Montaż agarowy: podstawowa metoda montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długotrwałego obrazowania

- Zacznij od dodania agarozy E3 o średniej lub niskiej temperaturze topnienia i podgrzewania, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Ostudzić agarozę do 37 stopni Celsjusza i dodać roztwór tricainy. Następnie znieczulij zarodki, dodając trikainę do szalki Petriego zawierającej zarodki w pożywce E3. Zakręć szalką Petriego, aby zebrać zarodki w środku.

Za pomocą pipety transferowej pobrać jeden zarodek z minimalną ilością pożywki. Trzymaj pipetę w pozycji pionowej i odbij zarodek, aby umieścić go na końcówce pipety. Teraz umieść zarodek w roztworze agarozy bez dodawania nadmiaru pożywki, co rozcieńczyłoby agarozę i zapobiegłoby żelowaniu. Delikatnie wymieszaj zarodek z agarozą i przenieś roztwór do dołka płytki obrazowej za pomocą pipety.

Umieść płytkę pod mikroskopem i za pomocą końcówki pipety ustaw zarodek w pożądanej orientacji. Gdy agaroza zastygnie, wlej na nią podłoże E3 zawierające trikainę, aby utrzymać nawodnienie agaru i zobrazować zarodek. W przykładowym protokole zamontujemy parabiotyczne zarodki danio pręgowanego do obrazowania i analizy.

Aby uzyskać obrazy zrośniętych zarodków, przygotuj 0,8% agarozę o niskiej temperaturze topnienia. Będąc jeszcze gorącym, podnieś jeden mililitr agarozy do 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuzy ustawionych w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Znieczulić zarodki parabiotyczne, dodając 1 mililitr z 4 miligramów na mililitr pH 7,0 tricainy do 25 mililitrów pożywki E3 zawierającej zarodki. Delikatnie zakręć naczyniem, aby zarodki zebrały się w środku.

Następnie za pomocą plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką narysuj zarodki w jak najmniejszej ilości płynu. Następnie obróć pipetę do góry pionowej i delikatnie odbij zarodki, aby osiadły na samym dnie pipety. Następnie przenieś zarodki do 1 mililitrowej podwielokrotności agarozy o niskiej temperaturze topnienia, lekko dotykając końcówki pipety o powierzchnię agarozy. Usunąć nadmiar płynu z pipety i za pomocą pipety delikatnie wymieszać zarodki w agarozie.

Następnie za pomocą pipety przenieś agarozę i zarodki do dołka na sześciodołkowej płytce ze szklanym dnem. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj końcówki ładującej żel przymocowanej do końca igły do drażnienia, aby umieścić zarodki blisko szkła nakrywkowego i w pożądanej orientacji do obrazowania. Po związaniu agarozy i dodaniu pożywki z tricainą do studzienek, należy użyć odwróconego mikroskopu konfokalnego z filtrem laserowym z odwróconym polem epifluorescencji lub mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem, aby uzyskać obrazy.

Aby uzyskać całe pole widzenia zarodka, użyj 4x subiektywnego. Użyj obiektywu 20x, aby zobrazować określoną tkankę. Przetwarzaj obrazy zgodnie z protokołem tekstowym.