Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących

Ogólnym celem tej procedury jest ocena potencji leków immunomodulujących przy użyciu automatycznego licznika komórek poprzez pomiar blastogenezy lub transformacji blastycznej limfocytów T. Analiza ta stanowi szybką metodę ilościowego określania aktywacji limfocytów T z wykorzystaniem automatycznego licznika komórek wyposażonego w funkcję pomiaru średnicy komórek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego, prostego i bezpośredniego pomiaru w pojedynczych komórkach, w przeciwieństwie do powszechnie stosowanych testów proliferacji limfocytów T.

Traktowanie limfocytów lekami immunomodulującymi spowoduje zwiększenie lub zmniejszenie szybkości i zakresu blastogenezy komórkowej. Przy użyciu analizy licznika komórek zakres tej blastogenezy można zmierzyć w ciągu około czterech minut na próbkę. W ciągu dziesięciu minut od uśmiercenia zwierzęcia spryskać brzuch myszy 70% etanolem i za pomocą nożyczek wykonać nacięcie w futrze i skórze po lewej stronie zwierzęcia.

Rozchyl skórę i odsuń ją, aby odsłonić otrzewną. Następnie nałóż 4% chlorheksydynę w miejscu ncięcia. Używając drugiej pary nożyczek i pincety, wykonaj nacięcie o długości 2–3 cm wzdłuż środkowej części brzucha, aby otworzyć otrzewną.

Następnie należy usunąć przykrepy trzewne oraz nadmiar tłuszczu otaczającego śledzionę i przenieść tkankę do naczynia z DPBS. Dalej, do 10 cm płytki hodowlanej należy dodać 10 ml kompletnego medium RPMI 1640 i rozgnieść śledziony pomiędzy dwiema sterylizowanymi matowymi szkiełkami przedmiotowymi. Zawiesinę tkankową należy przefiltrować przez sterylne nylonowe sito komórkowe o oczkach 40 µm do nowej 10 cm płytki hodowlanej w celu usunięcia tkanek łącznych i zanieczyszczeń, a następnie przenieść zawiesinę pojedynczych komórek do 50 ml probówki stożkowej do wirowania.

Resuspenduj osad w 20 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej przy łagodnym kołysaniu, zbierz komórki poprzez ponowne wirowanie i resuspenduj osad w dziesięciu mililitrach świeżej pożywki. Następnie ponownie odwirowuj komórki, aby resuspendować je w dwóch mililitrach kompletnej pożywki o temperaturze 37 °C.

Aby oczyścić limfocy T, należy najpierw dwukrotnie przemyć jedną lub dwie kolumny z wełny nylonowej na każdą śledzionę przy użyciu 5 mL pełnego medium RPMI, a następnie umieścić kolumny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 na jedną godzinę. Po zakończeniu inkubacji na górną część każdej kolumny należy nanieść 2 mL zawiesiny wyizolowanych splenocytów i pozwolić komórkom przejść przez kolumnę, aż ciecz osiągnie górną krawędź wełny. Następnie na górną część kolumn należy dodać 2 mL świeżego, podgrzanego do 37 °C pełnego medium i pozwolić mu przeniknąć przez wełnę nylonową, aż ciecz na górze kolumny osiągnie poziom wełny.

Następnie przykryj wełnę trzema mililitrami kompletnego medium o temperaturze 37 °C i umieść kolumnę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórek, aby wszystkie limfocyty B, fibroblasty i komórki akcesoryjne przywarły do włókien wełny. Po godzinie, w nowej probówce stożkowej o pojemności 50 ml, przemyj kolumnę dwukrotnie pięcioma mililitrami świeżego kompletnego medium, aby wypłukać nieprzylegające limfocyty T. Następnie odwirowaj komórki w celu ich zebrania.

