Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego
January 26th, 2017
Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.
Ogólnym celem tej metody jest zamontowanie zarodków danio pręgowanego w celu obrazowania na żywo, które umożliwia normalny wzrost tylnej części ciała. Metodę tę można dostosować do obrazowania innych regionów rozwijającego się danio pręgowanego. Technika ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak to, w jaki sposób zachowania poszczególnych komórek prowadzą do morfogenezy na poziomie całych tkanek.
Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona swobodny moment tylnego ciała przy jednoczesnym utrzymaniu zarodka we właściwej orientacji. Na początek dodaj agarozę o niskiej temperaturze topnienia o końcowym stężeniu 1,5% do pożywki E3 w 50-mililitrowej probówce i rozpuść agarozę przez podgrzanie w kuchence mikrofalowej. Pozwól, aby roztwór zrównoważył się do 42 do 45 stopni Celsjusza w łaźni wodnej lub inkubatorze stołowym.
Po wyciągnięciu szklanych igieł zgodnie z protokołem tekstowym. Za pomocą kleszczy przełam igłę tuż za punktem, w którym się zgina, tworząc czystą i ostrą igłę do orientacji zarodków i usuwania nadmiaru agarozy. Wyhodować zarodki do odpowiedniego stadium na podłożu E3.
Następnie pod lornetkowym mikroskopem preparacyjnym użyj pary ostrych kleszczy, aby usunąć zarodki. Inkubować zdekorionowane zarodki przez co najmniej pięć minut w roztworze roboczym trikainy. Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś zdekorionowany zarodek z minimalną ilością E3 bezpośrednio do 50-mililitrowej probówki z agarozą o temperaturze 45 stopni Celsjusza.
Usuń zarodek razem z około jednym mililitrem agarozy montażowej i przenieś około 100 mikrolitrów pożywki z zarodkiem do środka 10-milimetrowej mikrostudzienki na dnie 35-milimetrowej płytki Petriego ze szklanym dnem. W miarę ustawiania się podłoża mocującego przesuń zarodek na krawędź koła agarozy, z ogonem skierowanym na zewnątrz. Użyj igły kapilarnej, aby ustawić zarodek tak bocznie, jak to możliwe, aby zobrazować rozwój tylnej części ciała.
Następnie za pomocą naczynia włosowatego utrzymuj zarodek w pożądanej orientacji bocznej, aż żel całkowicie się zetnie. Gdy kropla agarozy stężeje, użyj roztworu roboczego trikainy, aby zalać szalkę Petriego. Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym z podstawą światła przechodzącego, wyreguluj położenie lustra i kąt padającego światła, tak aby silny kontrast pozwalał na wyraźne widoczne nacięcia w agarozie.
Aby wykonać cięcie pierwsze, użyj igły kapilarnej lub mikroskalpela, aby przeciąć agarozę ruchem piłowania w górę iw dół, w pobliżu i w połowie wzdłuż żółtka, tuż za tworzącymi się polami serca w dół piątego przedniego somitu i całkowicie przez agarozę do szkła. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że zarodek nie zostanie uszkodzony podczas krojenia agarozy na woreczku z żółtkiem. Następnie wykonaj drugie i trzecie nacięcie, zaczynając od zarodka w dół do szkła, stycznie do pierwszych pięciu somitów, umożliwiając grzbietowe rozwinięcie tylnego ciała.
Następnie, zaczynając od przecięcia pierwszego i trzeciego cięcia, wykonaj powolne cięcie ukośne w kierunku końca cięcia trzeciego, powoli podnosząc się w górę, aby usunąć kwadrat agarozy otaczający tylne ciało. Za pomocą pary ostrych kleszczy usuń usunięte bloki agarozy z pożywki zarodkowej, używając ścianki szalki Petriego jako podparcia podczas wyjmowania kawałków agarozy. Przed zamontowaniem próbki użyj 1% agarozy w E3, aby pokryć 100-milimetrowe plastikowe naczynie na wysokość pięciu milimetrów i pozwól mu stężeć.
Następnie umieść kroplę jednego mililitra agarozy o niskiej temperaturze topnienia na środku naczynia i pozwól jej również stężeć. Osadź zarodki w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Jednak tym razem usuń zarodek z 50-mililitrowej probówki agarozy z mniejszą kroplą roztworu i umieść tę małą kroplę na jednej mililitrowej kropli na środku naczynia.
Użyj igły kapilarnej, aby umieścić zarodek w środku małej kropli i utrzymuj jego prawidłową orientację, aż żel stwardnieje. Na koniec użyj roztworu roboczego tricainy, aby zalać naczynie i usunąć nadmiar agarozy. Przykład zarodka danio pręgowanego, któremu wstrzyknięto mRNA kodujące fotokonwertowalne białko fluorescencyjne kikumeGR, a następnie zamontowano go w stadium 15 somitów i poddano poklatkowemu wyobrażeniu przez 12 godzin, pokazano w tym animowanym filmie.
Tylne ciało może się swobodnie poruszać i wykazuje podobne zmiany w morfologii, jak u zarodków, które mogą rozwijać się bez kosmówki w normalnych warunkach hodowli. W tym filmie zarodki zostały wstrzyknięte w stadium 16 komórek za pomocą mRNA kodującego histon 2BRFP, który znakuje jądra, i CAAXGFP, który znakuje błony komórkowe. Obrazy wykonano na pionowym, wielofotonowym mikroskopie z 25-krotnym obiektywem zanurzonym w wodzie z 10-stopniowego stopnia somitowego przez trzy godziny, aby uwidocznić zachowanie komórek podczas tworzenia pąków ogonowych.
