reaktorów z obracającym się dyskiem.

Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Uważa się, że większość mikroorganizmów w naturze występuje w formie wspólnot związanych z powierzchnią w obrębie biofilmu.1 Biofilmy bakteryjne są zamknięte w macierzy i przytwierdzone...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla biofilmów bakteryjnych przy niskim lub umiarkowanym naprężeniu ścinającym z wykorzystaniem reaktora biofilmowego z przepływem kropelkowym lub reaktora z obracającym się dyskiem. Kupony w reaktorach biofilmowych są najpierw inokulowane bakteriami i inkubowane w temperaturze 37°C, aby umożliwić przywieranie komórek bakteryjnych do powierzchni wzrostu. Po przytwierdzeniu się komórek do kuponów uruchamia się przepływ pożywki, wytwarzając naprężenie ścinające, które oddziałuje podczas rozwoju biofilmu.Dojrzałe biofilmy można następnie zebrać w celu przeprowadzenia analizy i obserwacji. W celu określenia ultrastruktury powstałych biofilmów można zastosować skaningową mikroskopię elektronową. Jestem Blaze Balls.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak komory przepływowe, jest łatwość uzyskania wysokiej produkcji biomasy oraz wielu identycznych biofilmów. Procedurę tę zaprezentują Rachel Stevenson i Kelly Schwartz, technik oraz doktorantka z mojego laboratorium. Reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym składa się z czterech komór z portami wlotowymi dla pożywki oraz portami wylotowymi dla odpadów.Wewnątrz każdej komory znajduje się wyjmowany kupon, na którym narasta biofilm. Aby zmontować reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym, umieść kupony w każdej równoległej komorze i zabezpiecz pokrywy komór. Zautoklawuj zmontowany reaktor oraz rurki doprowadzające pożywkę, aby wysterylizować system przed użyciem.Należy również wysterylizować w autoklawie pożywkę do wzrostu biofilmu w celu zaszczepienia wysterylizowanego reaktora przepływowego typu kropelkowego. Aparaturę należy ustawić na płaskiej powierzchni i zacisnąć linie odpływowe. Następnie każdą komorę należy wypełnić 10 ml sterylnej pożywki wzrostowej na bazie triptych soy broth i dodać 100 µl staphylococcus aureus.Kulturę nocną wyhodowano w tym samym medium osobno dla każdej komory. Zaszczepiony reaktor umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18 godzin, aby umożliwić adhezję komórek do powierzchni kuponu. Po inkubacji odpięto zacisk z rurki odpływowej i umieszczono reaktor na drewnianym bloku pod kątem 10 stopni. Wszystkie czynności wykonano aseptycznie.Podłącz rurkę z pożywką do butelki zawierającej pożywkę w przepływie ciągłym. Przeciągnij linię rurek przez pompę i odpowietrz je, uruchamiając pompę z pełną prędkością. Po odpowietrzeniu rurek zatrzymaj pompę i przymocuj igły o rozmiarze 22 G i długości jednej cala do końców każdej z rurek.Przetrzyj korek wlotowy komory chusteczką nasączoną etanolem w sposób aseptyczny. Wprowadź igły przez korek wlotowy. Włącz pompę i pozwól, aby pożywka okapywała próbki.Przy szybkości przepływu wynoszącej około 125 µL/min, medium powinno przepływać w dół z otworu wlotowego do otworu odpływowego. Reaktor należy prowadzić w trybie przepływu ciągłego przez trzy dni, okresowo sprawdzając, czy odpływ z reaktora przebiega prawidłowo.Drenaż jest kontrolowany poprzez inspekcję wizualną komór w celu upewnienia się, że pożywka nie gromadzi się w ich wnętrzu. Jeśli pożywka się gromadzi, zaciśnięcie rurek odpływowych zazwyczaj ułatwi prawidłowy drenaż w celu zbioru biofilmów; w takim przypadku należy zatrzymać pompę i usunąć igły z reaktora. Następnie należy ustawić reaktor na płaskiej powierzchni.Po trzech dniach ciągłego przepływu biofilmy Staphylococcus aureus pojawiają się w postaci żółtej biomasy rozprzestrzenionej wzdłuż długości zaszczepionych kuponów. Skaningowa mikrografia elektronowa biofilmu ujawnia Staphylococcus aureus pokrywający kupon w formie wspólnoty biofilmu związanej z powierzchnią. Aby określić ilość uzyskanej biomasy, należy za pomocą sterylnej pęsety aseptycznie usunąć kupony, zebrać bakterie za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść je do probówki stożkowej zawierającej 5 mL sterylnego PBS.Używając homogenizatora tkankowego, rozbij grudki bakteryjne aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Jednostki tworzące kolonie są oznaczane ilościowo poprzez wysiew rozcieńczeń szeregowych na płytki z agarem tryptonowym, inkubację przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przeliczanie kolonii. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem składa się z chemostatu, przez który pompowana jest pożywka wzrostowa.Wirująca tarcza z prętem w kształcie gwiazdy oraz 18 kuponów zaprojektowanych tak, aby pasowały do tarczy. Aby złożyć reaktor, należy najpierw umieścić kupony w szczelinach wirującej tarczy. Następnie załadowaną tarczę należy umieścić w jednolitrowym zlewce szklanym z otworem przelewowym i zamknąć reaktor gumowym korkiem nr 15 z jednym otworem do przepływu pożywki oraz jednym otworem do napowietrzania.Zautoklawuj zmontowany reaktor wraz z przewodami doprowadzającymi, aby wysterylizować układ. W celu zaszczepienia reaktora, napełnij zlewkę 250 milliliters sterylnej pożywki hodowlanej i dodaj 500 microliters nocnej kultury staphylococcus aureus wyhodowanej w bulionie sojowym triptych. Umieść reaktor na mieszadle magnetycznym ustawionym na 250 rotations per minute i inkubuj go przez noc w temperaturze 37 degrees Celsius, aby umożliwić adhezję komórek do kuponów.Po inkubacji nocnej podłączyć rurkę wlotową do otworu w zbiorniku z pożywką oraz do pompy perystaltycznej. Włączyć pompę i ustawić przepływ na 0,25 milliliters per minute. Pozostawić reaktor w działaniu przez 24 godziny w temperaturze 37 degrees Celsius w celu zebrania powstałych biofilmów.Zatrzymaj reaktor i w warunkach aseptycznych wyjmij dysk, nie dotykając kuponów. Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij kupony i ostrożnie zanurz każdy z nich w sterylnym PBS, aby usunąć luźno przytwierdzone bakterie przed testowaniem związków przeciwdrobnoustrojowych.W warunkach aseptycznych umieść kupony w poszczególnych dołkach płytki 96-dołkowej zawierającej badane związki. Inkubuj płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przenieś kupony do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierających 1× PBS i rozbij biofilmy za pomocą homogenizatora.Na koniec należy wysiać rozcieńczenia seryjne komórek na pożywkę agarową w celu oznaczenia liczby żywych jednostek tworzących kolonie w próbce, zgodnie z wcześniejszym opisem. Wykres ten przedstawia liczbę jednostek tworzących kolonie w biofilmach przygotowanych przy użyciu reaktora z wirującym dyskiem i wystawionych na działanie nadtlenku wodoru, co potwierdza możliwość wytworzenia do 18 identycznych biofilmów. Zastosowanie reaktora z wirującym dyskiem sprawia, że technika ta jest idealna do testowania związków przeciwdrobnoustrojowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat prowadzenia biofilmów w reaktorach z przepływem kroplowym oraz w reaktorach z obracającym się dyskiem. Reaktory te stanowią alternatywę dla biofilmów w komorach przepływowych i na płytkach mikrotitracyjnych i są idealne w sytuacjach, gdy wymagana jest duża ilość biomasy biofilmu lub gdy planowane jest testowanie środków przeciwdrobnoustrojowych na uformowanych biofilmach.

