Name: Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj prosty protokół preparacyjny mózgów dorosłych Drosophila w mniej niż 10 sekund. Ta metoda zachowuje morfologię tkanek i ułatwia badania neurobiologii oraz genetyki neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Panu/Pani Enes Mehmet, Pani Kiarze Andrade, Pani Pilar Rodriguez, Chrisowi Kwokowi i Pani Dannie Ghafir za ich ogromne wsparcie dla projektu.

1. Roztwory używane do preparacji mózgu i barwienia immunofluorescencyjnego
<ol>
	<li>Przeanalizuj mózgi dorosłych much w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2 i 10 mM glukozy. Przed użyciem zagazuj aCSF 5% CO2 / 95% O2 przez 10 - 15 minut i nabij 2,5 mM CaCl2. Wysterylizuj roztwór aCSF, filtrując przez filtr membranowy 0,22 μm. 
	nuta: Przechowywać płyn CSF w temperaturze 4 °C, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu. Mózgi much można również preparować w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS), chociaż nie przeprowadzono szczegółowych porównań wpływu dwóch roztworów preparacyjnych na końcową jakość obrazowania wypreparowanych mózgów.</li>
	<li>Użyć 4% paraformaldehydu (PFA) przygotowanego w 1x PBS jako roztworu utrwalającego, który jest zwykle porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C. 
	ostrożność: PFA jest toksyczny i i należy obchodzić się z nim ostrożnie.</li>
	<li>Użyj 1x PBS do wypłukania PFA z mózgów i po ostatnim etapie mycia, podczas barwienia immunofluorescencyjnego wypreparowanych mózgów. Przygotuj 1x PBS z 10x PBS roztworu podstawowego (1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4 i 18 mM KH2PO4).</li>
	<li>Użyj 0,3% Tween-20 w 1x PBS (1x PBT) do wszystkich kolejnych etapów mycia podczas barwienia immunofluorescencyjnego wypreparowanych mózgów.</li>
</ol>
2. Mikrochirurgiczne preparowanie dorosłych głów muchowych
Uwaga: Procedura preparacji jest zilustrowana na rysunku 1.
<ol>
	<li>Znieczulić dorosłe muchy CO2. Za pomocą kleszczy podnieś muchę i krótko odwoskuj jej naskórek, zanurzając go w 70% etanolu na 3 - 5 sekund. Gwarantuje to, że żadne pęcherzyki nie przylegają do naskórka muchy po zanurzeniu w roztworze preparacyjnym aCSF lub 1X PBS.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym ze źródłem światła pod kątem, który nie będzie blokowany przez ręce, ustaw soczewkę obiektywu tak, aby uzyskać wyraźny widok muchy (powiększenie 1,2x). Użyj kleszczy ręką niedominującą, aby unieruchomić zwierzę i zanurz muchę w zimnym roztworze preparacyjnym z brzuchem skierowanym do góry, jak pokazano na rysunku 1A.</li>
	<li>Trzymaj kleszcze pod kątem 160 - 170° w stosunku do płytki preparcyjnej, wywierając niewielką siłę na brzuch muchy (zilustrowany strzałkami na rysunku 1A). Ten krok unieruchomi muchę i zmusi ją do przesunięcia głowy do tyłu o 15 - 25°, jednocześnie wysuwając trąbkę do góry. W tym procesie powinien stać się widoczny miękki i półprzezroczysty obszar naskórka, pod trąbką. Zwiększ powiększenie i dostosuj płaszczyznę ogniskowej do tego obszaru. 
	nuta: Nie trzymaj kleszczy zbyt mocno, ale raczej wystarczająco mocno, aby ustabilizować muchę. Zbyt duża siła spowoduje, że narządy wewnętrzne pękną w roztworze.</li>
	<li>Użyj dominującej ręki, aby docisnąć kleszcze preparacyjne tak, aby ich końcówki były zamknięte, co wytworzy łagodną siłę oporu na końcówkach kleszczy, tak aby kleszcze otworzyły się po zwolnieniu nacisku z ręki trzymającej. Ustaw kleszcze prostopadle do kleszczy trzymających muchę, jak pokazano na rysunku 1B.
	<ol>
		<li>Przebij zamknięte końcówki kleszczy preparacyjnych przez miękki i półprzezroczysty obszar naskórka pod trąbką, jak pokazano czerwoną strzałką na rysunku 1B. Ważne jest, aby nie penetrować kleszczy zbyt głęboko, aby dotknęły mózgu. Właściwy mózg powinien stać się widoczny. Utrzymuj stabilny chwyt rozporka ręką niedominującą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybko, ale stabilnie, zwolnij końcówki kleszczy preparacyjnych o własnej sile i polegaj na pędzie z tego uwolnienia, aby oderwać egzoszkielet otaczający głowę muchy. Nienaruszony mózg właściwy powinien stać się widoczny (biała tkanka bezpośrednio nad czubkiem dolnego kleszcza na rysunku 1C) Podążaj za wyimaginowaną linią, aby kierować pędem zwolnionych końcówek kleszczy (zilustrowanych jako zewnętrzne czerwone strzałki pokazane na rysunku 1C). To delikatnie usunie egzoszkielet i większość oka i tchawicy związanych z mózgiem z mózgu. Właściwy czas i siła zastosowana do otwarcia egzoszkieletu będą zależały od doświadczenia badacza. 
	nuta: Jest to najbardziej krytyczny krok podczas sekcji. Ważne jest, aby polegać na naturalnej sile generowanej przez pęd kleszczy otwierających, aby usunąć egzoszkielet, pozostawiając odsłonięte szczątki mózgu przyczepione do reszty ciała.</li>
	<li>Użyj kleszczy w dominującej ręce, aby ostrożnie usunąć resztki tkanek dodatkowych, takich jak tchawica, która wygląda jak struktury białych włókien pozostające przyczepione do mózgu. Uważaj, aby nie ciągnąć ani nie uszkodzić właściwego mózgu.</li>
</ol>
3. Immunofluorescencyjne barwienie mózgów
<ol>
	<li>Wypreparowane próbki mózgu wraz z powiązanymi z nimi tułowiami należy umieścić w około 1 ml 4% PFA przez 40 - 60 min. 
	nuta: W tym i kolejnych krokach należy przechowywać probówki lub płytki z próbkami na nutatorze, aby prawidłowo wymieszać próbki w roztworze.</li>
	<li>Spłukać 1 ml 1x PBS, pipetując roztwór w górę i w dół 3 razy. Uważaj, aby nie zassać mózgu.</li>
	<li>Umyj 5 razy 1x PBT przez 5 minut każdy. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.</li>
	<li>Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi we właściwym rozcieńczeniu O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia usuń przeciwciała pierwszorzędowe i umyj próbki 5 razy 1x PBT. Pozostawić próbki na 5 - 10 minut w 1x roztworze PBT pomiędzy każdym myciem. Przechowywać próbki na nutatorze podczas inkubacji.</li>
	<li>Umyte próbki inkubować w odpowiednich przeciwciałach drugorzędowych z sugerowanym rozcieńczeniem i czasem inkubacji.</li>
	<li>Przemyć próbki sześciokrotnie 1x PBT z 10-minutową inkubacją między każdym myciem. 
	Ten etap ma kluczowe znaczenie dla usunięcia nieswoistych przeciwciał drugorzędowych z próbki.</li>
	<li>Inkubować w rozcieńczeniu 1:10 000 1 mg / ml 4',6'-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w 1x roztworze PBT przez 30 minut. DAPI jest barwnikiem DNA, który wiąże się z regionami AT DNA i może być wykorzystany do ujawnienia ogólnej morfologii mózgu.</li>
	<li>Spłucz trzy razy 1x PBS.</li>
