Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Metoda ta pozwala na tworzenie zdefiniowanych przez użytkownika wzorów mikroorganizmów w kanale mikroprzepływowym. Po ustaleniu wzoru mikroorganizmy mogą być monitorowane w celu oceny ich długoterminowej fizjologii i interakcji z dużą przepustowością. Zastosowanie sił kapilarnych umożliwia niespecyficzną drogę do tworzenia wzorów, która ma zastosowanie w różnych klasach materiałów.

Na przykład cząstki koloidalne i bakterie. Co więcej, pozwala to na wytwarzanie dużych tablic z doskonałą kontrolą rozmieszczenia przestrzennego interesującego nas materiału. Do tej pory testowaliśmy i stosowaliśmy metodę na cząstkach koloidalnych i komórkach drobnoustrojów.

W rezultacie może znaleźć zastosowanie w inżynierii materiałowej i dziedzinach wymagających ilościowej analizy pojedynczych komórek, takich jak badania przesiewowe leków. Na początek przygotuj mieszaninę PDMS, mieszając elastomer z jego środkiem sieciującym. Następnie energicznie wymieszaj mieszaninę, aby równomiernie zmiksować oba składniki, aż utworzą się pęcherzyki powietrza, a mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą.

Teraz odgazuj mieszaninę w eksykatorze próżniowym, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte, a mieszanina znów będzie przezroczysta. Aby uzyskać matrycę podłogową chipa mikroprzepływowego o grubości 400 mikrometrów, wlej trzy gramy mieszaniny na matrycę krzemową i umieść wzorzec krzemowy na powlekarce wirowej, aby wirować powłokę pod kątem 21 razy G przez pięć sekund i 54 razy G przez 10 sekund. Ponownie Degasa w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza, jak opisano wcześniej.

Wlej 20 gramów mieszaniny PDMS do formy wydrukowanej w 3D, aby uzyskać mikrokanał, który będzie służył jako dach chipa mikroprzepływowego i odgazowuj go przez 30 minut, jak opisano wcześniej. Piecz wafel silikonowy i wydrukowaną w 3D formę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, a następnie przetnij PDMS wzdłuż konturu wydrukowanej w 3D formy i oderwij ją. Przetnij PDMS ostrzem wokół mikrokanalików i przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot kanału mikroprzepływowego.

Teraz odetnij PDMS i oderwij go od silikonowego wzorca i pokrój warstwę PDMS na mniejsze kawałki o tych samych wymiarach kanałów mikroprzepływowych, które zostaną połączone na wierzchu szablonów. Delikatnie pocieraj szablony i mikrokanaliki za pomocą 1% roztworu detergentu przez pięć minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną. Następnie przepłucz szablony i mikrokanaliki izopropanolem, a następnie spłucz je wodą dejonizowaną.

Teraz suszyć szablony i mikrokanaliki w temperaturze pokojowej przez minutę sprężonym powietrzem o ciśnieniu jednego bara. Umieść szablony i mikrokanaliki w myjce plazmowej powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry. Po włączeniu myjki plazmowej, szablony i mikrokanały należy traktować plazmowo przez 40 sekund, a następnie wyjąć je z oczyszczarki plazmowej i natychmiast przykleić mikrokanały na wierzchu szablonów.

Przechowuj chipy mikroprzepływowe w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć dni, aby zapewnić odzysk hydrofobowy PDMS. W dniu eksperymentu należy ustawić inkubator skrzynkowy na 37 stopni Celsjusza na kilka godzin przed eksperymentem, a następnie ustawić pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu, ustawiając taką samą temperaturę, jak w inkubatorze pudełkowym. 90 minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem i przepłucz kanał 100% etanolem przez co najmniej 10 minut, a następnie umieść chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowuj przez co najmniej 30 minut.

Teraz wymień etanol na wodę destylowaną i poddaj chip obróbce próżniowej przez co najmniej 30 minut. Wstaw chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aby usunąć wszelkie ślady płynu pozostawione w kanale. Odpipetować jeden mililitr pożywki MOPS do fiolki wirówkowej i dodać 10 mikrolitrów 0,132 molowego fosforanu potasu.

Porcję 100 mikrolitrów kultury przez noc przelać do fiolki wirówki i odwirować kulturę w temperaturze 2 300 razy G przez dwie minuty. Delikatnie wyrzuć supernatant w celu ponownego zawieszenia osadu w jednym mililitrze świeżej pożywki MOPS z 0,015% Tween 20 i 0,01% fosforanu potasu i załaduj zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki. Aby zabezpieczyć strzykawkę i połączenie rurki, należy bezpośrednio włożyć igłę do rurki.

Teraz zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę, aby pobrać zawiesinę bakteryjną i monitorować proces tworzenia wzoru za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Po ułożeniu matrycy z komórkami zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Teraz ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mikrolitrów na minutę, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału ponownie zwiększ natężenie przepływu. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.

Odpipetować 900 mikrolitrów 0,015%Tween 20 roztworu wodnego do fiolki wirówkowej, a następnie odpipetować do niej 100 mikrolitrów oryginalnej zawiesiny koloidalnej. Odwirować zawiesinę o stężeniu 13 500 razy G przez jedną minutę i delikatnie zastąpić supernatant wodnym roztworem Tween 20. Załaduj zawiesinę koloidalną do strzykawki o pojemności jednego mililitra i podłącz strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.

Wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w środkowej części w górnej części kanału i stopniowo dociskać zawiesinę, aż szablon zostanie pokryty. Pobrać zawiesinę koloidalną przy natężeniu przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę i zobrazować proces modelowania za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Zwiększ natężenie przepływu, gdy łąkotka szybko dotrze do końca szablonu.

Geometria kanału prostego została wykorzystana do stworzenia modelu stacjonarnych komórek fazowych fluorescencyjnego szczepu Escherichia coli, który zdeponował 83% z 5 000 analizowanych pułapek. Wzorzyste bakterie wznowiły wzrost w różnym czasie w ciągu 1,5 godziny od momentu, gdy kanał został wypełniony świeżym LB. Po wznowieniu wzrostu pojedyncze komórki bakteryjne zaczęły tworzyć indywidualne kolonie, które rozszerzały się, aż utworzyła się warstwa powierzchniowa i utracono rozdzielczość pojedynczej komórki. Analiza przeprowadzona na ponad 55 000 pułapek wykazała, że zielono-czerwone dimery wykonane z cząstek o średnicy dwóch i jednego mikrometra powstały odpowiednio w 93% i 89% analizowanych pułapek.

A zielono-czerwono-zielone trymery powstały w 52% pułapek. Odległość między wzorzystymi cząstkami można precyzyjnie kontrolować, wykonując dwa osadzenia w przeciwnych kierunkach, zatrzymując w ten sposób takie cząstki na przeciwległych końcach każdej pułapki. Ważne jest, aby zapewnić jednolitą temperaturę na całym szablonie, aby zapobiec kondensacji podczas procesu modelowania.

W tym celu umieszczamy podgrzewaną szklaną płytkę pod szablonem i ustawiamy ją na tę samą temperaturę, co inkubator skrzynkowy. Metoda ta może być stosowana w różnych badaniach biologicznych obejmujących ilościową analizę pojedynczych komórek. Unikalną zaletą jest jego wysoka przepustowość, która pozwala na tworzenie wzorców tysięcy komórek, dostarczając dużych statystyk na tej samej arenie eksperymentalnej.