Zastosowanie reaktorów z przepływem kroplowym i obrotowym dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus
December 27th, 2010
Szczegółowo przedstawiono protokoły wykorzystania biofilmów przepływowych w systemie otwartym z reaktorami przepływowymi i reaktorami z obrotowym dyskiem.
Ogólnym celem tej procedury jest wyhodowanie biofilmów bakteryjnych pod niską lub umiarkowaną siłą przy użyciu reaktora biofilmu z przepływem kroplowym lub reaktora z obrotowym dyskiem. Kupony w biofilmie reagują tak, jakby były najpierw zaszczepiane bakteriami i inkubowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić komórkom bakteryjnym przyleganie do powierzchni wzrostu. Gdy komórki przyczepią się do kuponów, rozpoczyna się przepływ pożywki wzrostowej, która wytwarza czystą siłę, która działa podczas rozwoju biofilmu.
Dojrzałe biofilmy można następnie zebrać w celu analizy, obserwacji biofilmów. Za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej można przeprowadzić badanie w celu określenia ultrastruktury wytwarzanych biofilmów. Jestem Blaze Balls.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komórki przepływowe, jest to, że łatwo można uzyskać wysoką produkcję biomasy i wiele identycznych biofilmów. Tę procedurę zademonstrują Rachel Stevenson i Kelly Schwartz, technik i doktorantka z mojego laboratorium. Reaktor biofilmu z przepływem kroplowym składa się z czterech komór z portami wejściowymi do wprowadzania mediów i portami odpływowymi do odprowadzania odpadów.
Wewnątrz każdej komory znajduje się wyjmowany kupon, na którym rośnie biofilm. Aby zmontować reaktor biofilmu z przepływem kroplowym, umieść kupony w każdej równoległej komorze i zabezpiecz pokrywy komory. Autoklawuj zmontowany reaktor, a także rurki z płynną pożywką, aby wysterylizować system przed użyciem.
Należy również autoklawować pożywkę do wzrostu biofilmu, aby zaszczepić wysterylizowany reaktor przepływowy kroplowy. Umieść urządzenie na płaskiej powierzchni i clamp przewody ściekowe. Następnie wypełnij każdą komorę 10 mililitrami sterylnego tryptyku pożywki sojowej na bazie bulionu sojowego i dodaj 100 mikrolitrów gronkowca złocistego.
Kultura nocna uprawiana w tym samym podłożu do każdej komory osobno. Umieść zaszczepiony reaktor w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 18 godzin, aby komórki mogły przylegać do powierzchni kuponu. Po inkubacji UNC zacisnąć rurkę odprowadzającą ścieki i umieścić reaktor na pochyłym drewnianym nożu do klocków pod kątem 10 stopni. Aseptycznie.
Podłącz rurkę z płynną pożywką do butelki zawierającej bulion odżywczy o ciągłym przepływie. Przeprowadź przewód rurowy przez pompę i zalej wężyk, uruchamiając pompę z pełną prędkością. Po zalaniu płynnej rurki zatrzymaj pompę i przymocuj 22-calowe igły do końca każdej rurki.
Wytrzyj korek wlotu komory chusteczką na etanol i aseptycznie. Wprowadzić igły przez korek wlotowy. Włącz pompę i pozwól, aby medium kapało na kupony.
Przy natężeniu przepływu około 125 mikrolitrów na minutę media powinny spływać w dół od portu wlotowego do portu ściekowego. Pracować w reaktorze w ciągłym przepływie przez trzy dni. Od czasu do czasu sprawdzanie reaktora pod kątem prawidłowego drenażu.
Drenaż jest sprawdzany poprzez oględziny komór, aby upewnić się, że media nie gromadzą się w komorach. Jeśli media gromadzą się, szczypią, rurki odpływowe zwykle sprzyjają prawidłowemu drenażowi w celu zebrania biofilmów, zatrzymania pompy i usunięcia igieł z reaktora. Następnie umieść reaktor na płaskiej powierzchni.
Po trzech dniach ciągłego przepływu pojawiają się biofilmy gronkowca złocistego w postaci żółtej biomasy rozsianej wzdłuż zaszczepionych odcinków. Skaningowy mikroskop elektronowy biofilmu ujawnia Staphylococcus aureus pokrywający kupon w powierzchniowo powiązanej społeczności biofilmu. Aby określić ilościowo otrzymaną biomasę, użyj sterylnych kleszczy, aby jak najbardziej septycznie usunąć kupony, zebrać bakterie za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść je do stożkowej probówki zawierającej pięć mililitrów sterylnego PBS.
Za pomocą tkanki homogenizator dezagreguj grudki bakteryjne, aż do uzyskania jednolitej zawiesiny. Jednostki tworzące kolonie określa się ilościowo poprzez posiewanie seryjnych rozcieńczeń na tryptykach na płytkach soglarowych, inkubowanie przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i liczenie kolonii. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem składa się ze statu chemos, przez który pompowane jest podłoże wzrostowe.
Obracający się dysk z gwiazdką i 18 kuponami zaprojektowanymi tak, aby pasowały do obracającego się dysku. Aby najpierw zmontować reaktor, załaduj kupony z obracającym się dyskiem do szczelin obracającego się dysku. Następnie umieść załadowany dysk w jednolitrowej szklanej zlewce z portem przelewowym i przykryj reaktor gumowym korkiem numer 15 z jednym otworem do przepływu mediów i jednym otworem do napowietrzania.