	<li>Przenieś próbki do naczynia preparacyjnego i oddziel mózgi od ciał w naczyniu sekcyjnym za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Po etapach barwienia i mycia zamontuj mózgi pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi i umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełku montażowym. W ten sposób próbki mózgu można łatwo odwrócić, tak aby obie strony mózgu mogły być zobrazowane z podobną intensywnością sygnału. 
	nuta: Zamontowanie mózgu na szkiełku nakrywkowym zamiast bezpośrednio na szkiełku montażowym umożliwia swobodne obracanie orientacji próbki. Proces montażu został wyjaśniony bardziej szczegółowo poniżej.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na szkiełku montażowym. Poszerzyć otwór końcówki pipety za pomocą ostrza i użyć go do przeniesienia mózgów w 1 roztworze PBS na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm.</li>
		<li>Umieść mózgi na środku szkiełka nakrywkowego, usuń płyn wokół mózgów za pomocą cienkiej końcówki pipety, a następnie dodaj kolejne 20 - 40 μl podłoża mocującego zapobiegającego blaknięciu (0,2% (w/v) galusanu n-propylu w 99,5% glicerolu klasy ACS) na mózgi. 
		nuta: Ilość dodanego podłoża montażowego zależy od liczby badanych mózgów.</li>
		<li>Delikatnie rozłóż mózgi, jednocześnie wypierając lepkie podłoże montażowe na zewnątrz. Umieść drugie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na wierzchu mózgu, najpierw opuszczając szkiełko z jednej strony, aż zetknie się z powierzchnią szkiełka montażowego, a następnie powoli opuszczając drugą stronę, aby zminimalizować kontakt mózgu z pęcherzykami powietrza. 
		nuta: Nie ma potrzeby stosowania przekładki pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi, ponieważ objętość podłoża montażowego i mózgów powinna zapewniać przestrzeń wystarczającą do oddzielenia dwóch szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Pozwól szkiełkom się uspokoić. Nadmiar płynu, który wydostaje się z boków szkiełek, usunąć chusteczką laboratoryjną.</li>
		<li>Aby zapobiec wypadnięciu szkiełek nakrywkowych z zamontowanymi mózgami z prowadnicy montażowej podczas transportu, użyj małego kawałka taśmy do przymocowania szkiełek nakrywkowych do prowadnicy montażowej. 
		nuta: Mózgi zamontowane pomiędzy szkiełkami mogą być natychmiast zobrazowane lub przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia bez znacznej utraty sygnału fluorescencyjnego, bez konieczności stosowania jakiegokolwiek uszczelniacza do uszczelniania szkiełek. W celu długotrwałego zachowania zabarwionych mózgów, bok dwóch zwojów można uszczelnić lakierem do paznokci i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C, chociaż poplamione mózgi mogą z czasem stracić swoje sygnały. Nie jest to zalecane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj odpowiedniego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego, aby zobrazować mózgi.
	<ol>
		<li>Najpierw uzyskaj obraz od strony mózgu bliżej obiektywu, a następnie ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe, aby próbki znalazły się pośrodku. Ten krok ułatwia uzyskanie obrazu drugiej strony tego samego mózgu.</li>
		<li>Użyj pionowego złożonego mikroskopu fluorescencyjnego i soczewki obiektywowej 20X, aby zobrazować cały mózg (przykłady na rycinie 2) oraz obiektywu 40X, aby zobrazować mniejsze obszary mózgu, takie jak neurony DA w regionie klastra Paired Anterior Medial (PAM) (przykłady na rycinie 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+flies+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Fruit flies in biomedical research.</a> Genetics. 199, 639-653 (2015).</li>
<li>Bellen, H. J., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morgan%27s+legacy%3A+fruit+flies+and+the+functional+annotation+of+conserved+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morgan's legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes.</a> Cell. 163, 12-14 (2015).</li>
<li>Aso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, 04577(2014).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).</li>
<li>Yamagata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+dopamine+neurons+mediate+reward+signals+for+short-+and+long-term+memories%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).</li>
<li>Waddell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Plasticity%3A+Dopamine+Tunes+the+Mushroom+Body+Output+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network.</a> Curr Biol. 26, 109-112 (2016).</li>
<li>Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroarchitecture+and+neuroanatomy+of+the+Drosophila+central+complex%3A+A+GAL4-based+dissection+of+protocerebral+bridge+neurons+and+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits.</a> J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).</li>
<li>Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+adult+Drosophila+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of adult Drosophila brains.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+muscle+and+dopaminergic+neuron+degeneration+caused+by+inactivation+of+Drosophila+Pink1+is+rescued+by+Parkin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).</li>
<li>Greene, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology+and+apoptotic+muscle+degeneration+in+Drosophila+parkin+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).</li>
<li>Whitworth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glutathione+S-transferase+activity+rescues+dopaminergic+neuron+loss+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).</li>
<li>Pesah, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+parkin+mutants+have+decreased+mass+and+cell+size+and+increased+sensitivity+to+oxygen+radical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress.</a> Development. 131, 2183-2194 (2004).</li>
<li>Trinh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decaffeinated+coffee+and+nicotine-free+tobacco+provide+neuroprotection+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease+through+an+NRF2-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson's disease through an NRF2-dependent mechanism.</a> J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).</li>
<li>Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+s-transferase+omega+1+activity+is+sufficient+to+suppress+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease.</a> J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wraz z rosnącym zainteresowaniem wykorzystaniem dorosłego mózgu Drosophila do badania chorób ludzkiego mózgu, obwodów neuronalnych i wyższych funkcji mózgu, konieczne jest opracowanie prostych i szybkich metod uzyskiwania nienaruszonych mózgów much do analiz całościowych, co jest szczególnie ważne w przypadku badań przesiewowych mózgu na dużą skalę. Nasza metoda zapewnia proste i łatwe do nauczenia podejście do wypreparowania głowy muchy (często w mniej niż 10 s z doświadczeniem) z dobrze zachowaną morfologią, k...

Modelowy organizm Drosophila, powszechnie znany jako muszka owocowa, od dawna ceniony jest za swoje eleganckie narzędzia genetyczne, krótki czas reprodukcji oraz wysoce zachowane szlaki molekularne i komórkowe. Muszka owocowa została z powodzeniem wykorzystana do analizy podstawowych szlaków sygnałowych, mechanizmów wzorcowania organizmów wielokomórkowych, a także mechanizmów leżących u podstaw rozwoju, funkcji i chorób neuronów1,2. Dzięki niedawnym postępom w technologiach znakowania i obrazowania komórek, mózg muszki owocowej stał się szczególnie skuteczny w precyzyjnym mapowaniu obwodów neuronalnych oraz w analizowaniu molekularnych i komórkowych podstaw wyższych funkcji mózgu, takich jak uczenie się i pamięć oraz rytm okołodobowy1,3,4,5,6,7,8.
Jedną szczególną zaletą systemu Drosophila jest jego stosunkowo mały rozmiar, pozwalający na przygotowanie całego montażu i badanie mózgu za pomocą zwykłego mikroskopu złożonego lub konfokalnego. Funkcja ta umożliwia szczegółową analizę anatomiczną i funkcjonalną obwodów neuronalnych, a nawet pojedynczego neuronu, na poziomie komórkowym i subkomórkowym, w kontekście całej tkanki mózgowej, zapewniając w ten sposób zarówno holistyczne spojrzenie na badany obiekt, jak i jego dokładną geometrię w całym mózgu. Biorąc jednak pod uwagę raczej miniaturowy rozmiar mózgu, stanowi to również wyzwanie techniczne w skutecznym wypreparowaniu nienaruszonej tkanki mózgowej z ochronnej obudowy głowy egzoszkieletu u dorosłej muchy. Szczegółowo opisano różne skuteczne i stosunkowo proste metody preparacji, które zwykle polegają na starannym i stopniowym usuwaniu obudowy głowy i związanych z nią tkanek, w tym oczu, tchawicy i tłuszczu z właściwego mózgu9, 10. Te mikrochirurgiczne metody preparacji często stawiają dość rygorystyczne wymagania co do jakości kleszczy preparacyjnych, opierając się na kleszczach z cienkimi, dobrze ustawionymi końcówkami, które można łatwo uszkodzić. Co więcej, ponieważ wypreparowane mózgi są często oddzielone od reszty ciała, mózgi mogą zostać łatwo utracone podczas późniejszych procesów barwienia i mycia ze względu na ich małe rozmiary i przezroczystość w buforze przetwarzania. Tutaj opisujemy stosunkowo prosty i łatwy do nauczenia, jednoetapowy protokół preparacji dla dorosłych mózgów, który utrzymuje wypreparowane mózgi przyczepione do tułowia. Proces preparacji często z łatwością usuwa większość tkanek związanych z mózgiem, takich jak oko i tchawica, oraz zmniejsza zapotrzebowanie na dobrej jakości kleszcze preparacyjne.
Dodatkowo, podczas obrazowania mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym, strona mózgu, która jest oddalona od źródła światła fluorescencyjnego, często wytwarza słabszy sygnał i mniej wyraźne obrazy ze względu na grubość całego mózgu. W tym miejscu opisujemy również prostą metodę montażu, która umożliwia łatwe odwracanie próbek mózgu, umożliwiając wygodne obrazowanie obu stron mózgu o podobnym natężeniu i jakości sygnału.
Jako dowód na słuszność koncepcji zastosowania tej metody do badania mózgu dorosłego człowieka, dalej badaliśmy obecność neuronów DA w mózgach much w1118; genotypu, który jest często używany jako linia rodzicielska do generowania muszek transgenicznych i kontroli typu dzikiego w wielu badaniach nad Drosophila.

<table><tbody><tr><td>w*; &nbsp; park&Delta; 21/TM3,&nbsp; P{GAL4-Kr.C}DC2,&nbsp; P{UAS-GFP. S65T}DC10,&nbsp; Sb1</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>51652</td><td>Balancer został przełączony na TM6B</td></tr><tr><td>PBac{WH}parkf01950</td><td>Exelixis at Harvard Medical School</td><td>f01950</td><td>Balancer został przełączony na TM6C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S640-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-990</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu, monohydrat monozasadowy (NaHCO3)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-198</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-265</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-500G</td><td>Zastępuje glukozę</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670-500G</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&nbsp; Filtry membranowe Durapore PVDF: Hydrofilowe: 0,22 i mikro; m Wielkość porów</td><td>Fisher Scientific</td><td>GVWP14250</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaliny, 10% (histologiczny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-20</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy, proszek, ultraczysty bioodczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-003-823</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td> Precyzyjna pęseta <td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Excelta z bardzo drobnymi końcówkami</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-055</td><td>Protokół nie wymaga bardzo drobnych punktów.&nbsp;</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozyny</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101</td><td></td></tr><tr><td>Rat-Elav-7E8A10 anty-elav</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>Clone 7E8A10</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Drugorzędowe, koniugat Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) wtórne, koniugat Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11037</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór DAPI (1 mg / ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Galusan propylu w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3130-100G</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik ACS do glicerolu, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axioimager Z1</td><td>Zeiss</td><td>Cytat</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome.2</td><td>Zeiss</td><td>Cytat</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td> Zen lite <td>Cytat</td><td></td></tr></tbody></table>

prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników drosophila

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Istnieje rosnące zainteresowanie wykorzystaniem Drosophila do modelowania chorób zwyrodnieniowych ludzkiego mózgu, mapowania obwodów neuronalnych w mózgach dorosłych oraz badania molekularnych i komórkowych podstaw wyższych funkcji mózgu. Kompleksowe przygotowanie dorosłych mózgów z dobrze zachowaną morfologią ma kluczowe znaczenie dla takich całościowych badań opartych na mózgu, ale może być technicznie trudne i czasochłonne. Protokół ten opisuje łatwe do nauczenia, jednoetapowe podejście do preparacji dorosłej głowy muchy w czasie krótszym niż 10 sekund, przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonego mózgu połączonego z resztą ciała, aby ułatwić kolejne etapy przetwarzania. Procedura pomaga usunąć większość tkanek oka i tchawicy normalnie związanych z mózgiem, które mogą zakłócać późniejszy etap obrazowania, a także stawia mniejsze wymagania co do jakości kleszczy preparacyjnych. Dodatkowo opisujemy prostą metodę, która umożliwia wygodne odwracanie zamontowanych próbek mózgu na szkiełku nakrywkowym, co jest ważne dla obrazowania obu stron mózgu o podobnej intensywności i jakości sygnału. Jako przykład protokołu przedstawiamy analizę neuronów dopaminergicznych (DA) w mózgach dorosłych much WT (w1118). Wysoka skuteczność metody preparacji sprawia, że jest ona szczególnie przydatna w badaniach na dużej skali mózgu dorosłych u Drosophila.

