Name: Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj warstwową metodę mocowania zarodków Danio rerio do poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia nieograniczony rozwój embrionów przy jednoczesnym utrzymaniu ich w stałej pozycji podczas obrazowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Albertowi Panowi i Arndtowi Sieakmannowi za prezenty w postaci transgenicznych ryb. Dziękujemy Koichi Kawakami z Narodowego Instytutu Genetyki, Narodowego Projektu Zasobów Biologicznych z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii za dar transgenicznego danio pręgowanego HGn39b. Dziękujemy również Fatimie Merchant i Kathleen Gajewski za pomoc przy mikroskopii konfokalnej oraz Tracey Theriault za zdjęcia.
Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of Environmental Health Sciences of the National Institutes of Health (grant numer P30ES023512 i numer kontraktu HHSN273201500010C). SU był wspierany przez stypendium z programu Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) oraz przez Hugh Roy and Lillie Endowment Fund. J-Å G był wspierany przez Fundację Roberta A. Welcha (E-0004).

Prezentowana tutaj praca nad zwierzętami została zatwierdzona przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu w Houston i Uniwersytetu Indiana.
1. Hodowla ryb
UWAGA: Praca z modelami kręgowców wymaga zatwierdzonego przez IACUC protokołu. Powinno być ono prowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi krajowymi i międzynarodowymi.
<ol>
	<li>Utrzymuj dorosłego danio pręgowanego zgodnie z opisem we wcześniej opublikowanej literaturze9.</li>
	<li>Po południu umieść dorosłe rybo danio pręgowanego w zbiornikach hodowlanych. Rozmnażaj samce do samic w stosunku 1: 2.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy w pożywce zarodkowej (E3: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, dostosowane do pH 7,0). Podwielokrotność roztworu podstawowego rozmieścić w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 4% (w/v) trikainy (MS-222) w wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemnej butelce. 
	UWAGA: Trikaina jest toksyczna i powinna być zważona i rozpuszczona w dygestorium.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy 20 mM N-fenylotiomocznika (PTU) w wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zarodków
<ol>
	<li>Po kryciu zebrać zarodki w E3 na szalce Petriego i inkubować je w temperaturze 26,5 °C przez około 28 godzin przed zamontowaniem. 
	UWAGA: Spowalnia to rozwój zarodków, tak że zarodki są w przybliżeniu w fazie 30 somitów na początku obrazowania.</li>
	<li>Znieczulać zarodki w 0,016-0,020% Trikainy w E3. Aby zahamować pigmentację, dodaj PTU do stężenia 200 μM.</li>
	<li>Odmówkować zarodki za pomocą kleszczy pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą dwóch kleszczy chwyć i delikatnie rozsuń kosmówkę, aby uwolnić zarodek.</li>
</ol>
4. Montaż w agarozie
UWAGA: Opracowana metoda montażu wymaga dwóch różnych stężeń niskotopliwej agarozy w E3 z 0,02% Trikainy i PTU w zależności od potrzeb. Pierwszy roztwór agarozy zawiera optymalne stężenie agarozy, przy którym zniekształcenia i ruchliwość są minimalne. Optymalizacja została opisana w kroku 5 poniżej.
<ol>
	<li>Podgrzać roztwory agarozy dla dwóch warstw (stężenie określone w kroku 5 poniżej i 1%) do temperatury 65 °C. Pozwól agarozie ostygnąć do około 30 °C tuż przed montażem, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło. Do montażu należy używać naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i szklanym dnem nakrywkowym nr 0. Szkło nakrywkowe przymocowane do dna naczynia tworzy płytką (głębokość ok. 1,2 mm) studzienkę, w której ma zostać umieszczony zarodek. 
