Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie prostej, jednoetapowej procedury preparacji mózgów dorosłych Drosophila, która może szybko wytworzyć mózgi o dobrze zachowanej morfologii nadającej się do analizy całego wierzchowca. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania z dziedziny neuronauki i genetyki. Obejmuje to dokładne mapowanie obwodów mózgowych, badanie skutków manipulacji genetycznych neuronów i funkcjonalną charakterystykę genów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że wiąże się z łatwą do nauczenia procedurą. Może ułatwić wypreparowanie mózgu dorosłej muchy o dobrze zachowanej morfologii w mniej niż 10 sekund. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kontrolowanie wymaganego pędu podczas zwalniania kleszczy w celu oderwania egzoszkieletu otaczającego głowę muchy wymaga umiejętności i praktyki.

Te maleńkie, irytujące muszki owocówki nauczyły nas wiele o zasadach biologicznych. Mogą również pomóc nam znaleźć przyczyny i lekarstwa na choroby ludzkie, takie jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona. Używając mikroskopu preparacyjnego ustawionego na powiększenie 1,2x, unieruchomij znieczuloną muchę i zanurz ją w zimnym roztworze preparacyjnym z brzuchem skierowanym do góry.

Trzymaj kleszcze pod kątem od 160 do 170 stopni zgodnie z płytką preparacyjną, a następnie wywieraj niewielką siłę na brzuch muchy. Powinno to unieruchomić muchę, zmusić głowę do tyłu o 15 do 25 stopni i wysunąć trąbkę do góry. Po tym manewrze powinien stać się widoczny miękki, półprzezroczysty obszar naskórka pod trąbką.

Zwiększ powiększenie i dostosuj płaszczyznę ogniskowej do tego obszaru. Używając dominującej ręki, weź parę kleszczy preparacyjnych i wywieraj nacisk, aby zamknąć końcówki. Ustaw kleszcze prostopadle do kleszczy krępujących muchę.

Przebij zamknięte końcówki kleszczy przez miękki półprzezroczysty obszar naskórka, uważając, aby nie wniknąć tak głęboko, aby dotknąć mózgu. Następnie szybko, ale systematycznie, zwolnij kleszcze, tak aby punkty się otworzyły, odrywając egzoszkielet głowy muchy. Wykorzystaj pęd po zwolnieniu końcówek kleszczy, aby delikatnie usunąć egzoszkielet i większość oka i tchawicy związanych z obudową głowy z tkanki mózgowej jednym ruchem.

Nienaruszony mózg powinien być teraz widoczny. Za pomocą kleszczy ostrożnie usuń pozostałe tkanki dodatkowe, takie jak biała włóknista tkanka tchawicy, uważając, aby nie ciągnąć ani nie uszkodzić właściwego mózgu. Umieść wypreparowane próbki mózgu wraz z powiązanymi torsami w około jednym mililitrze 4% paraformaldehydu na lodzie przez 40 do 60 minut.

Usuń paraformaldehyd, a następnie przepłucz próbki jednym mililitrem jednego X PBS, pipetując roztwór trzy razy w górę iw dół, uważając, aby nie zassać mózgu. Następnie usuń PBS, a następnie przemyj pięć razy jednym mililitrem jednego X PBT przez pięć minut każdy z nutacją. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania w odpowiednim rozcieńczeniu.

A następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z nutacją. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć próbki pięciokrotnie jednym mililitrem jednego X PBT przez pięć do 10 minut przy każdym płukaniu z nutacją. Dodać przeciwciało drugorzędowe do przemytych próbek w odpowiednim czasie rozcieńczania i inkubacji.

Następnie umyj próbki sześć razy w jednym mililitrze jednego X PBT przez 10 minut każda z nutacją. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia wszelkich niespecyficznie związanych przeciwciał drugorzędowych. Inkubować próbki w rozcieńczeniu od jednego do 10 000 jednego miligrama na mililitr DAPI w jednym mililitrze jednego roztworu X PBT przez 30 do 60 minut z nutacją.

Na koniec przepłukać próbki, dodając jeden mililitr jednego X PBS, a następnie trzykrotnie pipetując roztwór w górę iw dół. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku montażowym. Za pomocą pipety z odciętą końcówką przenieść mózgi w jednym roztworze X PBS na szkiełko nakrywkowe.