Po jednokrotnym przemyciu limfocytów T dziesięcioma mililitrami pełnej pożywki, zawiesić osad w dwóch mililitrach świeżej pełnej pożywki. Następnie należy policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 0,5 × 10⁶ komórek na mililitr w świeżej pełnej pożywce, aby wysiać je na 6- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowych, zależnie od wymagań eksperymentalnych. W ciągu 24 godzin od izolacji aktywować limfocyty T wyizolowane kolumną z wełny nylonowej za pomocą odpowiedniego stymulatora oraz badanego leku eksperymentalnego.

Po 12 do 72 godzinach należy użyć pipety o objętości 1 ml, aby delikatnie wymieszać aktywowane komórki poddane działaniu preparatu i rozbić wszelkie skupiska. W celu pomiaru średnic komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, należy przenieść 1 ml komórek z każdej studzienki do oddzielnych kubków na próbki, a następnie umieścić kubki w karuzeli próbek automatycznego licznika komórek. Należy wprowadzić identyfikator próbki oraz informacje o typie komórek, aby zarejestrować próbki i rozpocząć ich analizę.

Po zmieszaniu błękitu trypanowego z zawiesiną komórkową, komórki są przesuwane przez pole obrazowania, aż do momentu zgromadzenia obrazów około 100 komórek z każdej próbki. Oprogramowanie rysuje okrąg wokół każdej wykrytej komórki zabarwionej i niezabarwionej błękitem trypanowym w celu wyznaczenia średnicy komórki. Po pomiarze wszystkich komórek dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, który przedstawia wyniki w postaci całkowitej oraz żywej liczby komórek dla każdej zmierzonej średnicy.

Dane można następnie przedstawić w formie histogramów. Po dwóch dniach stymulacji PMA i jonomycyną obserwuje się istotne przesunięcie mediany rozkładu częstości w stronę większych średnic komórek, przy odpowiadającym temu spadku liczby limfocytów T o mniejszych średnicach. Przy stałym stężeniu jonomycyny wynoszącym 250 nanomolar, efekt PMA nie zmienia się istotnie po zwiększeniu stężenia bodźca aktywującego z dwóch do 250 nanogramów na mililitr.

Nie zaobserwowano również istotnej różnicy w proliferacji limfocytów T. Leki będące inhibitorami kalcyneuryny częściowo hamują zarówno blastogenezę, jak i proliferację limfocytów T. Leczenie limfocytów T związkami immunosupresyjnymi, które celują w kalcyneurynowy czynnik jądrowy aktywowanych limfocytów T, hamuje odpowiedź blastogenną o prawie 72%.

Rapamycyna i FTY720 wykazują umiarkowany, ale statystycznie istotny wpływ na blastogenezę. Natomiast TRAM34 najwyraźniej nie wpływa na proliferację limfocytów T myszy, nawet w stężeniach 700 nanomolar. W przypadku jednoczesnego zastosowania rapamycyny i cyklosporyny A, blastogeneza zostaje całkowicie zahamowana.

Podobne wyniki obserwuje się w przypadku mysich limfocytów T aktywowanych za pomocą magnetycznych kulek sprzężonych z przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28. Analizę tę można z powodzeniem wykorzystać do ilościowego określenia wpływu różnych leków immunomodulujących, co pozwala na lepszą ocenę ich potencji w porównaniu z typowymi testami proliferacji, które uwzględniają również wpływ komórek apoptotycznych i nekrotycznych. Dzięki tej metodzie można zmierzyć do 15 próbek w trybie wejściowym i wyjściowym, co umożliwia jednoczesne i następujące po sobie ilościowe określenie tempa blastogenezy oraz proliferacji.

Sporadycznie do celi przepływowej mogą dostać się pęcherzyki powietrza, co sprawia, że pomiar staje się bezużyteczny; dlatego przed zaakceptowaniem danych z każdej próby do analizy należy sprawdzić wszystkie obrazy pod kątem obecności pęcherzyków powietrza. Jednym z ograniczeń tej procedury jest to, że przy zbyt dużej ilości zanieczyszczeń w próbce, pomiar może zinterpretować te zanieczyszczenia jako żywe komórki. Po wprowadzeniu odpowiednich modyfikacji badanie to może zostać dostosowane do analizy zmian wielkości komórek neutrofilów i hepatocytów.