Name: Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Poznaj metodę montażu wspomaganego kapilarnością do tworzenia wzorców mikroorganizmów w mikrokanale. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie fizjologii i interakcji bakterii z wysoką przepustowością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony 179834 grantu SNSF PRIMA (dla E.S.), grantu badawczego ETH ETH-15 17-1 (R. S.) oraz nagrody Fundacji Gordona i Betty Moore w zakresie symbiozy mikroorganizmów wodnych (grant GBMF9197) (R. S.). Autorzy dziękują dr. Miguelowi Angelowi Fernandezowi-Rodriguezowi (Uniwersytet w Granadzie, Hiszpania) za obrazowanie bakterii metodą SEM i wnikliwe dyskusje. Autorzy dziękują dr Jen Nguyen (University of British Columbia, Kanada), dr Laurze Alvarez (ETH Zürich, Szwajcaria), Cameronowi Boggonowi (ETH Zürich, Szwajcaria) i dr Fabio Grillo za wnikliwe dyskusje.

1. Przygotowanie wzorca krzemowego
UWAGA: Szablony PDMS zawierające mikrofabrykowane pułapki, które tworzą szablon do koloidalnego i mikrobiologicznego wzorcowania, zostały wykonane zgodnie z metodą wprowadzoną przez Geisslera i wsp.17. Krzemowy wzorzec został przygotowany za pomocą konwencjonalnej litografii w pomieszczeniu czystym. Zapoznaj się z poniższymi krokami, aby zapoznać się z procedurą i tabelą materiałów dla sprzętu.
<ol>
	<li>Projektuj funkcje za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).</li>
	<li>Przygotuj maskę ze szkła chromowego z warstwą dodatniego fotorezystu, naświetlając zaprojektowane cechy za pomocą bezpośredniego lasera nagrywającego UV.
	<ol>
		<li>Opracuj maskę ze szkła chromowego za pomocą wywoływacza wirowego za pomocą wywoływacza o stosunku fotorezystu do wody 1:4 przez 15 s.</li>
		<li>Zanurz maskę w wytrawiaczu chromowym na 50 s.</li>
		<li>Obróbka plazmowa 10 cm płytki krzemowej przez 3 minuty przy mocy 600 W.</li>
		<li>Osadzać parę na warstwę heksametylodizylu i piec w temperaturze 110 °C, aby poprawić przyczepność do fotorezystu.</li>
		<li>Umieść warstwę fotorezystu na 4 500 × g na 2 min.</li>
		<li>Wystaw element na działanie promieniowania UV przez maskę ze szkła chromowanego za pomocą wyrównywacza maski przez 2 sekundy i wywołaj za pomocą wywoływacza, tak jak w przypadku maski.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zakończyć wytwarzanie wzorca krzemowego, wytrawić płytkę za pomocą głębokiej reaktywnej wymiany jonowej, dostosowując czas trawienia (<2 min), aby osiągnąć żądaną głębokość (mierzoną za pomocą profilometru).</li>
</ol>
2. Przygotowanie formy mikrokanałowej
<ol>
	<li>Zaprojektuj kanał za pomocą oprogramowania CAD i pokrój go za pomocą oprogramowania slicer, aby przekształcić zaprojektowany model w instrukcje dla drukarki 3D, ustawiając odległość krojenia na 0,05 mm.</li>
	<li>Wydrukuj kanał za pomocą drukarki 3D przez ~1 h.</li>
	<li>Umyj i utwardź formę w dedykowanej maszynie do utwardzania i mycia.
	<ol>
		<li>Umieść formę w pojemniku wypełnionym czystym alkoholem izopropylowym (IPA) i zmieszaj płyn (myj przez 20 min). Wyjmij pojemnik wypełniony IPA z maszyny.</li>
		<li>Po wyjęciu umytej formy z pojemnika IPA włóż ją z powrotem do pralki i utwardzaj przez 15 minut w temperaturze 35 °C. 
		UWAGA: Tabela materiałów zawiera informacje o drukarce 3D oraz maszynie do utwardzania i mycia używanej w protokole przygotowania formy. Model 3D został pocięty za pomocą zastrzeżonego oprogramowania slicera drukarki 3D.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wydruk w piecu UV na 12 godzin i umieść go w piekarniku w temperaturze 80 °C na 12 h. 
	UWAGA: Ten krok zapewnia, że cały polimer zostanie utwardzony, a cały nieutwardzony polimer zostanie usunięty z wydruku, ponieważ uniemożliwiłoby to utwardzenie PDMS.</li>
	<li>Silanizuj formę poprzez osadzanie z fazy gazowej silanu trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl).
	<ol>
		<li>Umieść formę 3D w eksykatorze próżniowym wraz z 20 μl 100% stężonego silanu trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylu) pipetowanego na folii aluminiowej umieszczonej w pobliżu formy.</li>
		<li>Wytworzyć próżnię w eksykatorze, aby wytworzyć parę i pozostawić na 40 minut.</li>
		<li>Wyjmij formę z eksykatora i przepłucz ją czystym etanolem przed wylaniem na nią PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Produkcja chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę PDMS, mieszając elastomer z jego środkiem sieciującym (tabela materiałów). Energicznie mieszaj mieszaninę, aby równomiernie zmiksować oba składniki, aż utworzą się pęcherzyki powietrza, a mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą. 
	UWAGA: Ilość środka sieciującego powinna wynosić 10% wagowo ilości elastomeru.</li>
	<li>Odgazowanie mieszaniny elastomeru i środka sieciującego w eksykatorze próżniowym w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza. Przenieść mieszaninę z eksykatora do pojemnika używanego do mieszania (krok 3.1). Kontynuuj proces odgazowywania, aż wszystkie pęcherzyki zostaną usunięte, a mieszanina znów będzie przezroczysta. 
	UWAGA: Zazwyczaj czas potrzebny do wysuszenia wynosi 30 minut.</li>
	<li>Wlej 3 g mieszaniny na wzorzec krzemowy, aby wytworzyć szablon, który posłuży jako "podłoga" chipa mikroprzepływowego. 
	UWAGA: Grubość warstwy PDMS można dostosować, zmieniając ilość mieszanki wylewanej na master krzemowy.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać matrycę o grubości 400 μm, należy wlać 3 g PDMS na matrycę wzorcową krzemu, umieścić wzorzec krzemowy na powlekarce wirowej i wirować na poziomie 21 × g przez 5 s i 54 × g przez 10 s, a następnie ponownie odgazować zgodnie z opisem w kroku 3.2 w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlej 20 g mieszaniny PDMS na wydrukowaną w 3D formę, aby uzyskać mikrokanał, który posłuży jako "dach" chipa mikroprzepływowego, i odgazuj go zgodnie z opisem w kroku 3.2 przez 30 minut.</li>
	<li>Piecz zarówno wafel silikonowy, jak i wydrukowaną w 3D formę w temperaturze 70 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
	<li>Oderwij warstwę PDMS od formy wydrukowanej w 3D, przetnij PDMS ostrzem wokół mikrokanałów i przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot kanału mikroprzepływowego.</li>
	<li>Oderwij PDMS od silikonowego wzorca i pokrój warstwę PDMS na mniejsze kawałki o tych samych wymiarach kanałów mikroprzepływowych, które zostaną połączone na wierzchu szablonów.</li>
	<li>Delikatnie przecieraj szablony i mikrokanaliki za pomocą 1% roztworu detergentu (patrz tabela materiałów) przez 5 minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną. Następnie przepłucz szablony i mikrokanaliki izopropanolem i spłucz je wodą dejonizowaną. Suszyć szablony i mikrokanaliki w temperaturze pokojowej przez 1 minutę sprężonym powietrzem o ciśnieniu 1 bar.</li>