Autoklaw, zmontowany reaktor i rurki wlotowe do sterylizacji systemu. Aby zaszczepić reaktor, napełnij zlewkę 250 mililitrami sterylnej pożywki hodowlanej i dodaj 500 mikrolitrów nocnej kultury gronkowca złocistego wyhodowanego w tryptyku sojowym. Umieść reaktor na płytce mieszającej ustawionej na 250 obrotów na minutę i inkubuj go przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby komórki mogły przylegać do kuponów.
Po całonocnej inkubacji podłączyć rurkę wlotową do portu w zbiorniku pożywki i do pompy perystaltycznej. Włącz pompę i ustaw przepływ na 0,25 mililitra na minutę. Pozwól reaktorowi pracować przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zebrać powstałe biofilmy.
Zatrzymać reaktor i aseptycznie. Wyjmij dysk bez dotykania kuponów. Za pomocą sterylnych kleszczy wyjmij kupony i ostrożnie zanurz każdy z nich w sterylnym PBS, aby usunąć luźno przyczepione bakterie do testowania związków przeciwdrobnoustrojowych.
W aseptyce umieść kupony w indywidualnych studzienkach 96-dołkowej płytki zawierającej interesujące związki. Inkubować płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przenieś kupony do 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych zawierających jeden raz PBS i rozproszyj biofilmy za pomocą homogenizatora.
Na koniec należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia komórek na pożywce agarowej w celu określenia liczby żywotnych jednostek tworzących kolonie na próbkę, jak opisano wcześniej. Ten wykres pokazuje liczbę jednostek tworzących kolonie w biofilmach przygotowanych przy użyciu reaktora z wirującym dyskiem i wystawionych na działanie nadtlenku wodoru, co daje zdolność do wytworzenia do 18 identycznych biofilmów. Zastosowanie reaktora z wirującym dyskiem sprawia, że technika ta idealnie nadaje się do testowania związków przeciwdrobnoustrojowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uruchomić przepływ kroplowy i biofilmy reaktora z obrotowym dyskiem. Te reaktory do biofilmu stanowią alternatywę dla biofilmów z komórkami przepływowymi i płytkami mikromiareczkowymi i są idealne, gdy potrzebna jest duża ilość biomasy biofilmu lub pożądane są testy przeciwdrobnoustrojowe na ustalonych biofilmach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokoły dotyczące hodowli biofilmów bakteryjnych z wykorzystaniem reaktorów przepływowych z kroplową dostawą i reaktorów z obracającymi się dyskami. Procedury szczegółowo opisują inokulację płytek z bakteriami oraz następujący rozwój biofilmów w warunkach kontrolowanych sił ścinających.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Inżynieria biofilmów
- Biotechnologia
Tło
- Biofilmy bakteryjne są złożonymi społecznościami przywierającymi do powierzchni.
- Zrozumienie rozwoju biofilmów jest kluczowe dla różnych zastosowań.
- Siły ścinające wpływają na strukturę i funkcję biofilmów.
- Różne konstrukcje reaktorów mogą wpływać na dynamiki wzrostu biofilmów.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowych protokołów dotyczących wzrostu biofilmów.
- Porównanie skuteczności reaktorów przepływowych z kroplową dostawą i reaktorów z obracającymi się dyskami.
- Ułatwienie analizy dojrzałych biofilmów.
Stosowane metody
- Inokulacja płytek komórkami bakteryjnymi.
- Inkubacja w temperaturze 37 stopni Celsjusza do przyczepienia się.
- Przepływ pożywki wzrostowej do stworzenia sił ścinających podczas rozwoju.
- Skanująca mikroskopia elektronowa do analizy biofilmów.
Główne wyniki
- Udane wyhodowanie biofilmów bakteryjnych w określonych warunkach.
- Porównanie struktur biofilmów z różnych typów reaktorów.
- Wgląd w wpływ sił ścinających na morfologię biofilmów.
- Szczegółowe obrazowanie biofilmów za pomocą mikroskopii elektronowej.
Wnioski
- Przedstawione protokoły są skuteczne w badaniach nad biofilmami.
- Wybór reaktora ma znaczący wpływ na cechy biofilmów.
- Dalsze badania mogą budować na tych metodach dla zaawansowanych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antimicrobial hypotheses in disease-relevant biofilm models.
- Supports functional validation of anti-biofilm targets and materials.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling shear and growth conditions.
- Provides reproducible platforms for portfolio triage of candidate compounds.
Screening & Assay Development
- Generates standardized, high-biomass biofilms for quantitative compound evaluation.
- Enables parallel production of identical biofilm samples for reproducibility.
- Supports scalable screening of antimicrobial efficacy and material performance.
- Delivers quantitative outputs such as colony forming units for assay comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with clinically relevant device and material testing.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-biofilm strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on robust biofilm challenge data.
- Provides mechanistic insight into biofilm resilience and removal under defined shear.
Pipeline & Workflow Integration
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antimicrobial and anti-fouling interventions in controlled biofilm systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biofilm assays for compound and material evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colony forming units and biofilm biomass for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with device and material testing relevant to clinical applications.
- Enterprise Reuse: Offers standardized, scalable platforms for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-biofilm efficacy and material performance.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm production workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective and device portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust biofilm data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biofilm quantification.
- Needs access to specialized reactors, incubators, and analytical tools such as homogenizers and microscopy.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- Adaptable to various coupon materials and device-relevant surfaces.
- Limited to in vitro modeling; translation to in vivo systems requires further validation.