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie reaktorów przepływowych i reaktorów z obracającą się tarczą do Staphylococcus aureus Analizy biofilmu

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

W tym filmie pokazujemy przygotowanie biofilmu in vitro przez S. aureus na wielodołkowej płytce pokrytej poli-L-lizyną. Płytka uformowana w biofilm może być wykorzystana do dalszych eksperymentów.

Synteza biofilmu in vitro przez Staphylococcus aureus

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Większość infekcji bakteryjnych wytwarza biofilm. Ze względu na środowisko, w którym działają, bakterie związane z biofilmem są często fenotypowo odporne na leki. Nowe cząsteczki przeciwbakteryjne, które zabijają bakterie w biofilmach, mają zatem wysoki priorytet. Opracowujemy test do szybkiego badania przesiewowego pod kątem związków przeciwdrobnoustrojowych, które są skuteczne w zwalczaniu biofilmów.

Celowanie w Staphylococcus aureus związany z biofilmem za pomocą testu wrażliwości na leki opartego na resazurynie

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

Ten artykuł szczegółowo opisuje metody, które demonstrują trzy popularne techniki zbierania i dezagregacji biofilmu na dwóch typach powierzchni, testowanie odporności metody zbierania oraz minimum informacji do rozważenia przy wyborze i optymalizacji technik zbioru i dezagregacji w celu zwiększenia odtwarzalności.

Zbiór i dezagregacja: pomijany krok w badaniach nad metodami biofilmu

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Ten protokół opisuje podejście łączące metody statyczne i dynamiczne do oceny skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmów w przemyśle mleczarskim. Podejście to może być również wykorzystane do testowania skuteczności nowych preparatów biologicznych lub chemicznych w zwalczaniu biofilmów.

Ocena skuteczności organicznych nadtlenokwasów w zwalczaniu biofilmu mlecznego przy użyciu podejścia łączącego metody statyczne i dynamiczne

Model infekcji skóry i tkanek miękkich u myszy jest wykorzystywany do oceny funkcji wirulencji gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz odpowiedzi immunologicznych gospodarza. W niniejszym materiale przedstawiamy model infekcji podskórnej w przebiegu zakażenia skóry i tkanek miękkich.

Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Poznaj metody hodowli biofilmów bakteryjnych Staphylococcus aureus w reaktorach z przepływem kroplowym i obrotowym dyskiem. Protokoły te umożliwiają analizę struktury biofilmu przy zastosowaniu sił ścinających.

Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Przeglądaj więcej filmów