	<li>Umieść szablony i mikrokanaliki w odkurzaczu plazmowym powierzchniami, które mają być sklejone, skierowanymi do góry. Włącz odkurzacz plazmowy i traktuj plazmowo szablony i mikrokanały przez 40 sekund. Wyjmij je z myjki plazmowej i natychmiast połącz mikrokanały na górze szablonów, stykając je ze sobą.</li>
	<li>Przechowuj chipy mikroprzepływowe w piecu w temperaturze 70 °C przez pięć dni, aby zapewnić hydrofobowy odzysk PDMS i mieć kąt zwilżania w optymalnym zakresie, od 30 do 60°10,11.</li>
</ol>
4. Wzorce bakteryjne
<ol>
	<li>Na dzień przed eksperymentem należy wyhodować populację Escherichia coli (szczep MG1655 prpsM-GFP). Zaszczepić kulturę bezpośrednio z zamrożonego bulionu i rosnąć przez noc przez 20 godzin w podłożu bulionowym lizogenicznym (LB) w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C. Dodać 50 μg/ml kanamycyny, aby komórki zachowały plazmid prpsM-GFP.</li>
	<li>W dniu eksperymentu ustaw inkubator skrzynkowy (<klasa silna="xfig">Rysunek 2A) na 37 °C na kilka godzin przed eksperymentem, aby uzyskać jednolitą i stabilną temperaturę przed rozpoczęciem eksperymentu. Ustaw pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C), ustawiając temperaturę na tę samą temperaturę, co inkubator pudełkowy. 
	UWAGA: Inkubator pudełkowy, w którym zamknięty jest cały system, w tym mikroskop (<klasa silna="xfig">Rysunek 2E), zapewnia utrzymanie jednolitej i stałej temperatury przez cały czas trwania eksperymentu, gdy kanał jest przepłukiwany pożywką.</li>
	<li>Dziewięćdziesiąt minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem (EtOH) i przepłucz kanał 100% EtOH przez co najmniej 10 minut. Umieść chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowuj przez co najmniej 30 minut. Wymień EtOH na wodę destylowaną i poddaj go próżniowej obróbce przez co najmniej 30 minut. Włóż chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 °C na 10 minut w celu wyjęcia wszelkie ślady cieczy pozostawione w kanale. 
	UWAGA: Ten krok jest konieczny, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w kanale po przepłukaniu pożywką hodowlaną. Ten protokół zapobiegania pęcherzykom został zaadaptowany z Wang et al.18.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml pożywki z kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) (1x) do fiolki wirówkowej i dodać 10 μl 0,132 M fosforanu potasu (K2HPO4). Wyjąć nocną kulturę z inkubatora w temperaturze 37 °C i podsycić 100 μl do fiolki wirówkowej i odwirować kulturę przy 2 300 × g przez 2 minuty. Delikatnie odpipetować supernatant z fiolek wirówkowych i ponownie zawiesić osad w 1 ml świeżej pożywki MOPS z 0,015% v/v Tween 20 i 0,01% v/v fosforanu potasu. 
	UWAGA: Typowe stężenie zawiesiny bakteryjnej mieści się w przedziale 0,015-0,15 obj., co zapewnia powstanie rozszerzonej i ruchomej strefy akumulacji oraz zapobiega gromadzeniu się cząstek na podłożu. Zastąpienie pożywki na noc świeżą pożywką minimalizuje ryzyko uwolnienia warstw bakterii na szablonie. Brak źródła węgla w świeżej pożywce zapobiega wzrostowi komórek w zawiesinie podczas tworzenia wzoru matrycowego. Stężenie 0,015% v/v Tween 20 w zawiesinie jest konieczne, aby kąt zwilżania cofającej się cieczy na matrycy PDMS mieścił się w optymalnym zakresie, od 30 do 60°.</li>
	<li>Załadować zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 1 ml i podłączyć strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.
	<ol>
		<li>Aby zabezpieczyć połączenie między strzykawką a rurką, należy bezpośrednio wprowadzić igłę o średnicy zewnętrznej 0,6 mm do rurki. Aby uniknąć rozsypania zawiesiny pozostałej w pobliżu wlotu w poprzek kanału, przepłucz świeże medium przez otwór używany jako wylot podczas procesu tworzenia wzoru (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3A-III), a nie przez otwór używany jako wlot.</li>
		<li>Zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. 
		UWAGA: Podczas procesu wtryskiwania cieczy powietrze może wydostawać się przez wylot znajdujący się na dolnym końcu kanału.</li>
		<li>Ustawić pompę strzykawkową tak, aby pobierała zawiesinę bakteryjną (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 3A-I) przy natężeniu przepływu 0,07-0,2 μL/min, co w opisanej geometrii odpowiada prędkości cofania się menisku 80-100 μm/min.</li>
		<li>Monitoruj proces tworzenia wzorów za pomocą oprogramowania mikroskopowego. 
		UWAGA: W tym przypadku 10-krotne powiększenie zostało użyte do monitorowania cofającego się menisku na szablonie, a 20-krotne powiększenie użyto do monitorowania osadzania się poszczególnych bakterii w mikrofabrykowanych pułapkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ułożeniu matrycy z komórkami (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A-II), zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu 2 μl/min, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału należy zwiększyć natężenie przepływu (15 μl/min) zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.</li>
</ol>
5. Wzorzec koloidalny
<ol>
	<li>Odpipetować 900 μl 0,015% v/v Tween 20 roztworu wodnego do fiolki wirówkowej i odpipetować do niej 100 μl oryginalnej zawiesiny koloidalnej. Odwirować zawiesinę o masie 13 500 × g przez 1 minutę. Delikatnie usunąć supernatant i zastąpić go wodnym roztworem Tween 20 (0,015% v/v). Powtórz ten proces trzy razy, aby zapewnić całkowitą wymianę rozpuszczalnika dostawcy z zawiesiny fabrycznej.</li>
	<li>Załaduj zawiesinę koloidalną do strzykawki o pojemności 1 ml i podłącz strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej. Wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w środkowej części, w górnej części kanału i stopniowo dociskać zawiesinę, aż szablon zostanie pokryty.</li>
	<li>Pobrać zawiesinę koloidalną przy natężeniu przepływu 0,07-0,2 μl/min, co odpowiada prędkości cofania się menisku wynoszącej 1-2 μm/min, i zobrazować proces modelowania za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Użyj 10-krotnego powiększenia, aby monitorować cofający się menisk na szablonie i 20-krotnego powiększenia, aby obserwować osadzanie się pojedynczych cząstek w mikrofabrykowanych pułapkach. Zwiększ natężenie przepływu, gdy menisk dotrze do końca szablonu, aby szybko opróżnić kanał. 
	UWAGA: Układy koloidalne złożone z kilku cząstek można wytworzyć, uruchamiając proces tworzenia wzoru od kroków 5.1 do 5.3 szeregowo. Kanał jest ładowany nową zawiesiną koloidalną w każdej iteracji zgodnie z pożądanym składem układów koloidalnych. Każdy etap tworzenia wzoru dodaje jedną cząstkę do układu koloidalnego i może być uruchamiany sekwencyjnie, aż pułapki zostaną wypełnione żądaną sekwencją cząstek. Skład powstałych układów koloidalnych zależy wyłącznie od sekwencji zawiesin koloidalnych używanych do wypełniania pułapek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
</ol>

