Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością
November 4th, 2021
Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.
Metoda ta pozwala na tworzenie zdefiniowanych przez użytkownika wzorów mikroorganizmów w kanale mikroprzepływowym. Po ustaleniu wzoru mikroorganizmy mogą być monitorowane w celu oceny ich długoterminowej fizjologii i interakcji z dużą przepustowością. Zastosowanie sił kapilarnych umożliwia niespecyficzną drogę do tworzenia wzorów, która ma zastosowanie w różnych klasach materiałów.
Na przykład cząstki koloidalne i bakterie. Co więcej, pozwala to na wytwarzanie dużych tablic z doskonałą kontrolą rozmieszczenia przestrzennego interesującego nas materiału. Do tej pory testowaliśmy i stosowaliśmy metodę na cząstkach koloidalnych i komórkach drobnoustrojów.
W rezultacie może znaleźć zastosowanie w inżynierii materiałowej i dziedzinach wymagających ilościowej analizy pojedynczych komórek, takich jak badania przesiewowe leków. Na początek przygotuj mieszaninę PDMS, mieszając elastomer z jego środkiem sieciującym. Następnie energicznie wymieszaj mieszaninę, aby równomiernie zmiksować oba składniki, aż utworzą się pęcherzyki powietrza, a mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą.
Teraz odgazuj mieszaninę w eksykatorze próżniowym, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte, a mieszanina znów będzie przezroczysta. Aby uzyskać matrycę podłogową chipa mikroprzepływowego o grubości 400 mikrometrów, wlej trzy gramy mieszaniny na matrycę krzemową i umieść wzorzec krzemowy na powlekarce wirowej, aby wirować powłokę pod kątem 21 razy G przez pięć sekund i 54 razy G przez 10 sekund. Ponownie Degasa w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza, jak opisano wcześniej.
Wlej 20 gramów mieszaniny PDMS do formy wydrukowanej w 3D, aby uzyskać mikrokanał, który będzie służył jako dach chipa mikroprzepływowego i odgazowuj go przez 30 minut, jak opisano wcześniej. Piecz wafel silikonowy i wydrukowaną w 3D formę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, a następnie przetnij PDMS wzdłuż konturu wydrukowanej w 3D formy i oderwij ją. Przetnij PDMS ostrzem wokół mikrokanalików i przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot kanału mikroprzepływowego.
Teraz odetnij PDMS i oderwij go od silikonowego wzorca i pokrój warstwę PDMS na mniejsze kawałki o tych samych wymiarach kanałów mikroprzepływowych, które zostaną połączone na wierzchu szablonów. Delikatnie pocieraj szablony i mikrokanaliki za pomocą 1% roztworu detergentu przez pięć minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną. Następnie przepłucz szablony i mikrokanaliki izopropanolem, a następnie spłucz je wodą dejonizowaną.
Teraz suszyć szablony i mikrokanaliki w temperaturze pokojowej przez minutę sprężonym powietrzem o ciśnieniu jednego bara. Umieść szablony i mikrokanaliki w myjce plazmowej powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry. Po włączeniu myjki plazmowej, szablony i mikrokanały należy traktować plazmowo przez 40 sekund, a następnie wyjąć je z oczyszczarki plazmowej i natychmiast przykleić mikrokanały na wierzchu szablonów.
Przechowuj chipy mikroprzepływowe w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć dni, aby zapewnić odzysk hydrofobowy PDMS. W dniu eksperymentu należy ustawić inkubator skrzynkowy na 37 stopni Celsjusza na kilka godzin przed eksperymentem, a następnie ustawić pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu, ustawiając taką samą temperaturę, jak w inkubatorze pudełkowym. 90 minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem i przepłucz kanał 100% etanolem przez co najmniej 10 minut, a następnie umieść chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowuj przez co najmniej 30 minut.