Można zobaczyć, jak komórki generują aktywne wypukłości i ruch kierunkowy, gdy pączek ogonowy tworzy się normalnie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 20 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że zarodek znajduje się w pozycji bocznej podczas wiązania żelu agarozowego.
W przeciwnym razie obszar zainteresowania szybko usunie się z pola widzenia podczas obrazowania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć jasne zrozumienie, jak montować zarodki danio pręgowanego w celu obrazowania na żywo tylnego wydłużenia ciała.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia uniwersalną metodę montażu do długotrwałego przetwarzania obrazów time-lapse żywych zarodków danio rzecznego, koncentrując się szczególnie na rozwoju tylnej części ciała. Technika ta pozwala na normalny rozwój, umożliwiając jednocześnie szczegółowe obserwacje zachowań komórkowych podczas morfogenezy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Techniki obrazowania żywych organizmów
- Embriologia danio rzecznego
Tło
- Rozumienie morfogenezy jest kluczowe w biologii rozwojowej.
- Danio rzeczne są organizmami modelowymi do badania rozwoju kręgowców.
- Techniki obrazowania żywych organizmów mogą zapewnić wgląd w dynamikę komórkową.
- Utrzymanie normalnego rozwoju podczas obrazowania jest znaczącym wyzwaniem.
Cel badania
- Opracowanie metody montażu zarodków danio rzecznego do obrazowania na żywo.
- Obserwacja wzrostu tylnej części ciała bez zakłócania normalnego rozwoju.
- Ułatwienie badania zachowań poszczególnych komórek w morfogenezie tkankowej.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworu agarozy o niskim punktem topnienia.
- Montaż zarodków danio rzecznego w agarozie do obrazowania.
- Utrzymanie zarodków we właściwej orientacji podczas obserwacji.
- Dostosowanie metody do obrazowania innych regionów rozwijającego się danio rzecznego.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na swobodny ruch tylnej części ciała.
- Normalny rozwój zarodków jest zachowany podczas obrazowania.
- Kluczowe zachowania komórkowe można obserwować w czasie rzeczywistym.
- Technika ta może być dostosowana do różnych badań rozwojowych.
Wnioski
- Ta metoda montażu jest skuteczna w długotrwałym obrazowaniu zarodków danio rzecznego.
- Daje cenny wgląd w procesy rozwojowe.
- Technika ta może ulepszać badania w biologii rozwojowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In biopharma R&D, reliable live imaging of vertebrate developmental processes supports target validation and phenotypic screening by enabling observation of morphogenetic mechanisms in a physiologically relevant system. This zebrafish mounting method provides a reproducible platform for assessing compound effects on tissue elongation and cellular dynamics, contributing to mechanistic de-risking in early discovery. Its adaptability across microscopy setups enhances workflow flexibility and cross-functional collaboration in preclinical model evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing posterior body elongation as a disease-relevant system for morphogenetic pathway analysis.
- Operational Value: Supports functional target validation through longitudinal observation of tissue outgrowth without developmental disruption.
- Predictive Value: Facilitates lead identification by linking cellular protrusions and directional movement to phenotypic outcomes in vertebrate development.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized zebrafish embryos for quantitative live imaging, ensuring consistent orientation and minimal perturbation during compound exposure.
- Reproducibility: The agarose embedding protocol allows for reliable sample preparation across upright, inverted, and light-sheet microscopy platforms.
- Scalability: Enables preparation of multiple embryos for parallel time-lapse imaging, supporting medium-throughput screening of developmental phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Provides a vertebrate model system to study conserved morphogenetic processes applicable to human developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations of cell behaviors with preclinical validation by preserving normal development during imaging.
- Risk-Adjusted Decisions: Generates predictive confidence in target modulation by linking phenotypic changes to mechanism of action in a intact organism.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing imaging-ready models for mechanistic studies of vertebrate development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling visualization of how cellular behaviors drive tissue-level morphogenesis in posterior body elongation.
- Screening: Delivers assay-ready samples with quantitative readouts on tissue outgrowth and cell movement, facilitating compound effect comparison.
- Analytics: Generates time-lapse datasets suitable for tracking cellular protrusions, directional migration, and morphological changes over developmental time.
- Translational Research: Connects early discovery imaging to preclinical continuity by maintaining normal embryogenesis during observation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable mounting capability applicable to multiple developmental stages and regions, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in vertebrate morphogenesis.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility across microscopy platforms through defined agarose embedding and orientation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of developmental toxicity or pathway modulation in a whole-organism context.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative phenotypic data for triage of leads affecting tissue elongation processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microsurgical techniques for embryo handling and agarose manipulation.
- Dependent on access to temperature-controlled water baths, microwells, and microscopy systems compatible with glass-bottomed dishes.
- Necessitates standardization of agarose concentration (1.5%) and equilibration temperature (42–45°C) across teams for consistent gel properties.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of embedding density and orientation constraints to preserve developmental freedom.
- Practical limitations include the 20-minute setup time per embryo and the need for careful orientation during gel setting to prevent drift of the region of interest.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Embedding Embryos for Inverted or Upright Microscopy
2:36
Removal of Excess Agarose Around the Posterior Body
4:03
Mounting of Embryos for Vertical Light-sheet Microscope
5:05
Results: Long-term Time Lapse Imaging of Mounted Zebrafish Embryos
6:15
Conclusion
