Szybka kwantyfikacja blastogenezy indukowanej mitogenem w limfocytach T w celu identyfikacji leków immunomodulujących
27 grudnia 2016
Mitogeneza limfocytów T towarzyszy transformacji blastogennej, po której objętość komórki zwiększa się przed podziałem komórki. W tym miejscu opisujemy metodę ilościowego określania blastogenezy w limfocytach T przy użyciu automatycznego licznika komórek z możliwością pomiaru średnic komórek.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena siły działania leków immunomodulujących przy użyciu automatycznego licznika komórek poprzez pomiar blastogenezy limfocytów T lub transformacji blastyzmu. Test ten zapewnia szybką metodę ilościowego określania aktywacji limfocytów T przy użyciu automatycznego licznika komórek, który jest wyposażony w pomiar średnic komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona szybki, prosty i bezpośredni pomiar pojedynczych komórek, w przeciwieństwie do zwykłych testów proliferacji limfocytów T.
Leczenie limfocytów lekami immunomodulującymi zwiększy lub zmniejszy szybkość i zakres blastogenezy komórkowej. Korzystając z testu licznika komórkowego, zakres tej blastogenezy można zmierzyć w ciągu około czterech minut na próbkę. W ciągu dziesięciu minut od złożenia ofiary spryskaj brzuch myszy 70 procentami etanolu i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w futrze i skórze po lewej stronie zwierzęcia.
Przytrzymaj skórę w rozkroku i z powrotem, aby odsłonić otrzewną. Następnie nałóż czteroprocentową chlorheksydynę na miejsce nacięcia. Za pomocą drugiego zestawu nożyczek i kleszczy wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe cięcie wzdłuż środkowego brzucha, aby otworzyć otrzewną.
Następnie usuń przyczepy trzewne i nadmiar tłuszczu otaczający śledzionę i przenieś tkankę do pojemnika DPBS. Następnie dodaj dziesięć mililitrów kompletnej pożywki RPMI 1640 do dziesięciocentymetrowej pożywki hodowlanej i zmiażdż śledziony między dwoma wysterylizowanymi szkiełkami z matowego szkła. Przefiltruj zawiesinę tkanek przez sterylne sitko do komórek nylonowych o grubości 40 mikronów do nowego dziesięciocentymetrowego naczynia hodowlanego, aby usunąć tkanki łączne i zanieczyszczenia oraz przenieść zawiesinę jednokomórkową do 50-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania.
Zawiesić osad w 20 mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek. Po dziesięciu minutach w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania i ponownie zawiesić osad w dziesięciu mililitrach świeżego podłoża. Następnie ponownie odwirować komórki w celu ponownego zawieszenia w dwóch mililitrach kompletnej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Aby oczyścić limfocyty T, najpierw umyj jedną do dwóch kolumn z wełny nylonowej na śledzionę dwa razy pięcioma mililitrami pełnego RPMI i umieść kolumny w inkubatorze do hodowli komórek o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla na jedną godzinę. Pod koniec inkubacji załadować dwa mililitry izolowanej zawiesiny splenocytów na wierzch każdej kolumny i pozwolić komórkom przejść przez kolumnę, aż ciecz dotrze do górnej części wełny. Następnie dodaj dwa mililitry świeżej pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza na szczyt kolumn i pozwól pożywce przejść przez wełnę nylonową, aż ciecz w górnej części kolumny dotrze do górnej części wełny.
Teraz przykryj wełnę trzema mililitrami kompletnego podłoża o temperaturze 37 stopni Celsjusza i włóż kolumnę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych, aby wszystkie komórki B, fibroblasty i komórki pomocnicze przylegały do włókien wełny. Po godzinie, w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, umyj kolumnę dwa razy pięcioma mililitrami świeżej, kompletnej pożywki, aby wymyć nieprzylegające limfocyty T. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie.
Po jednokrotnym umyciu limfocytów T dziesięcioma mililitrami kompletnej pożywki, ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach świeżej kompletnej pożywki. Następnie policz komórki i rozcieńcz zawiesinę do stężenia 0,5 razy dziesięć do sześciu komórek na mililitr w świeżej kompletnej pożywce do wysiewu na sześcio- lub 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami. W ciągu 24 godzin od ich izolacji aktywuj izolowane limfocyty T z kolumny z wełny nylonowej odpowiednim bodźcem i eksperymentalnym lekiem będącym przedmiotem zainteresowania.