	UWAGA: W tym przypadku stężenie o najmniejszej ruchliwości i zniekształceniach mieściło się w przedziale od 0,025 do 0,040% agarozy.</li>
	<li>Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety. Jeśli używasz mikropipety, odetnij zewnętrzną część końcówki, aby zwiększyć rozmiar otworu, aby pasował do zarodka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Dodaj pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szkło nakrywkowe przymocowane do dna naczynia, aby przykryć zarodek (warstwa 1) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Upewnij się, że agaroza zakrywa małą studzienkę, ale nie przeleje jej.</li>
	<li>Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym (22 mm x 22 mm) (<silna klasa="xfig">Ryc. 1C), aby utworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi.</li>
	<li>Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia (warstwa 2) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D). Gdy ta warstwa krzepnie, utrzymuje szkło nakrywkowe na miejscu.</li>
	<li>Wypełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu (warstwa 3) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1E). 
	UWAGA: W tej konfiguracji szkło nakrywkowe i 1% agarozy chronią dolną warstwę przed rozcieńczeniem.</li>
</ol>
5. Optymalizacja roztworu agarozy dla warstwy 1
<ol>
	<li>Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy 1, należy zastosować wieloskalowe podejście do wyszukiwania w siatce. Umieszczaj zarodki w rosnących stężeniach agarozy w zakresie od 0,01% do 1%, a następnie wykonaj obrazowanie poklatkowe ograniczenia wzrostu i ruchliwości zarodka w polu widzenia. Zidentyfikuj stężenia, w których zarówno zniekształcenie, jak i ruchliwość są minimalne.</li>
	<li>Aby jeszcze bardziej zoptymalizować stężenie agarozy, należy dopasować zarodki przy użyciu drobniejszego zakresu stężeń agarozy (np. od 0,025 do 0,040% agarozy) w zależności od stężenia, które okazało się najlepsze w kroku 5.1 (np. 0,025%, 0,028%, 0,031% itd.). 
	UWAGA: W naszym laboratorium optymalne stężenie agarozy wynosiło około 0,03%.</li>
</ol>
6. Obrazowanie poklatkowe
UWAGA: Ta metoda montażu działa dla każdego mikroskopu odwróconego z funkcją poklatkową do obrazowania fluorescencji i jasnego pola.
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe całego zarodka lub jego części przez okres do 55 godzin. Do obrazowania kilku zarodków należy użyć adaptera etapowego, który mieści kilka szalek z jednym zarodkiem zamontowanym na każdej szalce. Obracaj szalki jedna po drugiej, tak aby zarodki były ustawione w przybliżeniu poziomo, zgodnie z ustaleniami oka. W celu optymalnego wzrostu i rozwoju zarodka należy użyć stolika mikroskopowego z inkubatorem ustawionym na 28,5 °C.</li>
	<li>Wybierz obiektyw o małym powiększeniu w oprogramowaniu mikroskopu. Pod okularem zlokalizuj i dokładnie wyrównaj zarodki w poziomie, obracając szalki przy jasnym oświetleniu pola i zapisz ich lokalizację w oprogramowaniu. Utwórz nazwę pliku do automatycznego zapisywania danych. 
	UWAGA: W tym eksperymencie do zarejestrowania lokalizacji zarodków użyto obiektywu plan apo λ 4x 0,2 NA oraz zakładki XY w oknie akwizycji ND. Dane zostały zapisane w formacie .nd2. Cel został wybrany poprzez kliknięcie na jego ikony w zakładce Ti Pad.</li>
	<li>Ustaw rozmiar otworka, szybkość skanowania, rozmiar obrazu i powiększenie. Następnie wybierz obiektyw o większym powiększeniu do przechwytywania obrazów. 
