Name: Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj szybką metodę kwantyfikacji blastogenezy limfocytów T za pomocą automatycznego licznika komórek w celu oceny leków immunomodulujących. Technika ta pozwala na bezpośredni pomiar aktywacji pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Lucile Wrenshall za użycie czytnika płytek, Nancy Bigley za pożyteczną dyskusję i Tomowi Brownowi za dar myszy ICR. Praca ta została sfinansowana z grantu 1R01AI114804 z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych oraz ze środków Rozwoju Wydziału WSU (dla J.A.K.). Projekt J.N.G. był częściowo wspierany przez grant Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych R25GM090122.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Laboratoryjnych (Lab Animal Care and Use Committee) oraz Komisję Bioetyczną (Institutional Review Board) Wright State University.

UWAGA: Ludzkie PBMC są izolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll5.
1. Pobieranie śledziony
<ol>
	<li>Utrzymuj dorosłe samice myszy ICR w standardowych warunkach laboratoryjnych, zapewniając pokarm, wodę i ściółkę specyficzne dla tego gatunku. 
	UWAGA: W momencie eutanazji zwierzęta miały średni wiek 2,9 miesiąca i średnią masę ciała 30,4 g.</li>
	<li>W dniu izolacji (DOI) przeprowadź eutanazję zwierząt indywidualnie, bez obecności innych osobników tego samego gatunku. Dołóż wszelkich starań, aby zminimalizować stres myszy. Eutanazję przeprowadź za pomocą CO2 z wtórnym zwichnięciem stawów szyjnych w celu potwierdzenia śmierci.
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę, wciąż w klatce transportowej, w komorze z CO2 i uruchom przepływ gazu z prędkością 5 L/min. Taka prędkość przepływu wypiera tlen w zalecanym tempie 10-30% na minutę.</li>
		<li>Po utracie przytomności przez zwierzę zwiększ przepływ CO2 do 15 L/min. Sprawdź, czy oddech ustał, i pozostaw zwierzę w komorze przez dodatkowe 2 min.</li>
		<li>Wykonaj zwichnięcie stawów szyjnych z siłą rozciągającą, aby upewnić się, że nastąpiła śmierć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobierz śledzionę od zwierzęcia, stosując technikę aseptyczną w ciągu 10 min od śmierci.
	<ol>
		<li>Przed użyciem wysterylizuj w autoklawie dwa zestawy nożyczek i pęset do usunięcia śledziony. Zdezynfekuj powierzchnię do sekcji, nakładając 70% etanol.</li>
		<li>Nanieś 70% etanol na brzuch myszy. Używając jednego zestawu nożyczek i pęset, wykonaj nacięcie futra i skóry po lewej stronie brzucha, a następnie rozchyl i odsun skórę, aby odsłonić otrzewną. Po odsłonięciu nanieś 4% roztwór chlorheksydyny przed otwarciem otrzewnej.</li>
		<li>Używając drugiego zestawu nożyczek i pęset, wykonaj nacięcie o długości 2-3 cm wzdłuż środkowej części brzucha. Otwórz otrzewną i usuń śledzionę, odcinając przyczepy trzewne i nadmiar tłuszczu. Umieść śledzionę w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie surowych splenocytów
UWAGA: Wszystkie etapy należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza (dygestorium biologicznym), stosując technikę aseptyczną.
<ol>
	<li>Namocz pobrane śledziony w 10 ml dejonizowanej sterylnej H2O przez 5 min w 10-centymetrowej szalce hodowlanej, aby zlizować erytrocyty z powierzchni. 
	UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli śledziona została uszkodzona podczas izolacji.</li>
	<li>Aby uwolnić splenocyty, rozgnieć śledziony między dwiema wysterylizowanymi szkiełkami przedmiotowymi (matową stroną w stronę śledziony) nad nową 10-centymetrową szalką hodowlaną. Wymieszaj z 10 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2 mM L-glutaminy, 50 IU/ml penicyliny i 50 µg/ml streptomycyny (dalej określonej jako kompletna pożywka RPMI).</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez sterylne nylonowe sitko komórkowe o oczkach 40 µm do nowej 10-centymetrowej szalki hodowlanej, aby usunąć tkankę łączną i zanieczyszczenia.</li>
	<li>Zlizuj pozostałe erytrocyty, dodając 20 ml buforu do lizy RBC składającego się z 155 mM NH4Cl, 10 mM NaHCO3 i 0,1 mM EDTA o pH 7,4 i osmolalności ~300 mOsm/L. 
	UWAGA: Osmolalność mierzy się za pomocą osmometru krzepnięcia lub osmometru ciśnienia par.
	<ol>
		<li>Przenieś komórki z 10-centymetrowej płytki do 50-mililitrowej probówki stożkowej i wiruj przy 250 x g przez 10 min (4 °C).</li>
		<li>Usuń nadsącz, dodaj 20 ml buforu do lizy RBC i ponownie zawieś osad komórkowy poprzez pipetowanie.</li>
		<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej w buforze do lizy przez 10 min przy delikatnym kołysaniu.</li>
		<li>Wiruj przez 10 min przy 250 x g (4 °C), aby uzyskać osad komórkowy. Odlej bufor do lizy.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w 10 ml kompletnej pożywki RPMI i ponownie wiruj (250 x g, 10 min, 4 °C). Odrzuć nadsącz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawieś splenocyty w 2 ml kompletnej pożywki RPMI ogrzanej do 37 °C w celu przeniesienia ich na kolumnę z włókna wełny nylonowej.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie limfocytów T
<ol>
	<li>Przemyć kolumny z wełny nylonowej dwukrotnie 5 ml pełnej pożywki RPMI. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 przez 1 hr. 
	UWAGA: Niezbędne jest utrzymywanie wełny nylonowej w stanie wilgotnym przez cały czas trwania eksperymentu oraz stosowanie pełnej pożywki RPMI podgrzanej do 37 °C podczas wszystkich etapów izolacji na wełnie nylonowej.</li>
	<li>Nanieść wyizolowane splenocyty na kolumnę i inkubować przez 1 hr, aby umożliwić przyleganie limfocytów B, fibroblastów i komórek akcesoryjnych do wełny nylonowej.
	<ol>
		<li>Nanieść do kolumny 2 ml pożywki RPMI zawierającej splenocyty i przepuścić ją, aż osiągnie górną powierzchnię wełny nylonowej.</li>
		<li>Dodać 2 ml pełnej pożywki RPMI podgrzanej do 37 °C na wierzch wełny nylonowej i przepuścić medium przez wełnę, aż poziom cieczy osiągnie górną powierzchnię.</li>
		<li>Dodać do kolumny 3 ml ciepłej pełnej pożywki RPMI, aby całkowicie przykryć wełnę nylonową.</li>
		<li>Inkubować załadowaną kolumnę bez zakłócania w inkubatorze do hodowli komórkowych w 37 °C i 5% CO2 przez 1 hr.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eluować komórki, przemywając kolumnę dwukrotnie 5 ml pełnej pożywki RPMI. Przeprowadzić dodatkowe przemycie eluowanych komórek poprzez wirowanie.
