Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ogólnym celem tego protokołu jest oznakowanie i wizualizacja wielorzęskowych komórek danio pręgowanego in situ. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, takie jak czynniki regulujące wielorzęskowe siarczany w embrionalnej nerce danio pręgowanego? Główną zaletą tej techniki jest to, że zarówno transkrypty białkowe, jak i RNA mogą być znakowane jednocześnie, co jest przydatne w przypadku braku przeciwciał specyficznych dla danio pręgowanego.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy poszliśmy znakować komórki wielorzęskowe w przednerczuch, analizując obecność rzęsek po dokonaniu zmian w zarodku. Zacznij od utrwalenia zarodków danio pręgowanego po 24 godzinach od zapłodnienia w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie umyj zarodki dwa razy w PBS z 0,1% Tween 20 lub PBST, a następnie jedno przemycie pięcioma mililitrami 100% metanolu.

Następnie inkubuj zarodki w pięciu mililitrach świeżego 100% etanolu przez co najmniej 20 minut w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby przygotować zarodki do hybrydyzacji, należy nawodnić noworodki w pięciu mililitrach 50% metanolu i PBST przez pięć minut, a następnie przez pięć minut w pięciu mililitrach 30% metanolu i PBST. Umyj zarodki dwa razy przez pięć minut każdy w pięciu mililitrach PBST i inkubuj zarodki w pięciu mililitrach roztworu proteinazy K i PBST w proporcji jeden do 1 000 przez dwie minuty, a następnie wykonaj dwa kolejne płukania w pięciu mililitrach PBST.

Utrwal zarodki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przepłucz je dwoma mililitrami w pięciu mililitrach PBST 20. Aby ułatwić interakcje między zarodkami a roztworem hybrydyzacyjnym, przenieś zarodki do pięciu mililitrów PBST w pionowych probówkach wirówek z płaskim dnem w stojaku do mikrowirówek i umyj zarodki dwa razy po pięć minut w 1,5 mililitra roztworu hybrydyzacyjnego. Po drugim myciu inkubować zarodki w 1,5 mililitra świeżego roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 70 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji przez cztery do sześciu godzin.

Następnie zastąp roztwór hybrydyzacyjny 10 mikrolitrami interesującej nas sondy RNA i 500 mikrolitrami roztworu hybrydyzacyjnego do nocnej hybrydyzacji sondy w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj zarodki dwa razy w 1,5 mililitra 50% formamidu i 2X buforze soli fizjologiczno-cytrynianowej lub SSC przez 20 do 30 minut na płukanie w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Następnie umyj zarodki jeden raz w 1,5 mililitra samego 2X SSC w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 15 minut, a następnie dwa razy przepłucz w 1,5 mililitra 0,2X SSC w 70 stopniach Celsjusza przez 20 do 30 minut na pranie.

Po drugim praniu zastąp 0,2X SSC 1,5 mililitra odczynnika blokującego do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka zastąp odczynnik blokujący 0,2 mililitra anty-digoksyny w peroksydazie chrzanowej i odczynniku blokującym w stosunku jeden do 1 000 na trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem. Następnie umyj zarodki dwa do czterech razy w 1,5 mililitra buforu kwasu jabłkowego przez 10 do 15 minut na mycie, a następnie przez noc inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 1,5 mililitra świeżego buforu kwasu jabłkowego.

Następnego ranka zastąp bufor kwasu jabłkowego 1,5 mililitra PBS i umyj zarodki dwa razy w 1,5 mililitra PBS przez pięć minut na pranie. Inkubować zarodki w 0,2 mililitra stojącego roztworu fluorescencyjnego Si3 przez 60 minut, a następnie cztery kolejne 10-minutowe płukanie w 1,5 mililitra rosnących stężeń metanolu. Po ostatniej inkubacji inkubować zarodki w temperaturze pokojowej w 1,5 mililitra 1% nadtlenku wodoru i metanolu przez 30 minut.

