Warstwowa metoda mocowania do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej całych zarodków danio pręgowanego
14 stycznia 2020
Ten artykuł opisuje metodę montowania delikatnych zarodków danio pręgowanego do rozszerzonej poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Ta tania metoda jest łatwa do wykonania przy użyciu zwykłych naczyń mikroskopowych ze szklanym dnem do obrazowania pod dowolnym mikroskopem odwróconym. Montaż odbywa się w warstwach agarozy w różnych stężeniach.
Opracowaliśmy metodę montażu do obrazowania poklatkowego, która pozwala na nieograniczony wzrost delikatnych zarodków danio pręgowanego i jednocześnie utrzymuje je w całkowicie ustalonej pozycji. Ta metoda montażu jest szybka, łatwa i tania i działa w przypadku obrazowania laboratoryjnego na dowolnym mikroskopie odwróconym. Opracowaliśmy tę metodę do obrazowania żywych zarodków danio pręgowanego, ale można ją zmodyfikować do obrazowania innych małych modeli zwierząt wodnych.
Zacznij od hodowli dorosłego danio pręgowanego. Po południu umieść ryby w zbiornikach hodowlanych w stosunku samców do samic jeden do dwóch. Następnie przygotuj roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy w pożywce dla zarodków i rozpuść go, podgrzewając w kuchence mikrofalowej.
Podaniec roztwór agarozy do 1,5 mililitrowej probówki. Przygotować roztwór podstawowy 4% trikainy w wodzie destylowanej i przechowywać agarozę i trikainę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Trikaina jest toksyczna i musi być zważona i przygotowana w dygestorium.
Po kryciu zbierz zarodki danio pręgowanego w E3 na szalce Petriego i wysiaduj je w temperaturze 26,5 stopnia Celsjusza przez około 28 godzin przed zamontowaniem. Znieczulij zarodki 0,02% trikainą i zdechorionuj je pod mikroskopem, delikatnie chwytając i rozsuwając kosmówkę, aby uwolnić zarodek. Tuż przed montażem podgrzej roztwór agarozy do 65 stopni Celsjusza, a następnie pozwól mu ostygnąć do około 30 stopni Celsjusza, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło i dodaj trikainę do roztworu agarozy.
Używaj naczyń ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów z dnem ze szkła nakrywkowego o numerze zero. Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z jego bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety, a następnie ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety. Dodaj pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szklankę nakrywkową przymocowaną do dna naczynia, aby przykryć zarodek, upewniając się, że agaroza przykrywa małą studzienkę, ale nie przelewa się przez nią.
Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym, aby stworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi. Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia, co utrzyma szkło nakrywkowe na miejscu podczas krzepnięcia. Następnie napełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu.
Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy pierwszej, umieść zarodki w rosnących stężeniach agarozy i wykonaj obrazowanie poklatkowe w celu określenia stężenia, które minimalizuje zniekształcenia i ruchliwość zarodka, a następnie przetestuj dokładniejszy zakres stężeń na podstawie wyników. Najważniejszym krokiem tego protokołu jest określenie optymalnego stężenia agarozy dla warstwy pierwszej. Przetestuj różne nanostężenia agarozy, takie jak 0,030%0,032%itp.
aby znaleźć optymalne stężenie. Aby wykonać obrazowanie poklatkowe zarodków, użyj stolika mikroskopowego z inkubatorem ustawionym na 28,5 stopnia Celsjusza i obrazuj przez okres do 55 godzin. Aby jednocześnie zobrazować kilka zarodków, użyj adaptera stolika, który trzyma kilka szalek i obracaj szalki jedna po drugiej, tak aby zarodki były ustawione poziomo.
Wybierz obiektyw o małym powiększeniu, następnie zlokalizuj zarodki za pomocą okularu, a na koniec wyrównaj je w poziomie, obracając szalki. Zapisz lokalizację zarodków w oprogramowaniu i utwórz nazwę pliku do automatycznego zapisywania danych. Ustaw rozmiar otworka, szybkość skanowania, rozmiar obrazu i powiększenie.
Następnie wybierz większe powiększenie do przechwytywania obrazów i kanałów fluorescencji, które mają być obrazowane. Dla każdego kanału dostosuj moc lasera i wysokie napięcie detektora, upewniając się, że uzyskasz najlepszy możliwy zakres dynamiki, unikając nasycenia i ograniczając wybielanie zdjęć. Następnie, aby zobrazować cały zarodek za pomocą obiektywu 10X, ustaw ustawienia przechwytywania dużego obrazu w oprogramowaniu, aby zobrazować kilka pól widzenia i zszyć je razem, dostosowując pozycję zarodka, aby upewnić się, że mieści się w tym dużym obszarze obrazu.