	<ol>
		<li>Napełnić kolumnę do pełna 2 razy pełną pożywką RPMI i pozwolić roztworowi z kolumny spłynąć do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. 
		UWAGA: Należy unikać opukiwania lub uderzania w kolumnę, co może spowodować oderwanie limfocytów B, komórek akcesoryjnych i fibroblastów przylegających do wełny nylonowej.</li>
		<li>Zebrać frakcję przepływową i wirować przy 250 x g przez 10 min (4 °C), aby uzyskać pellet komórek. Przemyć raz 10 ml pełnej pożywki RPMI. Ponownie z pelletować komórki (250 x g, 10 min, 4 °C) i zawiesić ponownie w 2 ml pełnej pożywki RPMI.</li>
		<li>Zmierzyć gęstość komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć w pełnej pożywce RPMI do stężenia 0.5 x 106 komórek/ml.</li>
		<li>Zasiać alikwoty komórek o objętości 1 lub 2 ml do każdego dołka płytek hodowlanych 24- lub 6-dołkowych odpowiednio i hodować komórki w 37 °C z 5% CO2. 
		UWAGA: Na tym etapie do każdego dołka można dodać 1 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT), aby zwiększyć przeżywalność limfocytów T.</li>
		<li>Opcjonalnie: Potwierdzić wydajność protokołu izolacji za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten zazwyczaj daje wydajność ~80% limfocytów T23. 
		UWAGA: Komórki oczyszczone na wełnie nylonowej zawierają około 50% komórek CD4+ i 23% komórek CD8+. Aby dalej oczyścić subpopulacje CD4+ i CD8+, można przeprowadzić pojedynczy etap deplekcji immunomagnetycznej z użyciem ośmiu przeciwciał i kulek magnetycznych24. Alternatywnie, czystsze populacje limfocytów T CD4+ i CD8+ można wyizolować poprzez selekcję pozytywną lub negatywną za pomocą specyficznych przeciwciał.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Aktywacja limfocytów T i ekspozycja na lek eksperymentalny
<ol>
	<li>Aktywować limfocyty T w ciągu 24 h od izolacji poprzez dodanie PMA i soli wapniowej jonomycyny lub kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD2823,25,26. W momencie aktywacji dodać leki eksperymentalne (np. CsA, FK506, rapamycynę, TRAM-34 oraz FTY720). 
	UWAGA: W tym przypadku stężenia PMA wynosiły od 2 do 250 ng/ml, a stężenie jonomycyny utrzymano na poziomie 250 nM. Jeśli to możliwe, rozcieńczenia należy przygotować z alikwotów roztworów zapasowych każdego leku w taki sposób, aby objętość dodana do każdej studni z komórkami wynosiła ≥1 µl w celu zapewnienia powtarzalności. Magnetyczne kulki pokryte anty-CD3/anty-CD28 dodaje się w stosunku 1:1 (kulka do komórki). Zwiększenie liczby kulek na komórkę (tj. stosunku kulek do komórek) zwiększy intensywność stymulacji25,26. Kulki należy przemyć i ponownie zawiesić w pełnej pożywce RPMI przed dodaniem ich do komórek. Należy pamiętać, że błękit trypanu barwi kulki.</li>
	<li>Kultywować komórki przez 12-72 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przed analizą za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
</ol>
5. Gromadzenie danych za pomocą automatycznego licznika komórek
<ol>
	<li>Przed analizą próbki należy upewnić się, że komórki zostały delikatnie wymieszane za pomocą pipety serologicznej, aby uniknąć powstawania skupisk. Jest to szczególnie istotne w przypadku limfocytów aktywowanych ze względu na ich zwiększoną przylepność.
	<ol>
		<li>W przypadku kultur aktywowanych kuleczkami anti-CD3/CD28, po pipetowaniu przenieś próbkę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml lub 2 ml. Oddziel kuleczki, umieszczając probówkę na magnesie na 1-2 min. Do analizy wykorzystaj nadsącz zawierający komórki. 
		UWAGA: Zarówno komórki spoczynkowe, jak i aktywowane należy analizować w ciągu 1 h, aby uwzględnić ewentualną preaktywację komórek spoczynkowych przez surowicę obecną w pożywce hodowlanej. Po 12 h stymulacji PMA/ionomycyną wykryto niewielki wzrost rozmiaru komórek (Rysunek 2). Po 72 h nie zaobserwowano istotnego wzrostu rozmiaru komórek w porównaniu do 48 h (dane nie przedstawiono).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 1 ml zawiesiny komórkowej do kubka na próbkę i przeprowadź pomiar za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcją w podręczniku. 
	UWAGA: Dla każdej z prób należy użyć minimum 1 ml (maksimum 2 ml) hodowli komórkowej. Automatyczny licznik komórek wykorzystuje strzykawkę do wymieszania błękitu trypanu z zawiesiną komórkową, a następnie przepuszcza mieszaninę komórek z błękitem trypanu przez pole, które jest obrazowane i analizowane przez oprogramowanie. Oprogramowanie wykrywa komórki zabarwione błękitem trypanu, obrysowuje każdą komórkę okręgiem i wyznacza jej średnicę. Z każdej próbki gromadzonych jest 100 obrazów, na podstawie których określa się żywotność i rozmiary komórek. Próg detekcji zastosowanego tutaj licznika komórek ma dolną granicę 5 µm.</li>
	<li>Przenieś dane z każdego pomiaru do arkusza kalkulacyjnego w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Regularnie kalibruj urządzenie, używając 1 ml próbki kuleczek polistyrenowych o średnicy 6 µm i 8 µm. 
	UWAGA: Należy stosować rzeczywiste rozmiary kuleczek zmierzone przez producenta dla każdej partii, a nie rozmiary nominalne. Kuleczki 6 i 8 µm są wygodne, ponieważ średnice te są bliskie oczekiwanym średnicom spoczynkowych i aktywowanych limfocytów T (patrz Rysunek 1).</li>
</ol>
6. Analiza danych i statystyczna
<ol>
	<li>Przeanalizuj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego i graficznego. 
	UWAGA: Arkusz kalkulacyjny dla każdego pomiaru zawiera liczbę komórek o każdej średnicy (zakres: 5 µm do 70 µm). Komórki o średnicy powyżej 17 µm są usuwane z analizy, aby wykluczyć cząsteczki kurzu i małe pęcherzyki powietrza, które mogą zostać odczytane przez instrument jako żywe komórki.</li>
	<li>Przeprowadź weryfikację hipotez, stosując test t Welch’a dla zbiorów danych o nierównej wariancji; wyniki uznaje się za istotne statystycznie, jeśli p &lt; 0.001. Zastosowano następujący wzór: 
	<img alt="Wzór na test t dla dwóch prób; równanie do porównywania średnich próbek; narzędzie analizy statystycznej." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 1"> 
	 
