Szybkie subtraktywne modelowanie warstw żywych komórek za pomocą sondy mikroprzepływowej

Głównym celem metody przedstawionej w tym artykule wideo jest szybkie wygenerowanie przestrzennie zdefiniowanych wzorców komórek, aby ułatwić analizę czasoprzestrzenną interakcji międzykomórkowych in-situ. Przedstawiona strategia wykorzystuje technologię sond mikroprzepływowych. Mikrofabrykowana głowica sondy lokalizuje nanolitrowe objętości biochemikaliów na podłożach biologicznych, aby uformować monowarstwy komórek.

Główną zaletą techniki tworzenia wzorów opartej na urządzeniach wielofunkcyjnych jest to, że jest ona niemal natychmiastowa dzięki lokalnej lizie, co pozwala na modyfikację wzorów w czasie rzeczywistym. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że inne metody generowania wzorców komórkowych wymagają długich, wieloetapowych protokołów, zanim faktycznie zobaczymy sukces wzorców komórkowych. Aby przeprowadzić stabilne eksperymenty z hydrodynamicznym ograniczeniem przepływu na powierzchni komórki, parametry MFP muszą zostać zoptymalizowane.

W tym celu niezbędna jest demonstracja wizualna. Aditya Kashyap i Julien Cors zademonstrują tę procedurę. Moduły operacyjne platformy składają się z zmotoryzowanych strzykawek, zmotoryzowanych stopni i sterownika.

Urządzenie wielofunkcyjne jest podłączone do zmotoryzowanego stolika Z w celu kontrolowania odległości szczeliny między głowicą a podłożem, a uchwyt podłoża jest przymocowany do zmotoryzowanych stolików X i Y tworzących system skanowania. Głowica MFP posiada przelotki przepływowe do podłączenia do przepompowni, otwory montażowe do montażu głowicy na stoliku Z oraz kanały wychodzące z polerowanego wierzchołka. Wierzchołek jest ustawiony współpłaszczyznowo z substratem hodowli komórkowej.

Aby przygotować przepompownię i aparaturę do obsługi płynów, wyczyść strzykawki i tłoki strzykawek za pomocą sonikacji i 0,5% roztworu wybielacza w ultraczystej wodzie przed i po eksperymentach z żywymi komórkami. Dokładnie spłucz je wodą. Napełnić strzykawki wodą, zanurzając całkowicie ich końcówki w łaźni wodnej i zasysając za pomocą tłoka.

Usunąć płyn w łaźni wodnej w taki sposób, aby trzon strzykawki stykał się z uszczelką na wylocie strzykawki. Kontynuować zasysanie i przedmuchiwanie, aż w kolumnach strzykawki nie będą widoczne pęcherzyki powietrza. Podłączyć napełnione strzykawki do pomp strzykawkowych za pomocą złączy z dolnym zamkiem.

Za pomocą zaworu przełączającego zamontowanego na pompach skieruj ciecz ze strzykawki do jednej z dwóch kapilar prowadzących do głowicy MFP lub do zbiorników cieczy. Oczyść obie kapilary wodą ze strzykawek z prędkością przepływu około 10 do 50 mikrolitrów na minutę, w zależności od wielkości strzykawki, aż w strzykawkach pozostanie około 10 mikrolitrów wody. Wyczyść głowicę MFP przez sonikację przy użyciu detergentu do szkła do standardowego czyszczenia lub 0.5% wybielacza do rygorystycznego czyszczenia, przez pięć minut.

Oczyść kanały wodą, zanurzając wierzchołek w wodzie i stosując próżnię do przelotek. Sprawdź kanały pod mikroskopem stereoskopowym pod kątem potencjalnych przeszkód i w razie potrzeby powtórz poprzedni krok. Następnie zamontuj oczyszczoną głowicę na uchwycie głowicy i przykręć złącze do głowicy.

Włóż oczyszczone kapilary do odpowiedniego adaptera złącza mikroprzepływowego, który łączy się z przelotkami kanałów w głowicy. Przykręć uchwyt głowicy do stolika Z, który służy do kontroli odległości szczeliny między głowicą a monowarstwą ogniwa, przed wykonaniem kalibracji punktu końcowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Uzyskaj surową odległość bez przerwy, przesuwając głowicę MFP nad szkiełkiem komory bez komórek i powoli schodząc w krokach co pięć mikronów.