Po 12 do 72 godzinach użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie wymieszać aktywowane leczone komórki, aby usunąć wszelkie grudki. Aby zmierzyć średnice komórek za pomocą automatycznego licznika komórek, należy przenieść jeden mililitr poddanych działaniu komórek z każdej studzienki do indywidualnych kubków na próbki i umieścić kubki na próbki w karuzeli próbek automatycznego licznika komórek. Wprowadź identyfikator próbki i informacje o typie komórki, aby zarejestrować próbki i rozpocząć ich uruchamianie.
Po zmieszaniu błękitu trypanowego z zawiesiną komórkową, komórki są przepuszczane przez pole obrazowania, aż z każdej próbki zostanie pobranych około 100 obrazów komórek. Oprogramowanie rysuje okrąg wokół każdej wykrytej komórki barwionej na niebiesko i niebarwionej na niebiesko, aby określić średnicę komórki. Po zmierzeniu wszystkich komórek dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego, który pokazuje wyniki jako całkowitą i żywotną liczbę komórek dla każdej zmierzonej średnicy.
Dane mogą być następnie prezentowane w postaci histogramów. Po dwóch dniach stymulacji PMA i jonomycyną obserwuje się znaczne przesunięcie mediany rozkładu częstości w kierunku większych średnic komórek, przy czym liczba limfocytów T o mniejszych średnicach jest odpowiednio zmniejszona. Przy ustalonym stężeniu jonomycyny 250 nanomolowych efekt PMA nie ulega znaczącej zmianie poprzez podniesienie stężenia bodźca aktywacyjnego z dwóch do 250 nanogramów na mililitr.
Nie zaobserwowano również znaczącej różnicy w proliferacji limfocytów T. Leki hamujące kalcyneurynę częściowo hamują zarówno blastogenezę, jak i proliferację limfocytów T. Leczenie limfocytami T związkami immunosupresyjnymi, które celują w czynnik jądrowy kalcyneuryny aktywowanych limfocytów T, hamuje odpowiedź blastogenną o prawie 72 procent.
Rapamycyna i FTY720 wykazują umiarkowany, ale statystycznie istotny wpływ na blastogenezę. Podczas gdy TRAM34 najwyraźniej nie wpływa na proliferację mysich limfocytów T nawet przy stężeniach 700 nanomolowych. Gdy rapamycyna i cyklosporyna A są stosowane razem, blastogeneza jest całkowicie zahamowana.
Podobne wyniki obserwuje się w przypadku mysich limfocytów T aktywowanych sprzężonymi kulkami magnetycznymi anty-CD3 i anty-CD28. Test ten może być wykorzystany do skutecznego ilościowego określenia działania różnych leków immunomodulujących, dając lepszą ocenę siły działania leku w porównaniu z typowymi testami proliferacji, które obejmują również udział komórek apoptotycznych i martwiczych. Dzięki tej metodzie można zmierzyć do 15 próbek i na zewnątrz, co pozwala na jednoczesną i późniejszą kwantyfikację zarówno szybkości blastogenezy, jak i proliferacji.
Czasami pęcherzyki powietrza mogą dostać się do komory przepływowej, co sprawia, że pomiar nie nadaje się do użytku, dlatego wszystkie obrazy powinny zostać zbadane pod kątem pęcherzyków powietrza przed przyjęciem danych z każdej próby do analizy. Jednym z ograniczeń tej procedury jest to, że jeśli w próbce jest zbyt dużo zanieczyszczeń, pomiar może traktować je jako żywe komórki. Dzięki odpowiednim modyfikacjom test ten może zostać zaadaptowany do badania zmiany wielkości komórek w neutrofilach i hepatocytach.
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę ilościowego określania blastogenezy limfocytów T przy użyciu zautomatyzowanego licznika komórek. Technika ta umożliwia szybką pomiar średnic komórek, dostarczając informacji na temat aktywacji limfocytów T i efektów leków immunomodulujących.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Farmakologia
Tło
- Mitogeneza limfocytów T wiąże się z transformacją blastogenną.