	gdzie <img alt="Wartość średnia z indeksem dolnym 1; notacja statystyczna dla analizy." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 2"> i <img alt="Symbol średniej x-kreska z indeksem dolnym 2; reprezentacja statystyczna we wzorze." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 3"> to średnie próbek, <img alt="Wzór na równowagę statyczną, Σs₁²." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 4"> i <img alt="Równanie równowagi statycznej s^2/2, koncepcja matematyczna." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 5"> to wariancje próbek, a <img alt="Wzór na współczynnik załamania n1 sin θ1 = n2 sin θ2, schemat prawa optyki, badanie załamania światła." src="/files/ftp_upload/55212/55212eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 6"> i <img alt="Wzór na równowagę statyczną ΣF=0 schemat; analiza sił strukturalnych; zastosowanie edukacyjne" src="/files/ftp_upload/55212/55212eq7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Equation 7"> to wielkości próbek dla każdego zbioru danych. Liczbę stopni swobody oszacowano konserwatywnie, przyjmując mniejszą z dwóch wielkości próbek dla każdego porównania. Wykresy słupkowe przedstawiono jako średnią ± SEM.</li>
</ol>
7. Test proliferacji limfocytów T śledziony
<ol>
	<li>Zmierz proliferację limfocytów T za pomocą kolorymetrycznego testu proliferacji opartego na odczycie z czytnika płytek MTS lub MTT. 
	UWAGA: Test opiera się na redukcji związku tetrazoliowego MTS (odczynnika Owena) do rozpuszczalnego produktu formazanu, prawdopodobnie przez NADPH lub NADH wytwarzane w metabolicznie aktywnych komórkach przez enzymy dehydrogenazy.</li>
	<li>Policz oczyszczone limfocyty T za pomocą komory countingowej i zawieś je ponownie w pełnej pożywce RPMI-1640 do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml. 
	UWAGA: Na tym etapie do komórek można dodać 1 mM DTT.</li>
	<li>Aktywuj komórki za pomocą PMA i jonomycyny wraz z badanymi lekami, jeśli jest to wymagane, i delikatnie wymieszaj (podobnie jak w kroku 4).</li>
	<li>Przenieś 100 µl zawiesiny komórek do każdego dołka płytki 96-dołkowej przeznaczonej do hodowli komórkowej i inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 przez 48 hr. Do jednego dołka dodaj 100 µl pożywki RPMI-1640 bez komórek, aby uzyskać odczyt absorbancji tła.</li>
	<li>Dodaj 20 µl odczynnika opartego na MTS do każdego dołka i inkubuj w 37 °C przy 5% CO2 przez 4 hr.</li>
	<li>Wykonaj pomiary absorbancji przy 490 nm za pomocą czytnika płytek. Pomiary absorbancji odpowiadają liczbie metabolicznie aktywnych komórek w każdym dołku. 
	UWAGA: W razie potrzeby odejmij poziom tła. Wartości absorbancji tła zależą od rodzaju pożywki hodowlanej, surowicy, zewnętrznego pH oraz czasu ekspozycji odczynnika MTS na światło. Odczynniki oparte na MTS są światłoczułe, a ekspozycja na światło przez kilka godzin może skutkować wyższymi wartościami absorbancji tła.</li>
</ol>