	UWAGA: W tym eksperymencie obiektyw plan-apo 10x 0,45 NA został użyty do obrazowania całych zarodków, a obiektyw super-fluor 20x 0,75 NA został użyty do obrazowania części zarodka w większym powiększeniu. Otworek został ustawiony na 1,2 AU (19,2 μm dla obiektywu 10x), prędkość skanowania została ustawiona na czas przebywania piksela 2,4 μs, a rozmiar obrazu został ustawiony na 1024 x 1024 pikseli z powiększeniem skanowania wynoszącym jeden, co daje rozmiar piksela 1,24 μm dla obiektywu 10x i 0,62 μm dla obiektywu 20x.</li>
	<li>Wybierz kanały dla fluorescencji, która ma być obrazowana. Dostosuj ustawienia przechwytywania obrazu po jednym kanale na raz. Dla każdego kanału fluorescencyjnego dostosuj moc lasera i wysokie napięcie detektora, upewniając się, że zbierasz najlepszy możliwy zakres dynamiki, unikając nasycenia i ograniczając fotowybielanie. 
	UWAGA: W tym eksperymencie GFP obrazowano za pomocą zielonego kanału 488 (laser 488 nm i emisja między 500 a 550 nm), a RFP za pomocą kanału czerwonego 561 (laser 561 nm i emisja między 570 a 600 nm), a obraz transmisyjny został zebrany za pomocą lasera 561 nm i detektora światła przechodzącego (kanał TD).</li>
	<li>Aby zobrazować cały zarodek za pomocą obiektywu 10x, zobrazuj kilka pól widzenia z zakładkami i zszyj je razem za pomocą oprogramowania mikroskopowego. 
	UWAGA: Ponieważ zarodki znacznie się powiększą podczas obrazowania, upewnij się, że w polu widzenia jest miejsce przed i z tyłu zarodka. Użyj karty Skanuj duży obraz w oknie akwizycji ND i wybierz wzór 4 x 1 z 10% nałożeniem, aby uchwycić cztery sąsiednie pola widzenia.</li>
	<li>Skonfiguruj ustawienia przechwytywania stosów Z za pomocą oprogramowania mikroskopu. 
	UWAGA: Ponieważ zarodek jest zamontowany blisko dna szklanego naczynia, jego środek będzie odsuwał się od dna w miarę wzrostu. Użyj karty Z w oknie Akwizycja ND i wybierz opcję Asymetryczny zakres względny. W tej metodzie bieżąca płaszczyzna ostrości jest używana jako płaszczyzna odniesienia, a pozostałe płaszczyzny są asymetrycznie rozmieszczone powyżej i poniżej, aby objąć cały zarodek w objętości stosu Z, z wystarczającą ilością miejsca, aby uwzględnić wzrost próbki. We wszystkich eksperymentach interwał został ustawiony na 11 μm, a całkowity zasięg na około 45 płaszczyzn.</li>
	<li>Aby utrzymać ostrość wielu zarodków podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego, należy użyć automatycznego ustawiania ostrości. W przypadku obrazowania kilku zarodków należy dostosować indywidualne poziomy przesunięcia dla każdego zarodka, aby ustawić ostrość na płaszczyźnie odniesienia. 
	UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano laserowy system stabilizacji ostrości.</li>
	<li>Ustaw parametry poklatkowe w oprogramowaniu mikroskopu i obraz na czas 55 godzin w odstępach około 1 godzin. W każdym cyklu przechwytuj kolejno dwa zestawy danych zarodków i zapisuj dane automatycznie po każdym cyklu.</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania mikroskopowego w wersji on-line lub off-line. Jeśli zobrazowano więcej niż jeden zarodek, utwórz niezależne pliki dla każdego zarodka, dzieląc zestaw danych na podstawie lokalizacji obrazowania. Użyj projekcji maksymalnej intensywności lub podobnego narzędzia, aby przekonwertować zestawy danych czasu 3D na zestawy danych czasu 2D. Utwórz pliki filmowe, korzystając z opcji menu Zapisz jako, wybierając .avi jako format pliku. Wybierz opcję Bez kompresji z interwałami 200 ms, aby uzyskać prędkość odtwarzania 5 klatek /s. 
	UWAGA: Oryginalny zestaw danych dwóch zarodków w tym eksperymencie został podzielony za pomocą funkcji Podziel lokalizacje w oprogramowaniu (Plik | Import/Eksport | Podziel wielokrotności). Zestawy danych czasu 3D zostały przekonwertowane na zestawy danych czasu 2D przy użyciu funkcji projekcji maksymalnej intensywności (Obraz | Przetwarzanie ND| Utwórz obraz projekcji o maksymalnej intensywności w Z).</li>
</ol>