- Objętość komórki wzrasta przed podziałem podczas aktywacji.
- Tradycyjne testy mogą nie zapewniać bezpośrednich pomiarów reakcji pojedynczych komórek.
- Zautomatyzowane liczniki komórek mogą zwiększyć dokładność takich pomiarów.
Cel badania
- Oceniać potencjalność leków immunomodulujących na aktywację limfocytów T.
- Opracować szybki test do pomiaru blastogenezy limfocytów T.
- Ulepszyć istniejące testy proliferacji, koncentrując się na transformacji blast.
Stosowane metody
- Izolacja śledzionocytów ze śledzion szczurów.
- Użycie kolumn z wełny nylonowej do oczyszczania limfocytów T.
- Aktywacja limfocytów T za pomocą specyficznych stymulantów i leków.
- Pomiar średnic komórek za pomocą zautomatyzowanego licznika komórek.
Główne wyniki
- Zaobserwowano znaczące zmiany w rozkładach średnic komórek po leczeniu.
- Inhibitory kalcyneuryny znacząco hamowały blastogenezę limfocytów T.
- Leczenia skojarzone wykazywały pełne hamowanie blastogenezy.
- Test skutecznie ilościowo określił efekty leków w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Wnioski
- Test z użyciem zautomatyzowanego licznika komórek zapewnia szybką i dokładną metodę oceny aktywacji limfocytów T.
- Ta metoda może rozróżnić efekty różnych leków immunomodulujących.
- Oferuje lepszą ocenę potencjalności leków niż typowe testy proliferacji.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid quantification of T lymphocyte blastogenesis enables early assessment of immunomodulatory drug potency by measuring direct cellular responses. This approach supports target validation and mechanistic de-risking in discovery by providing quantitative, single-cell resolution data. It improves predictive confidence in lead identification by distinguishing drug effects on activation from nonspecific cytotoxicity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring blastogenic transformation as an early indicator of T cell activation.
- Operational Value: Enables rapid screening of immunomodulatory compounds with results in approximately four minutes per sample.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying drugs that significantly suppress blastogenesis, such as calcineurin inhibitors showing ~72% inhibition.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides direct measurement of individual cell diameters, avoiding confounding effects from apoptotic or necrotic cells in population-based assays.
- Operational Value: Uses automated cell counter to process up to 15 samples simultaneously, enhancing throughput and reproducibility.
- Assay Readiness: Generates quantitative diameter distributions that can be presented as histograms for comparative analysis across conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical validation by measuring a conserved activation process in both mouse and human T cells.
- Mechanistic De-risking: Differentiates drug effects on blastogenesis versus proliferation, as shown with rapamycin and FTY720 exhibiting moderate but significant effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables evaluation of combination therapies, such as rapamycin and cyclosporin A, which together completely inhibit blastogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical assessment of immunomodulatory candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying blastogenic response to stimuli like PMA/ionomycin or anti-CD3/CD28 beads.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, automated diameter measurement with minimal hands-on time.
- Analytics: Outputs viable cell counts and diameter distributions enabling statistical comparison of drug effects across concentrations.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary T cells from mouse spleens and human PBMCs, preserving physiological relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing immunomodulatory drugs across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of activation-induced cell enlargement.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability via automated cell counter instrumentation and standardized sample preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative data on drug effects on T cell activation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds with strong blastogenic suppression, such as calcineurin inhibitor combinations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary T cell isolation using nylon wool columns and aseptic tissue processing.
- Dependent on access to an automated cell counter capable of diameter measurement and trypan blue exclusion.
- Necessitates cross-team standardization of stimulation protocols (e.g., PMA/ionomycin or anti-CD3/CD28) and drug treatment timelines.
- Involves adaptation considerations for sample quality, as excessive debris may be misidentified as viable cells.
- Includes practical limitations such as susceptibility to air bubbles in the flow cell, requiring image inspection before data acceptance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Raw Splenocyte Preparation
2:36
T Lymphocyte Purification, Activation, and Experimental Drug Exposure
4:41
Automated Cell Counter Data Collection
5:40
Results: Representative Effects of T Cell Stimuli and Immunosuppressants on Cell Diameter and Proliferation
7:11
Conclusion