Następnie myj zarodki przez 10 minut na pranie w 1,5 mililitra opadającego roztworu metanolu, a następnie dwa pięciominutowe płukania w 1,5 mililitra PBS. Następnie umyj zarodki w 1,5 mililitra podwójnie destylowanej wody przez pięć minut, a następnie siedmiominutowe mycie w 1,5 mililitra acetonu o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Umyj zarodki w kolejnych 1,5 mililitra podwójnie destylowanej wody przez pięć minut, a następnie przemyj pięciominutowe w 1,5 mililitra PBST z 1% DMSO lub PBDT.

Inkubuj zarodki w temperaturze pokojowej w 1,5 mililitra PBDT z 10% FBS na kołysce przez dwie godziny. Następnie zastąp PBDT i FBS 1,5 mililitra przeciwciał pierwszorzędowych do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka umyj zarodki w 1,5 mililitra PBDT, FBS i 0,1 molowym chlorku sodu przez jedną minutę z kołysaniem, a następnie pięć 30-minutowych płukań w 1,5 mililitra PBDT, FBS i chlorku sodu.

Po ostatnim płukaniu umyj zarodki jeden raz w 1,5 mililitra PBDT i FBS tylko przez 30 minut z kołysaniem, a następnie przez noc inkubuj w 200 mikrolitrach odpowiednich przeciwciał drugorzędowych w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem. Następnego ranka szybko umyj zarodki dwa razy w 1,5 mililitra PBDT, a następnie 15-minutową inkubację w 1,5 mililitra DAPI na bujaku. Następnie umyj zarodki trzy razy w 1,5 mililitra PBDT z FBS i chlorkiem sodu przez 15 do 20 minut na mycie i przechowuj zarodki w 1,5 mililitra PBDT w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc przed światłem otoczenia.

Aby zobrazować nerki danio pręgowanego, ułóż zarodki bocznie na szkiełkach w około 10 mikrolitrach PBDT. Używając cienkich kleszczyków i mikroskopu preparacyjnego, ściśnij pierwszy zarodek za oczami, aby usunąć głowę i część kulki żółtkowej. Następnie delikatnie zeskrob pozostałą kulkę żółtka z ciała zarodka.

Podczas wyjmowania kulki żółtkowej należy uważać, aby nie dotknąć przedłużenia woreczka żółtkowego, ponieważ tkanka będąca przedmiotem zainteresowania łatwo się rozrywa i znajduje się bezpośrednio nad przedłużeniem. Użyj cienkiej chusteczki, aby usunąć zdysocjowane żółtko i dodatkowy płyn ze szkiełka. Następnie dodaj kroplę podłoża montażowego do pozostałego ogona i ustaw ogon na boki.

Spłaszcz ogon za pomocą szkiełka nakrywkowego i umieść suwak w zakrytym pudełku na szkiełka. Następnie użyj obiektywu 60X w mikroskopie konfokalnym, aby zobrazować rzęski nerki na odpowiednich kanałach fluorescencyjnych. Na poniższych reprezentatywnych obrazach zarodka danio pręgowanego wybarwionego tak, jak właśnie pokazano, komórki wielorzęskowe można zidentyfikować na podstawie wizualizacji antysensownej rybosondy używanej do rozpoznawania ekspresji transkryptu ODF3B, ciał podstawnych znakowanych gametą tubuliną i acetylowanych rzęsek znakowanych alfa tubuliną.

Rzeczywiście, przy tym powiększeniu zarodkowych przednerczy można zaobserwować wielorzęskową komórkę z transkryptami ODF3B, wieloma ciałami podstawnymi i rzęskami. Sąsiednią komórkę jednorzęskową można odróżnić po pojedynczym ciele podstawnym i fenotypie pojedynczej rzęski. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o użyciu świeżo utrwalonych zarodków i zabezpieczeniu próbek przed światłem otoczenia po dodaniu pierwszego przeciwciała.