<ol><li>Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeiss%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).</li>
<li>Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastogenic+response+of+purified+human+T-lymphocyte+populations+to+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV).</a> Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).</li>
<li>Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+murine+splenic+lymphocytes+to+concanavalin+A+and+to+co-stimulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator.</a> J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).</li>
<li>Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+induction+of+ion+channels+in+murine+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).</li>
<li>Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+cell+volume+of+human+blood+leucocytes+and+resident+and+activated+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages.</a> J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).</li>
<li>Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+lymphocyte+volume%3A+importance+of+reference+particle+deformability+and+counting+solution+tonicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity.</a> Blood. 57 (5), 894-899 (1981).</li>
<li>Cooper, H. L., Braverman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+resting+and+growth-stimulated+human+peripheral+lymphocytes.+Evidence+for+regulation+by+a+non-messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA.</a> Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).</li>
<li>Cooper, H. L., Braverman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+initiator+methionyl-tRNA+level+and+rate+of+protein+synthesis+during+human+lymphocyte+growth+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle.</a> J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).</li>
<li>Teague, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+changes+the+spectrum+but+not+the+diversity+of+genes+expressed+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).</li>
<li>Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+and+size+homeostasis+in+proliferating+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells.</a> Science. 325 (5937), 167-171 (2009).</li>
<li>Messele, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+techniques+for+measurement+of+in+vitro+T-cell+proliferation%3A+alternatives+to+the+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).</li>
<li>Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+cell+metabolic+colorimetric+assays+for+assessment+of+CD4%2B+T+cell+proliferation%3A+comparison+to+5-bromo-2-deoxyuridine+%28BrdU%29+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA.</a> J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).</li>
<li>Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MTT-assay+as+a+rapid+test+for+cell+proliferation+and+cell+killing%3A+application+to+human+peripheral+blood+lymphocytes+%28PBL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Allerg+Immunol+%28Leipz%29%22%5BJournal%5D)">The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL).</a> Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).</li>
<li>Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inaccuracies+in+MTS+assays%3A+major+distorting+effects+of+medium%2C+serum+albumin%2C+and+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids.</a> Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).</li>
<li>Rampersad, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+applications+of+Alamar+Blue+as+an+indicator+of+metabolic+function+and+cellular+health+in+cell+viability+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays.</a> Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).</li>
<li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li>
<li>Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ATP+production+in+whole+blood+and+lymphocyte+proliferation+in+response+to+phytohemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin.</a> J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).</li>
<li>Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+T-lymphocyte+responses+in+whole-blood+cultures+using+newly+synthesized+DNA+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).</li>
<li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+2007%3A+a+proliferation+of+probes+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lymphocyte+activation+and+proliferation+by+video+microscopy+and+digital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging.</a> Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).</li>
<li>Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+light+scatter+is+a+simple+measure+of+T-cell+activation+and+proliferation+but+is+not+universally+suited+for+doublet+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination.</a> Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).</li>
<li>Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+murine+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes.</a> Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).</li>
<li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+negative+enrichment+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li>
<li>Trickett, A., Kwan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+stimulation+and+expansion+using+anti-CD3%2FCD28+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads.</a> J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).</li>
<li>Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anti-CD3%2FCD28+mAb+coupled+magnetic+beads+permitting+subsequent+phenotypic+analysis+of+activated+human+T+cells+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).</li>
<li>Sigal, N. H., Dumont, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A%2C+FK-506%2C+and+rapamycin%3A+pharmacologic+probes+of+lymphocyte+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction.</a> Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).</li>
<li>Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+phosphatase+activity+in+T+lymphocytes+is+inhibited+by+FK+506+and+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).</li>
<li>Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+size+as+a+means+of+tracking+mTOR+activity+and+cell+fate+of+CD4%2B+T+Cells+upon+antigen+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition.</a> PLoS One. 10 (4), e0121710(2015).</li>
<li>Pollizzi, K. N., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cells+by+mTOR%3A+the+known+knowns+and+the+known+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns.</a> Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).</li>
<li>Mandala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+lymphocyte+trafficking+by+sphingosine-1-phosphate+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists.</a> Science. 296 (5566), 346-349 (2002).</li>
<li>Qin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+and+FTY720+are+potent+inhibitors+of+the+transient+receptor+potential+melastatin+7+%28TRPM7%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels.</a> Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).</li>
<li>Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+small-+and+intermediate-conductance+calcium-activated+potassium+channels+and+their+therapeutic+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications.</a> Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).</li>
<li>Petho, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-proliferative+effect+of+cation+channel+blockers+in+T+lymphocytes+depends+on+the+strength+of+mitogenic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation.</a> Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).</li>
<li>Wulff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+potent+and+selective+inhibitor+of+the+intermediate-conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+channel%2C+IKCa1%3A+a+potential+immunosuppressant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).</li>
<li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+cell+volume+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional significance of cell volume regulatory mechanisms.</a> Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).</li>
<li>Hue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+liver+carbohydrate+and+fatty+acid+metabolism+by+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume.</a> Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).</li>
<li>O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+aggregation+and+swelling+induced+by+chemotactic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents.</a> J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).</li>
<li>Hsu, L. S., Becker, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+changes+induced+in+rabbit+polymorphonuclear+leukocytes+by+chemotactic+factor+and+cytochalasin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B.</a> Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).</li>
<li>Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration-associated+volume+changes+in+neutrophils+facilitate+the+migratory+process+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro.</a> Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym miejscu opisujemy technikę szybkiego wykrywania i kwantyfikacji transformacji blastogennej komórek T przy użyciu automatycznego licznika komórek. W naszych warunkach (stymulacja jonomycyną 250 ng/ml PMA i 250 nM) powierzchnia komórki zwiększyła się dwukrotnie, a objętość trzykrotnie po 48 godzinach od aktywacji. Test jest wystarczająco czuły, aby wykryć wybuch w ciągu pierwszych 12 godzin aktywacji, gdzie objętość komórki wzrosła tylko 1,25-krotnie w porównaniu ze spoczynkiem (ryc. 2D). Bardziej fizjologicznie istotny mechanizm aktywacji limfocytów T przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem anty-CD3 i anty-CD28 wywołał znaczącą odpowiedź blastogeniczną, ze średnim 2,3-krotnym wzrostem objętości (72 godziny po aktywacji, ryc. 3D). Ludzkie komórki jednojądrzaste wykazały 2,6-krotną zmianę objętości po stymulacji PMA / jonomycyny przez 48 godzin (ryc. 4). Średnią średnicę i objętość mysich limfocytów T śledziony ICR określono odpowiednio na 6,9 μm i 1,9 x 10-4 nl. Ludzkie PBMC (od jednego zdrowego dawcy) miały średnią średnicę 7,7 μm i średnią objętość 2,7 x 10-4 nl. Korzystając z tego protokołu, przetestowaliśmy również rosnące stężenia PMA pod kątem ich zdolności do aktywacji limfocytów T. Te wyniki na pojedynczych komórkach były zgodne z testami proliferacji wykonanymi przy podobnych stężeniach PMA.
Przetestowano kilka związków, które według doniesień wpływają na proliferację komórek: FTY72031,32; leki immunosupresyjne cyklosporyna A, FK506 i rapamycyna27,28; i TRAM-34, bloker aktywowanych wapniem kanałów KCa3.133,35. Stwierdziliśmy, że w badanych stężeniach najsilniejszymi inhibitorami blastogenezy były CsA i FK506. Rapamycyna miała mniejszy, ale statystycznie istotny wpływ hamujący blastogenezę. Z drugiej strony TRAM-34 nie wpływał na blastogenezę.
CsA hamowało zarówno blastogenezę, jak i proliferację, ale nie całkowicie (Figura 2B i 2C), co pokazuje, że automatyczny pomiar licznika komórek jest dobrym korelatem skuteczności leku w proliferacji komórek T. W obecności rapamycyny wraz z CsA blastogeneza została całkowicie zahamowana, co sugeruje, że szlaki pośredniczone przez NFAT i mTOR w połączeniu mogą w pełni odpowiadać za powiększenie komórek T po mitogennej stymulacji PMA / jonomycyną (Figura 3C).
Zakres dynamiczny niektórych testów proliferacji jest ograniczony (zob. ryc. 2). Testy proliferacji, takie jak te, których użyliśmy (Figura 2C), zgłaszają sygnał, który obejmuje wkład komórek apoptotycznych i martwiczych. Zautomatyzowane pomiary zmiany średnicy nie mają tego ograniczenia, ponieważ pomiary dotyczą tylko żywotnych komórek. Żywotność komórek ocenia się poprzez wykluczenie barwienia błękitem trypanowym ze zdrowych, żywotnych komórek. W pomiarach wielkości użycie rozproszenia światła do przodu w cytometrii przepływowej może być problematyczne22. W pomiarach automatycznego licznika komórek nie stwierdzono populacji dubletowej (ryc. 1). Ponadto pomiar był wystarczająco dokładny, aby rozróżnić efekty cyklosporyny 100 i 200 nM (Tabela 1) i wykryć blastogenezę w ciągu 12 godzin od stymulacji mitogennej (Figura 2D).
Ten nowy test jest szczególnie przydatny w przypadku niewielkiej liczby próbek. W ciągu 1 godziny można zmierzyć do 15 próbek. Test ma jednak swoje ograniczenia, z których większość można złagodzić. Mimo że może skutecznie rozwiązać problem niewielkiej (<1 μm) różnicy w średnicy komórki, zastosowany przez nas model maszyny ma niższy próg wykrywania wynoszący 5 μm. Limit ten może powodować przeszacowanie bardzo małych rozmiarów komórek, ponieważ skutecznie wyklucza wszystkie komórki o mniejszych średnicach. Jednak nowsze modele licznika komórek mają progi detekcji na poziomie ~2 μm, co powinno złagodzić ten problem. Jeśli w próbce znajduje się zbyt dużo zanieczyszczeń, urządzenie traktuje je jako żywe komórki. Ponadto pęcherzyki powietrza mogą czasami dostać się do komory przepływowej i spowodować zniekształcenie obrazów komórek przechwyconych przez maszynę. Wydaje się, że zniekształcenie nie ma wpływu na określenie żywotności, ale może mieć wpływ na mierzone średnice. Dlatego zaleca się, aby wszystkie obrazy zostały sprawdzone przez eksperymentatora pod kątem pęcherzyków powietrza przed przyjęciem danych z każdej próby do analizy. Ponieważ oprogramowanie rysuje tylko okręgi wokół komórek, średnice komórek niesferycznych mogą być przekrzywione w kierunku długiej osi, co sprawia, że test jest mniej odpowiedni dla komórek niesferycznych.
Ten test jest szybki, trwa około 4 minut na próbkę, w porównaniu z testami proliferacji, które wymagają kilku godzin. Zbieranie danych jest również dość proste za pomocą oprogramowania dołączonego do urządzenia. Oprogramowanie może eksportować dane pomiarowe do arkusza kalkulacyjnego w celu analizy. Wreszcie, jest to pomiar jednokomórkowy, w przeciwieństwie do populacji; mierzona jest zarówno blastogeneza, jak i proliferacja; i jednocześnie rozróżnia komórki żywe i martwe. Może być stosowany do oceny różnych szczepów myszy pod kątem ich zdolności do wywoływania odpowiedzi immunologicznej. Test może być również z powodzeniem stosowany do pomiaru blastogenezy w limfocytach T od ludzkich dawców (ryc. 4), a także może być stosowany w innych typach komórek.
Wiadomo, że wzrost objętości komórek przyczynia się do regulacji metabolizmu: pęcznienie komórek stymuluje indukowaną glutaminą syntezę glikogenu i lipogenezę w hepatocytach36,37. Neutrofile wykazują wzrost objętości związany z migracją o 35-60%, podczas gdy czynniki chemotaktyczne wywołują 10-15% obrzęk38-40. Obecny test może być potencjalnie wykorzystany do badania tych procesów.