Teraz wymień etanol na wodę destylowaną i poddaj chip obróbce próżniowej przez co najmniej 30 minut. Wstaw chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aby usunąć wszelkie ślady płynu pozostawione w kanale. Odpipetować jeden mililitr pożywki MOPS do fiolki wirówkowej i dodać 10 mikrolitrów 0,132 molowego fosforanu potasu.
Porcję 100 mikrolitrów kultury przez noc przelać do fiolki wirówki i odwirować kulturę w temperaturze 2 300 razy G przez dwie minuty. Delikatnie wyrzuć supernatant w celu ponownego zawieszenia osadu w jednym mililitrze świeżej pożywki MOPS z 0,015% Tween 20 i 0,01% fosforanu potasu i załaduj zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki. Aby zabezpieczyć strzykawkę i połączenie rurki, należy bezpośrednio włożyć igłę do rurki.
Teraz zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę, aby pobrać zawiesinę bakteryjną i monitorować proces tworzenia wzoru za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Po ułożeniu matrycy z komórkami zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 stopni Celsjusza.
Teraz ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mikrolitrów na minutę, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału ponownie zwiększ natężenie przepływu. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.
Odpipetować 900 mikrolitrów 0,015%Tween 20 roztworu wodnego do fiolki wirówkowej, a następnie odpipetować do niej 100 mikrolitrów oryginalnej zawiesiny koloidalnej. Odwirować zawiesinę o stężeniu 13 500 razy G przez jedną minutę i delikatnie zastąpić supernatant wodnym roztworem Tween 20. Załaduj zawiesinę koloidalną do strzykawki o pojemności jednego mililitra i podłącz strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.
Wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w środkowej części w górnej części kanału i stopniowo dociskać zawiesinę, aż szablon zostanie pokryty. Pobrać zawiesinę koloidalną przy natężeniu przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę i zobrazować proces modelowania za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Zwiększ natężenie przepływu, gdy łąkotka szybko dotrze do końca szablonu.
Geometria kanału prostego została wykorzystana do stworzenia modelu stacjonarnych komórek fazowych fluorescencyjnego szczepu Escherichia coli, który zdeponował 83% z 5 000 analizowanych pułapek. Wzorzyste bakterie wznowiły wzrost w różnym czasie w ciągu 1,5 godziny od momentu, gdy kanał został wypełniony świeżym LB. Po wznowieniu wzrostu pojedyncze komórki bakteryjne zaczęły tworzyć indywidualne kolonie, które rozszerzały się, aż utworzyła się warstwa powierzchniowa i utracono rozdzielczość pojedynczej komórki. Analiza przeprowadzona na ponad 55 000 pułapek wykazała, że zielono-czerwone dimery wykonane z cząstek o średnicy dwóch i jednego mikrometra powstały odpowiednio w 93% i 89% analizowanych pułapek.
A zielono-czerwono-zielone trymery powstały w 52% pułapek. Odległość między wzorzystymi cząstkami można precyzyjnie kontrolować, wykonując dwa osadzenia w przeciwnych kierunkach, zatrzymując w ten sposób takie cząstki na przeciwległych końcach każdej pułapki. Ważne jest, aby zapewnić jednolitą temperaturę na całym szablonie, aby zapobiec kondensacji podczas procesu modelowania.
W tym celu umieszczamy podgrzewaną szklaną płytkę pod szablonem i ustawiamy ją na tę samą temperaturę, co inkubator skrzynkowy. Metoda ta może być stosowana w różnych badaniach biologicznych obejmujących ilościową analizę pojedynczych komórek. Unikalną zaletą jest jego wysoka przepustowość, która pozwala na tworzenie wzorców tysięcy komórek, dostarczając dużych statystyk na tej samej arenie eksperymentalnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie prezentuje platformę mikrofluidyczną wykorzystującą montaż wspomagany przez kapilarność do układania mikroskopicznych obiektów, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice. Ta metoda umożliwia monitorowanie długoterminowej fizjologii mikroorganizmów i ich interakcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrofluidyka
- Biotechnologia
- Mikrobiologia
Tło
- Kanały mikrofluidyczne umożliwiają precyzyjne manipulowanie małymi objętościami płynów.
- Siły kapilarne mogą być wykorzystywane do układania różnych materiałów.
- Zrozumienie zachowania mikroorganizmów jest kluczowe dla różnych zastosowań.
- Istniejące metody mogą nie posiadać elastyczności dla użytkownikowych wzorców.
Cel badania
- Rozwój metody wytwarzania użytkownikowych wzorców mikroorganizmów.
- Ocena długoterminowej fizjologii ułożonych mikroorganizmów.
- Zbadanie zastosowania sił kapilarnych w różnych klasach materiałów.
Stosowane metody
- Montaż wspomagany przez kapilarność w kanałach mikrofluidycznych.
- Układanie cząstek koloidalnych i komórek mikroorganizmów.
- Monitorowanie mikroorganizmów po ułożeniu.
- Ocena kontroli układu przestrzennego.
Główne wyniki
- Użytkownicy wzorce mikroorganizmów zostały pomyślnie stworzone.
- Metoda wykazała kontrolę nad ułożeniem przestrzennym materiałów.
- Długoterminowe monitorowanie mikroorganizmów było możliwe.
- Siły kapilarne zapewniły wszechstronne podejście dla różnych materiałów.
Wnioski
- Technologia oferuje nowatorskie podejście do układania mikroorganizmów.
- Ma potencjalne zastosowania w badaniu interakcji mikrobiowych.
- Metoda jest przystosowana do różnych rodzajów materiałów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This microfluidic platform enables high-throughput, user-defined patterning of microorganisms and microparticles, supporting quantitative single-cell analysis in drug discovery and microbial ecology studies. By combining geometric control with environmental modulation, it enhances predictive confidence in target validation and phenotypic screening workflows. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving reproducible spatial arrangements for mechanistic de-risking of microbial interactions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise spatial patterning of microbial strains for interaction studies.
- Operational Value: Supports biological de-risking by allowing controlled co-culture configurations to clarify pathway dependencies.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating quantitative data on distance-dependent microbe-microbe interactions under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by depositing thousands of individual cells with high spatial fidelity.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through capillary-force-driven patterning applicable across material classes.
- Screening Readiness: Enables reliable compound evaluation by providing large arrays of patterned microorganisms for high-throughput monitoring.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports disease-relevant systems by coupling single-cell deposition with microfluidic environmental control for microbial physiology studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Connects discovery through preclinical validation by enabling long-term monitoring of growth and colony formation post-patterning.
- Predictive De-risking: Focuses on mechanistic insights from patterned arrays, such as green-red dimer and trimer formation rates, to inform translational decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification, supporting hypothesis testing and assay readiness for antimicrobial or probiotic candidate evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled patterning of microbial strains to study interaction dynamics.
- Screening: Describes assay readiness through high-throughput patterning of microorganisms, allowing quantitative imaging of growth and interaction over time.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as trap occupancy rates (e.g., 83% for E. coli, 93% for 2μm particles) that help compare conditions and material behaviors.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling long-term physiology monitoring under controlled environmental conditions, relevant for microbial ecology translation.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable platform for patterning diverse materials, including bacteria and colloids, across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in microbial interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of patterning across microbial and colloidal systems.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in antimicrobial development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative single-cell interaction data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, plasma bonding, and hydrophobic recovery of PDMS.
- Depends on instrumentation including syringe pumps, heated stages, plasma cleaners, and microscopy systems for patterning and monitoring.
- Necessitates cross-team standardization of channel preparation, bacterial suspension handling, and environmental control protocols.
- Involves adaptation considerations for different microorganism sizes, growth rates, and colloidal material properties.
- Includes practical limitations such as the need for uniform temperature to prevent condensation and potential loss of single-cell resolution during colony expansion.
