Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest znakowanie i wizualizacja komórek wielorzęsistych u danio pręgowanego in situ. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak: jakie czynniki regulują siarczany wielorzęsiste w embrionalnej nerce danio pręgowanego? Główną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnego znakowania zarówno białek, jak i transkryptów RNA, co jest przydatne w przypadku braku przeciwciał specyficznych dla danio pręgowanego.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy znakować komórki wielorzęsiste w pronefrosie podczas analizy obecności rzęsek po wprowadzeniu zmian w embrionie. Należy rozpocząć od utrwalenia embrionów zebrafish 24 godziny po zapłodnieniu w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu przez dwie do czterech godzin w temperaturze pokojowej, bez mieszania. Następnie embriony należy przemyć dwukrotnie w PBS z 0,1% Tween 20 lub PBST, a następnie przemyć raz w pięciu mililitrach 100% methanolu.

Następnie inkubować zarodki w pięciu mililitrach świeżego 100% etanolu przez co najmniej 20 minut w temperaturze -20 °C. Aby przygotować zarodki do hybrydyzacji, rehydratować noworodki w pięciu mililitrach 50% metanolu i PBST przez pięć minut, a następnie przez pięć minut w pięciu mililitrach 30% metanolu i PBST. Przemyć zarodki dwukrotnie przez pięć minut w pięciu mililitrach PBST i inkubować zarodki w pięciu mililitrach roztworu proteinazy K i PBST w stosunku 1:1000 przez dwie minuty, a następnie niezwłocznie przeprowadzić kolejne dwa płukania w pięciu mililitrach PBST.

Utrwal zarodki w pięciu mililitrach 4% paraformaldehydu przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj dwukrotnie w pięciu mililitrach PBST 20. Aby ułatwić interakcje między zarodkami a roztworem hybrydyzacyjnym, przenieś zarodki do pięciu mililitrów PBST w pionowych probówkach do mikrowirówki z płaskim dnem umieszczonych w statywie i przemyj zarodki dwukrotnie przez pięć minut każdy raz w 1,5 mililitrach roztworu hybrydyzacyjnego. Po drugim płukaniu inkubuj zarodki w 1,5 mililitrach świeżego roztworu hybrydyzacyjnego w temperaturze 70 °C w piecu do hybrydyzacji przez cztery do sześciu godzin.

Następnie zastąp roztwór hybrydyzacyjny 10 µL odpowiedniej sondy RNA i 500 µL roztworu hybrydyzacyjnego, aby przeprowadzić hybrydyzację sondy przez noc w temperaturze 70 °C. Następnego dnia rano przemyj embriony dwukrotnie w 1,5 mL 50% formamidu i 2X buforu SSC przez 20 do 30 minut na każde płukanie w temperaturze 70 °C. Następnie przemyj embriony raz w 1,5 mL samego 2X SSC w temperaturze 70 °C przez 15 minut, a następnie dwukrotnie w 1,5 mL 0,2X SSC w temperaturze 70 °C przez 20 do 30 minut na każde płukanie.

Po drugim płukaniu zastąp 0,2X SSC 1,5 mililitrami odczynnika blokującego i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia rano zastąp odczynnik blokujący 0,2 mililitrami przeciwciał anty-digoksyna sprzężonych z peroksydazą chrzanową w odczynniku blokującym w stosunku 1:1 000 i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie przemyj zarodki od dwóch do czterech razy w 1,5 mililitrach buforu z kwasem jabłkowym przez 10 do 15 minut podczas każdego płukania, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w 1,5 mililitrach świeżego buforu z kwasem jabłkowym.

Następnego dnia rano należy zastąpić bufor z kwasem jabłkowym 1,5 mililitrami PBS i przemyć zarodki dwukrotnie w 1,5 mililitrach PBS przez pięć minut każdego płukania. Zarodki należy inkubować w 0,2 mililitrach fluorescencyjnego roztworu Si3 przez 60 minut, a następnie przeprowadzić cztery kolejne 10-minutowe płukania w 1,5 mililitrach roztworów metanolu o rosnącym stężeniu. Po ostatniej inkubacji należy inkubować zarodki w temperaturze pokojowej w 1,5 mililitrach 1% nadtlenku wodoru i metanolu przez 30 minut.

Następnie płukać zarodki przez 10 minut podczas każdego płukania w 1,5 ml roztworów metanolu o malejącym stężeniu, a następnie dwukrotnie przez pięć minut w 1,5 ml PBS. Dalej płukać zarodki w 1,5 ml wody dwukrotnie destylowanej przez pięć minut, a następnie przez siedem minut w 1,5 ml acetonu o temperaturze -20 °C. Płukać zarodki w kolejnych 1,5 ml wody dwukrotnie destylowanej przez pięć minut, a następnie przez pięć minut w 1,5 ml PBST z 1% DMSO lub PBDT.

Inkubować zarodki w temperaturze pokojowej w 1,5 mililitrów PBDT z 10% FBS na kołysarce przez dwie godziny. Następnie zastąpić PBDT i FBS 1,5 mililitrów przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka przemyć zarodki w 1,5 mililitrów PBDT, FBS i 0,1 molarnego chlorku sodu przez jedną minutę z kołysaniem, a następnie przeprowadzić pięć 30-minutowych płukań z kołysaniem w 1,5 mililitrów PBDT, FBS i chlorku sodu.

Po ostatnim płukaniu przemyj zarodki jednokrotnie w 1,5 ml PBDT i FBS przez 30 minut przy użyciu kołysarki, a następnie inkubuj przez noc w 200 µl odpowiednich przeciwciał wtórnych w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem. Następnego dnia rano szybko przemyj zarodki dwukrotnie w 1,5 ml PBDT, a następnie inkubuj przez 15 minut w 1,5 ml DAPI na kołysarce. Następnie przemyj zarodki trzykrotnie w 1,5 ml PBDT z FBS i chlorkiem sodu, przez 15 do 20 minut na każde płukanie, i przechowuj zarodki w 1,5 ml PBDT w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem otoczenia.

Aby obrazować nerki danio przebrózistego, ułóż embriony bokiem na szkiełkach przedmiotowych w około 10 µL PBDT. Używając precyzyjnej pęsety i mikroskopu sekcyjnego, ściśnij pierwszy embrion za oczami, aby usunąć głowę oraz część pęcherzyka żółtkowego. Następnie delikatnie zeskrob pozostałą część pęcherzyka żółtkowego z ciała embrionu.

Podczas usuwania kuli żółtkowej należy uważać, aby nie dotknąć wyrostka pęcherzyka żółtkowego, ponieważ interesująca nas tkanka łatwo ulega rozerwaniu i znajduje się bezpośrednio nad wyrostkiem. Do usunięcia rozdzielonego żółtka oraz nadmiaru cieczy z szkiełka należy użyć cienkiej chusteczki. Następnie należy dodać kroplę medium montażowego do pozostałego ogona i ustawić ogon bocznie.

Spłaszcz ogon za pomocą szkiełka nakrywki i umieść preparat w zamkniętym pudełku na preparaty. Następnie, używając obiektywu 60X w mikroskopie konfokalnym, wykonaj obrazowanie rzęsek nerek na odpowiednich kanałach fluorescencyjnych. Na poniższych reprezentatywnych obrazach zarodka zebrafish barwionego w opisany sposób, komórki wielorzęsiste można zidentyfikować na podstawie wizualizacji antysensownej sondy rybo-użytej do rozpoznania ekspresji transkryptu ODF3B, ciał podstawnych znakowanych tubuliną gamet oraz rzęsek znakowanych acetylowaną alfa-tubuliną.

Rzeczywiście, przy takim powiększeniu embrionalnegopronefryka można zaobserwować komórkę wielorzęsową z transkryptami ODF3B, wieloma ciałkami podstawnymi i rzęskami. Sąsiadującą komórkę jednorzęsową można odróżnić po fenotypie z pojedynczym ciałkiem podstawnym i pojedynczą rzęską. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu świeżo utrwalonych embrionów oraz o ochronie preparatów przed światłem otoczenia po dodaniu pierwszego przeciwciała.