<ol><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207(2013).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36(2014).</li>
<li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li>
<li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196(2012).</li>
<li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes%3A+tcf7+and+synembryn-like%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li>
<li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+MS-222+%28tricaine%29+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li>
<li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda montażu do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego jest opisana tutaj. Najważniejszym krokiem dla metody montażu jest określenie optymalnego stężenia agarozy, które pozwoli na nieograniczony wzrost zarodków danio pręgowanego, a jednocześnie utrzyma zarodki w całkowicie ustalonej pozycji do obrazowania konfokalnego. Ponieważ optymalne stężenie agarozy jest bardzo wąskie, wartość ta jest bardzo wrażliwa na błędy w pomiarze masy agarozy i objętości E3 podczas przygotowywania...

Danio pręgowany od dawna jest organizmem modelowym dla biologii rozwojowej, a mikroskopia jest główną metodą wizualizacji rozwoju embrionalnego. Zalety wykorzystania zarodków danio pręgowanego do badań rozwojowych to niewielkie rozmiary, przejrzystość optyczna, szybki rozwój i wysoka płodność dorosłych ryb. Wygenerowanie transgenicznych linii ryb danio pręgowanego wyrażających fluorescencję w określonych tkankach lub komórkach pozwoliło na bezpośrednią wizualizację rozwoju tkanek w sposób niemożliwy w przypadku większych kręgowców. W połączeniu z mikroskopią poklatkową można łatwo badać szczegóły i dynamikę rozwoju tkanki.
Trudność w obrazowaniu rozwoju danio pręgowanego polega na tym, że zarodki znacznie się wydłużają; zarodek wydłuża swoją długość cztery razy w ciągu pierwszych 3 dni życia1. Ponadto ciało wczesnego zarodka jest miękkie i łatwo ulega zniekształceniu, jeśli wzrost jest ograniczony. Jednak, aby wykonać mikroskopię konfokalną, zarodek musi zostać unieruchomiony. Aby utrzymać zarodki w ustalonej pozycji do konfokalnego obrazowania poklatkowego, są one regularnie znieczulane i umieszczane w 0,3-1% niskotopliwej agarozie. Ma to tę zaletę, że pozwala na pewien wzrost podczas obrazowania przez pewien okres czasu, jednocześnie ograniczając ruchy zarodka. Części zarodka można skutecznie zobrazować w ten sposób. Jednak przy stosowaniu tej metody do obrazowania całego zarodka przez dłuższy czas obserwuje się zniekształcenia spowodowane ograniczonym wzrostem spowodowanym przez agarozę. W związku z tym wymagane są inne metody montażu. Kaufmann i współpracownicy opisali alternatywne mocowanie zarodków danio pręgowanego do mikroskopii świetlnej, takie jak mikroskopia z selektywnym oświetleniem płaskim (SPIM), poprzez umieszczanie zarodków w probówkach z fluorowanego etylenu i propylenu (FEP) zawierających niskie stężenia agarozy lub metylocelulozy2. Technika ta zapewnia doskonałą wizualizację embriogenezy w czasie. Schmid i wsp. opisują montaż do sześciu zarodków w agarozie w probówkach FEB do mikroskopii arkuszowej3, zapewniając wizualizację kilku zarodków podczas jednej sesji obrazowania. Formy zostały użyte do stworzenia macierzy zarodków w celu efektywnego montowania większej liczby zarodków4. Masselkink i in. skonstruowali drukowane w 3D plastikowe formy, które można wykorzystać do wykonania silikonowych odlewów, w których można umieścić zarodki danio pręgowanego na różnych etapach, umożliwiając montaż w stałej pozycji do obrazowania, w tym obrazowania konfokalnego5. Druk 3D został również wykorzystany do wykonania form do spójnego pozycjonowania zarodków danio pręgowanego w formacie 96-dołkowym6. Niektóre formy są dostosowane do określonych etapów i mogą nie pozwalać na nieograniczony wzrost przez długi czas, podczas gdy inne formy są bardziej elastyczne. Niedawno Weijts i in. opublikowali projekt i wykonanie czterodołkowej płytki do obrazowania na żywo zarodków danio pręgowanego7. W tym naczyniu ogon i tułów znieczulonych zarodków ryb są umieszczane ręcznie pod przezroczystym silikonowym dachem przymocowanym tuż nad szkłem nakrywkowym, tworząc kieszeń. Zarodek jest następnie utrwalany w tej pozycji przez dodanie 0,4% agarozy. Mocowanie to pozwala na obrazowanie tylnej części (tułowia i ogona) zarodka o długości około 2 mm, a ponieważ w jednym dołku można zamontować do 12 zarodków, metoda ta pozwala na obrazowanie wielu próbek. Podobnie Hirsinger i Steventon zaprezentowali niedawno metodę, w której głowa ryby jest zamontowana w agarozie, podczas gdy ogon może swobodnie rosnąć, a metoda ta skutecznie ułatwia również obrazowanie obszaru tułowia i ogona zarodka8.
Ten artykuł opisuje metodę warstwowego montażu zarodków danio pręgowanego, która ogranicza ruchy zarodków, pozwalając jednocześnie na nieograniczony wzrost. Zaletą tej metody montażu jest to, że jest to tania, szybka i łatwa metoda montowania zarodków w różnych stadiach do obrazowania przy użyciu dowolnego mikroskopu odwróconego. Montaż pozwala na długotrwałe obrazowanie całego ciała (głowy, tułowia i ogona) podczas rozwoju zarodka. Aby pokazać użyteczność tej metody, zobrazowano rozwój całego zarodka naczyniowego, neuronalnego i mięśniowego u ryb transgenicznych. Dwa zarodki na sesję, na dwóch długościach fal w 3D, były obrazowane za pomocą mikroskopii poklatkowej przez 55 kolejnych godzin, aby wyświetlić filmy przedstawiające rozwój tkanki.

