Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Opracowaliśmy metodę montażu do obrazowania poklatkowego, która pozwala na nieograniczony wzrost delikatnych zarodków danio pręgowanego i jednocześnie utrzymuje je w całkowicie ustalonej pozycji. Ta metoda montażu jest szybka, łatwa i tania i działa w przypadku obrazowania laboratoryjnego na dowolnym mikroskopie odwróconym. Opracowaliśmy tę metodę do obrazowania żywych zarodków danio pręgowanego, ale można ją zmodyfikować do obrazowania innych małych modeli zwierząt wodnych.

Zacznij od hodowli dorosłego danio pręgowanego. Po południu umieść ryby w zbiornikach hodowlanych w stosunku samców do samic jeden do dwóch. Następnie przygotuj roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy w pożywce dla zarodków i rozpuść go, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.

Podaniec roztwór agarozy do 1,5 mililitrowej probówki. Przygotować roztwór podstawowy 4% trikainy w wodzie destylowanej i przechowywać agarozę i trikainę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Trikaina jest toksyczna i musi być zważona i przygotowana w dygestorium.

Po kryciu zbierz zarodki danio pręgowanego w E3 na szalce Petriego i wysiaduj je w temperaturze 26,5 stopnia Celsjusza przez około 28 godzin przed zamontowaniem. Znieczulij zarodki 0,02% trikainą i zdechorionuj je pod mikroskopem, delikatnie chwytając i rozsuwając kosmówkę, aby uwolnić zarodek. Tuż przed montażem podgrzej roztwór agarozy do 65 stopni Celsjusza, a następnie pozwól mu ostygnąć do około 30 stopni Celsjusza, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło i dodaj trikainę do roztworu agarozy.

Używaj naczyń ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów z dnem ze szkła nakrywkowego o numerze zero. Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z jego bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety, a następnie ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety. Dodaj pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szklankę nakrywkową przymocowaną do dna naczynia, aby przykryć zarodek, upewniając się, że agaroza przykrywa małą studzienkę, ale nie przelewa się przez nią.

Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym, aby stworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi. Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia, co utrzyma szkło nakrywkowe na miejscu podczas krzepnięcia. Następnie napełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu.

Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy pierwszej, umieść zarodki w rosnących stężeniach agarozy i wykonaj obrazowanie poklatkowe w celu określenia stężenia, które minimalizuje zniekształcenia i ruchliwość zarodka, a następnie przetestuj dokładniejszy zakres stężeń na podstawie wyników. Najważniejszym krokiem tego protokołu jest określenie optymalnego stężenia agarozy dla warstwy pierwszej. Przetestuj różne nanostężenia agarozy, takie jak 0,030%0,032%itp.

aby znaleźć optymalne stężenie. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe zarodków, użyj stolika mikroskopowego z inkubatorem ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza i obrazuj przez okres do 55 godzin. Aby jednocześnie zobrazować kilka zarodków, użyj adaptera stolika, który trzyma kilka szalek i obracaj szalki jedna po drugiej, tak aby zarodki były ustawione poziomo.

Wybierz obiektyw o małym powiększeniu, następnie zlokalizuj zarodki za pomocą okularu, a na koniec wyrównaj je w poziomie, obracając szalki. Zapisz lokalizację zarodków w oprogramowaniu i utwórz nazwę pliku do automatycznego zapisywania danych. Ustaw rozmiar otworka, szybkość skanowania, rozmiar obrazu i powiększenie.

Następnie wybierz większe powiększenie do przechwytywania obrazów i kanałów fluorescencji, które mają być obrazowane. Dla każdego kanału dostosuj moc lasera i wysokie napięcie detektora, upewniając się, że uzyskasz najlepszy możliwy zakres dynamiki, unikając nasycenia i ograniczając wybielanie zdjęć. Następnie, aby zobrazować cały zarodek za pomocą obiektywu 10X, ustaw ustawienia przechwytywania dużego obrazu w oprogramowaniu, aby zobrazować kilka pól widzenia i zszyć je razem, dostosowując pozycję zarodka, aby upewnić się, że mieści się w tym dużym obszarze obrazu.