Skonfiguruj ustawienia przechwytywania stosów Z zgodnie ze wskazówkami rękopisu. Aby utrzymać ostrość wielu zarodków podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego, należy użyć automatycznego ustawiania ostrości i dostosować indywidualne poziomy przesunięcia dla każdego zarodka, aby ustawić ostrość na płaszczyźnie odniesienia. Następnie ustaw parametry poklatkowe w oprogramowaniu mikroskopu, aby obrazować przez 55 godzin w odstępach jednogodzinnych.
W każdym cyklu przechwytuj kolejno dwa zestawy danych zarodków i automatycznie zapisuj dane. Użyj oprogramowania mikroskopu do przetwarzania obrazów. Jeśli zobrazowano więcej niż jeden zarodek, utwórz niezależne pliki dla każdego zarodka, dzieląc zestawy danych w zależności od lokalizacji obrazowania.
Przekształć zestawy danych czasu 3D w zestawy danych czasu 2D za pomocą projekcji maksymalnej intensywności lub podobnego narzędzia. Na koniec utwórz pliki filmowe, zapisując je jako AVI i wybierając opcję bez kompresji z interwałami 200 milisekund, aby uzyskać prędkość odtwarzania pięciu klatek na sekundę. Ta warstwowa metoda montażu umożliwia obrazowanie zarodków danio pręgowanego, umożliwiając im wzrost, ale jednocześnie ograniczając ich ruch.
Jeśli stężenie agarozy jest zbyt wysokie, zarodki ulegają zniekształceniu. Ale jeśli jest zbyt niski, wyjdą poza pole widzenia podczas mikroskopii poklatkowej. Stwierdzono, że optymalne stężenie agarozy wynosi od 0,028 do 0,034% Żywe transgeniczne danio pręgowane wykazujące ekspresję RFP w całym zarodku i GFP w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych obrazowano przez 55 godzin, podczas których wyrosło naczynie międzysegementalne, rozwinęło się unaczynienie podjelitowe i głowowe oraz nastąpiło zagęszczenie splotu żyły ogonowej z wydłużeniem tułowia.
Zarodki wykazujące ekspresję GFP i neurony ruchowe zostały zobrazowane w celu wizualizacji rozwoju neuronów ruchowych. Aksony neuronów ruchowych wyrastają z brzusznej cewy nerwowej nad somitami w kierunku brzusznej strony zarodka. Współrozwój grzbietowego kiełkowania aksonów neuronów ruchowych w odniesieniu do położenia naczyń międzysegmentowych zobrazowano przy użyciu większego powiększenia.
Umożliwiło to uwidocznienie drobniejszych szczegółów kiełkowania aksonów brzusznych, a także aksonów grzbietowych wyrastających z cewy nerwowej. Wraz ze wzrostem liczby somitów, somity rozciągają się również na długość i szerokość. Proces ten został zobrazowany przy użyciu transgenicznych embrionów wykazujących ekspresję GFP w mięśniach.
Ponieważ optymalne stężenie agarozy jest bardzo wąskie, jest ono bardzo wrażliwe na niewielkie zmiany w pomiarach podczas przygotowywania roztworu podstawowego agarozy i musi być ponownie zdefiniowane dla każdej nowej partii roztworu agarozy. Ważne jest, aby dokładnie ustawić parametry obrazowania, w tym rozmiar i rozdzielczość obrazu, prędkość skanowania, zoom, wysokie napięcie detektora i moc lasera, aby zapewnić spójność między eksperymentami, a także zmniejszyć możliwość fototoksyczności i wybielania zdjęć podczas długotrwałego obrazowania poklatkowego. Korzystając z tej metody mocowania transgenicznych zarodków danio pręgowanego, a następnie rozszerzonego obrazowania poklatkowego całego organizmu, możemy zwizualizować, jak różne tkanki rozwijają się razem.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę unieruchamiania delikatnych zarodków ryb zebrafish w celu obrazowania time-lapse przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia nieograniczony wzrost przy jednoczesnym utrzymaniu stałej pozycji zarodków, co czyni ją odpowiednią dla różnych modeli wodnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Techniki obrazowania
Wstęp
- Zarodki ryb zebrafish są delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się z nimi podczas obrazowania.
- Obrazowanie poklatkowe (time-lapse) jest niezbędne do badania procesów rozwojowych.
- Istniejące metody mogą nie zapewniać odpowiedniego wsparcia dla wzrostu zarodków.
- Konieczne jest opracowanie kosztowo efektywnego rozwiązania, aby zwiększyć jego dostępność w badaniach.
Cel badania
- Opracowanie prostej i niedrogiej metody montażu embrionów danio pręgowanego.
- Ułatwienie obrazowania poklatkowego bez negatywnego wpływu na żywotność embrionów.
- Zapewnienie techniki, którą można dostosować do innych małych modeli wodnych.
Zastosowane metody
- Hodowla dorosłych rybek danio w kontrolowanym środowisku.
- Przygotowanie roztworu stokowego agarozy niskotopliwej.
- Wykorzystanie szkiełek mikroskopowych z przeszklonym dnem do obrazowania.