<table><tbody><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>A9414</td><td>Rozpuszczony roztwór przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Naczynia ze szklanym dnem 35 mm ze szkiełkiem nakrywkowym nr 0 i szklanym dnem o średnicy 10 mm</td><td>MatTek Corporation, MA</td><td>P35GCOL-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>E10521</td><td>Rozpuszczony roztwór przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>N-fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P7629</td><td>Rozpuszczony roztwór przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>Mikro szkło osłonowe 22x22 mm</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Leica DMi8</td> Oprogramowanie <td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LAS X Oprogramowanie</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Microscope</td></tr><tr><td>DMC4500 mikroskop cyfrowy Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1S</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS AR wersja 4.40</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>Oprogramowanie NA</td><td>Microscope</td></tr></tbody></table>

warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamika rozwoju może być śledzona przez konfokalną mikroskopię poklatkową żywych transgenicznych zarodków danio pręgowanego wyrażających fluorescencję w określonych tkankach lub komórkach. Trudność w obrazowaniu całego rozwoju zarodka polega na tym, że zarodki danio pręgowanego znacznie się wydłużają. Po regularnym zamontowaniu w 0,3-1% niskotopliwej agarozie, agaroza nakłada ograniczenie wzrostu, prowadząc do zniekształceń w miękkim ciele zarodka. Jednak, aby wykonać konfokalną mikroskopię poklatkową, zarodek musi być unieruchomiony. W tym artykule opisano metodę warstwowego mocowania zarodków danio pręgowanego, która ogranicza ruchliwość zarodków, umożliwiając jednocześnie nieograniczony wzrost. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach. Aby zademonstrować użyteczność tej metody, cały rozwój naczyniowy, neuronalny i mięśniowy zarodka był obrazowany u transgenicznych ryb przez 55 kolejnych godzin. Ta metoda mocowania może być stosowana do łatwego i taniego obrazowania całych zarodków danio pręgowanego przy użyciu mikroskopów odwróconych bez konieczności stosowania form lub specjalnego sprzętu.

Opracowanie metody montażu 
Głównym celem niniejszej pracy było opracowanie niskokosztowej techniki montażu do obrazowania time-lapse rozwoju rybek zebrafish przez dłuższe okresy czasu. Warstwowa metoda montażu została opracowana, aby umożliwić pełny wzrost delikatnego ciała zarodka zebrafish, ograniczając jednocześnie jego ruchy. Jeśli stężenie agarozy w warstwie 1 jest zbyt wysokie, zarodki ulegną zniekształceniu i wygięciu (Rysunek 2). Zarodki hodowane w 0,1% i 0,5% ag...

Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Opracowaliśmy metodę montażu do obrazowania poklatkowego, która pozwala na nieograniczony wzrost delikatnych zarodków danio pręgowanego i jednocześnie utrzymuje je w całkowicie ustalonej pozycji. Ta metoda montażu jest szybka, łatwa i tania i działa w przypadku obrazowania laboratoryjnego na dowolnym mikroskopie odwróconym. Opracowaliśmy tę metodę do obrazowania żywych zarodków danio pręgowanego, ale można ją zmodyfikować do obrazowania innych małych modeli zwierząt wodnych.Zacznij od hodowli dorosłego danio pręgowanego. Po południu umieść ryby w zbiornikach hodowlanych w stosunku samców do samic jeden do dwóch. Następnie przygotuj roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy w pożywce dla zarodków i rozpuść go, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.Podaniec roztwór agarozy do 1,5 mililitrowej probówki. Przygotować roztwór podstawowy 4% trikainy w wodzie destylowanej i przechowywać agarozę i trikainę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Trikaina jest toksyczna i musi być zważona i przygotowana w dygestorium.Po kryciu zbierz zarodki danio pręgowanego w E3 na szalce Petriego i wysiaduj je w temperaturze 26,5 stopnia Celsjusza przez około 28 godzin przed zamontowaniem. Znieczulij zarodki 0,02% trikainą i zdechorionuj je pod mikroskopem, delikatnie chwytając i rozsuwając kosmówkę, aby uwolnić zarodek. Tuż przed montażem podgrzej roztwór agarozy do 65 stopni Celsjusza, a następnie pozwól mu ostygnąć do około 30 stopni Celsjusza, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło i dodaj trikainę do roztworu agarozy.Używaj naczyń ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów z dnem ze szkła nakrywkowego o numerze zero. Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z jego bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety, a następnie ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety. Dodaj pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szklankę nakrywkową przymocowaną do dna naczynia, aby przykryć zarodek, upewniając się, że agaroza przykrywa małą studzienkę, ale nie przelewa się przez nią.Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym, aby stworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi. Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia, co utrzyma szkło nakrywkowe na miejscu podczas krzepnięcia. Następnie napełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu.Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy pierwszej, umieść zarodki w rosnących stężeniach agarozy i wykonaj obrazowanie poklatkowe w celu określenia stężenia, które minimalizuje zniekształcenia i ruchliwość zarodka, a następnie przetestuj dokładniejszy zakres stężeń na podstawie wyników. Najważniejszym krokiem tego protokołu jest określenie optymalnego stężenia agarozy dla warstwy pierwszej. Przetestuj różne nanostężenia agarozy, takie jak 0,030%0,032%itp.aby znaleźć optymalne stężenie. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe zarodków, użyj stolika mikroskopowego z inkubatorem ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza i obrazuj przez okres do 55 godzin. Aby jednocześnie zobrazować kilka zarodków, użyj adaptera stolika, który trzyma kilka szalek i obracaj szalki jedna po drugiej, tak aby zarodki były ustawione poziomo.Wybierz obiektyw o małym powiększeniu, następnie zlokalizuj zarodki za pomocą okularu, a na koniec wyrównaj je w poziomie, obracając szalki. Zapisz lokalizację zarodków w oprogramowaniu i utwórz nazwę pliku do automatycznego zapisywania danych. Ustaw rozmiar otworka, szybkość skanowania, rozmiar obrazu i powiększenie.Następnie wybierz większe powiększenie do przechwytywania obrazów i kanałów fluorescencji, które mają być obrazowane. Dla każdego kanału dostosuj moc lasera i wysokie napięcie detektora, upewniając się, że uzyskasz najlepszy możliwy zakres dynamiki, unikając nasycenia i ograniczając wybielanie zdjęć. Następnie, aby zobrazować cały zarodek za pomocą obiektywu 10X, ustaw ustawienia przechwytywania dużego obrazu w oprogramowaniu, aby zobrazować kilka pól widzenia i zszyć je razem, dostosowując pozycję zarodka, aby upewnić się, że mieści się w tym dużym obszarze obrazu.Skonfiguruj ustawienia przechwytywania stosów Z zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Aby utrzymać ostrość wielu zarodków podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego, należy użyć automatycznego ustawiania ostrości i dostosować indywidualne poziomy