Następnie za pomocą kleszczy oddziel mózgi od ciał. Użyj cienkiej końcówki pipety, aby usunąć płyn wokół tkanki mózgowej. A następnie dodaj od 20 do 40 mikrolitrów środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

Delikatnie rozłóż mózgi, jednocześnie wypierając lepkie medium na zewnątrz. Zaczynając od jednej strony, delikatnie opuść drugie szkiełko nakrywkowe na próbki, uważając, aby zminimalizować kontakt mózgu z pęcherzykami. Poczekaj, aż zraze opadną, a następnie usuń nadmiar płynu z krawędzi zrazów za pomocą chusteczki laboratoryjnej.

Użyj małego kawałka taśmy, aby tymczasowo przymocować parę szkiełek nakrywkowych do szkiełka montażowego. Aby zobrazować próbki, należy użyć złożonego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Zdjęcia te pokazują widok z przodu i z tyłu tej samej dorosłej Drosophila.

Jądra komórkowe wizualizowano za pomocą barwienia DAPI, a neurony znakowano za pomocą markera neuronalnego i przeciwciał anty-ELAV. Neurony dopaminergiczne lub DA zostały ujawnione przez barwienie przeciwciałami anty-TH. Podobne poziomy intensywności zaobserwowano po obu stronach mózgu dla wszystkich kanałów obrazu.

Powiększone widoki przedniej i tylnej części mózgu pozwalają na szczegółowe badanie klastrów neuronalnych DA. Sparowany przedni klaster przyśrodkowy można zobaczyć na zdjęciach przednich, a sparowane tylne skupiska przyśrodkowe i sparowane tylne boczne w tylnej stronie mózgu. Kwantyfikacja tych neuronów ujawniła, że trzydniowe samce muszek szczepu w1118 mają zazwyczaj 27 neuronów DA w klastrze PPM w całym mózgu, 16 w klastrze PPL na półkulę i pięć w klastrze PAL na półkulę.

W każdym z PAM zaobserwowano średnio 97 neuronów DA clusters. 3D rekonstrukcja klastrów PAL i PAM wykazała również, że neurony DA w klastrze PAM mają stosunkowo małe rozmiary i słabsze barwienie TH niż te w innych klastrach, takich jak PAL. Coraz więcej badań koncentruje się na mózgach dorosłych muszek w celu analizy szlaków molekularnych i obwodów neuronalnych leżących u podstaw wyższych funkcji mózgu oraz do modelowania chorób mózgu u ludzi.

W takich badaniach opartych na mózgu konieczne będzie sprawne przygotowanie próbek mózgu o dobrze zachowanej morfologii. Może to być szczególnie ważne w przypadku badań przesiewowych na dużą skalę opartych na mózgu. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, gdy zmagałem się z utrzymaniem much w kleszczach.

Zamiast kleszczy z ostrymi końcówkami, których używa większość badaczy Drosophila, Shebna wypróbowała kleszcze z końcami i odkryła, że łatwiej jest przeprowadzić sekcję mózgu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 10 sekund, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Kiedyś przeprowadziłem sekcję około 100 mózgów o sześciu różnych genotypach do jednego eksperymentu w ciągu zaledwie jednego dnia.

Chociaż ta procedura preparacji może wydawać się prosta, ważne jest, aby najpierw przećwiczyć ją z zbędnymi muchami. Badacz może również mieć trudności z ustawieniem kleszczy bez niszczenia mózgu muchy. Wypreparowane mózgi można wykorzystać do innych badań, takich jak RNA, hybrydyzacja in situ oraz ekstrakcja próbki białka i RNA z tkanki mózgowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wypreparować mózgi much o dobrze zachowanej morfologii. Przewidujemy, że można opracować ulepszenia, aby ta procedura była prostsza i szybsza. W przyszłości może to zostać zautomatyzowane w przypadku badań na dużą skalę.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem i ostrymi kleszczami preparacyjnymi może być niebezpieczna. Podejmij środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, podczas obchodzenia się z roztworami utrwalającymi, a po zakończeniu sekcji natychmiast przykryj kleszcze przed odłożeniem ich na bok.