Rysunek 1 przedstawia główne etapy sekcji mózgu dorosłego osobnika, opisane powyżej. Rysunki 2 oraz 3 to reprezentatywne obrazy mózgów 3-dniowych dorosłych much typu WT (genotyp: w1118), które poddano podwójnemu barwieniu z użyciem przeciwciała przeciwko hydroksylazie tyrozynowej (TH, kolor czerwony na Rysunku 2 i biały na Rysunku 3), będącej markerem powszechnie stosowanym do znakowan...

Mózg dorosłego Drosophila jest cennym systemem do badania obwodów neuronalnych, wyższych funkcji mózgu i złożonych zaburzeń. Skuteczna metoda wycinania całej tkanki mózgowej z małej głowy muchy ułatwi badania oparte na mózgu. Tutaj opisujemy prosty, jednoetapowy protokół preparacji dorosłych mózgów o dobrze zachowanej morfologii.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis prostej, jednostopniowej procedury preparowania mózgów dorosłych much Drosophila, która pozwala na szybkie uzyskanie organów z dobrze zachowaną morfologią, odpowiednią do analizy całych preparatów (whole mount). Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu neuronauki i genetyki, w tym w precyzyjnym mapowaniu obwodów mózgowych, badaniu efektów manipulacji genetycznych w neuronach oraz funkcjonalnej charakterystyce genów.Główną zaletą tej techniki jest to, że opiera się ona na łatwej do opanowania procedurze. Pozwala ona na wypreparowanie mózgu dorosłej muchy z dobrze zachowaną morfologią w czasie krótszym niż 10 sekund. Demonstracja wideo tej metody jest kluczowa, ponieważ kontrolowanie pędu niezbędnego podczas puszczania pęsety w celu oderwania egzoszkieletu otaczającego głowę muchy wymaga umiejętności i wprawy.Te niewielkie, uciążliwe muszki owocówki dostarczyły nam wielu informacji na temat zasad biologicznych. Mogą one również pomóc w znalezieniu przyczyn i metod leczenia ludzkich schorzeń, takich jak choroba Alzheimera oraz choroba Parkinsona. Używając stereomikroskopu ustawionego na powiększeniu 1.2 X, unieruchom znieczuloną muszkę i zanurz ją w zimnym roztworze do sekcji, ustawiając odwłok stroną górną do góry.Trzymaj pęsetę pod kątem od 160 do 170 stopni względem płytki sekcyjnej, a następnie wywrzyj niewielką siłę na odwłok muchy. Powinno to unieruchomić muchę, odchylić głowę do tyłu o 15 do 25 stopni i wyprostować aparat gębowy ku górze. Po wykonaniu tego manewru widoczny powinien stać się miękki, półprzezroczysty obszar kutykuli pod aparatem gębowym.Zwiększ powiększenie i ustaw płaszczyznę ogniskowania na tym obszarze. Używając dominującej ręki, weź pęsetę anatomiczną i naciśnij ją, aby zamknąć końcówki. Ustaw pęsetę prostopadle do pęsety unieruchamiającej muchę.Przebij zamknięte końcówki pęsety przez miękki, półprzezroczysty obszar kutykuli, uważając, aby nie wprowadzić ich zbyt głęboko i nie uszkodzić mózgu. Następnie szybko, ale pewnie rozewrzyj pęsetę, rozrywając egzoszkielet głowy muchy. Wykorzystaj pęd powstający przy rozwieraniu końcówek pęsety, aby jednym ruchem delikatnie usunąć egzoszkielet oraz większość torebki głowy wraz z oczami i tchawiczkami z tkanki mózgowej.Nienaruszony mózg powinien być teraz widoczny. Używając pęsety, ostrożnie usuń pozostałe tkanki pomocnicze, takie jak biała włóknista tkanka tchawicy, dbając o to, aby nie pociągnąć ani nie uszkodzić samego mózgu. Umieść wypreparowane próbki mózgu wraz z powiązanymi tułowiami w około 1 ml 4% paraformaldehydu na lodzie na 40 do 60 minut.Usunąć paraformaldehyd, a następnie wypłukać próbki jedną mililitrem 1X PBS, pipetując roztwór w górę i w dół trzy razy, uważając, aby nie odessać mózgów. Następnie usunąć PBS i przemyć pięć razy jedną mililitrem 1X PBT przez pięć minut każde pranie, stosując nutację. Dodać odpowiednio rozcieńczony przeciwciało pierwszorzędowe.Następnie inkubować próbki przez noc w temperaturze 4 °C przy użyciu nutatora. Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć próbki pięciokrotnie 1 ml 1X PBT przez 5 do 10 minut podczas każdego mycia przy użyciu nutatora. Do przemytych próbek dodać przeciwciało drugorzędowe w odpowiednim rozcieńczeniu i na odpowiedni czas inkubacji.Następnie próbki należy przemyć sześciokrotnie w 1 ml 1X PBT przez 10 minut każde, stosując nutację. Krok ten jest kluczowy dla usunięcia wszystkich nieswoisto związanych przeciwciał wtórnych. Próbki inkubuje się w rozcieńczeniu 1:10 000 DAPI o stężeniu 1 mg/ml w 1 ml roztworu 1X PBT przez 30 do 60 minut z nutacją.Na koniec opłucz próbki, dodając 1 mL 1X PBS, a następnie trzykrotnie pobierając i wydalając roztwór za pomocą pipety. Umieść szkiełko nakrywką na szkiełku przedmiotowym. Używając pipety z odciętą końcówką, przenieś mózgi w roztworze 1X PBS na szkiełko nakrywkę.Następnie, używając pęsety, oddziel mózgi od ciał. Za pomocą cienkiej końcówki pipety usuń ciecz znajdującą się wokół tkanki mózgowej. Następnie dodaj od 20 do 40 µL medium montującego z antyfade.Delikatnie rozsuń mózgi, przesuwając lepkie medium na zewnątrz. Zaczynając od jednej strony, powoli opuść drugie szkiełko nakrywkowe na próbki, dbając o to, aby zminimalizować kontakt mózgów z pęcherzykami powietrza. Pozostaw szkiełka do osiadnięcia, a następnie usuń nadmiar cieczy z krawędzi szkiełek za pomocą chusteczki laboratoryjnej.Użyj małego kawałka taśmy, aby tymczasowo przymocować parę szkiełek nakrywek do szkiełka przedmiotowego. Do obrazowania próbek należy użyć złożonego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego. Przedstawione obrazy ukazują widoki przedni i tylny tej samej dorosłej muchy Drosophila.Jądra komórkowe zrównoleglono za pomocą barwienia DAPI, a neurony oznakowano przy użyciu pan-neuronalnego markera oraz przeciwciał anty-ELAV. Neurony dopaminergiczne (DA) wykazano za pomocą barwienia przeciwciałem anty-TH. W wszystkich kanałach obrazowania zaobserwowano podobny poziom intensywności po obu stronach mózgu.Powiększone widoki przedniej i tylnej części mózgu umożliwiają szczegółowe zbadanie skupisk neuronów dopaminergicznych (DA). Sparowany przedni skupisk medialny jest widoczny na obrazach przednich, natomiast sparowane tylne skupiska medialne i sparowane tylne skupiska boczne znajdują się w tylnej części mózgu. Ilościowe oznaczenie tych neuronów wykazało, że trzyodniowe samce much szczepu w1118 mają zazwyczaj 27 neuronów DA w skupisku PPM w całym mózgu, 16 w skupisku PPL na półkulę oraz pięć w skupisku PAL na półkulę.W każdym z klastrów PAM zaobserwowano średnio 97 neuronów DA. Rekonstrukcja 3D klastrów PAL i PAM wykazała również, że neurony DA w klastrze PAM mają względnie niewielkie rozmiary i słabsze barwienie TH niż neurony w innych klastrach, takich jak PAL. Coraz więcej badań koncentruje się na mózgach dorosłych much w celu analizy szlaków molekularnych i obwodów neuronalnych leżących u podstaw wyższych funkcji mózgu, a także w celu modelowania chorób ludzkiego mózgu.W tego typu badaniach opartych na analizie mózgu konieczne jest sprawne przygotowanie próbek tkanki mózgowej z dobrze zachowaną morfologią. Może to być szczególnie istotne w przypadku szeroko zakrojonych przesiewów w badaniach mózgu. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie w momencie, gdy miałem trudności z przytrzymaniem much pęsetą.Zamiast pęset z ostrymi końcówkami, których używa większość badaczy Drosophila, Shebna wypróbowała pęsety z tępymi końcówkami i stwierdziła, że dzięki nim preparowanie mózgów jest łatwiejsze. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, proces ten zajmuje mniej niż 10 s. Pewnego razu w ciągu jednego dnia preparowałam około 100 mózgów sześciu różnych genotypów na potrzeby jednego eksperymentu.Choć ta procedura sekcji może wydawać się prosta, ważne jest, aby najpierw przećwiczyć ją na muszkach przeznaczonych do utylizacji. Badacz może również mieć trudności z odpowiednim ustawieniem pęsety, aby nie uszkodzić mózgu muchy. Wypreparowane mózgi można wykorzystać w innych badaniach, takich jak analiza RNA, hybrydyzacja in situ oraz ekstrakcja białka i próbek RNA z tkanki mózgowej.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie przeprowadzić sekcję mózgów much z dobrze zachowaną morfologią. Przewidujemy, że możliwe będzie opracowanie ulepszeń, które uczynią tę procedurę prostszą i szybszą. W przyszłości może ona zostać zautomatyzowana na potrzeby badań na szeroką skalę.Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem oraz ostrymi pęsetami sekcyjnymi może być niebezpieczna. Podczas obchodzenia się z roztworami utrwalającymi należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, a po zakończeniu sekcji należy niezwłocznie zabezpieczyć końcówki pęset przed ich odłożeniem.

a-simple-one-step-dissection-protocol-for-whole-mount-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Opisujemy procedurę przygotowania zarodków Drosophila na różnych etapach rozwoju w celu wizualizacji embrionalnego układu nerwowego podczas embriogenezy.

Wizualizacja embrionalnego układu nerwowego w całych zarodkach Drosophila

Ten film opisuje metodę montażu nienaruszonych mózgów dorosłych much pod zjeżdżalnią mostkową i pokazuje protokół wykonywany na immunologicznie barwionych mózgach do mikroskopii fluorescencyjnej.

Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

Ten film opisuje, jak przeprowadzić sekcję i wyizolować mózg dorosłego Drosophila - procedura niezbędna do wizualizacji narządu, który w przeciwnym razie jest zasłonięty przez naskórek, oko i tkankę tchawicy. Przykładowy protokół przedstawia szczegółową demonstrację dającą wysokiej jakości preparaty, które można stosować do barwienia immunologicznego i metod obrazowania w neurobiologii Drosophila.

Drosophila Sekcja mózgu osoby dorosłej: metoda w neurobiologii much

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Komórki mają różne morfologie i nawiązują różnorodne interakcje ze swoimi sąsiadami. Protokół ten opisuje, w jaki sposób ujawnić morfologię pojedynczych komórek i zbadać interakcję komórka-komórka przy użyciu dobrze znanego systemu ekspresji Gal4 / UAS.

Zastosowanie techniki MultiColor FlpOut do badania wysokorozdzielczych morfologii pojedynczych komórek i interakcji komórkowych gleju u Drosophila

Ten artykuł przedstawia chirurgiczną metodę preparowania siatkówki poczwarki Drosophila wraz z protokołami przetwarzania tkanek do immunohistochemii, analizy zachodniej i ekstrakcji RNA.

Rozwarstwienie siatkówki poczwarki Drosophila w celu immunohistochemii, analizy zachodniej i izolacji RNA

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Poznaj prosty protokół preparacyjny mózgów dorosłych Drosophila w mniej niż 10 sekund. Ta metoda zachowuje morfologię tkanek i ułatwia badania neurobiologii oraz genetyki neuronów.

Prosty, jednoetapowy protokół preparacyjny do przygotowania mózgów dorosłych osobników Drosophila

Przeglądaj więcej filmów