- Zastosowanie mikroskopów odwróconych do konfokalnej mikroskopii poklatkowej.
Główne wyniki
- Metoda ta skutecznie wspiera wzrost embrionów rybek zebrafish.
- Embriony pozostają unieruchomione w jednej pozycji podczas sesji obrazowania.
- Technika ta jest szybka i łatwa w implementacji.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do obrazowania innych gatunków wodnych.
Wnioski
- Ta metoda montażu usprawnia możliwość badania rozwoju danio przebrzuchłego.
- Stanowi ona niskokosztową alternatywę dla badaczy.
- Podejście to można modyfikować dla różnych małych modeli wodnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie rozwoju całego organizmu w żywych embrionach zebrafish jest kluczowe dla walidacji celów i przesiewu fenotypowego we wczesnych etapach odkrywania leków. Konwencjonalne metody montażu ograniczają wzrost embrionów, wprowadzając artefakty, które naruszają wierność danych i interpretację mechanistyczną. Ta warstwowa metoda z użyciem agarozy umożliwia nieograniczony wzrost przy jednoczesnej immobilizacji embrionów, co wspiera wiarygodne obrazowanie podłużne w celu minimalizacji ryzyka hipotez terapeutycznych i zwiększenia pewności predykcyjnej w modelach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację jednoczesnego rozwoju naczyń krwionośnych, neuronów i mięśni w ciągu 55 godzin, bez zniekształceń wywołanych wzrostem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną, niskokosztową metodę unieruchomienia kompatybilną ze standardowymi mikroskopami odwróconymi, co zmniejsza zmienność w badaniach obrazowych typu time-lapse.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, wysokorozdzielcze dane z lapse-time dotyczące specyficznej dla tkanki ekspresji GFP/RFP, co umożliwia precyzyjne odczyty fenotypowe podczas przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje łatwo dostępne materiały (agarozę o niskiej temperaturze topnienia, szalki z szklanym dnem, tricainę) oraz standardowe ustawienia konfokalne, co wspiera standaryzację i skalowalność testów w projektach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na uchwycenie procesów istotnych dla przebiegu choroby, takich jak kiełkowanie naczyń międzysegmentalnych oraz kiełkowanie aksonów neuronów ruchowych, zapewniając przejście od modulacji celu genetycznego do wyniku fenotypowego.
- Wartość operacyjna: Wspiera automatyczne ustawianie ostrości i obrazowanie w stosach Z przez dłuższe okresy, co ułatwia spójne gromadzenie danych do oceny biomarkerów translacyjnych i walidacji modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od testowania hipotez dotyczących celu, przez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, dostarczając zdolnych do wzrostu i stabilnych po unieruchomieniu embrionów w celu ograniczania ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez umożliwienie długoterminowego obrazowania współrozwijających się tkanek (naczyń krwionośnych, neuronów, mięśni) w kontekstach istotnych dla danej choroby.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe odczyty fluorescencji, niezbędne do wiarygodnej oceny związków w kampaniach screeningu fenotypowego.
- Analityka: Umożliwia tworzenie projekcji maksymalnej intensywności oraz mozaikowanie obrazów dużych obszarów, generując analizowalne zbiory danych 2D i 3D w czasie, służące do statystycznego porównywania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wczesne interwencje genetyczne z późną ciągłością fenotypową, taką jak tworzenie splotu naczyniowego i wzrost aksonów, wspierając decyzje o dalszym rozwoju oparte na biomarkerach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi niezależną od platformy, wielokrotnego użytku metodę obrazowania wodnych modeli organizmów, którą można dostosować do różnych projektów bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu lub form.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstw
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez eliminację artefaktów wynikających z ograniczenia wzrostu, zwiększając pewność co do relacji między cechą docelową a fenotypem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej optymalizacji stężenia agarozy oraz kontroli środowiskowej (temperatura, trikaina, nawodnienie).
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wysokiej jakości danych podłużnych na temat dynamiki wielotkankowej, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki dokładnym i powtarzalnym wynikom przesiewania fenotypowego, które odzwierciedlają rzeczywiste odpowiedzi biologiczne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli rybek zebrafish, pracy z embrionami oraz optymalizacji mikroskopii konfokalnej.
- Zależy od precyzyjnego przygotowania roztworów zapasowych agarozy o niskiej temperaturze topnienia oraz znieczulenia trikainą w kontrolowanych warunkach.
- Wymaga kalibracji stężenia agarozy (0,028–0,034%) dla każdej partii, aby zrównoważyć unieruchomienie z możliwością wzrostu.
- Wymaga standaryzacji parametrów obrazowania (moc lasera, wzmocnienie detektora, prędkość skanowania, krok Z), aby zminimalizować fototoksyczność i zapewnić spójność między seriami pomiarowymi.
- Ograniczone do embrionów optycznie przezroczystych; modele pigmentowane lub nieprzezroczyste mogą wymagać dodatkowego oczyszczania lub alternatywnych strategii montażu.