Po kontakcie sondy z podłożem należy obserwować pierścienie Newtona. Jest to przybliżone oszacowanie. Dokładne położenie należy uzyskać po dostosowaniu współpłaszczyznowości wierzchołka sondy do podłoża.

Po uformowaniu upewnij się, że pierścienie Newtona są symetryczne. Aby zapewnić współpłaszczyznowość wierzchołka sondy, wyreguluj nachylenie głowicy za pomocą goniometru na styku głowicy i stolika Z. Odsuń głowicę MFP o 20 mikronów od podłoża i wyreguluj nachylenie za pomocą goniometru.

Powtarzaj regulację opadania, zerowania i pochylenia, aż pierścienie Newtona staną się symetryczne w kontakcie. Przy wyregulowanym nachyleniu ustaw pozycję Z, która tworzy symetryczne pierścienie Newtona, na zero. Następnie należy przygotować ciecz procesową dla wewnętrznego kanału iniekcyjnego i roztwór buforowy do ekstrakcji wymagany do wtrysku zewnętrznego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Za pomocą przewodu odpływowego podłączyć do pomp strzykawkowych, usunąć pozostałą wodę i zassać odgazowane roztwory do strzykawek z prędkością 40 mikrolitrów na minutę, aż strzykawki będą pełne. Zapewnia to napełnianie strzykawek, łączników i kapilar bez pęcherzyków powietrza. Aby przygotować monowarstwy komórek na szkiełkach komorowych, należy rozlać komórki w kolbach T przy użyciu standardowych protokołów hodowli komórkowych.

Po osiągnięciu zbiegu komórek w kolbach hodowlanych trypsynizuj i zbieraj komórki. Zasiej 0,2 miliona komórek na centymetr kwadratowy w każdym z dwukomorowych szkiełek w celu wykonania wzoru. Hoduj komórki przez 48 godzin, używając komórek w jednej z komór jako kontroli wzrostu i żywotności komórek.

Po osiągnięciu zbiegu komórek na szkiełkach komory, inkubować komórki przez 45 minut z 500 mikrolitrami roztworu barwnika do śledzenia komórek o stężeniu 10 mikromolowym, przygotowanego w pożywce bez surowicy. Odbywa się to w celu wizualizacji komórek podczas tworzenia wzorców. Umyj oznakowane komórki PBS, delikatnie przepłukując każdą komorę za pomocą pipety.

Następnie należy wyhodować komórki w pożywce uzupełnionej surowicą w celu przeprowadzenia eksperymentów z modelami. Hydrodynamiczne ograniczenie przepływu lokalizuje ciecze poprzez jednoczesne wtryskiwanie i zasysanie cieczy procesowej. W zamknięciu hierarchicznym wiele cieczy procesowych jest zamkniętych, przy czym zewnętrzny HFC osłania próbkę przed HFC przetwarzanym wewnętrznie.

Przesuń urządzenie wielofunkcyjne nad monowarstwą ogniwa w odległości 50 mikronów od szkiełka podstawowego. Ta odległość szczeliny zapewnia kontakt hierarchicznego HFC, a także uwzględnia zmiany powierzchni i grubości jednej warstwy. Wstrzyknięcie wodorotlenku sodu w ilości sześciu lub ośmiu mikrolitrów na minutę przez I-dwa.

Oceń inne natężenia przepływu, korzystając z reguł przepływu w protokole tekstowym. Moduluj rozmiar wewnętrznego HFC, zmieniając stosunek natężeń przepływu do wstrzykiwań QI-two i QI-one za pomocą strzykawek do wstrzykiwań. Na przykład użyj QI-one między 1,3 mikrolitra na minutę a czterech mikrolitrów na minutę, przy czym QI-dwa jest ustalony na osiem mikrolitrów na minutę, aby uzyskać ślad wodorotlenku sodu od 150 do 300 komórek.

Wstrzyknąć kompletne medium z najbardziej zewnętrznych otworów na głowicy MFP z natężeniem przepływu 20 mikrolitrów na minutę, aby uwzględnić parowanie pożywki i aspirację podczas pracy hHFC. Aby utworzyć wzór monowarstw komórek, ustaw oprogramowanie stage tak, aby skanowało głowicę sondy nad monowarstwą komórki w określonych przez użytkownika wzorach z prędkością skanowania 10 mikronów na sekundę i odległością przerwy 50 mikronów. Gdy zagnieżdżony hHFC działa i styka się z monowarstwą, zeskanuj urządzenie wielofunkcyjne z trajektorią żądanego wzorca, aby usunąć wzorzyste komórki.

W przypadku kokultury po pierwszym usunięciu typu komórkowego należy zasiać inną linię komórkową, aby wypełnić luki, tak jak poprzednio. Przygotować stację pobierania próbek do dalszej analizy lizatu. Pokazano tutaj przykład stacji pobierania próbek, która składa się z wydrukowanego w trzech D ośmiopaskowego uchwytu do PCR.

Przetrzyj uchwyt probówki 70% etanolem lub innymi środkami odkażającymi powierzchnię, w zależności od wymaganej dla danego zastosowania. Użyj magnetycznego klipsa na uchwycie probówki, aby przymocować go do uchwytu podłoża. Po przygotowaniu stacji pobierania próbek należy ustawić głowicę MFP w odległości 100 mikronów od monowarstwy.

Rozpocznij pracę hHFC od 50-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu jako cieczy procesowej dla wewnętrznego kanału wtryskowego o natężeniu przepływu jednego mikrolitra na minutę dla QI-jeden, sześciu mikrolitrów na minutę dla QI-dwa, minus siedmiu mikrolitrów na minutę dla QA-jeden i minus-17,5 mikrolitrów na minutę dla QA-dwa. Gdy ograniczenie przepływu ustabilizuje się, opuść głowicę sondy na odległość szczeliny 50 mikronów, aby przeprowadzić lokalną lizę na bazie wodorotlenku sodu w wybranej subpopulacji komórek z hHFC. Po zakończeniu lizy subpopulacji skierować głowę w stronę probówek w stacji pobierania próbek.

Wyrzuć zebrany lizat bezpośrednio do probówek PCR. Po przetworzeniu lizatu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, załaduj lizat do standardowego przepływu pracy qPCR zgodnie z ustawieniami dostawcy urządzenia. Kontrolując stosunek cieczy iniekcyjnych w hierarchicznym HFC, modulowana jest wielkość śladu w kontakcie z powierzchnią ogniwa.

Prędkości przepływu zostały dobrane w taki sposób, że dominującym mechanizmem lizy komórek jest efekt chemiczny, a nie ścinanie. Zostało to potwierdzone przez wyznaczenie ścinania za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów. Pokazano tutaj generowanie siatki wysp komórkowych poprzez programowanie trajektorii skanowania za pomocą urządzenia wielofunkcyjnego.

Modulacja wielkości śladu za pomocą współczynnika cieczy iniekcyjnej pozwala na kontrolę rozdzielczości usuwania komórek. Metoda ta może być stosowana do sekwencyjnej kohodowli wielu populacji komórek, generując w ten sposób złożone wzorce interakcji międzykomórkowych. Zastosowanie wodorotlenku sodu jako cieczy procesowej sprawia, że lizat jest kompatybilny z analizą komórek opartą na PCR.

W tym przypadku zawartość DNA określono ilościowo na podstawie pięciu i jednego odcisku stopy, a następnie poddano lizie przy użyciu opisanej metody. Po opanowaniu tę technikę można wykonać na komórkach w mniej niż 30 minut. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że kanały i naczynia włosowate są wolne od pęcherzyków powietrza, ponieważ może to niekorzystnie wpłynąć na HFC.

Nie zapominaj, że praca z wodorotlenkiem sodu, roztworem chemicznym, może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne. Postępując zgodnie z tą procedurą, możemy lokalnie analizować komórki przez barwienie immunologiczne lub sekwencjonowanie DNA-RNA za pomocą lizy za pośrednictwem MFP, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które białka ulegają nadmiernej ekspresji z powodu geometrycznego uwięzienia komórek. Po opracowaniu technika ta może utorować drogę naukowcom w dziedzinie biologii molekularnej do badania sygnalizacji między- i zewnątrzkomórkowej podczas wytwarzania i degeneracji tkanek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak subtraktywnie tworzyć modele monowarstw komórek ustawionych w MFP do lokalnego przetwarzania i tworzyć złożone geometrie kokultur komórek.