Skonfiguruj ustawienia przechwytywania stosów Z zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Aby utrzymać ostrość wielu zarodków podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego, należy użyć automatycznego ustawiania ostrości i dostosować indywidualne poziomy przesunięcia dla każdego zarodka, aby ustawić ostrość na płaszczyźnie odniesienia. Następnie ustaw parametry poklatkowe w oprogramowaniu mikroskopu, aby obrazować przez 55 godzin w odstępach jednogodzinnych.

W każdym cyklu przechwytuj kolejno dwa zestawy danych zarodków i automatycznie zapisuj dane. Użyj oprogramowania mikroskopu do przetwarzania obrazów. Jeśli zobrazowano więcej niż jeden zarodek, utwórz niezależne pliki dla każdego zarodka, dzieląc zestawy danych w zależności od lokalizacji obrazowania.

Przekształć zestawy danych czasu 3D w zestawy danych czasu 2D za pomocą projekcji maksymalnej intensywności lub podobnego narzędzia. Na koniec utwórz pliki filmowe, zapisując je jako AVI i wybierając opcję bez kompresji z interwałami 200 milisekund, aby uzyskać prędkość odtwarzania pięciu klatek na sekundę. Ta warstwowa metoda montażu umożliwia obrazowanie zarodków danio pręgowanego, umożliwiając im wzrost, ale jednocześnie ograniczając ich ruch.

Jeśli stężenie agarozy jest zbyt wysokie, zarodki ulegają zniekształceniu. Ale jeśli jest zbyt niski, wyjdą poza pole widzenia podczas mikroskopii poklatkowej. Stwierdzono, że optymalne stężenie agarozy wynosi od 0,028 do 0,034% Żywe transgeniczne danio pręgowane wykazujące ekspresję RFP w całym zarodku i GFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych obrazowano przez 55 godzin, podczas których wyrosło naczynie międzysegementalne, rozwinęło się unaczynienie podjelitowe i głowowe oraz nastąpiło zagęszczenie splotu żyły ogonowej z wydłużeniem tułowia.

Zarodki wykazujące ekspresję GFP i neurony ruchowe zostały zobrazowane w celu wizualizacji rozwoju neuronów ruchowych. Aksony neuronów ruchowych wyrastają z brzusznej cewy nerwowej nad somitami w kierunku brzusznej strony zarodka. Współrozwój grzbietowego kiełkowania aksonów neuronów ruchowych w odniesieniu do położenia naczyń międzysegmentowych zobrazowano przy użyciu większego powiększenia.

Umożliwiło to uwidocznienie drobniejszych szczegółów kiełkowania aksonów brzusznych, a także aksonów grzbietowych wyrastających z cewy nerwowej. Wraz ze wzrostem liczby somitów, somity rozciągają się również na długość i szerokość. Proces ten został zobrazowany przy użyciu transgenicznych embrionów wykazujących ekspresję GFP w mięśniach.

Ponieważ optymalne stężenie agarozy jest bardzo wąskie, jest ono bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w pomiarach podczas przygotowywania roztworu podstawowego agarozy i musi być ponownie zdefiniowane dla każdej nowej partii roztworu agarozy. Ważne jest, aby dokładnie ustawić parametry obrazowania, w tym rozmiar i rozdzielczość obrazu, prędkość skanowania, zoom, wysokie napięcie detektora i moc lasera, aby zapewnić spójność między eksperymentami, a także zmniejszyć możliwość fototoksyczności i wybielania zdjęć podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego. Korzystając z tej metody mocowania transgenicznych zarodków danio pręgowanego, a następnie rozszerzonego obrazowania poklatkowego całego organizmu, możemy zwizualizować, jak różne tkanki rozwijają się razem.