T limfocyty są głównymi komórkami odpowiedzialnymi za odporność adaptacyjną u ssaków. Wiadomo, że reagują one na specyficzne peptydy antygenowe prezentowane przez cząsteczki MHC na powierzchni komórek prezentujących antygen. Po aktywacji pokrewnego receptora limfocytów T (TCR) komórka powiększa się w procesie zwanym transformacją blastogenną lub blastogenezą. Proces ten jest wykrywalny w ciągu pierwszych ~6 godzin po zastosowaniu bodźca1. Podczas blastogenezy objętość poszczególnych limfocytów T zwiększa się od 2 do4-krotnie 2-6. Limfocyty zaczynają się namnażać w procesie zwanym ekspansją klonalną, którego celem jest wygenerowanie jak największej liczby klonów komórek zawierających TCR specyficznych dla antygenu. Komórki potomne następnie pełnią swoją funkcję immunologiczną, różnicując się w cytotoksyczne (CD8+) lub pomocnicze (CD4+) efektorowe limfocyty T. Tak więc naiwne limfocyty T we krwi ludzkiej lub mysiej znajdują się w fazie G0 (spoczynkowej) cyklu komórkowego i wspierają minimalną aktywność metaboliczną. Po ekspozycji na antygeny lub mitogeny limfocyty T ponownie wchodzą w cykl komórkowy, przy jednoczesnej stymulacji transkrypcji i syntezie białek7-10. Mitogeny, takie jak 12-mirystynian forbolu 13-octan (PMA) i jonomycyna stymulują limfocyty poprzez aktywację szlaków sygnałowych zależnych od kinazy białkowej C (PKC)i Ca2+ 1. Aktywacja limfocytów T za pomocą PMA/jonomycyny omija etapy sygnalizacji TCR.
Testy proliferacji in vitro są szeroko stosowane do oceny funkcji limfocytów i odpowiedzi na bodźce. Odczyty proliferacji są zwykle wykonywane od jednego do trzech dni po rozpoczęciu stymulacji limfocytów T i odzwierciedlają zbiorowy stan setek lub tysięcy komórek. Siłę działania różnych mitogenów i leków immunomodulujących in vitro można ocenić, po prostu mierząc tempo proliferacji w obecności tych związków. Niektóre z tych testów i ich ograniczenia omówiono poniżej.
Dla bezpośredniego zliczania numerów komórek, procedura jest czasochłonna, z dużym prawdopodobieństwem błędów operatora.
Dla syntezy DNA, test inkorporacji 3H-tymidyny mierzy syntezę DNA, ale jego głównym ograniczeniem jest radiotoksyczność. Nieradioaktywną alternatywą jest BrdU, ale zakres liniowej odpowiedzi na wzrost komórek jest ograniczony i wymagane jest leczenie przeciwciałami, co zwiększa liczbę etapów procedury11,12.
Dla aktywności metabolicznej, sole tetrazolowe (MTT, MTS, XTT i WST-1) oraz testy kolorymetryczne na bazie barwnika rezazuryny informują o ogólnym stanie metabolicznym dzielących się populacji komórek. Jednak MTT nie jest rozpuszczalny w pożywce hodowlanej, co wymaga dodatkowych etapów płukania, co powoduje błędy w pomiarze; XTT potrzebuje dodatkowych komponentów, aby skutecznie redukować; Na pomiary oparte na MTS, WST-1 i resazurynie ma wpływ pH pożywki hodowlanej i jej składników: surowicy, albuminy lub czerwieni fenolowej13-16. Testy te nie mierzą rzeczywistej liczby żywotnych komórek, ale raczej szacują połączoną aktywność enzymów. W związku z tym szybkość proliferacji może nie być dokładnie określona za pomocą testów metabolicznych ze względu na nieliniową korelację między liczbą komórek a redukcją barwnika12,17.
Do pomiaru stężenia ATP, wzrost ATP wywołany aktywacją limfocytów T koreluje z proliferacją. Jednak zwiększenie wewnątrzkomórkowego ATP jest jednym z początkowych etapów aktywacji limfocytów T; Wiele kroków w tyle jest faktyczna proliferacja17,18.
Do testu rozcieńczania barwnika, barwnik fluorescencyjny CFSE barwi komórki poprzez kowalencyjne wiązanie z białkami wewnątrzkomórkowymi. Barwnik wykazuje zależny od proliferacji spadek intensywności fluorescencji, który może śledzić liczbę podziałów komórkowych. Jednak ze względu na znakowanie białek kowalencyjnych funkcje tych białek mogą być zagrożone. Barwnik jest toksyczny dla komórek w wyższych stężeniach. Jednak przy niższych stężeniach barwnika początkowa intensywność fluorescencji jest zmniejszona, co zmniejsza liczbę podziałów komórkowych, które można śledzić. Dodatkowo, po znakowaniu za pomocą CFSE, następuje niezależna od proliferacji ~50% utrata początkowej fluorescencji w ciągu pierwszych 24 do 48 godzin, co ogranicza zakres dynamiczny tego testu19,20.
Większość tych testów odzwierciedla zbiorczy stan dużej liczby komórek i wymaga traktowania komórek barwnikami fluorescencyjnymi. Komórki martwicze i apoptotyczne mogą również przyczyniać się do tych pomiarów, chyba że zostaną usunięte z analizy przez barwienie chemikaliami lub przeciwciałami.
Blastogeneza limfocytów może być oceniana za pomocą różnych metod, takich jak mikroskopia optyczna czy cytometria przepływowa4,21,22. W tym miejscu opisujemy szybką metodę pomiaru rozmiarów komórek T za pomocą automatycznego licznika komórek, który zbiera obrazy komórek w czasie rzeczywistym, które są przechowywane i mogą być ponownie analizowane w późniejszym czasie. Oprócz pomiarów wielkości, urządzenie to zapewnia dokładną liczbę komórek i procent żywotnych komórek, zgodnie z wykluczeniem trypanowego niebieskiego barwnika. Urządzenie użyte w tym protokole jest dostępne na rynku, a producent przetestował precyzję przyrządu przy użyciu trzech różnych przyrządów i kilku kontroli koncentracji i żywotności. Wyniki tych badań wykazały współczynnik wariancji, który wynosił na ogół poniżej 6%. Jak zaznaczono w protokole, urządzenie jest regularnie kalibrowane za pomocą kulek polistyrenowych o średnicy 6 μm i 8 μm. Zaletą stosowania licznika komórek do różnicowania spoczynkowych limfocytów T i limfoblastów T na podstawie średnicy komórki jest łatwość użycia i zautomatyzowany charakter analizy. Oprogramowanie jest w stanie narysować okrąg wokół każdej komórki i obliczyć średnicę komórki. Dodatkowo obrazy są widoczne dla operatora, który może zweryfikować dokładność instrumentu w identyfikacji komórek i prawidłowym narysowaniu okręgu wokół nich. Jeśli chodzi o ograniczenia, instrument sam w sobie nie jest w stanie odróżnić szczątków od komórek; Dlatego ważne jest, aby operator oglądał każdy obraz w trakcie jego przetwarzania. Istnieje możliwość włączenia pęcherzyków powietrza, co zmniejszy liczbę użytecznych pól do analizy; Zdarza się to jednak rzadko, jeśli wykonywana jest regularna konserwacja spłukiwania.
W tym badaniu, grupy limfocytów T śledziony były stymulowane jonomycyną i zwiększały stężenie PMA przez 12-48 godzin. Stężenia PMA tak niskie jak 2 ng/ml indukowały zarówno silną odpowiedź blastogeniczną, jak i znaczną proliferację. Pomiary wpływu kilku leków, takich jak leki immunosupresyjne cyklosporyna A (CsA), FK506 (takrolimus) i rapamycyna (syrolimus), a także blokery kanałów jonowych TRAM-34 i FTY720 (fingolimod), na blastogenezę wykazały dobrą zgodność z raportowanym wpływem na proliferację. Mierzono również odpowiedź blastogenną ludzkich PBMC na PMA/jonomycynę i stymulację mysich komórek T kulkami magnetycznymi pokrytymi przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28.
Test licznika komórkowego określa ilościowo zarówno blastogenezę, jak i szybkość proliferacji (gęstość komórki) jednocześnie, ale oddzielnie, w przeciwieństwie do wyżej wymienionych metod, które analizują kombinację tych efektów. Przedstawiony protokół zapewnia szybką i solidną technikę oceny siły działania środków mitogennych i immunomodulujących.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M Nylonowe sitka komórkowe&nbsp;</td><td>Kolumny z</td><td></td> włókna wełnianego nylonowego Thermo Fisher Scientific 22363547 <td></td></tr><tr><td></td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml&nbsp;</td><td>The Lab Depot</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki poddane działaniu kultur komórkowych</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki poddane hodowli komórkowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek&nbsp;</td><td>Test na bazie Promega</td><td>G3582</td><td>MTS</td></tr><tr><td>Cyklosporyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mysz T-Aktywator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-mirystynian 13-octan (PMA)&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>356150010</tr><tr><td>Sól wapniowa jonomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals&nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>100x w magazynie</td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>10x kolba</td></tr><tr><td>1,4-ditiotreitol (DTT)&nbsp;</td><td>Research Products International</td><td>12/3/3483</td><td>środek redukujący</td></tr><tr><td>8 i mikro; M Wielkość mikrocząstek Standard&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84192-5ML-F</td><td>Rzeczywisty&nbsp; 8.02 &mikro; m</td></tr><tr><td>6 i mikro; M Wielkość mikrocząstek Standard&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89756-5ML-F</td><td>Rzeczywisty 6.084 &mikro; </td></tr><tr><td>m Pojedynczy magnetyczny stojak separacyjny do probówki 1,5 - 2 ml</td><td>V& P Naukowy, Inc.</td><td></td><td></td>VP772F5</tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td>Czytnik hybrydowy <td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1&nbsp;</td><td>Analizator żywotności komórek Vi-CELL Bio Tek</td><td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Redlica Beckman</td><td>731050</td><td></td></tr></tbody></table>

szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach t w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Proliferacja limfocytów w odpowiedzi na stymulację antygenową lub mitogenną jest łatwo mierzalnym zjawiskiem, przydatnym do testowania immunomodulujących (tj. immunosupresyjnych lub immunostymulujących) związków chemicznych i leków biologicznych. Jednym z najwcześniejszych etapów mitogenezy jest powiększenie komórki lub transformacja blastogenna, po której objętość komórki wzrasta przed podziałem. Zwykle jest wykrywalny w ciągu pierwszych kilku godzin stymulacji limfocytów T. W tym miejscu opisujemy szybką metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T wyizolowanych ze śledziony myszy i ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) przy użyciu automatycznego licznika komórek. Różne powszechnie stosowane testy proliferacji są w większości pracochłonne i odzwierciedlają tylko ogólny efekt populacji, a nie indywidualne efekty komórkowe w populacji. W przeciwieństwie do tego, prezentowany zautomatyzowany test licznika komórek zapewnia szybkie, bezpośrednie i precyzyjne pomiary średnic komórek, które można wykorzystać do oceny skuteczności różnych mitogenów i leków immunomodulujących in vitro.

Wykorzystaliśmy ten test do porównania tworzenia blastów limfocytów podczas stymulacji PMA (estrem forbolu) oraz ionomycyną (ionoforem wapnia). Rycina 1A przedstawia rozkład częstości średnic spoczynkowych i farmakologicznie aktywowanych limfocytów T śledziony. Traktowanie komórek PMA/ionomycyną przez ok. 2 dni spowodowało znaczne przesunięcie mediany rozkładu w stronę większych średnic (patrz np. referencja4). Liczba komórek o mniejszych średnicach uległa w konsekwencji zmniejszeniu. Aby upewnić się, że urządzenie podaje prawidłowe średnice, przeprowadziliśmy dwie kalibracje z użyciem kulek polistyrenowych o średnicach 6 µm i 8 µm (patrz Materiały Tabela). Ryciny 1B i 1C pokazują odczyty z aktywowanych limfocytów T nałożone na standard 8 µm oraz spoczynkowych limfocytów T nałożone na standard 6 µm. Rycina 1D przedstawia rozmiary kulek kontrolnych podane przez producenta w zestawieniu z medianami średnic zmierzonymi za pomocą naszego automatycznego licznika komórek. Wydawało się, że rozmiar 6 µm został w naszych pomiarach lekko zawyżony, prawdopodobnie ze względu na to, że próg pomiarowy instrumentu posiada dolną granicę wynoszącą 5 µm. Jednak odchylenie standardowe średnic kulek obliczone na podstawie pomiarów licznika komórek było zgodne z odchyleniem standardowym podanym przez producenta. Z tych eksperymentów wnioskujemy, że urządzenie to może być niezawodnie stosowane do porównywania rozmiarów spoczynkowych i stymulowanych mitogenem limfocytów T myszy oraz że urządzenie potrafi dokładnie mierzyć rzeczywiste średnice komórek.
Następnie przystąpiono do badania zależności średniego przyrostu średnicy od stężenia PMA i stwierdzono, że przy stałym stężeniu jonomycyny wynoszącym 250 nM, efekt PMA nie uległ istotnej zmianie po zwiększeniu jego stężenia z 2 do 250 ng/ml (Rysunek 2A). Z wykorzystaniem testu opartego na MTS zmierzono proliferację limfocytów T przy stężeniach PMA wynoszących 50 i 250 ng/ml i nie stwierdzono znaczących różnic (Rysunek 2C), co było zgodne z danymi dotyczącymi średnicy komórek. Inhibitory kalcyneuryny, cyklosporyna A (300 nM) i FK506 (1 nM), hamowały zarówno blastogenezę (Rysunek 2B), jak i proliferację (Rysunek 2C). W obu przypadkach hamowanie nie było jednak całkowite. Pomiary wykonane 12 h po dodaniu PMA/jonomycyny wykazały wzrost średnicy o 7,2% i 6,8% odpowiednio dla 50 ng/ml i 250 ng/ml PMA (Rysunek 2D). Przyrosty rozmiaru przy tych dwóch stężeniach nie różniły się istotnie, podobnie jak w przypadku stymulacji trwającej 48 h (por. Rysunek 2A).
Dane dotyczące średnicy komórek zebrane z nieaktywowanych i aktywowanych limfocytów T po 48 hr stymulacji PMA/ionomycyną zostały zestawione w Tabeli 1. Średnia powierzchnia i objętość nieaktywowanych limfocytów T śledziony myszy ICR wynosiły odpowiednio 151.4 µm2 oraz 1.9 x 10-4 nl. Średnia powierzchnia i objętość aktywowanych limfocytów T wynosiły odpowiednio 300.6 µm2 oraz 5.9 x 10-4 nl. Całkowity średni wzrost średnicy dla wszystkich aktywowanych komórek wyniósł 40.92% (Tabela 1).
Przetestowaliśmy również inne związki chemiczne, o których raportowano, że wykazują działanie immunosupresyjne: CsA, FK506, rapamycynę, FTY720 oraz TRAM-34. Na Ryc. 3 przedstawiono pomiary wielkości komórek uzyskane dla spoczynkowych i aktywowanych limfocytów T w obecności i w nieobecności tych leków. CsA i FK506, które celują w zależny od kalcyneuryny czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T (NFAT)27,28, były najsilniejszymi inhibitorami, hamując odpowiedź blastogeniczną o niemal 72% (Ryc. 3A i 3B). Co ciekawe, wraz ze wzrostem stężeń PMA skuteczność CsA i FK506 nieznacznie spadła, mimo że w nieobecności tych leków nie odnotowano dalszego wzrostu średnicy komórek (Ryc. 2A i 2B). Rapamycyna, immunosupresant hamujący białko mTOR (mammalian target of rapamycin)29,30, wykazała umiarkowany, ale statystycznie istotny efekt (Ryc. 3A, 3B i 3C). FTY720 jest agonistą receptora sfingozyny-1-fosforanu, który hamuje migrację limfocytów do krążenia31, a ostatnio stwierdzono, że hamuje on również TRPM7, kanał kationowy silnie wyrażany w limfocytach T32. Zarówno FTY720, jak i rapamycyna