przesunięcia dla każdego zarodka, aby ustawić ostrość na płaszczyźnie odniesienia. Następnie ustaw parametry poklatkowe w oprogramowaniu mikroskopu, aby obrazować przez 55 godzin w odstępach jednogodzinnych.W każdym cyklu przechwytuj kolejno dwa zestawy danych zarodków i automatycznie zapisuj dane. Użyj oprogramowania mikroskopu do przetwarzania obrazów. Jeśli zobrazowano więcej niż jeden zarodek, utwórz niezależne pliki dla każdego zarodka, dzieląc zestawy danych w zależności od lokalizacji obrazowania.Przekształć zestawy danych czasu 3D w zestawy danych czasu 2D za pomocą projekcji maksymalnej intensywności lub podobnego narzędzia. Na koniec utwórz pliki filmowe, zapisując je jako AVI i wybierając opcję bez kompresji z interwałami 200 milisekund, aby uzyskać prędkość odtwarzania pięciu klatek na sekundę. Ta warstwowa metoda montażu umożliwia obrazowanie zarodków danio pręgowanego, umożliwiając im wzrost, ale jednocześnie ograniczając ich ruch.Jeśli stężenie agarozy jest zbyt wysokie, zarodki ulegają zniekształceniu. Ale jeśli jest zbyt niski, wyjdą poza pole widzenia podczas mikroskopii poklatkowej. Stwierdzono, że optymalne stężenie agarozy wynosi od 0,028 do 0,034% Żywe transgeniczne danio pręgowane wykazujące ekspresję RFP w całym zarodku i GFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych obrazowano przez 55 godzin, podczas których wyrosło naczynie międzysegementalne, rozwinęło się unaczynienie podjelitowe i głowowe oraz nastąpiło zagęszczenie splotu żyły ogonowej z wydłużeniem tułowia.Zarodki wykazujące ekspresję GFP i neurony ruchowe zostały zobrazowane w celu wizualizacji rozwoju neuronów ruchowych. Aksony neuronów ruchowych wyrastają z brzusznej cewy nerwowej nad somitami w kierunku brzusznej strony zarodka. Współrozwój grzbietowego kiełkowania aksonów neuronów ruchowych w odniesieniu do położenia naczyń międzysegmentowych zobrazowano przy użyciu większego powiększenia.Umożliwiło to uwidocznienie drobniejszych szczegółów kiełkowania aksonów brzusznych, a także aksonów grzbietowych wyrastających z cewy nerwowej. Wraz ze wzrostem liczby somitów, somity rozciągają się również na długość i szerokość. Proces ten został zobrazowany przy użyciu transgenicznych embrionów wykazujących ekspresję GFP w mięśniach.Ponieważ optymalne stężenie agarozy jest bardzo wąskie, jest ono bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w pomiarach podczas przygotowywania roztworu podstawowego agarozy i musi być ponownie zdefiniowane dla każdej nowej partii roztworu agarozy. Ważne jest, aby dokładnie ustawić parametry obrazowania, w tym rozmiar i rozdzielczość obrazu, prędkość skanowania, zoom, wysokie napięcie detektora i moc lasera, aby zapewnić spójność między eksperymentami, a także zmniejszyć możliwość fototoksyczności i wybielania zdjęć podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego. Korzystając z tej metody mocowania transgenicznych zarodków danio pręgowanego, a następnie rozszerzonego obrazowania poklatkowego całego organizmu, możemy zwizualizować, jak różne tkanki rozwijają się razem.

a-layered-mounting-method-for-extended-time-lapse-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

Ten artykuł opisuje metodę montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania. Metoda ta jest opłacalna i łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.

Warstwowy montaż agaru: przygotowanie żywych zarodków danio pręgowanego do długoterminowego obrazowania za pomocą odwróconego mikroskopu

Ten film opisuje krok po kroku instrukcje dotyczące montażu żywych zarodków danio pręgowanego na 6-dołkowej płytce przy użyciu niskotopliwej agarozy. Zapewnia również proces pozyskiwania obrazów żywych zarodków i analizowania ich za pomocą oprogramowania.

Montaż agarowy: podstawowa metoda montowania żywych zarodków danio pręgowanego do długotrwałego obrazowania

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Rozwój danio pręgowanego można obserwować przez wiele dni za pomocą mikroskopii z lekkim arkuszem, gdy zarodki są umieszczane w optycznie przezroczystych rurkach polimerowych z agarozą o niskim stężeniu.

Wielowarstwowe mocowanie do długotrwałej mikroskopii świetlnej danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj warstwową metodę mocowania zarodków Danio rerio do poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Technika umożliwia nieograniczony rozwój embrionów przy jednoczesnym utrzymaniu ich w stałej pozycji podczas obrazowania.

Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów