Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Ogólnym celem tej procedury jest ocena siły działania leków immunomodulujących przy użyciu automatycznego licznika komórek poprzez pomiar blastogenezy limfocytów T lub transformacji blastyzmu. Test ten zapewnia szybką metodę ilościowego określania aktywacji limfocytów T przy użyciu automatycznego licznika komórek, który jest wyposażony w pomiar średnic komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybki, prosty i bezpośredni pomiar pojedynczych komórek, w przeciwieństwie do zwykłych testów proliferacji limfocytów T.

Leczenie limfocytów lekami immunomodulującymi zwiększy lub zmniejszy szybkość i zakres blastogenezy komórkowej. Korzystając z testu licznika komórkowego, zakres tej blastogenezy można zmierzyć w ciągu około czterech minut na próbkę. W ciągu dziesięciu minut od złożenia ofiary spryskaj brzuch myszy 70 procentami etanolu i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w futrze i skórze po lewej stronie zwierzęcia.

Przytrzymaj skórę w rozkroku i z powrotem, aby odsłonić otrzewną. Następnie nałóż czteroprocentową chlorheksydynę na miejsce nacięcia. Za pomocą drugiego zestawu nożyczek i kleszczy wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe cięcie wzdłuż środkowego brzucha, aby otworzyć otrzewną.

Następnie usuń przyczepy trzewne i nadmiar tłuszczu otaczający śledzionę i przenieś tkankę do pojemnika DPBS. Następnie dodaj dziesięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640 do dziesięciocentymetrowej pożywki hodowlanej i zmiażdż śledziony między dwoma wysterylizowanymi szkiełkami z matowego szkła. Przefiltruj zawiesinę tkanek przez sterylne sitko do komórek nylonowych o grubości 40 mikronów do nowego dziesięciocentymetrowego naczynia hodowlanego, aby usunąć tkanki łączne i zanieczyszczenia oraz przenieść zawiesinę jednokomórkową do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania.

Zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania i ponownie zawiesić osad w dziesięciu mililitrach świeżego podłoża. Następnie ponownie odwirować komórki w celu ponownego zawieszenia w dwóch mililitrach kompletnej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby oczyścić limfocyty T, najpierw umyj jedną do dwóch kolumn z wełny nylonowej na śledzionę dwa razy pięcioma mililitrami pełnego RPMI i umieść kolumny w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji załadować dwa mililitry izolowanej zawiesiny splenocytów na wierzch każdej kolumny i pozwolić komórkom przejść przez kolumnę, aż ciecz dotrze do górnej części wełny. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza na szczyt kolumn i pozwól pożywce przejść przez wełnę nylonową, aż ciecz w górnej części kolumny dotrze do górnej części wełny.

Teraz przykryj wełnę trzema mililitrami kompletnego podłoża o temperaturze 37 stopni Celsjusza i włóż kolumnę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych, aby wszystkie komórki B, fibroblasty i komórki pomocnicze przylegały do włókien wełny. Po godzinie, w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, umyj kolumnę dwa razy pięcioma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki, aby wymyć nieprzylegające limfocyty T. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie.

Po jednokrotnym umyciu limfocytów T dziesięcioma mililitrami kompletnej pożywki, ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach świeżej kompletnej pożywki. Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę do stężenia 0,5 razy dziesięć do sześciu komórek na mililitr w świeżej kompletnej pożywce do wysiewu na sześcio- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. W ciągu 24 godzin od ich izolacji aktywuj izolowane limfocyty T z kolumny z wełny nylonowej odpowiednim bodźcem i eksperymentalnym lekiem będącym przedmiotem zainteresowania.

Po 12 do 72 godzinach użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie wymieszać aktywowane leczone komórki, aby usunąć wszelkie grudki. Aby zmierzyć średnice komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, należy przenieść jeden mililitr poddanych działaniu komórek z każdej studzienki do indywidualnych kubków na próbki i umieścić kubki na próbki w karuzeli próbek automatycznego licznika komórek. Wprowadź identyfikator próbki i informacje o typie komórki, aby zarejestrować próbki i rozpocząć ich uruchamianie.

Po zmieszaniu błękitu trypanowego z zawiesiną komórkową, komórki są przepuszczane przez pole obrazowania, aż z każdej próbki zostanie pobranych około 100 obrazów komórek. Oprogramowanie rysuje okrąg wokół każdej wykrytej komórki barwionej na niebiesko i niebarwionej na niebiesko, aby określić średnicę komórki. Po zmierzeniu wszystkich komórek dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, który pokazuje wyniki jako całkowitą i żywotną liczbę komórek dla każdej zmierzonej średnicy.

Dane mogą być następnie prezentowane w postaci histogramów. Po dwóch dniach stymulacji PMA i jonomycyną obserwuje się znaczne przesunięcie mediany rozkładu częstości w kierunku większych średnic komórek, przy czym liczba limfocytów T o mniejszych średnicach jest odpowiednio zmniejszona. Przy ustalonym stężeniu jonomycyny 250 nanomolowych efekt PMA nie ulega znaczącej zmianie poprzez podniesienie stężenia bodźca aktywacyjnego z dwóch do 250 nanogramów na mililitr.

Nie zaobserwowano również znaczącej różnicy w proliferacji limfocytów T. Leki hamujące kalcyneurynę częściowo hamują zarówno blastogenezę, jak i proliferację limfocytów T. Leczenie limfocytami T związkami immunosupresyjnymi, które celują w czynnik jądrowy kalcyneuryny aktywowanych limfocytów T, hamuje odpowiedź blastogenną o prawie 72 procent.

Rapamycyna i FTY720 wykazują umiarkowany, ale statystycznie istotny wpływ na blastogenezę. Podczas gdy TRAM34 najwyraźniej nie wpływa na proliferację mysich limfocytów T nawet przy stężeniach 700 nanomolowych. Gdy rapamycyna i cyklosporyna A są stosowane razem, blastogeneza jest całkowicie zahamowana.

Podobne wyniki obserwuje się w przypadku mysich limfocytów T aktywowanych sprzężonymi kulkami magnetycznymi anty-CD3 i anty-CD28. Test ten może być wykorzystany do skutecznego ilościowego określenia działania różnych leków immunomodulujących, dając lepszą ocenę siły działania leku w porównaniu z typowymi testami proliferacji, które obejmują również udział komórek apoptotycznych i martwiczych. Dzięki tej metodzie można zmierzyć do 15 próbek i na zewnątrz, co pozwala na jednoczesną i późniejszą kwantyfikację zarówno szybkości blastogenezy, jak i proliferacji.

Czasami pęcherzyki powietrza mogą dostać się do komory przepływowej, co sprawia, że pomiar nie nadaje się do użytku, dlatego wszystkie obrazy powinny zostać zbadane pod kątem pęcherzyków powietrza przed przyjęciem danych z każdej próby do analizy. Jednym z ograniczeń tej procedury jest to, że jeśli w próbce jest zbyt dużo zanieczyszczeń, pomiar może traktować je jako żywe komórki. Dzięki odpowiednim modyfikacjom test ten może zostać zaadaptowany do badania zmiany wielkości komórek w neutrofilach i hepatocytach.