<ol><li>Choi, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+bacteria+microarray+using+selective+patterning+of+polyelectrolyte+multilayer+and+poly%28ethylene+glycol%29-poly%28lactide%29+deblock+copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of bacteria microarray using selective patterning of polyelectrolyte multilayer and poly(ethylene glycol)-poly(lactide) deblock copolymer.</a> Macromolecular Research. 18 (3), 254-259 (2010).</li>
<li>Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+toward+phytoplankton+drives+organic+matter+partitioning+among+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1576-1581 (2016).</li>
<li>Thomas, C. M., Nielsen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of%2C+and+barriers+to%2C+horizontal+gene+transfer+between+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of, and barriers to, horizontal gene transfer between bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 3 (9), 711-721 (2005).</li>
<li>Suo, Z., Avci, R., Yang, X., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Immobilization+and+patterning+of+live+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Efficient Immobilization and patterning of live bacterial cells.</a> Langmuir. 24 (8), 4161-4167 (2008).</li>
<li>Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-specific+functional+studies+in+a+microfluidic+array+of+primary+mammalian+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4291-4298 (2006).</li>
<li>Akselrod, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-guided+assembly+of+heterotypic+three-dimensional+living+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Laser-guided assembly of heterotypic three-dimensional living cell microarrays.</a> Biophysical Journal. 91 (9), 3465-3473 (2006).</li>
<li>Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+properties+of+dead+or+alive+single-patterned+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical properties of dead or alive single-patterned bacteria.</a> Langmuir. 25 (10), 5731-5736 (2009).</li>
<li>Cerf, A., Cau, J. C., Vieu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+assembly+of+bacteria+on+chemical+patterns+using+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces%3A+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Controlled assembly of bacteria on chemical patterns using soft lithography.</a> Colloids and Surfaces: B Biointerfaces. 65 (2), 285-291 (2008).</li>
<li>Rozhok, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+motile+bacterial+cells+to+prealigned+holed+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Attachment of motile bacterial cells to prealigned holed microarrays.</a> Langmuir. 22 (26), 11251-11254 (2006).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcontact+printing+of+living+bacteria+arrays+with+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution.</a> Nano Letters. 7 (7), 2068-2072 (2007).</li>
<li>Ingham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+micro-Petri+dish%2C+a+million-well+growth+chip+for+the+culture+and+high-throughput+screening+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The micro-Petri dish, a million-well growth chip for the culture and high-throughput screening of microorganisms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18217-18222 (2007).</li>
<li>Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+chemostat%3A+an+agarose-based%2C+microfluidic+device+for+high-throughput%2C+single-cell+studies+of+bacteria+and+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities.</a> Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).</li>
<li>Ni, S., Isa, L., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+assembly+as+a+tool+for+the+heterogeneous+integration+of+micro-+and+nanoscale+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Capillary assembly as a tool for the heterogeneous integration of micro- and nanoscale objects.</a> Soft Matter. 14 (16), 2978-2995 (2018).</li>
<li>Ni, S., Leemann, J., Buttinoni, I., Isa, L., Wolf, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+colloidal+molecules+from+sequential+capillarity-assisted+particle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Programmable colloidal molecules from sequential capillarity-assisted particle assembly.</a> Science Advances. 2 (4), 1501779(2016).</li>
<li>Ni, S., Leemann, J., Wolf, H., Isa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+Insights+into+mechanisms+of+capillary+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discussions%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle Insights into mechanisms of capillary assembly.</a> Faraday Discussions. 181, 225-242 (2014).</li>
<li>Pioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+capillarity-assisted+particle+assembly+in+a+microfluidic+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Sequential capillarity-assisted particle assembly in a microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 21 (5), 888-895 (2021).</li>
<li>Geissler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+metal+nanowires+using+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Fabrication of metal nanowires using microcontact printing.</a> Langmuir. 19 (15), 6301-6311 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+prevention+of+bubble+formation+and+accumulation+for+long-term+culture+of+pancreatic+islet+cells+in+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Systematic prevention of bubble formation and accumulation for long-term culture of pancreatic islet cells in microfluidic device.</a> Biomedical Microdevices. 14 (2), 419-426 (2012).</li>
<li>Crowley, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+cell+death+by+propidium+iodide+uptake+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring cell death by propidium iodide uptake and flow cytometry.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 7, 647-651 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisana tutaj platforma mikroprzepływowa umożliwia modelowanie obiektów o rozmiarach mikro, takich jak koloidy i bakterie, w określone układy przestrzenne na podłożu PDMS. Pełna kontrola nad warunkami środowiskowymi oferowana przez mikrofluidykę oraz możliwość modelowania komórek z mikrometryczną precyzją zapewnianą przez technologię sCAPA sprawia, że jest to bardzo obiecująca platforma dla przyszłych badań z zakresu fizjologii i ekologii.
W eksperymentach przedstawionych w tej pracy master kr...

