Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Ogólnym celem tej metody jest montaż embrionów Danio pręgowanego do obrazowania na żywo w sposób, który umożliwia normalny wzrost tylnego regionu ciała. Metodę tę można dostosować do obrazowania innych obszarów rozwijającego się organizmu Danio pręgowanego. Technika ta pomaga w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak wpływ zachowań poszczególnych komórek na morfogenezę na poziomie całych tkanek.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona swobodny ruch tylnej części ciała przy jednoczesnym zachowaniu prawidłowej orientacji zarodka. Aby rozpocząć, należy dodać agarozę o niskiej temperaturze topnienia do medium E3 w probówce o pojemności 50 mililitrów do końcowego stężenia 1.5%, a następnie rozpuścić agarozę, podgrzewając ją w kuchence mikrofalowej. Pozostawić roztwór do wyrównania temperatury do 42-45 stopni Celsjusza w kąpieli wodnej lub inkubatorze laboratoryjnym.

Po wyciągnięciu szklanych igieł zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą pęsety odłam igłę tuż za punktem jej zgięcia, aby uzyskać czystą i ostrą igłę do orientowania embrionów oraz usuwania nadmiaru agarozy. Hoduj embriony w medium E3 do odpowiedniego stadium rozwoju.

Następnie pod binokularowym mikroskopem stereoskopowym, za pomocą ostrej pęsety, przeprowadź dechorionację embrionów. Inkubuj zdechorionowane embriony przez co najmniej pięć minut w roztworze roboczym trikainy. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś zdechorionowany embrion z minimalną ilością E3 bezpośrednio do probówki o pojemności 50 ml z agarozą o temperaturze 45 °C.

Wyjąć embrion wraz z około jednym mililitrem agarozy montażowej i przenieść około 100 µL medium z embrionem do centrum 10 mm mikrowypustki na dnie szalki Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem. Podczas tężenia medium montażowego przesunąć embrion do krawędzi kręgu agarozy, tak aby ogon był skierowany na zewnątrz. Użyć igły kapilarnej, aby ustawić embrion jak najbardziej bocznie w celu obrazowania rozwoju tylnej części ciała.

Następnie za pomocą kapilary utrzymuj embrion w pożądanej orientacji bocznej, aż żel całkowicie stężeje. Po stężeniu kropli agarozy zalej szalkę Petriego roztworem roboczym trikainy. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego z podstawą z oświetleniem przechodzącym, dostosuj położenie lustra oraz kąt padania światła tak, aby silny kontrast pozwolił na wyraźne dostrzeżenie nacięć w agarozie.

Aby wykonać pierwsze cięcie, należy użyć igły kapilarnej lub mikroskalpela i przeciąć agarosem ruchem piłującym (góra-dół), sąsiadującym z żółtkiem i w połowie jego długości, tuż za formującymi się polami serca, w dół do piątego somitu przedniego, całkowicie przez agarozę aż do szkła. W tym miejscu kluczowe jest upewnienie się, że embrion nie zostanie uszkodzony podczas przecinania agarozy nad workiem żółtkowym. Następnie należy wykonać drugie i trzecie cięcie, zaczynając od embrionu w dół do szkła, stycznie do pierwszych pięciu somitów, co umożliwi grzbietowe rozłożenie tylnej części ciała.

Następnie, zaczynając od punktu przecięcia nacięć pierwszego i trzeciego, wykonaj powolne cięcie ukośne w stronę końca nacięcia trzeciego, jednocześnie powoli unosząc narzędzie do góry, aby odseparować kwadrat agarozy otaczający tylną część ciała. Za pomocą ostrych pęset wyjmij odseparowane bloki agarozy z medium dla embrionów, opierając się o ściankę szalki Petriego podczas ich wyjmowania. Przed montażem próbki, użyj 1% agarozy w E3, aby pokryć 100 milimetrową plastikową szalkę warstwą o wysokości pięciu milimetrów i poczekaj, aż stężeje.

Następnie nanieś kroplę 1 ml agarozy o niskiej temperaturze topnienia na środek szalki i poczekaj, aż również stężeje. Osadź embriony w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, tak jak pokazano wcześniej w tym filmie. Jednak tym razem wyjmij embrion z probówki o pojemności 50 ml z agarozą za pomocą mniejszej kropli roztworu, a następnie nanieś tę małą kroplę na wierzch kropli 1 ml znajdującej się w centrum szalki.

Użyj igły kapilarnej, aby ustawić embrion w centrum małej kropli i utrzymać jego prawidłową orientację aż do stężenia żelu. Na koniec wypełnij szalkę roboczym roztworem trikainy i usuń nadmiar agarozy. Przykład embrionu zebrafish wstrzykniętego mRNA kodującym fotokonwertowalne białko fluorescencyjne kikumeGR, a następnie zamontowanego w stadium 15 somytów i poddanego obrazowaniu time-lapse przez 12 godzin, przedstawiono w tym animowanym filmie.

Tylna część ciała może poruszać się swobodnie i wykazuje zmiany morfologiczne podobne do tych obserwowanych u embrionów rozwijających się poza chorionem w normalnych warunkach hodowli. W tym filmie embriony w stadium 16 komórek zostały wstrzyknięte mRNA kodującym histone 2BRFP, które znakuje jądra komórkowe, oraz CAAXGFP, które znakuje błony komórkowe. Obrazy wykonano za pomocą pionowego mikroskopu wielofotonowego z obiektywem imersyjnym w wodzie 25X, od stadium 10 somytów przez trzy godziny, aby zwizualizować zachowania komórek podczas formowania się pączka ogonowego.

Można zaobserwować, że komórki tworzą aktywne wypustki i poruszają się kierunkowo podczas prawidłowego formowania się pączka ogonowego. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w 20 minut, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zarodek znajduje się w pozycji bocznej podczas zestalania żelu agarozowego.

W przeciwnym razie obszar zainteresowania szybko przesunie się poza pole widzenia podczas obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak montować embriony Zebrafish do obrazowania na żywo elongacji tylnej części ciała.