miały porównywalny wpływ na blastogenezę, redukując średni wzrost średnicy z 52% do około 34% (Ryc. 3A i 3B). TRAM-34 jest blokerem aktywowanego wapniem kanału potasowego KCa3.133. W stężeniu 700 nM TRAM-34 okazał się nieskuteczny w mysich limfocytach T, co jest zgodne z niedawnym badaniem proliferacji ludzkich limfocytów T; jego skuteczność może zależeć od rodzaju i siły stymulacji mitogennej34 (Ryc. 3A i 3B). TRAM-34 w stężeniu 700 nM był skuteczny w blokowaniu kanałów KCa3.1 w naszych eksperymentach elektrofizjologicznych metodą patch-clamp (dane nie pokazano). Porównanie to przeprowadzono między komórkami spoczynkowymi a komórkami eksponowanymi na leki w wielu próbach w ramach tego samego eksperymentu po 48 hr. Przy jednoczesnym zastosowaniu rapamycyny i CsA blastogeneza została całkowicie zahamowana (Ryc. 3C).
Aktywacja mysich limfocytów T za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami anty-CD3/anty-CD28 przez 72 h spowodowała 27% wzrost średnicy, który w obecności CsA został zredukowany do 5% (Rysunek 3D). W przypadku ludzkich komórek mononuklearnych aktywacja PMA/ionomycyną przez 48 h spowodowała wzrost średnicy o 33%, a aktywacja w obecności CsA zmniejszyła tę odpowiedź do 23% (Rysunek 4).
<img alt="Wykresy rozkładu średnic komórek porównujące komórki spoczynkowe i aktywowane oraz limfocyty T CR i kuleczki." src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Rozkłady częstości średnic limfocytów T z śledziony mysiej. (A) Czarne kolumny oznaczają komórki spoczynkowe, a czerwone kolumny komórki aktywowane PMA/ionomycyną (48 h). (B) Rozkłady aktywowanych limfocytów T ze śledziony naniesione na wzorzec kalibracyjny wielkości cząstek 8 µm. (C) Rozkłady limfocytów T w stanie spoczynku naniesione na wzorzec kalibracyjny 6 µm. Liczba użytych komórek i kuleczek jest podana w ramkach. (D) Mediana średnicy zmierzonej za pomocą licznika komórek wykreślona w funkcji średnicy kuleczek podanej przez producenta. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy przedstawiające średnicę i absorbancję w odpowiedzi na różne stężenia PMA." src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Zależność aktywacji limfocytów T myszy od stężenia PMA. (A) Średnice limfocytów T niepoddanych działaniu PMA lub traktowanych PMA w stężeniach 2, 50 i 250 ng/ml przy stałym stężeniu jonomycyny (250 nM). (B) Pomiary licznikiem komórek dla spoczywających i aktywowanych (2, 50, 250 ng/ml PMA) limfocytów T w obecności i w nieobecności 300 nM CsA lub 1 nM FK506. (C) Test proliferacji MTS przy stężeniach 50 i 250 ng/ml PMA z dodatkiem 250 nM jonomycyny w obecności i w nieobecności 300 nM CsA. Istotne różnice (p &lt; 0.001) oznaczono gwiazdkami. n oznacza całkowitą liczbę prób. Dane pochodzą z komórek izolowanych od 3 myszy. (D) Średnice spoczywających i aktywowanych limfocytów T (250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny) 12 h po aktywacji w obecności i w nieobecności 300 nM CsA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza wykresu słupkowego wzrostu komórek; warunki: aktywowane/spoczynkowe; zmienne: CAA, rapamycyna, TRAM-34." src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wpływ CsA, FK506, FTY720, rapamycyny i TRAM-34 na wielkość komórek. (A i C) Średnice spoczynkowych i aktywowanych PMA/ionomycyną mysich limfocytów T w obecności i w nieobecności leków. Stężenia podano w ramce. (B) Dane z panelu A przedstawione jako procentowy wzrost w stosunku do średnicy spoczynkowego limfocytu T. Aktywację limfocytów przeprowadzono przy użyciu 250 ng/ml PMA i 250 nM ionomycyny, a pomiary wykonano po 48 hr. (D) Pomiary licznikiem komórek dla spoczynkowych i aktywowanych anty-CD3/CD28 limfocytów T, 72 hr po aktywacji w obecności i nieobecności 300 nM CsA. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żywotność komórek w stosunku do rozkładu średnic; wykres słupkowy przedstawia zmienność rozmiarów w zależności od warunków." src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Blastogeneza w ludzkich PBMC po stymulacji mitogenami. (A) Czarne słupki oznaczają PBMC w stanie spoczynku, a czerwone słupki aktywowane PBMC. (B) Średnie średnice PBMC w stanie spoczynku i aktywowanych, w obecności i przy braku 300 nM CsA. Komórki aktywowano za pomocą 250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny, a pomiary wykonano po 48 hr aktywacji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Kolumna1</td >
			<td >Spoczywające</td >
			<td >Aktywowane</td >
			<td >CsA 100 nM</td >
			<td >CsA 200 nM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średnica średnia</td >
			<td >6.94 µm</td >
			<td >9.78 µm</td >
			<td >8.19 µm</td >
			<td >7.92 µm</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średni wzrost średnicy</td >
			<td></td >
			<td >40.92%</td >
			<td >17.88%</td >
			<td >14.09%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Powierzchnia średnia</td >
			<td >151.37 µm²</td >
			<td >300.61 µm²</td >
			<td >210.56 µm²</td >
			<td >197.22 µm²</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Średni wzrost powierzchni</td >
			<td></td >
			<td >98.59%</td >
			<td >39.00%</td >
			<td >30.16%</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Podsumowanie średnicy komórek oraz względnych przyrostów powierzchni. Pomiary wykonano 48 h po aktywacji za pomocą 250 ng/ml PMA i 250 nM jonomycyny.

Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.

Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena potencji leków immunomodulujących przy użyciu automatycznego licznika komórek poprzez pomiar blastogenezy lub transformacji blastycznej limfocytów T. Analiza ta stanowi szybką metodę ilościowego określania aktywacji limfocytów T z wykorzystaniem automatycznego licznika komórek wyposażonego w funkcję pomiaru średnicy komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego, prostego i bezpośredniego pomiaru w pojedynczych komórkach, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych testów proliferacji limfocytów T.Traktowanie limfocytów lekami immunomodulującymi spowoduje zwiększenie lub zmniejszenie szybkości i zakresu blastogenezy komórkowej. Przy użyciu analizy licznika komórek zakres tej blastogenezy można zmierzyć w ciągu około czterech minut na próbkę. W ciągu dziesięciu minut od uśmiercenia zwierzęcia spryskać brzuch myszy 70% etanolem i za pomocą nożyczek wykonać nacięcie w futrze i skórze po lewej stronie zwierzęcia.Rozchyl skórę i odsuń ją, aby odsłonić otrzewną. Następnie nałóż 4% chlorheksydynę w miejscu ncięcia. Używając drugiej pary nożyczek i pincety, wykonaj nacięcie o długości 2–3 cm wzdłuż środkowej części brzucha, aby otworzyć otrzewną.Następnie należy usunąć przykrepy trzewne oraz nadmiar tłuszczu otaczającego śledzionę i przenieść tkankę do naczynia z DPBS. Dalej, do 10 cm płytki hodowlanej należy dodać 10 ml kompletnego medium RPMI 1640 i rozgnieść śledziony pomiędzy dwiema sterylizowanymi matowymi szkiełkami przedmiotowymi. Zawiesinę tkankową należy przefiltrować przez sterylne nylonowe sito komórkowe o oczkach 40 µm do nowej 10 cm płytki hodowlanej w celu usunięcia tkanek łącznych i zanieczyszczeń, a następnie przenieść zawiesinę pojedynczych komórek do 50 ml probówki stożkowej do wirowania.Resuspenduj osad w 20 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej przy łagodnym kołysaniu, zbierz komórki poprzez ponowne wirowanie i resuspenduj osad w dziesięciu mililitrach świeżej pożywki. Następnie ponownie odwirowuj komórki, aby resuspendować je w dwóch mililitrach kompletnej pożywki o temperaturze 37 °C.Aby oczyścić limfocy T, należy najpierw dwukrotnie przemyć jedną lub dwie kolumny z wełny nylonowej na każdą śledzionę przy użyciu 5 mL pełnego medium RPMI, a następnie umieścić kolumny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji na górną część każdej kolumny należy nanieść 2 mL zawiesiny wyizolowanych splenocytów i pozwolić komórkom przejść przez kolumnę, aż ciecz osiągnie górną krawędź wełny. Następnie na górną część kolumn należy dodać 2 mL świeżego, podgrzanego do 37 °C pełnego medium i pozwolić mu przeniknąć przez wełnę nylonową, aż ciecz na górze kolumny osiągnie poziom wełny.Następnie przykryj wełnę trzema mililitrami kompletnego medium o temperaturze 37 °C i umieść kolumnę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek, aby wszystkie limfocyty B, fibroblasty i komórki akcesoryjne przywarły do włókien wełny. Po godzinie, w nowej probówce stożkowej o pojemności 50 ml, przemyj kolumnę dwukrotnie pięcioma mililitrami świeżego kompletnego medium, aby wypłukać nieprzylegające limfocyty T. Następnie odwirowaj komórki w celu ich zebrania.Po jednokrotnym przemyciu limfocytów T dziesięcioma mililitrami pełnej pożywki, zawiesić osad w dwóch mililitrach świeżej pełnej pożywki. Następnie należy policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 0,5 × 10⁶ komórek na mililitr w świeżej pełnej pożywce, aby wysiać je na 6- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowych, zależnie od wymagań eksperymentalnych. W ciągu 24 godzin od izolacji aktywować limfocyty T wyizolowane kolumną z wełny nylonowej za pomocą odpowiedniego stymulatora oraz badanego leku eksperymentalnego.Po 12 do 72 godzinach należy użyć pipety o objętości 1 ml, aby delikatnie wymieszać aktywowane komórki poddane działaniu preparatu i rozbić wszelkie skupiska. W celu pomiaru średnic komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, należy przenieść 1 ml komórek z każdej studzienki do oddzielnych kubków na próbki, a następnie umieścić kubki w karuzeli próbek automatycznego licznika komórek. Należy wprowadzić identyfikator próbki oraz informacje o typie komórek, aby zarejestrować próbki i rozpocząć ich analizę.Po zmieszaniu błękitu trypanowego z zawiesiną komórkową, komórki są przesuwane przez pole obrazowania, aż do momentu zgromadzenia obrazów około 100 komórek z każdej próbki. Oprogramowanie rysuje okrąg wokół każdej wykrytej komórki zabarwionej i niezabarwionej błękitem trypanowym w celu wyznaczenia średnicy komórki. Po pomiarze wszystkich komórek dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, który przedstawia wyniki w postaci całkowitej oraz żywej liczby komórek dla każdej zmierzonej średnicy.Dane można następnie przedstawić w formie histogramów. Po dwóch dniach stymulacji PMA i jonomycyną obserwuje się istotne przesunięcie mediany rozkładu częstości w stronę większych średnic komórek, przy odpowiadającym temu spadku liczby limfocytów T o mniejszych średnicach. Przy stałym stężeniu jonomycyny wynoszącym 250 nanomolar, efekt PMA nie zmienia się istotnie po zwiększeniu stężenia bodźca aktywującego z dwóch do 250 nanogramów na mililitr.Nie zaobserwowano również istotnej różnicy w proliferacji limfocytów T. Leki będące inhibitorami kalcyneuryny częściowo hamują zarówno blastogenezę, jak i proliferację limfocytów T. Leczenie limfocytów T związkami immunosupresyjnymi, które celują w kalcyneurynowy czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T, hamuje odpowiedź blastogenną o prawie 72%.Rapamycyna i FTY720 wykazują umiarkowany, ale statystycznie istotny wpływ na blastogenezę. Natomiast TRAM34 najwyraźniej nie wpływa na proliferację limfocytów T myszy, nawet w stężeniach 700 nanomolar. W przypadku jednoczesnego zastosowania rapamycyny i cyklosporyny A, blastogeneza zostaje całkowicie zahamowana.Podobne wyniki obserwuje się w przypadku mysich limfocytów T aktywowanych za pomocą magnetycznych kulek sprzężonych z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Analizę tę można z powodzeniem wykorzystać do ilościowego określenia wpływu różnych leków immunomodulujących, co pozwala na lepszą ocenę ich potencji w porównaniu z typowymi testami proliferacji, które uwzględniają również wpływ komórek apoptotycznych i nekrotycznych. Dzięki tej metodzie można zmierzyć do 15 próbek w trybie wejściowym i wyjściowym, co umożliwia jednoczesne i następujące po sobie ilościowe określenie tempa blastogenezy oraz proliferacji.Sporadycznie do celi przepływowej mogą dostać się pęcherzyki powietrza, co sprawia, że pomiar staje się bezużyteczny; dlatego przed zaakceptowaniem danych z każdej próby do analizy należy sprawdzić wszystkie obrazy pod kątem obecności pęcherzyków powietrza. Jednym z ograniczeń tej procedury jest to, że przy zbyt dużej ilości zanieczyszczeń w próbce, pomiar może zinterpretować te zanieczyszczenia jako żywe komórki. Po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji badanie to może zostać dostosowane do analizy zmian wielkości komórek neutrofilów i hepatocytów.

rapid-quantification-mitogen-induced-blastogenesis-t-lymphocytes-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Nowatorskie generacje testów funkcjonalnych, takich jak interferon gamma (IFN-γ) ELISpot, które wykrywają produkcję cytokin na poziomie pojedynczej komórki i zapewniają zarówno ilościową, jak i jakościową charakterystykę odpowiedzi limfocytów T, mogą być używane do oceny komórkowych odpowiedzi immunologicznych skierowanych przeciwko wirusowi ospy wietrznej i półpaśca (VZV).

Opracowanie testu ELISpot IFN-γ do oceny odporności komórkowej specyficznej dla wirusa ospy wietrznej i półpaśca po przeszczepieniu krwi pępowinowej

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy protokół do określenia in vivo aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 naiwnych komórek T CD4 (limfocytów T) indukowanych przez komórki dendrytyczne (DC) pochodzące ze szpiku kostnego GM-CSF. Ponadto protokół ten opisuje izolację komórek BM i T, wytwarzanie prądu stałego oraz transfer adoptywny komórek DC i T.

Mysi model in vivo do pomiaru naiwnej aktywacji, proliferacji i różnicowania Th1 limfocytów T CD4 indukowanych przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Bioenergetyka limfocytów T CD8 może być badana za pomocą testu stresu Mito. Metodologia ta może być wykorzystana do badania ostrego i przewlekłego programowania metabolicznego. Protokół ten opisuje podejścia do badania relacji między biologią receptora komórek T a analizą bioenergetyczną.

Pomiar funkcji mitochondrialnej naiwnych i efektorowych limfocytów T CD8

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj szybką metodę kwantyfikacji blastogenezy limfocytów T za pomocą automatycznego licznika komórek w celu oceny leków immunomodulujących. Technika ta pozwala na bezpośredni pomiar aktywacji pojedynczych komórek.

Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Przeglądaj więcej filmów