Przestrzenne wzorcowanie pojedynczych mikroorganizmów, szczególnie w obszarach eksperymentalnych, które umożliwiają pełną kontrolę nad warunkami środowiskowymi, takich jak urządzenia mikroprzepływowe, jest wysoce pożądane w szerokim zakresie kontekstów. Na przykład, układanie mikroorganizmów w regularne tablice pozwoliłoby na dokładne obrazowanie dużej liczby pojedynczych komórek i badanie ich wzrostu, fizjologii, ekspresji genów w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, i podatność na leki. Pozwoliłoby to również na badanie interakcji komórka-komórka, które są szczególnie interesujące w badaniach nad komunikacją komórkową (np. quorum sensing), karmieniem krzyżowym (np. symbioza glonów i bakterii) lub antagonizmem (np. allelopatia), z pełną kontrolą nad lokalizacją przestrzenną komórek względem siebie. Badania nad fizjologią i ewolucją komórek1, badania interakcji komórka-komórka2, badania przesiewowe różnicowania fenotypowego3, monitoring środowiskowy4, oraz badania przesiewowe leków5 należą do dziedzin, które mogą znacznie skorzystać z technologii zdolnej do przeprowadzenia takiej ilościowej analizy pojedynczej komórki.
W ostatnich latach zaproponowano kilka strategii izolowania i obsługi pojedynczych komórek, od holograficznych pułapek optycznych6 i heterogenicznych metod funkcjonalizacji powierzchni7,8,9,10 do jednokomórkowych chemostatów11 i mikrofluidyki kropelkowej12. Metody te są albo bardzo wymagające technicznie, albo wpływają na fizjologię komórki i nie zapewniają wysokoprzepustowej platformy do modelowania drobnoustrojów, które można badać przez długi czas, zapewniając rozdzielczość pojedynczej komórki, pełny dostęp optyczny i kontrolę nad warunkami środowiskowymi. Celem tego artykułu jest opisanie platformy do modelowania bakterii z mikrometryczną precyzją w określonych układach przestrzennych na powierzchni PDMS poprzez montaż wspomagany kapilarnie. Platforma ta umożliwia precyzyjne i elastyczne przestrzenne wzorcowanie mikroorganizmów oraz umożliwia pełny dostęp optyczny i kontrolę nad warunkami środowiskowymi, dzięki swojej mikroprzepływowej naturze.
Technologia stojąca za tą platformą to opracowana w ostatnich latach technologia montażu, nazwana sCAPA13,14,15 (sekwencyjny montaż cząstek wspomagany kapilarnością), który został zintegrowany z platformą mikroprzepływową16. Menisk parującej kropli cieczy, cofając się nad wzorzystym substratem z polidimetylosiloksanu (PDMS) wewnątrz kanału mikroprzepływowego, wywiera siły kapilarne, które zatrzymują poszczególne cząstki koloidalne zawieszone w cieczy w mikrometrycznych studzienkach mikrowytwarzanych na podłożu (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1A). Zawieszone cząstki są najpierw transportowane do granicy faz powietrze-ciecz za pomocą prądów konwekcyjnych, a następnie umieszczane w pułapkach za pomocą kapilaryzacji. Siły kapilarne wywierane przez poruszającą się łąkotkę działają na większą skalę w porównaniu z siłami biorącymi udział w oddziaływaniach cząstek.
Tak więc, na mechanizm montażu nie ma wpływu materiał, wymiary i właściwości powierzchni cząstek. Parametry takie jak stężenie cząstek, prędkość menisku, temperatura i napięcie powierzchniowe zawiesiny są jedynymi parametrami, które wpływają na wydajność procesu modelowania. Szczegółowy opis wpływu w/w parametrów na proces tworzenia wzorców czytelnik znajdzie w13,14,15. W oryginalnej technologii sCAPA13,14,15, proces tworzenia wzoru koloidalnego został przeprowadzony w systemie otwartym i wymagał bardzo precyzyjnego stopnia piezoelektrycznego do prowadzenia zawieszenia po szablonie. Platforma ta wykorzystuje inną strategię i umożliwia tworzenie wzorów za pomocą standardowego sprzętu powszechnie stosowanego w mikrofluidyce w kontrolowanym środowisku, minimalizując w ten sposób ryzyko zanieczyszczenia próbek.
Ta platforma mikroprzepływowa została najpierw zoptymalizowana na cząstkach koloidalnych, aby stworzyć regularne tablice cząstek obojętnych, a następnie z powodzeniem zastosowana do bakterii. Obie platformy mikroprzepływowe są opisane w tym artykule (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B,C). Większość etapów przygotowawczych i sprzętu eksperymentalnego opisanego w protokole jest wspólna dla obu zastosowań (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Przedstawiamy wzór koloidalny, aby pokazać, że technika ta może być używana do wykonywania wielu sekwencyjnych osadzania na tej samej powierzchni w celu tworzenia złożonych, wielomateriałowych wzorów. W szczególności na każdym etapie osadzano pojedynczą cząstkę na pułapkę, tworząc układy koloidalne o określonej geometrii i składzie, podyktowane wyłącznie geometrią pułapek i kolejnością napełniania. Jeśli chodzi o wzorzec bakteryjny, opisano pojedyncze osadzania, w wyniku których jedna bakteria jest osadzana w jednej pułapce. Gdy komórki są wzorowane na powierzchni, kanał mikroprzepływowy jest przepłukiwany pożywką w celu pobudzenia wzrostu bakterii, co jest wstępnym etapem każdego badania jednokomórkowego.

<table><tbody><tr><td>Alcatel AMS 200SE I-Speeder</td><td>Alcatel Micro Machining System</td><td></td><td>głębokiej reaktywnej wymiany jonowej</td></tr><tr><td>Detergent</td><td>Alconox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ400K developer</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ400K</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 mL Strzykawka (Luer-Lock)</td><td>BD</td><td>300912</td><td>służy do spłukiwania świeżego bulionu lizogenicznego do kanału mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Życie inkubatora pudełkowego</td><td> Usługi obrazowania</td><td>stosowane w celu zapewnienia jednolitej i stałej temperatury w kanale</td>Wirówka Eppendorf 5424R służy do wymiany pożywki nocnej na świeżą minimalną pożywkę Fiolka wirówkowa Eppendorf 30120086 1,5 ml CETONI Base 120 Pompa strzykawkowa CETONI GmbH Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 0,98 i mikro;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> m (red)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi267</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 1,08 i mikro; m (green)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi182</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 2,07 i mikro; m (green)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoGreen-Fi183</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne cząstki PS o średnicy 2,08 i mikro; m (red)</td><td>microParticles GmbH</td><td>PS-FluoRed-Fi180</td><td></td></tr><tr><td>Gigabatch 310 M</td><td>PVA TePla</td><td></td><td>służy do obróbki plazmowej 10 cm płytki krzemowej</td></tr><tr><td>H401-T-CONTROLLER</td><td>Sterownik Okolab</td><td></td><td>podgrzewanej płyty szklanej</td></tr><tr><td>H601-NIKON-TS2R-GLASS</td><td>Podgrzewana płyta szklana</td><td>Okolab</td><td></td></tr><tr><td>Heidelberg DWL 2000</td><td>Heidelberg Instruments</td><td></td><td>Bezpośredni laser UV writer</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe, U 100, ze</td> strzykawką luer <td>Codan Medical ApS</td><td>CODA621640</td><td>1 ml służącą do pobierania płynnej zawiesiny podczas procesu tworzenia wzoru</td></tr><tr><td>Klayout</td><td>Opensource</td><td></td><td>używany do projektowania funkcji na krzemowym masterze</td></tr><tr><td>LB Broth, Miller (Luria-Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>244610</td><td>Rosół lizogeniczny spłukiwany do kanału mikroprzepływowego</td></tr><tr><td>Masterflex rurka transferowa</td><td>Masterflex</td><td>HV-06419-05</td><td>0,020 '' ID, 0,06 '' OD</td></tr><tr><td>MOPS (10x)</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>rozcieńczona dziesięciokrotnie wodą miliQ i używana do wymiany podłoża na noc</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti2</td><td>Mikroskop Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>openSCAD</td><td>Opensource</td><td></td><td>używany do projektowania formy</td></tr><tr><td>Grupa bankomatów</td> <td>OPTIspin SB20</td><td>51-0002-01-00</td><td>wywoływacz wirowy</td></tr><tr><td>Komora plazmowa Zepto</td><td>Diener Electronic</td><td>ZEPTO-1</td><td>służy do plazmowej obróbki matrycy i mikrokanału w celu ich połączenia</td></tr><tr><td>Dodatni fotorezystu AZ1505</td><td>MicroChemicals</td><td>AZ1505</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td>dodany do MOPS 1x</td></tr><tr><td>Prusa utwardzanie i pralka CW1S</td><td>Prusa</td><td></td><td>służy do zapewnienia, że cały polimer jest utwardzony, a nieutwardzony polimer jest usuwany z formy</td></tr><tr><td>Prusa Resin - Tough</td><td>Prusa Research a.s.</td><td></td><td>Światłoczuła płynna żywica UV 405nm do druku 3D</td></tr><tr><td>Drukarka 3d Prusa SL1</td><td>Prusa</td><td></td><td>używana do drukowania formy</td></tr><tr><td>Waga</td><td>VWR-CH</td><td>611-2605</td><td>służy do ważenia mieszaniny PDMS</td></tr><tr><td>Wafel krzemowy (10 cm)</td><td>Silicon Materials Inc.</td><td></td><td>N/Phos < 100> 1-10 &Omega; cm</td></tr><tr><td>S&uuml; Nakładka maski ss MA6</td><td>SUSS MicroTec Group</td><td></td><td>służy do wyrównania maski ze szkła chromowanego i podłoża oraz odsłonięcia podłoża</td></tr><tr><td>Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td>; utwardzacz</tr><tr><td>Techni Etch Cr01</td><td>Technic</td><td></td><td>wytrawiacz chromu</td></tr><tr><td>Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyl) silan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>używany do silianizacji formy wydrukowanej w 3D</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>służy do zapewnienia optymalnego kąta zwilżania podczas procesu modelowania</td></tr><tr><td>Veeco Dektak 6 M</td><td>Profilometr</td><td>Veeco</td><td></td></tr><tr><td>VTC-100 Vacuum Spin Coater</td><td>MTI corporation</td><td></td><td>Próżniowa powlekarka wirowa</td></tr></tbody></table>

modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Patterning of Microorganisms and Microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly

Kontrolowane tworzenie wzorów mikroorganizmów w określonych układach przestrzennych oferuje unikalne możliwości dla szerokiego zakresu zastosowań biologicznych, w tym badań nad fizjologią i interakcjami mikroorganizmów. Na najprostszym poziomie, dokładne wzorce przestrzenne mikroorganizmów umożliwiłyby wiarygodne, długoterminowe obrazowanie dużej liczby pojedynczych komórek i zwiększyłyby możliwości ilościowego badania zależnych od odległości interakcji między mikroorganizmami. Co bardziej wyjątkowe, sprzężenie dokładnych wzorców przestrzennych i pełnej kontroli nad warunkami środowiskowymi, jakie oferuje technologia mikroprzepływowa, zapewniłoby potężną i wszechstronną platformę do badań pojedynczych komórek w ekologii drobnoustrojów. 
Ten artykuł przedstawia platformę mikroprzepływową do tworzenia wszechstronnych i zdefiniowanych przez użytkownika wzorów mikroorganizmów w kanale mikroprzepływowym, umożliwiając pełny dostęp optyczny dla długoterminowego, wysokoprzepustowego monitorowania. Ta nowa technologia mikroprzepływowa opiera się na kapilarnym składaniu cząstek i wykorzystuje siły kapilarne powstające w wyniku kontrolowanego ruchu parującej zawiesiny wewnątrz kanału mikroprzepływowego do osadzania pojedynczych mikroobiektów w szeregu pułapek mikrowytwarzanych na podłożu z polidimetylosiloksanu (PDMS). Osadzanie sekwencyjne generuje pożądany układ przestrzenny jednego lub wielu typów obiektów o rozmiarach mikro, podyktowany wyłącznie geometrią pułapek i kolejnością napełniania. 
Platforma została skalibrowana przy użyciu cząstek koloidalnych o różnych wymiarach i materiałach: okazała się potężnym narzędziem do generowania różnorodnych wzorów koloidalnych i funkcjonalizacji powierzchni uwięzionych cząstek. Ponadto platforma została przetestowana na komórkach mikrobiologicznych, wykorzystując komórki Escherichia coli jako bakterię modelową. Tysiące pojedynczych komórek zostało wymodelowanych na powierzchni, a ich wzrost był monitorowany w czasie. W tej platformie sprzężenie osadzania pojedynczych komórek i technologii mikroprzepływowej umożliwia zarówno geometryczne wzorce mikroorganizmów, jak i precyzyjną kontrolę warunków środowiskowych. Otwiera to tym samym okno na fizjologię pojedynczych drobnoustrojów i ekologię interakcji mikroorganizm-mikroorganizm, jak wykazały wstępne eksperymenty.

Opracowano platformę mikroprzepływową, która wykorzystuje montaż wspomagany kapilarnością do rozmieszczania cząstek koloidalnych i bakterii w pułapkach wykonanych metodą mikrofabrykacji na matrycy z PDMS. Zaprojektowano dwie różne geometrie kanałów, aby zoptymalizować rozmieszczanie koloidów i bakterii za pomocą montażu wspomaganego kapilarnością. Pierwsza geometria kanału (Rysunek 1B) składa się z trzech równoległych sekcji o długości 23 mm, pomiędzy którymi nie ma fizycznej bariery. Dwie b...

Prezentujemy technologię, która wykorzystuje wspomagany kapilarność montaż w platformie mikroprzepływowej do modelowania mikroobiektów zawieszonych w cieczy, takich jak bakterie i koloidy, w określone tablice na podłożu z polidimetylosiloksanu.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Controlled patterning of microorganisms into defined spatial arrangements offers unique possibilities for a broad range of biological applications, ...

Metoda ta pozwala na tworzenie zdefiniowanych przez użytkownika wzorów mikroorganizmów w kanale mikroprzepływowym. Po ustaleniu wzoru mikroorganizmy mogą być monitorowane w celu oceny ich długoterminowej fizjologii i interakcji z dużą przepustowością. Zastosowanie sił kapilarnych umożliwia niespecyficzną drogę do tworzenia wzorów, która ma zastosowanie w różnych klasach materiałów.Na przykład cząstki koloidalne i bakterie. Co więcej, pozwala to na wytwarzanie dużych tablic z doskonałą kontrolą rozmieszczenia przestrzennego interesującego nas materiału. Do tej pory testowaliśmy i stosowaliśmy metodę na cząstkach koloidalnych i komórkach drobnoustrojów.W rezultacie może znaleźć zastosowanie w inżynierii materiałowej i dziedzinach wymagających ilościowej analizy pojedynczych komórek, takich jak badania przesiewowe leków. Na początek przygotuj mieszaninę PDMS, mieszając elastomer z jego środkiem sieciującym. Następnie energicznie wymieszaj mieszaninę, aby równomiernie zmiksować oba składniki, aż utworzą się pęcherzyki powietrza, a mieszanina PDMS będzie wyglądać na nieprzezroczystą.Teraz odgazuj mieszaninę w eksykatorze próżniowym, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte, a mieszanina znów będzie przezroczysta. Aby uzyskać matrycę podłogową chipa mikroprzepływowego o grubości 400 mikrometrów, wlej trzy gramy mieszaniny na matrycę krzemową i umieść wzorzec krzemowy na powlekarce wirowej, aby wirować powłokę pod kątem 21 razy G przez pięć sekund i 54 razy G przez 10 sekund. Ponownie Degasa w celu usunięcia uwięzionych pęcherzyków powietrza, jak opisano wcześniej.Wlej 20 gramów mieszaniny PDMS do formy wydrukowanej w 3D, aby uzyskać mikrokanał, który będzie służył jako dach chipa mikroprzepływowego i odgazowuj go przez 30 minut, jak opisano wcześniej. Piecz wafel silikonowy i wydrukowaną w 3D formę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny, a następnie przetnij PDMS wzdłuż konturu wydrukowanej w 3D formy i oderwij ją. Przetnij PDMS ostrzem wokół mikrokanalików i przebij otwory, które będą służyć jako wlot i wylot kanału mikroprzepływowego.Teraz odetnij PDMS i oderwij go od silikonowego wzorca i pokrój warstwę PDMS na mniejsze kawałki o tych samych wymiarach kanałów mikroprzepływowych, które zostaną połączone na wierzchu szablonów. Delikatnie pocieraj szablony i mikrokanaliki za pomocą 1% roztworu detergentu przez pięć minut, a następnie spłucz wodą dejonizowaną. Następnie przepłucz szablony i mikrokanaliki izopropanolem, a następnie spłucz je wodą dejonizowaną.Teraz suszyć szablony i mikrokanaliki w temperaturze pokojowej przez minutę sprężonym powietrzem o ciśnieniu jednego bara. Umieść szablony i mikrokanaliki w myjce plazmowej powierzchniami łączącymi skierowanymi do góry. Po włączeniu myjki plazmowej, szablony i mikrokanały należy traktować plazmowo przez 40 sekund, a następnie wyjąć je z oczyszczarki plazmowej i natychmiast przykleić mikrokanały na wierzchu szablonów.Przechowuj chipy mikroprzepływowe w piekarniku w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć dni, aby zapewnić odzysk hydrofobowy PDMS. W dniu eksperymentu należy ustawić inkubator skrzynkowy na 37 stopni Celsjusza na kilka godzin przed eksperymentem, a następnie ustawić pompę strzykawkową i podgrzewaną szklaną płytkę na stoliku mikroskopu, ustawiając taką samą temperaturę, jak w inkubatorze pudełkowym. 90 minut przed eksperymentem umieść chip mikroprzepływowy w naczyniu wypełnionym 100% etanolem i przepłucz kanał 100% etanolem przez co najmniej 10 minut, a następnie umieść chip mikroprzepływowy w eksykatorze próżniowym i odgazowuj przez co najmniej 30 minut.Teraz wymień etanol na wodę destylowaną i poddaj chip obróbce próżniowej przez co najmniej 30 minut. Wstaw chip mikroprzepływowy do piekarnika w temperaturze 70 stopni Celsjusza na 10 minut, aby usunąć wszelkie ślady płynu pozostawione w kanale. Odpipetować jeden mililitr pożywki MOPS do fiolki wirówkowej i dodać 10 mikrolitrów 0,132 molowego fosforanu potasu.Porcję 100 mikrolitrów kultury przez noc przelać do fiolki wirówki i odwirować kulturę w temperaturze 2 300 razy G przez dwie minuty. Delikatnie wyrzuć supernatant w celu ponownego zawieszenia osadu w jednym mililitrze świeżej pożywki MOPS z 0,015% Tween 20 i 0,01% fosforanu potasu i załaduj zawiesinę bakteryjną do jednomililitrowej strzykawki. Aby zabezpieczyć strzykawkę i połączenie rurki, należy bezpośrednio włożyć igłę do rurki.Teraz zamontuj strzykawkę na pompie strzykawkowej i wstrzyknij zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w górnej części kanału, aż zawiesina pokryje obszar szablonu pułapkami. Ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę, aby pobrać zawiesinę bakteryjną i monitorować proces tworzenia wzoru za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Po ułożeniu matrycy z komórkami zwiększ natężenie przepływu pobierania, aby szybko opróżnić kanał mikroprzepływowy i przepłukać go świeżym LB, który został wcześniej odgazowany przez co najmniej 30 minut i wstępnie podgrzany w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Teraz ustaw pompę strzykawkową na natężenie przepływu dwóch mikrolitrów na minutę, aby delikatnie przepłukać kanał. Po napełnieniu kanału ponownie zwiększ natężenie przepływu. Uzyskuj obrazy rosnących bakterii w żądanym powiększeniu i odstępie czasu.Odpipetować 900 mikrolitrów 0,015%Tween 20 roztworu wodnego do fiolki wirówkowej, a następnie odpipetować do niej 100 mikrolitrów oryginalnej zawiesiny koloidalnej. Odwirować zawiesinę o stężeniu 13 500 razy G przez jedną minutę i delikatnie zastąpić supernatant wodnym roztworem Tween 20. Załaduj zawiesinę koloidalną do strzykawki o pojemności jednego mililitra i podłącz strzykawkę do chipa za pomocą rurki mikroprzepływowej.Wstrzyknąć zawiesinę do chipa mikroprzepływowego przez wlot znajdujący się w środkowej części w górnej części kanału i stopniowo dociskać zawiesinę, aż szablon zostanie pokryty. Pobrać zawiesinę koloidalną przy natężeniu przepływu od 0,07 do 0,2 mikrolitra na minutę i zobrazować proces modelowania za pomocą oprogramowania mikroskopowego. Zwiększ natężenie przepływu, gdy łąkotka szybko dotrze do końca szablonu.Geometria kanału prostego została wykorzystana do stworzenia modelu stacjonarnych komórek fazowych fluorescencyjnego szczepu Escherichia coli, który zdeponował 83% z 5 000 analizowanych pułapek. Wzorzyste bakterie wznowiły wzrost w różnym czasie w ciągu 1,5 godziny od momentu, gdy kanał został wypełniony świeżym LB. Po wznowieniu wzrostu pojedyncze komórki bakteryjne zaczęły tworzyć indywidualne kolonie, które rozszerzały się, aż utworzyła się warstwa powierzchniowa i utracono rozdzielczość pojedynczej komórki. Analiza przeprowadzona na ponad 55 000 pułapek wykazała, że zielono-czerwone dimery wykonane z cząstek o średnicy dwóch i jednego mikrometra powstały odpowiednio w 93% i 89% analizowanych pułapek.A zielono-czerwono-zielone trymery powstały w 52% pułapek. Odległość między wzorzystymi cząstkami można precyzyjnie kontrolować, wykonując dwa osadzenia w przeciwnych kierunkach, zatrzymując w ten sposób takie cząstki na przeciwległych końcach każdej pułapki. Ważne jest, aby zapewnić jednolitą temperaturę na całym szablonie, aby zapobiec kondensacji podczas procesu modelowania.W tym celu umieszczamy podgrzewaną szklaną płytkę pod szablonem i ustawiamy ją na tę samą temperaturę, co inkubator skrzynkowy. Metoda ta może być stosowana w różnych badaniach biologicznych obejmujących ilościową analizę pojedynczych komórek. Unikalną zaletą jest jego wysoka przepustowość, która pozwala na tworzenie wzorców tysięcy komórek, dostarczając dużych statystyk na tej samej arenie eksperymentalnej.

patterning-microorganisms-microparticles-through-sequential

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Źródło: Pioli, R., et al., Modeling of microorganisms and microparticles through Sequential Capillarity-assisted Assembly. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje metodę wychwytywania pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie komórek Escherichia coli (E. coli) w pułapkach mikroprzepływowych przy użyciu bezwęglowej zawiesiny i kontrolowanego przepływu, a następnie dodawania składników odżywczych w celu wyzwalania wzrostu i obrazowania fluorescencyjnego mikrokolonii.

Wzorce mikroprzepływowe i śledzenie wzrostu bakterii jednokomórkowych na podstawie fluorescencji

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorów komórkowych na SiO2 kompatybilną z mikrofabrykacją. Predefiniowany wzór parylenu-C jest drukowany fotolitograficznie na płytkach SiO2. Po inkubacji z surowicą (lub innym roztworem aktywacyjnym) komórki przylegają specyficznie (i rosną zgodnie z zgodnością) leżącego poniżej parylenu-C, będąc jednocześnie odpychane przez regiony SiO2.

Wzorcowanie komórek na zdefiniowanych fotolitograficznie 
Parylene-C: Substraty SiO2

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Tutaj demonstrujemy prostą metodę produkcji mikrokropelek o kontrolowanej wielkości, monodyspersyjnych, typu woda w oleju (W/O) za pomocą kapilarnego odśrodkowego urządzenia mikroprzepływowego. Metoda ta wymaga jedynie niewielkiej objętości próbki i umożliwia produkcję o wysokiej wydajności. Spodziewamy się, że ta metoda będzie przydatna do szybkich analiz biochemicznych i komórkowych.

Kapilarne odśrodkowe urządzenie mikroprzepływowe do formowania mikrokropel monodyspersyjnych o kontrolowanej wielkości

Proponujemy prostą technikę samoorganizacji koloidalnych nanocząstek krzemionki w celu stworzenia nanofluidycznego połączenia między dwoma mikrokanałami w polidimetylosiloksanie (PDMS). Korzystając z tej techniki, nanoporowatą membranę perełkową o wielkości porów do ~45 nm wbudowano w mikrokanał i zastosowano do elektrokinetycznego wstępnego zagęszczenia próbek DNA.

Tworzenie połączeń nanofluidycznych poniżej 50 nm w chipie mikroprzepływowym PDMS poprzez proces samoorganizacji cząstek koloidalnych

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Testy kropelek wody w oleju są przydatne do chemii analitycznej, ewolucji enzymów i analizy pojedynczych komórek, ale zazwyczaj wymagają mikrofluidyki do formowania kropel. W tym miejscu opisujemy emulgację z szablonami cząstek, bezprzepływowe podejście do wykonywania testów kropelkowych.

Emulgacja szablonowa cząstek umożliwia oznaczanie kropel bez mikroprzepływowości

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Ten protokół opisuje metodę tworzenia wzorców komórkowych bez tuszu, bez etykiet, niezależną od podłoża, opartą na efekcie magnetycznym Archimedesa.

Wzorcowanie komórek przy użyciu strategii magnetyczno-archimedesowej

Poznaj metodę montażu wspomaganego kapilarnością do tworzenia wzorców mikroorganizmów w mikrokanale. Technika umożliwia długoterminowe monitorowanie fizjologii i interakcji bakterii z wysoką przepustowością.

Modelowanie mikroorganizmów i mikrocząstek poprzez sekwencyjny montaż wspomagany kapilarnością

Przeglądaj więcej filmów